JPH06102276A - Composition and method for separation employed in measurement of hyperbaric lipoprotein-cholesterol - Google Patents
Composition and method for separation employed in measurement of hyperbaric lipoprotein-cholesterolInfo
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は体液試料中の高比重リポ
蛋白−コレステロールを測定するための分離用組成物お
よび分離方法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a separating composition and a separating method for measuring high-density lipoprotein-cholesterol in a body fluid sample.
【０００２】[0002]
【従来の技術】コレステロールは動脈硬化と強い関わり
を持った体内物質である。コレステロールは脂溶性のた
め、通常、体液（血液等）中では蛋白と結合しており、
リポ蛋白として存在する。体液中のリポ蛋白はその比重
により、カイロミクロン、超低比重リポ蛋白、低比重リ
ポ蛋白、高比重リポ蛋白に大別されるが、主成分は低比
重蛋白と高比重蛋白である。高比重リポ蛋白はＨＤＬ
（High Density Lipoprotein）、低比重リポ蛋白はＬＤ
Ｌ（Low Density Lipoprotein ）とそれぞれ略記されて
いる。Cholesterol is a substance in the body that is strongly associated with arteriosclerosis. Since cholesterol is fat-soluble, it is usually bound to proteins in body fluids (blood, etc.),
It exists as a lipoprotein. Lipoproteins in body fluids are roughly classified into chylomicron, ultra-low-density lipoprotein, low-density lipoprotein, and high-density lipoprotein according to their specific gravities, but the main components are low-density protein and high-density protein. High density lipoprotein is HDL
(High Density Lipoprotein), LD for low density lipoprotein
L (Low Density Lipoprotein) is abbreviated respectively.
【０００３】近年の研究により、この二つは体内におけ
る役割が、まったく異なることがわかってきた。ＨＤＬ
は体組織に対して、コレステロールを供給する役割を持
ち、ＬＤＬは逆に、体組織の過剰、または不要なコレス
テロールを除去する役割を持つというものである。その
ため、体液中の総コレステロールのみならず、それぞれ
の値を測定することで、動脈硬化性疾患の診断が行われ
ている。特に、ＨＤＬ−コレステロール値が、指標とし
て適当であることから、主にこちらが使われている。Recent studies have revealed that the two have completely different roles in the body. HDL
Has a role of supplying cholesterol to body tissues, and LDL, on the contrary, has a role of removing excess or unnecessary cholesterol in body tissues. Therefore, the arteriosclerotic disease is diagnosed by measuring not only the total cholesterol in the body fluid but also the respective values. In particular, the HDL-cholesterol level is mainly used because it is suitable as an index.
【０００４】総コレステロールの測定は、現在自動分析
器により行われているが、ＨＤＬ−コレステロール値を
測定しようとする際には、共存する他のリポ蛋白とＨＤ
Ｌを分離しなければならない。この分析測定法には、超
遠心分離法、沈澱法、電気泳動法、カラムクロマト法、
免疫化学法などがあるが、現在、沈澱法が最もよく使わ
れている。沈澱法は、体液（検体）に沈澱剤を加え、リ
ポ蛋白の内、比重の小さいカイロミクロン、超低比重リ
ポ蛋白、ＬＤＬを凝集沈澱させ、分離した上清中のＨＤ
Ｌ−コレステロールを測定するものである。この分離に
は、3000ｒｐｍで１０分程度の遠心分離が必要であり、
小型の遠心分離器が現在用いられている。また、沈澱剤
としては、ヘパリン−Ｍｎ2+、ヘパリン−Ｃａ2+、デキ
ストラン硫酸−Ｍｇ2+、リンタングステン酸−Ｍｇ2+、
ポリエチレングリコール等が使われている。The total cholesterol is currently measured by an automatic analyzer, but when trying to measure the HDL-cholesterol level, other coexisting lipoproteins and HD
L must be separated. This analytical measurement method includes ultracentrifugation, precipitation, electrophoresis, column chromatography,
Although there are immunochemical methods and the like, the precipitation method is currently most commonly used. In the precipitation method, a precipitating agent is added to a body fluid (sample) to aggregate and precipitate chylomicron, ultra-low-density lipoprotein, and LDL, which have a small specific gravity, among lipoproteins, and HD in the separated supernatant
It measures L-cholesterol. This separation requires centrifugation at 3000 rpm for about 10 minutes,
Small centrifuges are currently in use. As the precipitating agent, heparin -Mn 2+, heparin -Ca 2+, dextran sulfate -Mg 2+, -Mg phosphotungstic acid 2+,
Polyethylene glycol is used.
