JPH06113859A - Nib gene of mosaic virus of leaf spot of sweet potato - Google Patents
Nib gene of mosaic virus of leaf spot of sweet potatoInfo
- Publication number
- JPH06113859A JPH06113859A JP4289384A JP28938492A JPH06113859A JP H06113859 A JPH06113859 A JP H06113859A JP 4289384 A JP4289384 A JP 4289384A JP 28938492 A JP28938492 A JP 28938492A JP H06113859 A JPH06113859 A JP H06113859A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sweet potato
- mosaic virus
- gene
- nib
- virus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、サツマイモ斑紋モザイ
クウイルスの遺伝子のうち、ＮＩｂタンパク質遺伝子に
関するものである。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to the NIb protein gene of sweet potato mottle mosaic virus genes.
【０００２】[0002]
【従来の技術】従来、サツマイモにおいては、塊根部に
おける帯状粗皮病と称される疾病が発生し、問題となっ
ている。本病は、サツマイモ斑紋モザイクウイルス（Ｓ
ＰＦＭＶ）の一系統（強毒系統、Ｓ）の感染によって生
じることが明らかにされている。本ウイルスは、ウイル
ス分類上ジャガイモＹウイルスと同じグループに属する
もので、紐状の形をとり、長さが８５０〜８８０ナノメ
ーターである。アブラムシにより非永続的に伝搬され、
ウイルスの構成成分は遺伝子の本体としてＲＮＡとそれ
を取り囲む外被タンパク質（サブユニットが約２，２０
０個）を含む。ＲＮＡ遺伝子にはＲＮＡ合成に関与する
とされるタンパク質をコードする領域が含まれ、通常Ｎ
Ｉｂ（核封入体ｂ）と呼ばれている。2. Description of the Related Art Conventionally, in sweet potato, a disease called zonal scab in the tuberous root has occurred and has become a problem. This disease is caused by the sweet potato mottle mosaic virus (S
It has been clarified that it is caused by infection of one strain (PFMV) (strongly virulent strain, S). This virus belongs to the same group as the potato Y virus in terms of virus classification, has a string-like shape, and has a length of 850 to 880 nanometers. Non-persistently propagated by aphids,
The components of the virus are RNA, which is the main body of the gene, and the coat protein that surrounds it (subunit is approximately 2,20
0) is included. The RNA gene contains a region encoding a protein that is considered to be involved in RNA synthesis, and is usually N
It is called Ib (nuclear inclusion body b).
【０００３】[0003]
【発明が解決しようとする課題】ＳＰＦＭＶゲノムＲＮ
Ａのこの領域に関する知見は少なく、その塩基配列も報
告されていない。そこで本発明者らは、サツマイモ斑紋
モザイクウイルスの機能・役割を解明するための手段と
して、本遺伝子のクローニングを計画した。そして、今
回本ウイルスのｃＤＮＡクローニングを行い、本タンパ
ク質をコードする領域の遺伝子構造を解明し、本発明を
完成した。[Problems to be Solved by the Invention] SPFMV Genome RN
There is little knowledge about this region of A, and its base sequence has not been reported. Therefore, the present inventors planned cloning of this gene as a means for elucidating the function / role of sweet potato mottle mosaic virus. Then, this time, the cDNA of the virus was cloned to elucidate the gene structure of the region encoding the protein, thus completing the present invention.
【０００４】[0004]
【課題を解決するための手段】その結果、本発明におい
ては、アミノ酸配列を有するＮＩｂタンパク質をコード
する遺伝子を得た。As a result, in the present invention, a gene encoding an NIb protein having an amino acid sequence was obtained.
【０００５】[0005]
【作用】上記の手段によって、本発明のサツマイモ斑紋
モザイクウイルスのＮＩｂ遺伝子は、ＳＰＦＭＶ抵抗性
植物を作出することが可能となる。By the means described above, the NIb gene of the sweet potato mottle mosaic virus of the present invention makes it possible to produce SPFMV resistant plants.
