JPH06122633A - Antibody having immunoactivity on streptococcus mutans and dental caries preventive - Google Patents

Antibody having immunoactivity on streptococcus mutans and dental caries preventive

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JPH06122633A
JPH06122633A JP29810292A JP29810292A JPH06122633A JP H06122633 A JPH06122633 A JP H06122633A JP 29810292 A JP29810292 A JP 29810292A JP 29810292 A JP29810292 A JP 29810292A JP H06122633 A JPH06122633 A JP H06122633A
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JP
Japan
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antibody
pac
fragment
antigen
mutans
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Application number
JP29810292A
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Japanese (ja)
Inventor
Yasukuni Nishida
安邦 西田
Motoyuki Nakai
素行 中井
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Lion Corp
Original Assignee
Lion Corp
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Publication date
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Publication of JPH06122633A publication Critical patent/JPH06122633A/en
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Abstract

PURPOSE:To provide an antibody high in dental caries-preventive activity leading to excellent dental caries-preventive effect, also greatly high in safety. CONSTITUTION:The objective antibody can be obtained by immunizing mammals or birds with an antigen, a fragment obtained by nicking a protein antigen having sticking activity to teeth surface and produced from Streptococcus mutans. The fragment consists of a polypeptide containing part or the whole of an amino acid sequence from the 478th amino acid (aspartic acid) to the 1000th amino acid (glutamine).

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【0001】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、う蝕を誘発する病原菌
である口腔連鎖球菌のストレプトコッカス・ミュータン
ス(以下、S.mutansという)に対して免疫活性
を有する抗体及び該抗体を有効成分として含むう蝕予防
剤に関する。
The present invention relates to an antibody having immunological activity against Streptococcus mutans (hereinafter referred to as S. mutans) of oral streptococcus which is a pathogenic bacterium that induces dental caries, and the antibody as an active ingredient. The present invention relates to an agent for preventing dental caries.

【0002】[0002]

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】ストレ
プトコッカス・ミュータンス・グループ(Strept
ococcusmutans group)は、ヒトや
動物にう蝕を引き起こす細菌であることが知られてい
る。このグループの中で、ヒトのう蝕に深く関与してい
るのは、血清型c型に属するS.mutansである。
S.mutansは、ヒトの歯面上に形成されるペリク
ルに吸着する。ペリクルとは、唾液中のタンパク質等か
らなる歯面上の被膜のことを指す。本菌は、ペリクルへ
の吸着後、グルコシルトランスフェラーゼと呼ばれる菌
体外酵素により合成される多糖によって強固に固着し、
酸で歯のエナメル質の脱灰を引き起こす。
BACKGROUND OF THE INVENTION Streptococcus mutans group (Strept)
Ococcus mutans group) is known to be a bacterium that causes caries in humans and animals. Of this group, S. cerevisiae, which belongs to serotype c, is deeply involved in caries in humans. mutans.
S. Mutans adsorb to pellicle formed on the human tooth surface. The pellicle refers to a coating on the tooth surface that is composed of proteins and the like in saliva. After adsorbing to the pellicle, this bacterium is firmly fixed by a polysaccharide synthesized by an extracellular enzyme called glucosyltransferase,
Acid causes tooth enamel demineralization.

【0003】S.mutansがペリクルに吸着する際
に重要な因子は、本菌の表層に存在する分子量約19万
のフィムブリエと呼ばれるタンパク質抗原であり、PA
c、I/II、B,P1,IF等様々な名称で呼ばれる
が、本明細書では、PAc(Protein anti
gen serotype c)と呼ぶ。また、ペリク
ル側の因子としては、唾液中に含まれるS.mutan
sの凝集因子の関与が示唆されている。
S. An important factor in the adsorption of mutans on the pellicle is a protein antigen called fimbriae with a molecular weight of about 190,000, which is present on the surface layer of this bacterium
Although referred to by various names such as c, I / II, B, P1, IF, in this specification, PAc (Protein anti) is used.
gen serototype c). Further, as a factor on the pellicle side, S. cerevisiae contained in saliva. mutan
The involvement of the s aggregation factor has been suggested.

【0004】PAcで免疫した動物より得られる抗体に
より、S.mutansの付着が阻止されることは、既
に報告されている。しかし、このような方法で得られる
抗体をう蝕予防剤として利用する際、最も重要なこと
は、PAcのどの部位を認識する抗体が有効抗体となる
かという点である。しかし、この点に関しては、現在ま
で明らかにされていない。
Antibodies obtained from animals immunized with PAc were used to transform S. It has been previously reported that the attachment of mutans is blocked. However, when the antibody obtained by such a method is used as a caries preventive agent, the most important point is which part of PAc will be the effective antibody. However, this point has not been clarified until now.

【0005】即ち、PAcに対する抗体をう蝕予防抗体
として用いる際、有効な抗体を効率に得ることが必要と
されるが、PAcそのもので免疫した場合、有効性に関
与しない抗体が多量に生成されるという問題点が生ず
る。このことは、有効性、安全性の点からみても好まし
いことではない。
That is, when an antibody against PAc is used as a caries-preventing antibody, it is necessary to efficiently obtain an effective antibody, but when immunized with PAc itself, a large amount of an antibody that is not involved in efficacy is produced. The problem arises that This is not preferable in terms of effectiveness and safety.

【0006】このため、このような不利のない、よりう
蝕予防効果の高い抗体が望まれる。
[0006] Therefore, an antibody having such a disadvantage and a higher caries-preventing effect is desired.

【0007】[0007]

【課題を解決するための手段及び作用】本発明者は上記
要望に応えるため鋭意検討を行った結果、PAcを切断
して得られた断片のうち、アミノ酸478番(アスパラ
ギン酸)〜1000番(グルタミン)を含む断片がPA
cの唾液付着領域となることを知見すると共に、この断
片のポリペプチドを抗原とし、これを哺乳類や鳥類に免
疫することによって得られた抗体がS.mutansに
対する免疫活性を特異的に示し、S.mutansの歯
面への付着に対する充分な阻害効果を有し、う蝕予防の
有効成分として非常に優れた効果を与えることを知見
し、本発明をなすに至った。
Means and Actions for Solving the Problems As a result of extensive studies to meet the above-mentioned needs, the present inventor has found that among the fragments obtained by cleaving PAc, amino acids 478 (aspartic acid) to 1000 ( The fragment containing glutamine) is PA
The antibody obtained by immunizing mammals and birds with the polypeptide of this fragment as an antigen was found to be the salivary adhesion region of S. c. S. mutans, specifically showing immunoreactivity against S. mutans, The inventors have found that they have a sufficient inhibitory effect on the attachment of mutans to the tooth surface and give a very excellent effect as an active ingredient for preventing dental caries, and thus completed the present invention.