【０００５】一方、遠心分離を不要とした沈澱試薬も試
みられている。この試薬は沈澱剤を水に不溶性の担体と
結合させたものであり、遠心分離の操作なしで、不要な
他のリポ蛋白を除去することができる（特開昭63-18269
号）。On the other hand, precipitation reagents that do not require centrifugation have been tried. This reagent is obtained by binding a precipitant to a water-insoluble carrier, and can remove other unwanted lipoproteins without the operation of centrifugation (JP-A-63-18269).
issue).
【０００６】[0006]
【発明が解決すべき問題点】従来は、体液中のＨＤＬを
測定する際に、遠心分離の処理が不可欠で、経済的、簡
便さの点で十分満足のいく方法ではなかった。また、特
開昭63-18269号記載の方法は、遠心分離は不要であるも
のの、特別に調製した試薬を必要としており、その担体
については比重1.0 〜2.0 のものが要求され、必ずしも
良い方法とは言えないものであった。[Problems to be Solved by the Invention] Conventionally, when measuring HDL in a body fluid, a centrifugation treatment was indispensable, and it was not a sufficiently satisfactory method in terms of economy and convenience. Further, the method described in JP-A-63-18269 does not require centrifugation, but requires a specially prepared reagent, and its carrier is required to have a specific gravity of 1.0 to 2.0, which is not always a good method. It was something I couldn't say.
【０００７】[0007]
【発明の構成】上記したこれらの従来技術の問題点に着
目し、遠心分離操作を必要としない正確で簡便なＨＤＬ
測定方法を見出すべく鋭意検討した結果、本発明者らは
従来の沈澱剤に沈澱助剤を加えることにより、目的が達
成されることを見出し、本発明を完成した。なお、生化
学的検査において、必要な分画を得るための分離方法は
いくつかあるが、沈澱剤と沈澱助剤を組合せる例は知ら
れていない。Focusing on the above-mentioned problems of the prior art, an accurate and simple HDL which does not require a centrifugation operation.
As a result of extensive studies to find out a measuring method, the present inventors have found that the purpose can be achieved by adding a precipitation aid to a conventional precipitation agent, and completed the present invention. In the biochemical test, there are several separation methods for obtaining the necessary fractions, but no example of combining a precipitant and a precipitation aid is known.
【０００８】本発明は、体液中のＨＤＬ測定の際に、Ｈ
ＤＬと他のリポ蛋白を分ける分離用組成物および分離方
法に関する。本発明の分離用組成物は、（１）沈澱剤お
よび（２）沈澱助剤からなる。本発明の分離用組成物に
おいて、（１）の沈澱剤は、従来用いられている沈澱用
試薬なら何でもよい。例えば、デキストラン硫酸−Ｍｇ
2+、リンタングステン酸−Ｍｇ2+、ヘパリン−Ｍｎ2+、
ヘパリン−Ｃａ2+、ポリエチレングリコールやこれらの
２以上の混合物が挙げられる。According to the present invention, when measuring HDL in body fluid, H
The present invention relates to a separating composition and a separating method for separating DL and other lipoproteins. The separating composition of the present invention comprises (1) a precipitating agent and (2) a precipitating aid. In the separating composition of the present invention, the precipitating agent (1) may be any conventionally used precipitating reagent. For example, dextran sulfate-Mg
2+, -Mg phosphotungstic acid 2+, heparin -Mn 2+,
Examples include heparin-Ca 2+ , polyethylene glycol and mixtures of two or more thereof.