【０００６】[0006]
【実施例】以下、本発明の一実施例を具体的に説明す
る。本発明におけるＳＰＦＭＶのＲＮＡのコードするｃ
ＤＮＡのクローニングは、化１ないし化３に示す遺伝子
情報に基づいて適当なプローブを作成し、ウイルスＲＮ
Ａから得られるｃＤＮＡライブラリーから、あるいは逆
転写ＰＣＲ法を用いてウィルスＲＮＡから直接得ること
ができる。EXAMPLE An example of the present invention will be specifically described below. C encoded by SPFMV RNA in the present invention
For cloning DNA, an appropriate probe is prepared based on the gene information shown in Chemical formula 1 to Chemical formula 3,
It can be obtained directly from the cDNA library obtained from A or from viral RNA using the reverse transcription PCR method.
【０００７】また、化１ないし化３の情報を利用しない
場台、例えば本発明者らが用いた以下の方法に従い、あ
るいはこの方法を必要に応じて修飾した方法で行うこと
もできる。It is also possible to carry out the method without using the information of Chemical formulas 1 to 3, for example, according to the following method used by the present inventors, or by modifying this method as necessary.
【０００８】まず、普通系のＳＰＦＭＶ株（Ｏ株）感染
アサガオ葉からウイルス粒子を精製し、さらにそれから
ＲＮＡを抽出する。このＲＮＡを鋳型にしてｃＤＮＡを
合成した。このｃＤＮＡファージミドベクターｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔに組み込み、大腸菌を形質転換すること
によりｃＤＮＡライブラリーを得た。形質転換した大腸
菌を個別に培養し、プラスミドを抽出、インサートの有
無を調べることにより、約０．８Ｋｂｐのインサートを
もつｃＤＮＡクローンを得た。これをプローブとしてコ
ロニーハイブリダイゼーションを行った結果、最大約
２．３Ｋｂｐのインサー−卜を含むクローンが得られ
た。First, virus particles are purified from morning glory leaves infected with a normal SPFMV strain (O strain), and RNA is extracted therefrom. CDNA was synthesized using this RNA as a template. This cDNA phagemid vector pBlue
A cDNA library was obtained by incorporating it into escript and transforming E. coli. The transformed E. coli was individually cultured, the plasmid was extracted, and the presence or absence of the insert was examined to obtain a cDNA clone having an insert of about 0.8 Kbp. As a result of colony hybridization using this as a probe, a clone containing an inserter of about 2.3 Kbp at maximum was obtained.
【０００９】さらに上記インサートがＳＰＦＭＶ−Ｓの
ＲＮＡとハイブリダイズすることを確認した後、このｃ
ＤＮＡをプローブにして、同様に作成したＳＰＦＭＶ−
ＳのｃＤＮＡライブラリーから最長約３．５Ｋｂｐのイ
ンサートを含むクローンが得られ、その塩基配列を決定
した。その結果、化１ないし化３に示すようなＮＩｂタ
ンパク質の遺伝子の塩基配列が明らかになった。Further, after confirming that the above-mentioned insert hybridizes with SPFMV-S RNA, this c
SPFMV- prepared in the same manner using DNA as a probe
A clone containing an insert of up to about 3.5 Kbp was obtained from the S cDNA library, and its nucleotide sequence was determined. As a result, the nucleotide sequences of the NIb protein genes shown in Chemical formulas 1 to 3 were clarified.
【００１０】この塩基配列から明らかとなったＮＩｂタ
ンパク質のアミノ酸配列と、タバコエッチウイルス（Ｔ
ＥＶ）（Ａｌｌｉｓｏｎら、１９８６）、夕バコベイン
モットリングウイルス（ＴＶＭＶ）（Ｄｏｍｉｅｒら、
１９８６）、ＰＶＹ（Ｒｏｂａｇｌｉａら、１９８９）
およびプラムポックスウイルス（ＰＰＶ）（Ｔｅｙｃｈ
ｅｎｅｙら、１９８９）由来の同クンパク質のアミノ酸
配列と比較した。The amino acid sequence of the NIb protein revealed from this nucleotide sequence and the tobacco etch virus (T
EV) (Allison et al., 1986), Yu Bacobein Mottling virus (TVMV) (Domier et al.,
1986), PVY (Robaglia et al., 1989).
And plumpox virus (PPV) (Teych
The amino acid sequence of the same protein from eney et al., 1989) was compared.
【００１１】ＰＰＶとの間のホモロジーが最も高く約６
８％、そのほかのウイルス（ＴＥＶ、ＴＶＭＶ、ＰＶ
Ｙ）では６０〜６１％であった。The highest homology with PPV is about 6
8%, other viruses (TEV, TVMV, PV
In Y), it was 60 to 61%.