【0008】従って、本発明は、ストレプトコッカス・
ミュータンスから得られる歯面への付着作用を有するタ
ンパク質抗原を切断した断片であって、該断片がアミノ
酸478番(アスパラギン酸)〜1000番(グルタミ
ン)の一部又は全部を含むポリペプチドを抗原とし、こ
れを哺乳類又は鳥類に免疫することによって得られた、
ストレプトコッカス・ミュータンスに対して免疫活性を
有する抗体、及び、この抗体を有効成分とするう蝕予防
剤を提供する。なお、上記アミノ酸番号はシグナルペプ
チドを含むものである。
Accordingly, the present invention provides Streptococcus
A fragment obtained by cleaving a protein antigen having an action of adhering to a tooth surface, which is obtained from mutans, wherein the fragment is a polypeptide containing a part or all of amino acids 478 (aspartic acid) to 1000 (glutamine). And obtained by immunizing this with mammals or birds,
Provided are an antibody having an immunological activity against Streptococcus mutans, and a caries preventive agent containing the antibody as an active ingredient. The above amino acid numbers include signal peptides.

【0009】以下、本発明につき更に詳しく説明する
と、本発明の抗体は、PAc断片のうちアミノ酸478
番(アスパラギン酸)〜1000番(グルタミン)の一
部又は全部を含むポリペプチドを抗原として哺乳類又は
鳥類を免疫することによって得られる免疫グロブリンか
らなるものである。
The present invention will be described in more detail below. The antibody of the present invention comprises amino acid 478 of the PAc fragment.
No. (aspartic acid) to No. 1000 (glutamine), or an immunoglobulin obtained by immunizing a mammal or a bird with a polypeptide containing part or all of the glutamine as an antigen.

【0010】ここで、このようなポリペプチドは、公知
の遺伝子工学的手法を採用してPAcを断片化し、その
発現タンパク質を得る方法によって製造することができ
る。
Here, such a polypeptide can be produced by a method of obtaining a protein expressed by fragmenting PAc using a known genetic engineering technique.

【0011】この方法を更に詳しく説明すると、S.m
utansの染色体DNAより、PCR(Polyme
rase chain reaction)法によりP
Ac遺伝子断片を増幅する。PCR法に用いるプライマ
ーDNAは、既に公知であるpac遺伝子の塩基配列を
もとにDNA合成機で適当な長さを合成する。その際、
ベクタープラスミドへのクローニングが容易になるよう
適当な制限酵素認識配列を付加するのが望ましい。
This method will be described in more detail. m
tans chromosomal DNA, PCR (Polyme
Rase chain reaction) method
The Ac gene fragment is amplified. The primer DNA used in the PCR method is synthesized with an appropriate length by a DNA synthesizer based on the already known base sequence of the pac gene. that time,
It is desirable to add an appropriate restriction enzyme recognition sequence to facilitate cloning into a vector plasmid.

【0012】プラスミドベクターとしては、一般に市販
されている発現ベクターを用いることができるが、アフ
ィニィティー精製が可能なよう、あるクロマト担体に選
択的に結合できるタンパク質との融合タンパク質として
発現できるように設計されたものが望ましい。融合させ
るタンパク質の例としては、APTG(p−Amino
phenyl−β−D−thiogalactopyr
anoside)をリガンドとするβ−ガラクトシダー
ゼ、クロラムフェニコールをリガンドとするクロラムフ
ェニコールアセチルトランスフェラーゼ、IgGをリガ
ンドとするprotein−A、マルトースをリガンド
とするマルトース結合タンパク質(MBA)等が挙げら
れる。また、ポリアルギニン付加による陽イオン交換で
の精製、ポリヒスチジン付加によるNi2+金属キレート
精製等も可能である。更に、これら融合させるタンパク
質の上流あるいは下流にプロテアーゼによる切断部位を
コードする配列が挿入されていれば、目的のタンパク質
のみを遊離させることができる。
[0012] As the plasmid vector, an expression vector which is generally commercially available can be used, but it must be designed so that it can be expressed as a fusion protein with a protein that can be selectively bound to a certain chromatographic carrier so as to allow affinity purification. Designed is desirable. Examples of proteins to be fused include APTG (p-Amino
phenyl-β-D-thiogalactopyr
β-galactosidase having an anoside) as a ligand, chloramphenicol acetyltransferase having chloramphenicol as a ligand, protein-A having IgG as a ligand, and maltose binding protein (MBA) having maltose as a ligand. Further, purification by cation exchange by addition of polyarginine and purification of Ni 2+ metal chelate by addition of polyhistidine are also possible. Furthermore, if a sequence encoding a cleavage site by a protease is inserted upstream or downstream of these proteins to be fused, only the target protein can be released.

【0013】pac遺伝子断片のクローニングは、増幅
した断片及びベクターDNAを適当な制限酵素で切断
し、次いでリガーゼを用いて連結することができる。組
換えDNAの大腸菌への導入は、従来からの方法により
行い、目的のプラスミドであることは、制限酵素による
切断等で確認できる。また、クローニングされた遺伝子
断片を大腸菌で発現させ、PAcに対する抗体を用いた
ウェスタンブロット等で確認すれば、さらに確実であ
る。
The pac gene fragment can be cloned by cutting the amplified fragment and the vector DNA with an appropriate restriction enzyme, and then ligating with ligase. Introduction of the recombinant DNA into Escherichia coli is carried out by a conventional method, and it can be confirmed that the desired plasmid is a plasmid by digestion with a restriction enzyme. It is more reliable if the cloned gene fragment is expressed in E. coli and confirmed by Western blotting using an antibody against PAc.

【0014】発現させたPAc断片タンパク質の精製
は、ベクターの種類により異なる。また、精製を容易に
する機能の付加されていないベクター系の場合でも、P
Acに対する抗体を用いたアフィニィティークロマトグ
ラフィーが可能である。更に、従来から使用されている
イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、塩析等古典
的方法も使用できる。
Purification of the expressed PAc fragment protein depends on the type of vector. Even in the case of a vector system that does not have the function of facilitating purification, P
Affinity chromatography using an antibody against Ac is possible. Furthermore, classical methods such as ion exchange chromatography, gel filtration and salting out that have been conventionally used can also be used.

【0015】なお、上記の方法は、大腸菌を宿主とした
場合であるが、この他、枯草菌、酵母、動植物等の宿主
−ベクター系も使用できることはいうまでもない。
In the above method, Escherichia coli is used as a host, but it goes without saying that a host-vector system such as Bacillus subtilis, yeast, animals and plants can also be used.

【0016】また、本発明では、c型のS.mutan
sについて述べたが、g型のS.sobrinusもほ
ぼ同じアミノ酸配列を有する表層タンパク質抗原をも
ち、これも同様な領域が付着部位と予想される。
In the present invention, the c-type S. mutan
s, the g-type S. Sobrinus also has a surface protein antigen having almost the same amino acid sequence, and a similar region is expected to be an attachment site.

【0017】本発明の抗体は、上記ポリペプチドを抗原
とし、これを免疫した哺乳動物(馬、牛、羊、ヤギ等)
又は鳥類、特に家禽(鶏等)の血清、乳、卵、卵黄等よ
り得られるが、この場合免疫方法などは公知の方法を採
用し得る。
The antibody of the present invention is a mammal (horse, cow, sheep, goat, etc.) immunized with the above-mentioned polypeptide as an antigen.
Alternatively, it can be obtained from serum, milk, egg, egg yolk, etc. of birds, especially poultry (chicken etc.), and in this case, known methods can be adopted as the immunization method and the like.