【０００９】本発明の分離用組成物において、（２）の
沈澱助剤は、以下の条件を満たすものならば何でもよ
い。 １）水に不溶であること、 ２）微粒子であること（好ましい粒子サイズは３２〜１
５０μｍである）、 ３）比重が1.0 よりも大きいこと、 ４）化学的に安定であること、 ５）測定系に関与しないこと。In the separating composition of the present invention, the precipitation aid of (2) may be any as long as it satisfies the following conditions. 1) Insoluble in water, 2) Fine particles (preferable particle size is 32 to 1)
50 μm), 3) Specific gravity is greater than 1.0, 4) Chemical stability, 5) Do not participate in the measurement system.
【００１０】好ましい沈澱助剤としては、寒天末、ケイ
ソウ土、酸化アルミニウム末、炭酸カルシウム末、セル
ロース末、炭素末、樹脂末等が挙げられる。これらは、
試薬として市販されているものを特別の処理をすること
なしにそのまま用いることができる。Preferred precipitation aids include agar powder, diatomaceous earth, aluminum oxide powder, calcium carbonate powder, cellulose powder, carbon powder, resin powder and the like. They are,
A commercially available reagent can be used as it is without any special treatment.
【００１１】本発明の分離用組成物中の沈澱助剤の割合
は、重量基準で２〜３０％が好ましく、特に好ましいの
は５〜２５％である。本発明の分離用組成物において
は、沈澱剤と沈澱助剤は予め混合しておいてもよいし、
用時に混合してもよい。The proportion of the precipitation aid in the separating composition of the present invention is preferably from 2 to 30% by weight, particularly preferably from 5 to 25%. In the separating composition of the present invention, the precipitating agent and the precipitating aid may be mixed in advance,
You may mix at the time of use.
【００１２】[0012]
【発明の効果】本発明の分離用組成物を投入後、約１０
分間静置することにより、体液検体はＨＤＬを含む上清
分画とその他のリポ蛋白を含む沈澱分画に分離される。
二分された検体をそのまま自動分析器にかけ、上清のコ
レステロール値を測定することにより、簡便にＨＤＬ−
コレステロールが測定できる。EFFECTS OF THE INVENTION After adding the separating composition of the present invention, about 10
The body fluid sample is separated into a supernatant fraction containing HDL and a precipitation fraction containing other lipoproteins by allowing to stand for a minute.
The halved sample is directly applied to an automatic analyzer, and the cholesterol level of the supernatant is measured, so that HDL-
Cholesterol can be measured.
【００１３】[0013]
【実施例】以下、実施例および比較例により本発明を詳
述するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
なお、自動分析器は（株）日立製作所製アナライザー７
０５型を用いた。The present invention will be described in detail below with reference to examples and comparative examples, but the present invention is not limited thereto.
The automatic analyzer is Analyzer 7 manufactured by Hitachi, Ltd.
Type 05 was used.
【００１４】実施例１：本発明の分離用組成物を用いた
ＨＤＬ−コレステロールの測定 自動分器用サンプルカップ５個に酸化アルミナ（ナカラ
イテスク社製）を３０ｍｌずつ入れた。このカップにそ
れぞれ市販の沈澱試薬５種（各２００μｌずつ）を加
え、さらに各々に同じ血清検体（各２００μｌずつ）を
加えた。カップの内容物をよく撹拌し、１０分間静置
し、そのまま自動分析器にかけ、コレステロール測定試
薬（コレスカラー・コース，東洋紡績（株）社製）によ
り、コレステロールを測定し、この値をＨＤＬ−コレス
テロール値とした。Example 1 Measurement of HDL-Cholesterol Using the Separation Composition of the Present Invention 30 ml of alumina oxide (manufactured by Nacalai Tesque, Inc.) was placed in 5 sample cups for an automatic separator. Five commercially available precipitation reagents (200 μl each) were added to the cups, and the same serum sample (200 μl each) was added to each cup. Stir the contents of the cup well, let it stand for 10 minutes, put it on an automatic analyzer as it is, measure cholesterol with a cholesterol measuring reagent (Choles color course, Toyobo Co., Ltd.), and measure this value with HDL- The cholesterol level was used.
【００１５】比較例１：遠心分離を用いた従来の方法で
のＨＤＬ−コレステロールの測定 試験管に実施例１で用いたものと同じ市販の沈澱試薬５
種（各２００μｌずつ）を取り、同じ血清検体（各２０
０μｌずつ）を加えた。内容物をよく撹拌し、１０分間
静置した後、3000ｒｐｍ×１０分間の遠心分離を行なっ
た。各試料の上清を自動分析器用サンプルカップに各々
取り、実施例１と同様の方法によりＨＤＬ−コレステロ
ール値を求めた。表１に実施例１と比較例１の結果をあ
わせて示す。Comparative Example 1 Measurement of HDL-Cholesterol by Conventional Method Using Centrifugation The same commercially available precipitation reagent 5 used in Example 1 was used in a test tube.
Seed (200 μl each) was taken and the same serum sample (20 each)
0 μl each). The contents were well stirred, allowed to stand for 10 minutes, and then centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes. The supernatant of each sample was placed in a sample cup for an automatic analyzer, and the HDL-cholesterol value was determined by the same method as in Example 1. Table 1 also shows the results of Example 1 and Comparative Example 1.
【００１６】[0016]
【表１】 [Table 1]
【００１７】［考察］表１から明らかなように、各沈澱
剤によるバラつきは若干見られるが、各沈澱剤を用いた
実施例１と比較例１の数値はよく一致しており、本発明
の方法によれば十分正確な測定値を得られることが分か
る。[Discussion] As is clear from Table 1, there are some variations due to each precipitating agent, but the numerical values of Example 1 using each precipitating agent and Comparative Example 1 are in good agreement, and the results of the present invention are shown. It can be seen that the method gives sufficiently accurate measurements.
【００１８】実施例２：本発明の分離用組成物を用いた
ＨＤＬ−コレステロールの測定 0.5 Ｍ ＭＥＳバッファー（２−（Ｎ−モルホリノ）エ
タンスルホン酸バッファー，６０ｍｌ）、ＭｇＣｌ
2 （６０ｍｌ）、２％リンタングステン酸（５０ｍｌ）
およびイオン交換水（３０ｍｌ）を混合し、沈澱試薬
（リンタングステン酸−Ｍｇ2+）を調製した。自動分析
器用サンプルカップ３０個にケイソウ土（和光純薬工業
製）を３０ｍｇずつ入れた。このカップに、上記で調製
した沈澱試薬（各２００μｌずつ）を加え、各々に種類
の異なる血清３０検体（各２００μｌずつ）を各々加え
た。内容物をよく撹拌し、１０分間静置し、そのまま自
動分析器にかけ、コレステロール測定試薬（デタミナー
−ＴＣ−５５５，協和メディックス（株）製）によりコ
レステロールを測定し、この値をＨＤＬ−コレステロー
ル値とした。Example 2: Measurement of HDL-cholesterol using the separating composition of the present invention 0.5 M MES buffer (2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid buffer, 60 ml), MgCl 2
2 (60 ml), 2% phosphotungstic acid (50 ml)
And ion-exchanged water (30 ml) were mixed to prepare a precipitation reagent (phosphotungstic acid-Mg 2+ ). 30 mg of diatomaceous earth (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) was placed in 30 sample cups for an automatic analyzer. The precipitation reagent prepared above (200 μl each) was added to this cup, and 30 different kinds of serum samples (200 μl each) were added to each. The contents were well stirred, allowed to stand for 10 minutes, placed on an automatic analyzer as they were, and cholesterol was measured with a cholesterol measuring reagent (Determiner-TC-555, manufactured by Kyowa Medix Co., Ltd.), and this value was regarded as the HDL-cholesterol value. did.