【００１２】以下に本発明の実施例をさらに詳細に説明
する。操作の手順は特に記述しない限りマニアチスらの
記載（ＭｏｒｅｃｕｌａｅｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）［ゴ−ルド・スプリ
ング・ハーバー ・ラボラトリー、１９８２］に従っ
た。Examples of the present invention will be described in more detail below. The procedure of operation is described by Maniatis et al. (Molecular Cloning: A La) unless otherwise stated.
Beverage Manual [Gold Spring Harbor Laboratory, 1982].
【００１３】［実験例ｌ］ ＳＰＦＭＶのＮＩｂ遺伝子
のｃＤＮＡクロ−ニング （１）ＳＰＦＭＶ−ＲＮＡの調製 材料はＳＰＦＭＶ−Ｏおよび−Ｓ株に感染したアサガオ
を用いた。接種約２週間後のアサガオをＵｓｕｇｉら
（１９９１）の方法を用いてウイルス粒了を精製した。
さらにウイルス粒子からＭｏｙｅｒおよびＣａｌｉ（１
９８５）の方法を一部修正してＲＮＡを抽出した。ウイ
ルス溶液（０．３〜０．４ｍｇ／ｍｌ）に等量のＲＮＡ
拙出液（０．２Ｍ 炭酸アンモニウム，ｐＨ９．２％Ｓ
ＤＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．０５％プロテナーゼ
Ｋ）を加え、約２０分間室温で振とうした。ついでフェ
ノール処理を約１０分行い、低速遠心分離により水層部
分を得た。[Experimental Example 1] cDNA cloning of the NIb gene of SPFMV (1) Preparation of SPFMV-RNA The materials used were morning glory infected with SPFMV-O and -S strains. About 2 weeks after the inoculation, morning glory was purified by using the method of Usugi et al. (1991).
Furthermore, from virus particles, Moyer and Cali (1
RNA was extracted by partially modifying the method of 985). Equal amount of RNA in virus solution (0.3-0.4 mg / ml)
Liquid (0.2M ammonium carbonate, pH 9.2% S
DS, 2 mM EDTA and 0.05% proteinase K) were added and shaken for about 20 minutes at room temperature. Next, phenol treatment was performed for about 10 minutes, and low-speed centrifugation was performed to obtain a water layer portion.
【００１４】この操作を２回繰り返し、エーテル処埋を
２回行った後、水層に対し１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリ
ウムを加え、さらに２．５倍量のエタノールを加えるこ
とによりＲＮＡを沈殿化させた。遠心分離によりエタノ
ールを取り除いたあと、トリス・ＦＤＴＡ緩衝液に溶か
した。After repeating this operation twice and carrying out ether treatment twice, RNA was precipitated by adding 1/10 amount of 3M sodium acetate to the aqueous layer and further adding 2.5 times amount of ethanol. Made into After removing ethanol by centrifugation, it was dissolved in Tris-FDTA buffer.
【００１５】 （２）ｃＤＮＡライブラリーの作成とスクリーニング はじめにポティウイルスＲＮＡは３′末端にポリＡ配列
をもつので、オリゴｄＴをプライマーとする二本鎖ｃＤ
ＮＡを合成した。さらにｃＤＮＡの両末端を平滑にした
あと、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩの切断部位をもつリン
カーを結合した。この一連の過程は市販のｃＤＮＡ合成
キット（ファルマシア社製）を利用し、キッ卜の説明書
の通りに処理した。リンカーを両末端に持つｃＤＮＡを
ファージミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒ
ａｔｅｇｅｎｅ社製）のＥｃｏＲＩサイトに挿入した。
この反応はライゲーションキット（ＴＡＫＡＲＡ社製）
を用い、キッ卜の説明書に示された方法によった。この
反応産物を大腸菌、ＪＭｌ０９またはＨＢ１０１へＨａ
ｎａｈａｎ（１９８６）の方法により形質転換した。(2) Preparation and screening of cDNA library First, since potyvirus RNA has a poly A sequence at the 3'end, double-stranded cD using oligo dT as a primer
NA was synthesized. After blunting both ends of the cDNA, linkers having EcoRI and NotI cleavage sites were ligated. In this series of processes, a commercially available cDNA synthesis kit (Pharmacia) was used and processed according to the instructions of the kit. A cDNA having a linker at both ends is used as a phagemid vector pBluescript (Str
Eatgene's EcoRI site.