【0018】具体的には、哺乳動物への免疫方法として
は、皮下注射、筋肉注射、腹腔内投与等による通常の方
法や点鼻、点眼等の方法によって行うことができる。抗
原の投与量は、所望の抗体価が得られ、かつ免疫動物に
対して悪影響を与えない量を適宜選択すればよい。な
お、必要に応じて例えばフロイント完全アジュバント
(FCA)、フロイント不完全アジュバント(FI
A)、水酸化アルミニウム等のアジュバントを該抗原と
共に併用してもよい。
Specifically, as a method for immunizing a mammal, a usual method such as subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal administration or the like, or a method such as nasal drop or eye drop can be used. The dose of the antigen may be appropriately selected so that the desired antibody titer can be obtained and the animal is not adversely affected. If necessary, for example, Freund's complete adjuvant (FCA), Freund's incomplete adjuvant (FI
A), an adjuvant such as aluminum hydroxide may be used in combination with the antigen.

【0019】例えば、小動物では抗原1〜500μg
(タンパク質として)、大動物は0.1〜1mgを1回
量として2〜5週間おきに3〜5回常法によって免疫す
る。兎の場合、抗原液(タンパク質として100〜20
0μg/ml)を等量のフロイント完全アジュバントと
混合したものを2〜5週間おきに3〜5回投与し、最終
免疫後、10〜14日目に動物から常法により採血し、
免疫グロブリンを含有するプラズマを得る。これをその
まま使用することもできるし、更に常法により精製して
抗血清、あるいは免疫グロブリンとして使用することも
できる。
For example, in small animals, the antigen is 1 to 500 μg.
As a protein, a large animal is immunized with 0.1 to 1 mg once every 2 to 5 weeks for 3 to 5 times by a conventional method. In the case of rabbits, the antigen solution (100 to 20 as protein)
(0 μg / ml) mixed with an equal amount of Freund's complete adjuvant was administered 3 to 5 times every 2 to 5 weeks, and 10 to 14 days after the final immunization, blood was collected from the animals by a conventional method,
A plasma containing immunoglobulins is obtained. This can be used as it is, or further purified by a conventional method and used as antiserum or immunoglobulin.

【0020】一方、免疫に使用する鶏としては、特に制
限はないが、抗体の生産性という観点から、白色レッグ
ホーン等の卵用種を使用できる。また、抗原による免疫
方法としては、皮下注射、腹腔内投与等による通常の方
法や、点鼻、点眼等の方法によって行うことができる。
抗原の投与量は、所望の抗体価が得られ、かつ鶏に対し
て悪影響を与えない量を適宜選択すればよい。通常初回
免疫から数週間で投与抗原に対して特異的に反応する抗
体が鶏卵(卵黄)中に得られる。なお、必要に応じて例
えばフロイント完全アジュバント(FCA)、フロイン
ト不完全アジュバント(FIA)、水酸化アルミニウム
等のアジュバントを該抗原と共に併用してもよい。免疫
から1ヶ月以上経過した鶏から採取した卵より、本発明
の抗PAc断片抗体を調製することができる。
On the other hand, chickens to be used for immunization are not particularly limited, but eggs such as white leghorns can be used from the viewpoint of antibody productivity. As an immunization method with an antigen, a usual method such as subcutaneous injection or intraperitoneal administration, or a method such as nasal drop or eye drop can be used.
The dose of the antigen may be appropriately selected so that the desired antibody titer is obtained and the chicken is not adversely affected. Usually, an antibody that specifically reacts with the administered antigen is obtained in chicken eggs (yolk) within a few weeks after the initial immunization. If necessary, an adjuvant such as Freund's complete adjuvant (FCA), Freund's incomplete adjuvant (FIA), or aluminum hydroxide may be used in combination with the antigen. The anti-PAc fragment antibody of the present invention can be prepared from an egg collected from a chicken that has passed one month or more after immunization.

【0021】なお、卵黄中の抗体価は、酵素免疫吸着法
(ELISA)、ラジオイムノアッセイ等を用いて測定
することができる。これらの方法により、免疫後に2週
間程度間隔で抗体価を測定することにより抗体価の推移
を追跡することができる。また、精製抗体の活性は、菌
体凝集法も利用される。抗体力価の持続性については約
3ヶ月くらい高抗体価である。免疫後抗体価の減少が見
られた場合、適当な間隔で適宜追加免疫をすることによ
り抗体価を上昇させることができる。
The antibody titer in egg yolk can be measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay or the like. By these methods, the transition of the antibody titer can be traced by measuring the antibody titer at intervals of about 2 weeks after immunization. For the activity of the purified antibody, the cell aggregation method is also used. Regarding the persistence of antibody titer, the antibody titer is high for about 3 months. When a decrease in antibody titer is observed after immunization, the antibody titer can be increased by appropriately performing booster immunization at appropriate intervals.

【0022】本発明の抗PAc断片抗体は、例えば上記
のようにして免疫した鶏の卵黄に含まれる免疫グロブリ
ンを抽出・分離することによって得ることができる。こ
の抽出・分離方法としては、例えば多糖、ポリエチレン
グリコールを用いた沈澱法や、エタノール、プロパノー
ル、クロロホルムを用いた抽出法等、通常用いられてい
る免疫グロブリンを抽出・分離できる種々の方法が利用
できる。
The anti-PAc fragment antibody of the present invention can be obtained by, for example, extracting and separating immunoglobulin contained in egg yolk of the chicken immunized as described above. As the extraction / separation method, for example, a precipitation method using a polysaccharide or polyethylene glycol, an extraction method using ethanol, propanol, or chloroform, and various methods that can be used to extract / separate commonly used immunoglobulins can be used. .

【0023】以上のようにして得られた本発明の抗PA
c断片抗体は、S.mutans菌に存在している菌体
表層蛋白(PAc)と特異的に反応し、S.mutan
s菌に対して免疫活性を有する。即ち、S.mutan
sの歯面への付着を阻害する効果を有し、該抗体を口腔
内に投与することによってS.mutansの口腔への
定着を阻止し、う蝕を予防することができる。
The anti-PA of the present invention obtained as described above
The c-fragment antibody is S. S. mutans, which specifically reacts with the cell surface protein (PAc) present in S. mutans, mutan
It has an immunological activity against s. That is, S. mutan
It has the effect of inhibiting the adhesion of S. s to the tooth surface, and the S. It is possible to prevent mutans from colonizing the oral cavity and prevent caries.

【0024】従って、本発明の抗体は、う蝕予防剤の有
効成分として好適に使用されるもので、本発明のう蝕予
防剤は、上記の抗PAc断片抗体を含み、その口腔への
投与形態に応じて種々の形に調製される。例えば、マウ
スウオッシュや練歯磨等として利用する場合には、各種
成分を用いてこれらを調製する際に、本発明の抗PAc
断片抗体の有効量を含有させればよい。抗PAc断片抗
体のう蝕予防剤への配合量は、その投与形態に応じた投
与量に従って適宜選択すればよく、例えば菌体凝集価1
000凝集単位以上の抗体を0.0001〜10重量%
程度とすることができる。
Therefore, the antibody of the present invention is preferably used as an active ingredient of a caries preventive agent, and the caries preventive agent of the present invention contains the above-mentioned anti-PAc fragment antibody and is administered to the oral cavity. It is prepared in various forms depending on the form. For example, when used as a mouthwash, toothpaste, etc., the anti-PAc of the present invention should be prepared when these ingredients are prepared.
It suffices to include an effective amount of the fragment antibody. The amount of the anti-PAc fragment antibody to be incorporated into the caries preventive agent may be appropriately selected according to the dose according to the mode of administration, for example, bacterial cell aggregation value 1
0.0001 to 10% by weight of an antibody of 000 aggregation units or more
It can be a degree.