【００１９】比較例２：遠心分離を用いた従来の方法で
のＨＤＬ−コレステロールの測定 試験管３０本に、実施例２で用いたものと同じ、種類の
異なる血清３０検体（各２００μｌずつ）を取り、各々
にデタミナー・ＨＤＬ（２００ｍｌ）を加えた。内容物
をよく混合し１０分間静置した後、3000ｒｐｍ×１０分
間の遠心分離を行なった。各試料の上清を自動分析器用
サンプルカップに各々取り、実施例２と同様の方法によ
り、ＨＤＬ−コレステロール値を求めた。図１に実施例
２と比較例２の相関関係を示す。Comparative Example 2 Measurement of HDL-Cholesterol by Conventional Method Using Centrifugation 30 test tubes were filled with 30 different serum samples (200 μl each) different from those used in Example 2. Then, Determiner HDL (200 ml) was added to each. The contents were mixed well and allowed to stand for 10 minutes, and then centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes. The supernatant of each sample was placed in a sample cup for an automatic analyzer, and the HDL-cholesterol value was determined by the same method as in Example 2. FIG. 1 shows the correlation between Example 2 and Comparative Example 2.
【００２０】［考察］実施例２と比較例２の間には、 Ｙ＝0.933 Ｘ＋3.91 相関関係 ｒ＝0.962 の回帰式で示される関係が見られ、良好な相関を示し
た。[Discussion] Between Example 2 and Comparative Example 2, a relation represented by a regression equation of Y = 0.933 X + 3.91 correlation r = 0.962 was observed, showing a good correlation.
【００２１】実施例３：本発明の分離用組成物を用いた
ＨＤＬ−コレステロールの測定 ケイソウ土に代えて、酸化アルミニウム（ナカライテス
ク製）を用いて、種類の異なる血清５６検体について、
実施例２と同様の操作を行ない、各コレステロール値を
求めた。Example 3 Measurement of HDL-Cholesterol Using Separation Composition of the Present Invention Instead of diatomaceous earth, aluminum oxide (manufactured by Nacalai Tesque) was used for 56 different serum samples.
The same operation as in Example 2 was performed to determine each cholesterol value.
【００２２】比較例３：遠心分離を用いた従来の方法で
のＨＤＬ−コレステロールの測定 実施例３と同一の検体について、比較例２と同様の操作
を行ない、各ＨＤＬ−コレステロール値を求めた。図２
に実施例３と比較例３の相関関係を示す。Comparative Example 3: Measurement of HDL-Cholesterol by Conventional Method Using Centrifugation The same sample as in Example 3 was subjected to the same operation as in Comparative Example 2 to determine each HDL-cholesterol value. Figure 2
Shows the correlation between Example 3 and Comparative Example 3.
【００２３】［考察］実施例３と比較例３の間には、 Ｙ＝0.991 Ｘ＋2.154 相関関係 ｒ＝0.989 の回帰式で示される関係が見られ、良好な相関を示し
た。[Discussion] Between Example 3 and Comparative Example 3, a relationship represented by a regression equation of Y = 0.991 X + 2.154 Correlation r = 0.89 was observed, showing a good correlation.
【００２４】実施例４：本発明の分離用組成物を用いた
ＨＤＬ−コレステロールの測定（同一検体における再現
性） 異なる血清３０検体に代えて、同一の血清２０検体を用
いて、実施例２と同様の操作により、ＨＬＤ−コレステ
ロール値を求めた。結果を表２に示す。Example 4: Measurement of HDL-cholesterol using the composition for separation of the present invention (reproducibility in the same sample) 20 samples of the same serum were used instead of 30 samples of different serum, and The HLD-cholesterol value was obtained by the same operation. The results are shown in Table 2.
【００２５】[0025]
【表２】 [Table 2]
【００２６】［考察］２０回の測定数値はよく一致して
おり、ＳＤ＝1.14、ＣＶ＝2.22％と再現性よく測定でき
ていることが分かる。[Discussion] It can be seen that the measured values of 20 times are in good agreement with each other, and SD = 1.14 and CV = 2.22% can be measured with good reproducibility.
【００２７】実施例５：各種の沈澱助剤を用いた本発明
の分離用組成物を用いたＨＤＬ−コレステロールの測定 ケイソウ土に代えて、各種の試薬を沈澱助剤として用
い、実施例４と同様の操作を行なった。各２０検体の平
均値を表３に示す。Example 5: Measurement of HDL-cholesterol using the separating composition of the present invention using various precipitation aids Various reagents were used as precipitation aids in place of diatomaceous earth as in Example 4. The same operation was performed. Table 3 shows the average value of 20 samples.
【００２８】[0028]
【表３】 [Table 3]
【００２９】［考察］ケイソウ土に比べて、いずれも数
値は高めに出ているが、いずれも使用可能であることが
分かる。[Discussion] Compared with diatomaceous earth, the numerical values are higher than those of diatomaceous earth, but it can be seen that both can be used.
【図１】本発明の分離用組成物を用いたＨＤＬ−コレス
テロールの測定（実施例２）と遠心分離を用いた従来の
方法による測定（比較例２）との相関関係を示すグラフ
である。FIG. 1 is a graph showing a correlation between measurement of HDL-cholesterol using the separating composition of the present invention (Example 2) and measurement by a conventional method using centrifugation (Comparative Example 2).
【図２】本発明の分離用組成物を用いたＨＤＬ−コレス
テロールの測定（実施例３）と遠心分離を用いた従来の
方法による測定（比較例３）との相関関係を示すグラフ
である。FIG. 2 is a graph showing a correlation between measurement of HDL-cholesterol using the separating composition of the present invention (Example 3) and measurement by a conventional method using centrifugation (Comparative Example 3).
Claims (6)
ポ蛋白−コレステロール測定のための高比重リポ蛋白分
画分離用組成物。1. A composition for separating a high-density lipoprotein fraction for measuring high-density lipoprotein-cholesterol, which comprises a precipitating agent and a precipitation aid.
ンタングステン酸−Ｍｇ2+、ヘパリン−Ｍｎ2+、ヘパリ
ン−Ｃａ2+、ポリエチレングリコールまたはこれらの２
以上の混合物である請求項１記載の組成物。Wherein the precipitating agent is dextran sulfate -Mg 2+, -Mg phosphotungstic acid 2+, heparin -Mn 2+, heparin -Ca 2+, polyethylene glycol or 2 of these
The composition according to claim 1, which is a mixture of the above.
ルミニウム末、炭酸カルシウム末、セルロース末、炭素
末または樹脂末である請求項１または２記載の組成物。3. The composition according to claim 1, wherein the precipitation aid is agar powder, diatomaceous earth, aluminum oxide powder, calcium carbonate powder, cellulose powder, carbon powder or resin powder.
ｍである請求項１記載の組成物。4. The particle size of the precipitation aid is 32-150 μm.
The composition of claim 1 which is m.
る請求項１記載の組成物。5. The composition according to claim 1, wherein the proportion of the precipitation aid is 2 to 30% by weight.
ポ蛋白−コレステロール測定のための高比重リポ蛋白−
コレステロール測定のための高比重リポ蛋白分画分離組
成物を用いて体液から高比重リポ蛋白分画を分離する方
法。6. A high-density lipoprotein comprising a precipitant and a precipitation aid-high-density lipoprotein for measuring cholesterol-
A method for separating a high-density lipoprotein fraction from a body fluid using a high-density lipoprotein fraction separation composition for measuring cholesterol.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27499192A JPH06102276A (en) | 1992-09-18 | 1992-09-18 | Composition and method for separation employed in measurement of hyperbaric lipoprotein-cholesterol |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27499192A JPH06102276A (en) | 1992-09-18 | 1992-09-18 | Composition and method for separation employed in measurement of hyperbaric lipoprotein-cholesterol |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06102276A true JPH06102276A (en) | 1994-04-15 |
Family
ID=17549384
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27499192A Pending JPH06102276A (en) | 1992-09-18 | 1992-09-18 | Composition and method for separation employed in measurement of hyperbaric lipoprotein-cholesterol |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06102276A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6762062B2 (en) | 1999-01-27 | 2004-07-13 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Method of determining cholesterol and sensor applicable to the same |
-
1992
- 1992-09-18 JP JP27499192A patent/JPH06102276A/en active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6762062B2 (en) | 1999-01-27 | 2004-07-13 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Method of determining cholesterol and sensor applicable to the same |
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