This reaction is a ligation kit (manufactured by TAKARA)
Was used according to the method indicated in the instruction manual of the kit. The reaction product was transformed into E. coli, JM109 or HB101 with Ha.
Transformation was carried out by the method of nahan (1986).
【００１６】このようにして得られたＳＰＦＭＶ−Ｏの
ｃＤＮＡライブラリーよりプラスミドを少量迅速調製
し、インサートをもつクローン（約０．８ＫｂｐのｃＤ
ＮＡ）を得た。このｃＤＮＡをプローブとして放射性［
32Ｐ］で標識し、コロニーハイブリダイゼーションを行
なった結果、最大約２．３ ＫｂｐのｃＤＮＡクローン
を得た。さらに本ｃＤＮＡがＳＰＦＭＸＶ−ＳのＲＮＡ
とハイブリダイズすることを確認した後に、本ｃＤＮＡ
をプローブとしてＳＰＦＭＶ−ＳのｃＤＮＡライブラリ
ーをスクリ−ニングし、最大約３．５ＫｂｐのｃＤＮＡ
クローンを得た。A small amount of a plasmid was rapidly prepared from the SPFMV-O cDNA library thus obtained, and a clone having an insert (cD of about 0.8 Kbp was prepared.
NA) was obtained. Using this cDNA as a probe
As a result of colony hybridization after labeling with [ 32 P], a cDNA clone with a maximum of about 2.3 Kbp was obtained. Further, this cDNA is RNA of SPFMXV-S.
After confirming that it hybridizes with
The SPFMV-S cDNA library was screened using
I got a clone.
【００１７】このｃＤＮＡを、常法に従いダイデオキシ
法により塩基配列を決定したところ、一つの大きな読み
取り枠が見い出され、その一部がＴＥＶ，ＰＰＶ，ＴＶ
ＭＶ，ＰＶＹのゲノムＲＮＡで見い出されているＮＩｂ
のタンバク質をコードしている領域であることを明らか
にした。When the nucleotide sequence of this cDNA was determined by the dideoxy method according to the conventional method, one large open reading frame was found, and a part of it was TEV, PPV, TV.
NIb found in MV and PVY genomic RNA
It was revealed that it is a region encoding the protein of.
【００１８】[0018]
【発明の効果】以上説明したように本発明のサツマイモ
斑紋モザイクウイルスのＮＩｂ遺伝子によれば、サツマ
イモ斑紋モザイクウイルスとは分類学上異なるグループ
のウィルスである，タバコモザイクウィルス（ＴＭＶ）
（Ｇｏｌｅｍｂｏｓｋｉら、１９９０）、キュウリモザ
イクウイルス（ＣＭＶ）（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９９
２）、ピーアーリ一ブラウニングウイルス（ＰＥＢＶ）
（ＭａｃｋＦａｌａｎｅａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ，１９９
２）のもつＲＮＡ合成関与遺伝子の完全長あるいは一部
の遺伝子を植物へ導入することによりウイルス抵抗性を
示すことが報告されており、遺伝子組換え技術を用い
て、本遺伝子を植物へ組み込み、ＳＰＦＭＶ抵抗性植物
を作出することが可能である。INDUSTRIAL APPLICABILITY As described above, according to the NIb gene of sweet potato mottle mosaic virus of the present invention, tobacco mosaic virus (TMV), which is a group of viruses taxonomically different from sweet potato mottle mosaic virus
(Golemboski et al., 1990), cucumber mosaic virus (CMV) (Anderson et al., 199).
2), Pearly Browning Virus (PEBV)
(MackFalane and Davies, 199
It has been reported that virus resistance is exhibited by introducing a full-length or a part of the genes involved in RNA synthesis in 2) into plants, and this gene is incorporated into plants by gene recombination technology. It is possible to create SPFMV resistant plants.