【0025】なお、本発明のう蝕予防剤において、上記
抗体としては精製した抗体を用いてもよく、或いは上記
抗原を免疫した哺乳動物や鳥類の血清、乳、卵、卵黄を
そのまま用いてもよい。
In the caries preventive agent of the present invention, a purified antibody may be used as the above antibody, or serum, milk, egg or yolk of mammals or birds immunized with the above antigen may be used as it is. Good.

【0026】また、本発明のう蝕予防剤は、上述したよ
うにマウスウオッシュ、歯磨類、その他の種々の口腔用
組成物の形態に調製され、これらの成分としては組成物
の種類に応じた公知の成分を配合し得る。
Further, the caries preventive agent of the present invention is prepared in the form of mouthwash, toothpaste, and various other oral compositions as described above, and these ingredients depend on the type of composition. Known components may be blended.

【0027】[0027]

【発明の効果】本発明の抗体はう蝕予防効果が高く、こ
の抗体を有効成分とするう蝕予防剤は優れたう蝕予防効
果を与える上、安全性も非常に高いものである。
INDUSTRIAL APPLICABILITY The antibody of the present invention has a high caries-preventing effect, and a caries-preventing agent containing this antibody as an active ingredient has an excellent caries-preventing effect and is extremely safe.

【0028】[0028]

【実施例】以下、参考例、実施例を示して本発明を更に
具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限され
るものではない。
EXAMPLES The present invention will be described more specifically below with reference to reference examples and examples, but the present invention is not limited to the following examples.

【0029】〔参考例〕S.mutans染色体の調製 S.mutans MT8148株を20mM D,L
−トレオニンを添加したトッド・ヘビット培地で37℃
で18時間培養した。遠心して集菌後、TE(10mM
Tris・Cl,1mM EDTA)バッファーで洗
い、20%グルコースを含む同バッファーに懸濁した。
菌懸濁液に8mg/mlリゾチームを加え、37℃で3
0分作用させ、次いで0.1mg/ml N−アセチル
ムラミダーゼSGを添加して50℃において30分で溶
菌させた。溶菌液に0.3mg/ml RNase、
0.3mg/mlプロナーゼEで各々37℃で30分作
用させた。次いで、2%N−ラウリルザルコシンNa塩
を加え、37℃で30分後、遠心して染色体を得た。こ
れをさらにフェノール−クロロホルム1:1の抽出溶媒
で抽出し、TEバッファーで透析して精製した。
Reference Example S. Mutans Chromosome Preparation mutans MT8148 strain 20 mM D, L
-37 ° C in Todd-Hebit medium supplemented with threonine
It was cultured for 18 hours. After collecting cells by centrifugation, TE (10 mM
(Tris.Cl, 1 mM EDTA) buffer and washed with the same buffer containing 20% glucose.
Add 8 mg / ml lysozyme to the bacterial suspension and mix at 37 ° C for 3
The mixture was allowed to act for 0 minutes, and then 0.1 mg / ml N-acetylmuramidase SG was added to lyse the cells at 50 ° C. for 30 minutes. 0.3 mg / ml RNase in the lysate,
0.3 mg / ml Pronase E was allowed to act for 30 minutes at 37 ° C. Then, 2% N-lauryl sarcosine Na salt was added, and after 30 minutes at 37 ° C., centrifugation was performed to obtain a chromosome. This was further extracted with an extraction solvent of phenol-chloroform 1: 1 and dialyzed against TE buffer for purification.

【0030】pac遺伝子断片のクローニング pac遺伝子の図1に示す領域をPCR法で増幅した。
その際プライマーDNAの5’末端側に制限酵素Kpn
I及びSalI認識配列をもつよう合成した。ベクター
DNAとしては市販のpAXプラスミドを使用した。な
お、図中の番号は、シグナル配列を含むpac遺伝子の
塩基番号を示し、括弧内の番号はアミノ酸配列番号を示
す。
Cloning of pac gene fragment The region shown in FIG. 1 of the pac gene was amplified by PCR.
At that time, the restriction enzyme Kpn was added to the 5'end of the primer DNA.
It was synthesized to have I and SalI recognition sequences. A commercially available pAX plasmid was used as the vector DNA. The numbers in the figure show the base numbers of the pac gene containing the signal sequence, and the numbers in parentheses show the amino acid sequence numbers.

【0031】pac遺伝子断片及びベクターDNAをK
pnI及びSalIで切断した。次に両断片をリガーゼ
で連結し、エシェリヒア・コリ(E.coli)NM5
22株に導入した。得られた形質転換株よりプラスミド
を抽出し、KpnI及びSalIで再切断し、ベクター
に挿入された断片の長さが予期された通りであることを
確認した。
K the pac gene fragment and vector DNA
Digested with pnI and SalI. Next, both fragments were ligated with ligase, and E. coli NM5
Introduced into 22 strains. A plasmid was extracted from the obtained transformant and re-cut with KpnI and SalI to confirm that the length of the fragment inserted into the vector was as expected.

【0032】pac遺伝子断片の発現及び精製 pac断片の挿入されたpAXをもつプラスミドをLB
培地で培養し、OD600が0.5程度になったらラクト
ース・プロモーターの誘導物質であるIPTGを0.1
〜0.2mM添加し、25℃で18時間培養した。集菌
後、適当なバッファーで洗い、1mM EDTAを含む
トリスバッファーに懸濁した。超音波で菌体を破壊後、
遠心して上清を得た。発現は、上清のSDS−PAGE
及びPAcに対する抗体によるウェスタンブロット法で
確認した。
Expression and Purification of pac Gene Fragment A plasmid having pAX with the inserted pac fragment was LB
After culturing in the medium, when the OD 600 reaches about 0.5, IPTG, which is an inducer of the lactose promoter, is added to 0.1.
˜0.2 mM was added, and the mixture was cultured at 25 ° C. for 18 hours. After collecting the cells, the cells were washed with an appropriate buffer and suspended in Tris buffer containing 1 mM EDTA. After destroying the cells with ultrasonic waves,
The supernatant was obtained by centrifugation. Expression is by SDS-PAGE of supernatant
And the antibody against PAc were confirmed by Western blotting.

【0033】発現したβ−ガラクトシダーゼとPAc断
片の融合タンパク質は、β−ガラクトシダーゼの基質の
誘導体であるAPTG(p−Aminophenyl−
β−thiogalactopyranoside)を
担体に結合させたアフィニィティークロマトグラフィー
に吸着させた後、pHを10.0に上げることで溶出し
た。さらにpAXは、β−ガラクトシダーゼの下流に−
Ile−Glu−Gly−Arg−の配列を有するよう
設計されており、この融合タンパク質をエンドプロテア
ーゼXaで処理することによりPAc断片を遊離し、上
記のAPTGカラムを再度通すことでPAc断片を精製
した。
The expressed fusion protein of β-galactosidase and PAc fragment is APTG (p-Aminophenyl-) which is a derivative of the substrate of β-galactosidase.
β-thiogalactopyranoside) was adsorbed on the affinity chromatography in which the carrier was bound, and then eluted by raising the pH to 10.0. Furthermore, pAX is located downstream of β-galactosidase-
It was designed to have the sequence Ile-Glu-Gly-Arg-, and the fusion protein was treated with endoprotease Xa to release the PAc fragment, and the PAc fragment was purified by passing through the APTG column again. .

【0034】PAc断片と唾液成分の相互作用 上記方法で得られたPAc断片を炭酸バッファー(pH
9.6)で希釈してELISAプレートに吸着させた。
1mM CaCl2を含むリン酸バッファー(pH7.
2)で洗浄後、ヒトより採取した全唾液を添加した。同
様にリン酸バッファーで洗浄後、ビオチンで標識したP
Acタンパク質を加えた。同様に洗浄後、アルカリフォ
スファターゼで標識したストレプトアビジンを添加し
た。次いで洗浄後、発色基質を加えてOD405を測定し
た。以上の方法でPAc断片の唾液付着性を検討した結
果を図2に示す。
Interaction between PAc fragment and salivary component The PAc fragment obtained by the above method was treated with carbonate buffer (pH
It was diluted with 9.6) and adsorbed on an ELISA plate.
Phosphate buffer containing 1 mM CaCl 2 (pH 7.
After washing in 2), whole saliva collected from human was added. Similarly, after washing with a phosphate buffer, P labeled with biotin
Ac protein was added. After washing in the same manner, streptavidin labeled with alkaline phosphatase was added. Then, after washing, a chromogenic substrate was added and OD 405 was measured. The results of examining the salivary adhesiveness of PAc fragments by the above method are shown in FIG.

【0035】図2の結果より、アミノ酸478番〜10
00番を含むPAc断片がPAcと同等の唾液成分付着
性を有することが確認された。
From the results of FIG. 2, amino acids 478 to 10
It was confirmed that the PAc fragment containing No. 00 has the same salivary component adhesiveness as PAc.

【0036】〔実施例1〕(PAc断片に対する鶏卵抗
体の調製) 参考例で得られたβ−ガラクトシダーゼとPAc(47
8〜1000)の融合蛋白質をエンドプロテアーゼXa
で処理した。SDS−PAGEでPAc断片の遊離を確
認した後、再度APTGカラムを通し、その素通り画分
を得ることでPAc(478〜1000)を精製した。
[Example 1] (Preparation of hen egg antibody against PAc fragment) β-galactosidase and PAc (47) obtained in Reference Example
8-1000) fusion protein to endoprotease Xa
Processed in. After confirming the release of the PAc fragment by SDS-PAGE, PAc (478 to 1000) was purified by passing through the APTG column again to obtain the flow-through fraction.

【0037】以上の調製法によって得られた抗原を1m
g/ml含む液0.5mlとFIA(フロイント不完全
アジュバント)0.5mlを1:1の割合で混合して、
W/O型のエマルジョンとした。得られたエマルジョン
を鶏の左右の胸筋に0.5mlずつ注射し、初回免疫を
行った後、下記の方法に従って、採取した卵から得た水
溶性画分(WSF)抗体価を測定し、その推移を検討し
た結果、鶏卵抗体80単位ml(1mg/ml)の液が
10ml得られた。
1 m of the antigen obtained by the above preparation method
0.5 ml of a liquid containing g / ml and 0.5 ml of FIA (Freund's incomplete adjuvant) were mixed at a ratio of 1: 1,
It was a W / O type emulsion. 0.5 ml each of the obtained emulsion was injected into the left and right pectoral muscles of the chicken, and after performing the initial immunization, the water-soluble fraction (WSF) antibody titer obtained from the collected eggs was measured according to the following method, As a result of examining the transition, 10 ml of a liquid containing 80 units ml (1 mg / ml) of the hen egg antibody was obtained.

【0038】卵からの抗体の採取方法 卵から分離した卵黄に等量の水を加え、さらに等量の
0.5%λカラギーナンの懸濁液を加え、撹拌後、80
00rpm,20分で遠心上清を得、これを抗体含有画
分(WSF)とした。なお、WSFの力価の測定法は下
記の通りである。
Method of collecting antibody from egg To the yolk separated from the egg, an equal amount of water was added, and an equal amount of a suspension of 0.5% λ carrageenan was added, and after stirring, 80
A centrifugal supernatant was obtained at 00 rpm for 20 minutes, and this was used as an antibody-containing fraction (WSF). The method for measuring the titer of WSF is as follows.

【0039】抗体価の測定法 (1)菌体浮遊液 TYC agar上のコロニー1〜2個を200mlの
BHI brothに接種し、37℃で18時間嫌気的
に培養後、集菌し、0.1%牛血清アルブミンを添加し
た生理食塩水(以下、BSA生食水という)で3回洗浄
する。洗浄した菌体をBSA生食水に浮遊させ、OD
550nm1.0に調整する。菌体浮遊液は、用時調製とす
る。 (2)試料抗体 希釈倍率20,30,50,70,90からそれぞれ2
n倍希釈する。 (3)操作法 マイクロプレート上で50μlの希釈抗体と50μlの
菌体浮遊液を混合、撹拌後、37℃で3時間、更に4℃
で一夜静置する。 (4)菌体凝集の判定 一夜静置後、マイクロプレート底を観察し、菌体のスポ
ットが出現しない場合を凝集陽性とし、わずかなスポッ
トでも観察された場合は凝集陰性とする。
Method for measuring antibody titer (1) Suspension of microbial cells One to two colonies on TYC agar were inoculated into 200 ml of BHI broth, cultured anaerobically at 37 ° C. for 18 hours, and then collected. Wash 3 times with physiological saline containing 1% bovine serum albumin (hereinafter referred to as BSA saline). The washed cells are suspended in BSA saline and OD
Adjust to 550nm 1.0. The cell suspension should be prepared before use. (2) Sample antibody Dilution ratio of 20, 30, 50, 70, 90 to 2 each
Dilute n times. (3) Operation method 50 μl of diluted antibody and 50 μl of cell suspension were mixed on a microplate, stirred, and then at 37 ° C. for 3 hours, then at 4 ° C.
Then let stand overnight. (4) Judgment of bacterial cell aggregation After standing overnight, the bottom of the microplate is observed, and when the bacterial cell spot does not appear, it is determined to be aggregation positive, and when even a few spots are observed, it is determined to be aggregation negative.

【0040】〔実施例2〕(抗血清、母乳及び抗体の調
製法) 実施例1と同様に精製したPAc(478〜1000)
を50〜2000μg/mlの濃度に調製し、等量のフ
ロイント不完全アジュバントと混合し、妊娠ヤギ、ウサ
ギ、ウシ、ウマの背部皮下に体重1kg当り0.3ml
を注射して免疫し、その後2〜4週間おきに抗原とフロ
イント不完全アジュバントとを混合したもので3回免疫
し、出産後に初乳を採取し、また抗血清については、上
記と同様に4回免疫後、採血し凝固させ、その遠心上清
をサンプルとした。
[Example 2] (Method for preparing antiserum, breast milk and antibody) PAc purified in the same manner as in Example 1 (478 to 1000)
Was prepared at a concentration of 50 to 2000 μg / ml, mixed with an equal amount of Freund's incomplete adjuvant, and 0.3 ml per kg of body weight was subcutaneously applied to the back of pregnant goats, rabbits, cows and horses.
And then immunized three times with a mixture of an antigen and Freund's incomplete adjuvant every 2 to 4 weeks, and colostrum was collected after delivery. After the immunization, blood was collected and coagulated, and the centrifugation supernatant was used as a sample.

【0041】次に上記初乳サンプルに等量の0.9%の
食塩水を加え、12000rpmで60分間遠心分離し
た後、上層の脂肪と沈澱物を除いて中間の液成分を採取
し、これに濃塩酸を加え、pH4に調製した。更に50
00rpmで30分間遠心分離した後、その上清をトリ
スハイドロキシアミノメタンで中和し、硫酸アンモニウ
ムを加えて75%飽和にし、得られた沈澱物を採取し、
これをリン酸緩衝液で透析して、母乳の抗体成分(内
液)を得た。また、上記抗血清に硫酸アンモニウムを加
えて50%飽和とし、得られた沈澱物をリン酸緩衝液で
透析して、抗血清の抗体(内液)を得た。
Next, an equal amount of 0.9% saline was added to the above colostrum sample, and the mixture was centrifuged at 12000 rpm for 60 minutes. Then, the upper layer fat and precipitate were removed, and an intermediate liquid component was collected. Concentrated hydrochloric acid was added to adjust the pH to 4. 50 more
After centrifuging at 00 rpm for 30 minutes, the supernatant was neutralized with trishydroxyaminomethane, ammonium sulfate was added to 75% saturation, and the obtained precipitate was collected,
This was dialyzed against a phosphate buffer to obtain an antibody component (internal solution) of breast milk. Further, ammonium sulfate was added to the above antiserum to make it 50% saturated, and the obtained precipitate was dialyzed against a phosphate buffer to obtain an antiserum antibody (internal solution).

【0042】実施例1と同様に抗体価を測定した結果、
血清抗体約280単位/ml(1mg/ml)の液及び
初乳抗体20単位/ml(1mg/ml)の液がそれぞ
れ得られた。
As a result of measuring the antibody titer in the same manner as in Example 1,
A liquid containing about 280 units / ml (1 mg / ml) of serum antibody and a liquid containing 20 units / ml (1 mg / ml) of colostral antibody were obtained.

【0043】〔実施例3〕(抗体によるS.mutan
sの平滑面への付着抑制効果) TYC agarプレートにS.mutans1044
9を塗抹して、18時間嫌気的に培養後、同プレートよ
り単コロニーを採取し、4mlのBHI培地に18時間
嫌気培養した。その後、培養液200μlを100ml
のBHI培地に植菌し、18時間嫌気培養した。菌体を
遠心で集め、50mMのリン酸緩衝液で3回洗浄後、同
緩衝液にて菌の濁度2.0になるように調製した(用時
調製)。
[Example 3] (S. mutan by antibody)
The effect of suppressing the adhesion of s to the smooth surface) S. mutans1044
After smearing 9 and anaerobically culturing for 18 hours, single colonies were collected from the plate and anaerobically cultivated in 4 ml of BHI medium for 18 hours. After that, 100 μl of 200 μl of culture solution
BHI medium was inoculated and anaerobically cultured for 18 hours. The bacterial cells were collected by centrifugation, washed 3 times with a 50 mM phosphate buffer solution, and then adjusted to a turbidity of 2.0 with the same buffer solution (prepared before use).

【0044】次に、下記の実験液を約60度の傾斜状態
にし、37℃、18時間好気条件下で培養した。次いで
4mlの蒸留水で3回洗浄した後、3mlの蒸留水を加
え、超音波処理し、OD550nmで濁度を測定し、下記式
から付着抑制率を評価した。結果を表1に示す。実験液 調製菌液 1.5ml 10%ショ糖液 0.3ml 50mMリン酸緩衝液(pH6.8) 0.9ml 30凝集単位抗体液 0.3ml (または50mMリン酸緩衝液(pH6.8))
Next, the following experimental solution was tilted at about 60 degrees and incubated at 37 ° C. for 18 hours under aerobic conditions. Then, after washing 3 times with 4 ml of distilled water, 3 ml of distilled water was added, ultrasonic treatment was performed, turbidity was measured at OD 550 nm , and the adhesion inhibition rate was evaluated from the following formula. The results are shown in Table 1. Experimental solution preparation Bacterial solution 1.5 ml 10% sucrose solution 0.3 ml 50 mM phosphate buffer (pH 6.8) 0.9 ml 30 aggregation unit antibody solution 0.3 ml (or 50 mM phosphate buffer (pH 6.8))

【0045】[0045]

【数1】 [Equation 1]

【0046】[0046]

【表1】 [Table 1]

【0047】〔実施例4〕(抗PAc断片抗体のう蝕抑
制効果) 兎を用いて調製した3種の抗血清を用いてハムスターに
よるう蝕抑制実験を行った。ハムスターは実験開始時3
週令の雄各群8匹を、飼料はう蝕誘発性飼料Diet2
000を、感染菌株はS.mutans 10449を
使用した。実験期間は、菌感染終了後3週間で、その
間、1日2回、凝集単位3単位に調製した抗血清0.2
mlをハムスター口腔内に滴下し、20ストロークそれ
ぞれ歯列をブラッシングした。う蝕の判定はカイズの方
法(Keyes, P.H.:J.dent. Re
s., 23:439−444,1944)に準じて行
った。結果を表2に示す。
Example 4 (Caries Suppressing Effect of Anti-PAc Fragment Antibody) A caries suppression experiment by hamsters was carried out using three kinds of antisera prepared using rabbits. Hamsters start experiment 3
Eight groups of week-old males were used as the diets for the caries-inducing diet Diet2.
000, and the infectious strain is S. mutans 10449 was used. The experimental period was 3 weeks after the bacterial infection was completed, during which time 0.2 times of antiserum prepared into 3 units of agglutination units was used twice a day.
ml was dropped into the oral cavity of the hamster, and the tooth row was brushed for each of 20 strokes. The determination of caries is performed by the method of Kize (Keyes, PH: J. dent. Re).
s. , 23: 439-444, 1944). The results are shown in Table 2.

【0048】[0048]

【表2】 [Table 2]

【0049】実施例3,4の結果より、本発明の抗PA
c断片抗体が抗PAc抗体や抗S.mutans全菌抗
体より優れたう蝕抑制効果を与えることが認められる。
From the results of Examples 3 and 4, the anti-PA of the present invention was obtained.
The c-fragment antibody is anti-PAc antibody or anti-S. It is recognized that a caries inhibitory effect superior to that of the mutans whole bacterium antibody is given.

【0050】〔実施例5〕以下、う蝕予防剤の処方例を
示す。 (1)歯磨剤 第2リン酸カルシウム・2水和物 50.0% ソルビット 10.0% グリセリン 10.0% カラゲナン 1.0% ソジウムラウリルサルフェート 1.0% 香料 1.0% サッカリン 0.1% エタノール 2.0% デキストラナーゼ 0.02% 抗PAc断片ヤギ乳抗体 0.2%水 残 100.0%
Example 5 The following is a prescription example of a caries preventive agent. (1) Dentifrice Dicalcium phosphate dihydrate 50.0% Sorbit 10.0% Glycerin 10.0% Carrageenan 1.0% Sodium lauryl sulphate 1.0% Fragrance 1.0% Saccharin 0.1% Ethanol 2.0% Dextranase 0.02% Anti-PAc fragment goat milk antibody 0.2% Water remaining 100.0%

【0051】 (2)歯磨剤 無水ケイ酸 30.0% グリセリン 30.0% ソルビット 20.0% カルボキシメチルセルロース 1.0% ソジウムラウリルサルフェート 1.2% 香料 1.0% サッカリン 0.1% エタノール 2.0% フッ化ナトリウム 0.1% 抗PAc断片馬血清抗体 0.1%水 残 100.0%(2) Dentifrice Silicic anhydride 30.0% Glycerin 30.0% Sorbit 20.0% Carboxymethyl cellulose 1.0% Sodium lauryl sulfate 1.2% Fragrance 1.0% Saccharin 0.1% Ethanol 2.0% Sodium fluoride 0.1% Anti-PAc fragment horse serum antibody 0.1% Water remaining 100.0%

【0052】 (3)歯磨剤 水酸化アルミニウム 45.0% ソルビット 20.0% カラゲナン 0.5% カルボキシメチルセルロース 1.0% ラウリルジエタノールアマイド 1.0% ショ糖モノラウレート 2.0% 香料 1.0% サッカリン 0.1% 抗PAc断片牛乳抗体 0.3%水 残 100.0%(3) Dentifrice Aluminum hydroxide 45.0% Sorbit 20.0% Carrageenan 0.5% Carboxymethyl cellulose 1.0% Lauryl diethanolamide 1.0% Sucrose monolaurate 2.0% Perfume 1. 0% Saccharin 0.1% Anti-PAc fragment milk antibody 0.3% Water 100.0%

【0053】 (4)歯磨剤 第2リン酸カルシウム 45.0% カルボキシメチルセルロース 1.0% カラゲナン 0.5% ソルビット 35.0% プロピレングリコール 3.0% N−ラウロイルメチルタウリンナトリウム 0.5% ゼラチン 1.0% パラオキシ安息香酸エチル 0.2% サッカリンナトリウム 0.1% 香料 1.0% モノフルオロリン酸ナトリウム 0.7% 抗PAc断片鶏卵抗体 0.4%水 残 100.0%(4) Dentifrice Dicalcium phosphate 45.0% Carboxymethylcellulose 1.0% Carrageenan 0.5% Solbit 35.0% Propylene glycol 3.0% N-lauroylmethyl taurine sodium 0.5% Gelatin 1. 0% Ethyl paraoxybenzoate 0.2% Sodium saccharin 0.1% Fragrance 1.0% Sodium monofluorophosphate 0.7% Anti-PAc fragment chicken egg antibody 0.4% Water 100.0% remaining

【0054】 (5)歯磨剤 水酸化アルミニウム 40.0% カルボキシメチルセルロースナトリウム 1.0% カラゲナン 0.5% ソルビット 35.0% プロピレングリコール 3.0% N−ミリストイルメチルタウリンナトリウム 0.5% ペプタイド 1.0% パラオキシ安息香酸メチル 0.2% サッカリンナトリウム 0.1% 香料 1.0% 抗PAc断片羊血清抗体 0.5%水 残 100.0%(5) Dentifrice Aluminum hydroxide 40.0% Carboxymethylcellulose sodium 1.0% Carrageenan 0.5% Solbit 35.0% Propylene glycol 3.0% N-myristoylmethyl taurine sodium 0.5% Peptide 1 0.0% Methyl paraoxybenzoate 0.2% Sodium saccharin 0.1% Fragrance 1.0% Anti-PAc fragment sheep serum antibody 0.5% Water 100.0%

【0055】 (6)歯磨剤 無水ケイ酸 20.0% カルボキシメチルセルロースナトリウム 1.0% ソルビット 50.0% ポリエチレングリコール 5.0% N−パルミトイルメチルタウリンナトリウム 0.5% カゼイン 1.0% パラオキシ安息香酸ナトリウム 0.2% サッカリンナトリウム 0.1% 香料 1.0% フッ化ナトリウム 0.2% 抗PAc断片鶏卵抗体 0.3%水 残 100.0%(6) Dentifrice 20.0% Silicic Acid Sodium Carboxymethyl Cellulose 1.0% Sorbit 50.0% Polyethylene Glycol 5.0% N-Palmitoyl Methyltaurine Sodium 0.5% Casein 1.0% Paraoxybenzoic Acid Sodium acid 0.2% Saccharin sodium 0.1% Fragrance 1.0% Sodium fluoride 0.2% Anti-PAc fragment chicken egg antibody 0.3% Water remaining 100.0%

【0056】 (7)洗口剤 エタノール 20.0% 香料 1.0% サッカリン 0.05% ラウリルジエタノールアマイド 0.3% クロルヘキシジングルコン酸塩 0.01% 抗PAc断片馬血清抗体 0.1%水 残 100.0%(7) Mouthwash Ethanol 20.0% Perfume 1.0% Saccharin 0.05% Lauryl diethanolamide 0.3% Chlorhexidine gluconate 0.01% Anti-PAc fragment horse serum antibody 0.1% Water 100.0% remaining

【0057】 (8)洗口剤 ソルビット 10.0% エタノール 20.0% N−ミリストイルメチルタウリンナトリウム 0.5% ショ糖ステアリン酸エステル 1.0% ペプタイド 0.5% パラオキシ安息香酸メチル 0.1% ステビオサイド 0.1% 香料 0.5% デキストラナーゼ 0.2% フッ化ナトリウム 0.2% 抗PAc断片鶏卵抗体 0.2%水 残 100.0%(8) Mouthwash Solbit 10.0% Ethanol 20.0% N-Myristoylmethyltaurine sodium 0.5% Sucrose stearate 1.0% Peptide 0.5% Methyl paraoxybenzoate 0.1 % Stevioside 0.1% Fragrance 0.5% Dextranase 0.2% Sodium fluoride 0.2% Anti-PAc fragment chicken egg antibody 0.2% Water remaining 100.0%

【0058】 (9)洗口剤 ソルビット 10.0% エタノール 20.0% N−ステアロイルメチルタウリンナトリウム 0.5% POE(20)ソルビタンモノオレート 1.0% コラーゲン 0.5% パラオキシ安息香酸メチル 0.1% サッカリンナトリウム 0.1% 香料 0.5% 抗PAc断片牛乳抗体 0.4%水 残 100.0%(9) Mouthwash Solbit 10.0% Ethanol 20.0% N-stearoylmethyltaurine sodium 0.5% POE (20) Sorbitan monooleate 1.0% Collagen 0.5% Methyl paraoxybenzoate 0 1% Saccharin sodium 0.1% Fragrance 0.5% Anti-PAc fragment milk antibody 0.4% Water 100.0%

【0059】 (10)タブレット アラビアゴム 6.0% ブドウ糖 72.0% ゼラチン 3.0% 香料 0.2% l−メントール 0.1% スペアミントオイル 0.1% アスコルビン酸ナトリウム 0.1% 抗PAc断片羊乳抗体 0.1%水 残 100.0%(10) Tablets Gum arabic 6.0% Glucose 72.0% Gelatin 3.0% Perfume 0.2% l-Menthol 0.1% Spearmint oil 0.1% Sodium ascorbate 0.1% Anti-PAc Fragmented sheep milk antibody 0.1% water 100.0% remaining

【0060】 (11)ガム ガムベース 43.9% 炭酸カルシウム 2.0% 水アメ 15.0% 砂糖 30.0% ショ糖パルミテイト 1.0% フルクトース 4.0% アルドース 3.0% 香料 1.0%抗PAc断片鶏卵抗体 0.1% 100.0%(11) Gum Gum base 43.9% Calcium carbonate 2.0% Water candy 15.0% Sugar 30.0% Sucrose palmitate 1.0% Fructose 4.0% Aldose 3.0% Fragrance 1.0 % Anti-PAc fragment chicken egg antibody 0.1% 100.0%

【0061】 (12)アイスクリーム クリーム(脱脂率50%) 16.84% 無糖脱脂練乳 24.24% 砂糖 11.25% コーンシロップ 4.65% 安定剤 0.35% 抗PAc断片抗体含有牛乳 37.67%抗PAc断片抗体含有卵黄 5.00% 100.0%(12) Ice cream Cream (50% defatted rate) 16.84% Non-fat condensed milk without sugar 24.24% Sugar 11.25% Corn syrup 4.65% Stabilizer 0.35% Milk containing anti-PAc fragment antibody 37.67% Egg yolk containing anti-PAc fragment antibody 5.00% 100.0%

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図1】参考例で用いたpac遺伝子断片領域の説明図
である。
FIG. 1 is an explanatory diagram of a pac gene fragment region used in a reference example.

【図2】同領域の唾液付着性の結果を示すグラフであ
る。
FIG. 2 is a graph showing the results of saliva adhesion in the same region.

【手続補正書】[Procedure amendment]

【提出日】平成4年11月17日[Submission date] November 17, 1992

【手続補正1】[Procedure Amendment 1]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】0019[Correction target item name] 0019

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction content]

【0019】例えば、小動物では抗原1〜500μg
(タンパク質として)、大動物は0.1〜10mgを1
回量として2〜5週間おきに3〜5回常法によって免疫
する。兎の場合、抗原液(タンパク質として100〜
000μg/ml)を等量のフロイント完全アジュバン
トと混合したものを2〜5週間おきに3〜5回投与し、
最終免疫後、10〜14日目に動物から常法により採血
し、免疫グロブリンを含有するプラズマを得る。これを
そのまま使用することもできるし、更に常法により精製
して抗血清、あるいは免疫グロブリンとして使用するこ
ともできる。
For example, in small animals, the antigen is 1 to 500 μg.
(As protein), for large animals 1 to 10 mg
Immunization is performed 3 to 5 times every 2 to 5 weeks by a conventional method. In the case of rabbits, the antigen solution (100 to 2 as protein)
000 μg / ml) mixed with an equal amount of Freund's complete adjuvant was administered 3 to 5 times every 2 to 5 weeks,
On the 10th to 14th day after the final immunization, blood is collected from the animal by a conventional method to obtain plasma containing immunoglobulin. This can be used as it is, or further purified by a conventional method and used as antiserum or immunoglobulin.

【手続補正2】[Procedure Amendment 2]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】0039[Correction target item name] 0039

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction content]

【0039】抗体価の測定法 (1)菌体浮遊液 TYC agar上のS.mutans10449コロ
ニー1〜2個を200mlのBHI brothに接種
し、37℃で18時間嫌気的に培養後、集菌し、0.1
%牛血清アルブミンを添加した生理食塩水(以下、BS
A生食水という)で3回洗浄する。洗浄した菌体をBS
A生食水に浮遊させ、OD550nm1.0に調整す
る。菌体浮遊液は、用時調製とする。 (2)試料抗体 希釈倍率20,30,50,70,90からそれぞれ2
倍希釈する。 (3)操作法 マイクロプレート上で50μlの希釈抗体と50μlの
菌体浮遊液を混合、撹拌後、37℃で3時間、更に4℃
で一夜静置する。 (4)菌体凝集の判定 一夜静置後、マイクロプレート底を観察し、菌体のスポ
ットが出現しない場合を凝集陽性とし、わずかなスポッ
トでも観察された場合は凝集陰性とする。
Method for measuring antibody titer (1) Suspension of bacterial cells S. cerevisiae on TYC agar 200 ml of BHI broth was inoculated with 1-2 mutans 10449 colonies and cultured anaerobically at 37 ° C. for 18 hours, and then collected to 0.1
A physiological saline solution containing bovine serum albumin (hereinafter referred to as BS
Wash it three times with A). Washed cells are BS
A. Float in saline and adjust to OD 550nm 1.0. The cell suspension should be prepared before use. (2) Sample antibody Dilution ratio of 20, 30, 50, 70, 90 to 2 each
Dilute n- fold. (3) Operation method 50 μl of diluted antibody and 50 μl of cell suspension were mixed on a microplate, stirred, and then at 37 ° C. for 3 hours, then at 4 ° C.
Then let stand overnight. (4) Judgment of bacterial cell aggregation After standing overnight, the bottom of the microplate is observed, and when the bacterial cell spot does not appear, it is determined to be aggregation positive, and when even a few spots are observed, it is determined to be aggregation negative.

【手続補正3】[Procedure 3]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】0046[Correction target item name] 0046

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction content]

【0046】[0046]

【表1】 [Table 1]

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 A61K 39/00 ACK G 9284−4C 39/09 9284−4C ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 5 Identification code Internal reference number FI Technical indication location A61K 39/00 ACK G 9284-4C 39/09 9284-4C

Claims (2)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項1】 ストレプトコッカス・ミュータンスから
得られる歯面への付着作用を有するタンパク質抗原を切
断した断片であって、該断片がアミノ酸478番(アス
パラギン酸)〜1000番(グルタミン)の一部又は全
部を含むポリペプチドを抗原とし、これを哺乳類又は鳥
類に免疫することによって得られた、ストレプトコッカ
ス・ミュータンスに対して免疫活性を有する抗体。
1. A fragment obtained by cleaving a protein antigen having an action of adhering to a tooth surface, obtained from Streptococcus mutans, which fragment is part of amino acids 478 (aspartic acid) to 1000 (glutamine) or An antibody having immunological activity against Streptococcus mutans, which is obtained by immunizing a mammal or a bird with a polypeptide containing the whole as an antigen.
【請求項2】 請求項1記載の抗体を有効成分とするう
蝕予防剤。
2. A caries preventive agent comprising the antibody according to claim 1 as an active ingredient.
JP29810292A 1992-10-09 1992-10-09 Antibody having immunoactivity on streptococcus mutans and dental caries preventive Pending JPH06122633A (en)

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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002015931A1 (en) * 2000-08-24 2002-02-28 Washington Dental Service Immunologic method for the prevention of dental caries
US7875598B2 (en) 2004-03-04 2011-01-25 The Regents Of The University Of California Compositions useful for the treatment of microbial infections
US9351490B2 (en) 2006-09-06 2016-05-31 The Regents Of The University Of California Selectively targeted antimicrobial peptides and the use thereof

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US10111926B2 (en) 2006-09-06 2018-10-30 The Regents Of The University Of California Selectively targeted antimicrobial peptides and the use thereof

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