フロントページの続き (72)発明者 林 隆治 茨城県つくば市東新井11−４ (72)発明者 宇杉 富雄 沖縄県石垣市字登城911熱研宿舎13Front Page Continuation (72) Inventor Ryuji Hayashi 11-4 Higashiarai, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture (72) Inventor Tomio Usugi 911 Thermal Research Camp, Ishigaki City, Okinawa Prefecture 13
Claims (1)
質をコードする遺伝子であることを特徴とするサツマイ
モ斑紋モザイクウイルスのＮＩｂ遺伝子。Claims: [Chemical 2] [Chemical 3] A NIb gene of sweet potato mottle mosaic virus, which is a gene encoding an NIb protein having the amino acid sequences shown in Chemical formulas 1 to 3.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP04289384A JP3103876B2 (en) | 1992-10-01 | 1992-10-01 | Nucleotide sequence of NIb gene of sweet potato mottled mosaic virus virulent strain (SPFMV-S) and method for producing same plant |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP04289384A JP3103876B2 (en) | 1992-10-01 | 1992-10-01 | Nucleotide sequence of NIb gene of sweet potato mottled mosaic virus virulent strain (SPFMV-S) and method for producing same plant |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06113859A true JPH06113859A (en) | 1994-04-26 |
| JP3103876B2 JP3103876B2 (en) | 2000-10-30 |
Family
ID=17742524
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP04289384A Expired - Lifetime JP3103876B2 (en) | 1992-10-01 | 1992-10-01 | Nucleotide sequence of NIb gene of sweet potato mottled mosaic virus virulent strain (SPFMV-S) and method for producing same plant |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3103876B2 (en) |
-
1992
- 1992-10-01 JP JP04289384A patent/JP3103876B2/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| PHYTOPATHOLOGY=1992 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3103876B2 (en) | 2000-10-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Klessig | Two adenovirus mRNAs have a common 5′ terminal leader sequence encoded at least 10 kb upstream from their main coding regions | |
| AU700952B2 (en) | PCR-based cDNA subtractive cloning method | |
| Imai et al. | Molecular cloning of double-stranded RNA virus genomes. | |
| Cornelissen et al. | Complete nucleotide sequence of tobacco streak virus RNA 3 | |
| Dougherty et al. | Nucleotide sequence at the 3′ terminus of pepper mottle virus genomic RNA: evidence for an alternative mode of potyvirus capsid protein gene organization | |
| Janda et al. | High efficiency T7 polymerase synthesis of infectious RNA from cloned brome mosaic virus cDNA and effects of 5′ extensions on transcript infectivity | |
| US6617496B1 (en) | Effecting virus resistance in plants through the use of negative strand RNAs | |
| EP0429483B1 (en) | Potyvirus coat protein genes and plants transformed therewith | |
| Axelrod et al. | Coliphage Qβ RNA replication: RNA catalytic for single-strand release | |
| Asamizu et al. | Molecular cloning and characterization of the genome of wound tumor virus: a tumor-inducing plant reovirus | |
| JPH05130871A (en) | Additional production of thermus aquaticus dna polymerase in escherichia coli | |
| Abad et al. | Comparison of the capsid protein cistron from serologically distinct strains of sweetpotato feathery mottle virus (SPFMV) | |
| JP2004501646A5 (en) | ||
| Stupina et al. | Analysisin Vivoof Turnip Crinkle Virus Satellite RNA C Variants with Mutations in the 3′-Terminal Minus-Strand Promoter | |
| Lubinski et al. | Mechanism of in vitro synthesis of covalently linked dimeric RNA molecules by the poliovirus replicase | |
| Van der Vossen et al. | The 5′ terminal sequence of alfalfa mosaic virus RNA 3 is dispensable for replication and contains a determinant for symptom formation | |
| JPH06113859A (en) | Nib gene of mosaic virus of leaf spot of sweet potato | |
| JP3055787B2 (en) | Cucumber mosaic virus coat protein gene | |
| Masuta et al. | Effects of extra 5'non-viral bases on the infectivity of transcripts from a cDNA clone of satellite RNA (strain Y) of cucumber mosaic virus | |
| US5304731A (en) | Vector | |
| JP3116083B2 (en) | Coat protein gene and 3'-terminal untranslated region of sweet potato latent virus | |
| JP3090680B2 (en) | Spider virus gene | |
| US5859224A (en) | Base sequence of the coat protein gene of papaya leaf-distortion mosaic virus | |
| JP3215863B2 (en) | The genome of konjac mosaic virus and its use | |
| US7125971B2 (en) | Full-length genomic RNA of papaya leaf-distortion mosaic virus |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |