JPH0591A - Production of retinoic acid - Google Patents
Production of retinoic acidInfo
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- JPH0591A JPH0591A JP17471591A JP17471591A JPH0591A JP H0591 A JPH0591 A JP H0591A JP 17471591 A JP17471591 A JP 17471591A JP 17471591 A JP17471591 A JP 17471591A JP H0591 A JPH0591 A JP H0591A
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Abstract
Description
【0001】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は下記式(II)The present invention relates to the following formula (II)
【化3】
で示されるレチノイン酸の製造法に関する。本発明によ
り製造されるレチノイン酸は、ビタミンA活性を有する
レチノイド類に属し、医薬、栄養剤として有用な化合物
であり、特に抗ガン作用、抗老化作用がレチノイド類の
中で最も大きい点で注目されている化合物である。[Chemical 3] Relates to a method for producing retinoic acid. The retinoic acid produced by the present invention belongs to retinoids having vitamin A activity and is a compound useful as a medicine and a nutritional agent. In particular, it is noted that it has the largest anticancer action and antiaging action among retinoids. Is a compound.
【0002】[0002]
【従来の技術およびその課題】従来、式(II)で表わさ
れるレチノイン酸の製造法としては、β−ヨノン[4−
(2,6,6−トリメチル−1−シクロヘキセン−1−
イル)−3−ブテン−2−オン]を骨格として、これに
不飽和脂肪鎖を付加する化学合成法が知られている。し
かし、この方法は操作が煩雑で収率が低い等の欠点を有
しており、安価に効率よくレチノイン酸を製造するには
問題があった。一方、動物体内では、植物体から摂取さ
れたβ−カロチンなどのプロビタミンAが酵素的にレチ
ノール、レチナールおよびレチノイン酸に変換されてい
ることが知られており(The Journal of Biological Ch
emistry, 263: 17372, 1988 )、生成されたレチノイド
類は主にレチニルパルミチン酸の形で肝臓内に大量に蓄
積されている。従って、レチノイン酸を動物体内より分
離精製して取得する方法も可能であるが、この方法も動
物体内のレチノイン酸含量が微量であるために(レチノ
イン酸の血中濃度はレチノールの1/100 以下であ
る。)、分離・精製操作が煩雑であるという欠点を有し
ており、レチノイン酸の安価な製造法とはなり得ない。
従って、本発明の課題は医薬、栄養剤として有用なレチ
ノイン酸を、微生物を用いてより簡単な操作で安価に効
率よく製造する方法を提供することにある。2. Description of the Related Art Conventionally, as a method for producing retinoic acid represented by the formula (II), β-ionone [4-
(2,6,6-trimethyl-1-cyclohexene-1-
[Ill) -3-buten-2-one] is used as a skeleton, and a chemical synthesis method in which an unsaturated fatty chain is added thereto is known. However, this method has drawbacks such as complicated operation and low yield, and there is a problem in efficiently producing retinoic acid at low cost. On the other hand, in animals, it is known that provitamin A such as β-carotene ingested from plants is enzymatically converted into retinol, retinal and retinoic acid (The Journal of Biological Ch
Emistry, 263 : 17372, 1988), the retinoids produced are mainly accumulated in the liver in the form of retinyl palmitate. Therefore, a method of separating and purifying retinoic acid from the animal body is also possible, but this method also has a small amount of retinoic acid content in the animal body (the blood concentration of retinoic acid is 1/100 or less that of retinol. However, it has a drawback that the separation / purification operation is complicated and cannot be an inexpensive method for producing retinoic acid.
Therefore, an object of the present invention is to provide a method for efficiently producing retinoic acid, which is useful as a medicine or a nutrient, at a low cost by a simpler procedure using a microorganism.
【0003】[0003]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、レチノー
ル(後記の式(I)でRがCH2 OHの化合物)、レチ
ナール(後記の式(I)でRがCHOの化合物)および
レチニルパルミチン酸(後記の式(I)でRがCH2 O
COC15H31の化合物)、特にレチニルパルミチン酸が
動物の肝臓または幽門垂から極めて容易かつ安価に取得
されること、並びにレチニル酢酸(後記の式(I)でR
がCH2 OCOCH3 の化合物)が比較的安価に化学合
成されることに着目し、これらのレチノイド類をレチノ
イン酸に変換してレチノイン酸を取得する方法に関して
鋭意研究し、その結果、微生物を用いて極めて効率よく
レチノイン酸を製造できる方法を見出だし、本発明を完
成した。DISCLOSURE OF THE INVENTION The present inventors have found that retinol (a compound of the formula (I) described below in which R is CH 2 OH), retinal (a compound of the formula (I) described below in which R is CHO) and retinol. Nylpalmitic acid (in the formula (I) described below, R is CH 2 O
COC 15 H 31 compound), in particular retinyl palmitate, is very easily and cheaply obtained from the liver or pyloric appendix of an animal, and retinyl acetic acid (R in formula (I) below).
CH 2 OCOCH 3 compound) is relatively inexpensively chemically synthesized, and earnestly studied on a method of converting these retinoids into retinoic acid to obtain retinoic acid, and as a result, using a microorganism. The present invention has been completed by finding a method capable of extremely efficiently producing retinoic acid.
【0004】すなわち、本発明は式(I)That is, the present invention has the formula (I)
【化4】
(式中、RはCH2 OH、CHO、CH2 OCOCH3
またはCH2 OCOC15H31を示し、二重結合構造は全
てトランス型である。)で表わされるレチノイド類を式
(II)[Chemical 4] (In the formula, R is CH 2 OH, CHO, CH 2 OCOCH 3
Or CH 2 OCOC 15 H 31 is shown, and all double bond structures are trans type. ) Is represented by the formula (II)
【化5】
(式中、二重結合構造は全てトランス型である。)で表
わされるレチノイン酸に変換する能力を有する微生物の
培養物またはその処理物と式(I)の化合物とを反応せ
しめ、反応混合物から式(II)で表わされるレチノイン
酸を取得することを特徴とするレチノイン酸の製造法を
提供したものである。[Chemical 5] (In the formula, all double bond structures are in the trans form.) A culture of a microorganism having the ability to convert to retinoic acid represented by the formula or a treated product thereof is reacted with a compound of the formula (I) to obtain a compound from the reaction mixture. The present invention provides a method for producing retinoic acid, which comprises obtaining retinoic acid represented by the formula (II).
【0005】以下、本発明の製造法を詳しく説明する。
本発明の出発原料である式(I)で表わされる化合物
は、レチノール(R=CH2 OH)、レチナール(R=
CHO)またはレチニル酢酸(R=CH2 OCOC
H3 )、レチニルパルミチン酸(R=CH2 OCOC15
H31)などのレチニルエステルであり、これらの化合物
はそれ自体公知の化合物であるか、または公知化合物の
製造方法に準じて容易に製造されるものである。Hereinafter, the manufacturing method of the present invention will be described in detail.
The compound represented by the formula (I), which is the starting material of the present invention, includes retinol (R = CH 2 OH) and retinal (R =
CHO) or retinyl acetic acid (R = CH 2 OCOC
H 3 ), retinyl palmitate (R = CH 2 OCOC 15
H 31 ), etc., and these compounds are known compounds per se, or can be easily produced according to the known methods for producing compounds.
【0006】本発明で用いられる、式(I)で表わされ
る化合物を式(II)で表わされるレチノイン酸に変換す
る能力を有する微生物としては、ストレプトマイセス属
(Streptomyces)、アミコラタ属(Amy
colata)、モナスカス属(Monascus)、
シゾフィラム属(Schizophyllum)、アス
コキィタ属(Ascochyta)、コレトトリカム属
(Colletotrichum)からなる群より選ば
れる微生物が挙げられ、好ましくはストレプトマイセス
・コエルレオルビダス(Streptomyces c
oeruleorubidus)、ストレプトマイセス
・テスタセウス(Streptomyces test
aceus)、アミコラタ・オートトロフィカ(Amy
colata autotrophica)、モナスカ
ス・エスピー(Monascussp.)、シゾフィラ
ム・コミュネ(Schizophyllum comm
une)、アスコキィタ・エスピー(Ascochyt
a sp.)、コレトトリカム・アトラメンタリウム
(Colletotrichum atramenta
rium)、およびこれらの変異株、またはこれらの遺
伝子操作や細胞融合によって誘導される、本発明の特徴
である式(I)で表わされる化合物を式(II)で表わさ
れるレチノイン酸に変換する能力を有する微生物からな
る群より選ばれる微生物である。選択される微生物の具
体例としては、ストレプトマイセス・コエルレオルビダ
ス(Streptomyces coeruleoru
bidus)ATCC 13740株、ストレプトマイセス・
テスタセウス(Streptomyces testa
ceus)ATCC 21469株、アミコラタ・オートトロ
フィカ(Amycolata autotrophic
a)IFO 12743株、モナスカス・エスピー(Mona
scus sp.)F-308株、シゾフィラム・コミュネ
(Schizophyllum commune)IF
O 6505 株、アスコキィタ・エスピー(Ascochy
ta sp.)FI-13 株、コレトトリカム・アトラメ
ンタリウム(Colletotrichum atra
mentarium)IFO 5256 株が挙げられる。上
記微生物のうちATCC番号の付された微生物は Ameri
can Type Culture Collection (ATCC)発行の Cat
alogue of Bacteria & Bacteriophages, 第17版(198
9)に記載されており、該ATCCから入手することが
できる。IFO番号の付された微生物は、(財)醗酵研
究所(IFO)発行の List of Cultures, 第8版(19
88)に記載されており、該IFOから入手することがで
きる。FI-13 株およびF-308株の菌学的性質は次に示
すとおりであり、それぞれの株は微生物工業研究所に、
各々微工研菌寄第12307 号および第12308 号として寄託
されている。The microorganisms having the ability to convert the compound represented by the formula (I) into the retinoic acid represented by the formula (II) used in the present invention include Streptomyces and Amycolata ( Amy ).
cola ), Monascus genus ( Monascus ),
A microorganism selected from the group consisting of the genus Schizophyllum , the genus Ascochyta , and the genus Colletotrichum is preferable, and Streptomyces coerulerubidus ( Streptomyces c) is preferable.
eureureorubidus ), Streptomyces test
aceus ), Amycolata autotrophia ( Amy)
cora autotrophia ), Monascus sp., Schizophyllum comm
une), Asukokyita sp (Ascochyt
a sp. ), Colletotrichum atramenta
rum ), and mutants thereof, or the ability to convert the compound represented by the formula (I), which is a feature of the present invention, into the retinoic acid represented by the formula (II), which is induced by genetic engineering or cell fusion thereof. A microorganism selected from the group consisting of microorganisms having Specific examples of selected microorganisms include Streptomyces coeruleoru.
bidus ) ATCC 13740 strain, Streptomyces
Testaseus ( Streptomyces testa
ceus) ATCC 21469 strain, Amikorata Auto Trophy mosquito (Amycolata autotrophic
a ) IFO 12743 strain, Monascus SP ( Mona
scus sp. ) F-308 strain, Schizophyllum commune IF
O 6505 shares, Ascochy
ta sp. ) FI-13 strain, Colletotrichum-ATRA Men thallium (Colletotrichum atra
Mentalium ) IFO 5256 strain. Among the above microorganisms, ATCC numbered microorganisms are Ameri
Cat issued by can Type Culture Collection (ATCC)
alogue of Bacteria & Bacteriophages, 17th Edition (198
9) and can be obtained from the ATCC. Microorganisms with IFO numbers are listed in the List of Cultures, 8th Edition (19th Edition), published by Fermentation Research Institute (IFO).
88) and can be obtained from the IFO. The mycological properties of the FI-13 and F-308 strains are as shown below.
They have been deposited as Microorganism Research Institute Nos. 12307 and 12308, respectively.
【0007】FI-13 株の菌学的性質
ポテト・デキストロース寒天培地上で非常に薄いピン
クがかった菌糸層を形成する。菌糸の発達は十分ではな
く、やや湿った形状となる。分生子は分生子殻の内部に
形成される。分生子殻は胃袋状で頂部に空間があり、そ
の内壁は暗く膜状となる。分生子は2細胞からなり、楕
円形でその幅は1.5μmよりも大きい。分生子形成細胞
は透明な短いフラスコ形を呈し、環紋構造を持たない。F-308株の菌学的性質
ポテト・デキストロース寒天培地上で白色の非常によ
く発達した菌糸層を形成し、淡黄色の色素を生成する。
分生子は幅が8−10μmで底部の幅が広く、分生子形
成細胞から隔壁により分断される。分生子形成細胞は環
紋と呼ばれる特有の構造を持つ。分生子は連鎖し、分生
子形成細胞から押し出され求心的に形成される。有性生
殖で生じた子嚢細胞は、球形で開口部のない閉子嚢殻内
に形成された子嚢に含まれる。以上の特徴を基に、 The
genera of fungi sporulating in pure culture (J.A.
von Arx, 1970)にて検索したところ、FI-13 はアス
コキィタ・エスピー(Ascochyta sp.)、
F-308はモナスカス・エスピー(Monascus s
p.)と同定された。[0007]Mycological properties of FI-13 strain
Very thin pins on potato dextrose agar
It forms a dark mycelial layer. Mycelia development is not enough
The shape becomes slightly damp. Conidia are inside the conidia shell
It is formed. The conidium shell is stomach-shaped and has a space at the top.
The inner wall of is dark and filmy. Conidia consist of two cells, ellipsoid
It is circular and its width is greater than 1.5 μm. Conidia forming cells
Has a clear short flask shape and no ring structure.Mycological properties of F-308 strain
Very white white on potato dextrose agar
It forms a well-developed mycelium layer and produces a pale yellow pigment.
Conidia have a width of 8-10 μm and a wide bottom,
Separated from adult cells by septa. Conidia forming cells are rings
It has a unique structure called a crest. Conidia are chained, conidium
It is extruded from the progenitor cells and formed afferently. Sexual life
The ascomycete cells produced by breeding are spherical and have no openings in the ascidian capsule.
Included in the ascos that is formed in the. Based on the above features, The
genera of fungi sporulating in pure culture (J.A.
von Arx, 1970) found that FI-13
Coquita SP (Ascochyta sp. ),
F-308 is Monascus SP (Monascus s
p. ) Was identified.
【0008】上記微生物を培養する培地は特に限定され
ず、微生物の培養に用い得るものであればよい。例え
ば、炭素源としては、上記微生物の利用可能なものであ
ればいずれも使用でき、具体的には、グルコース、フル
クトース、シュクロース、デキストリン等の糖類、グリ
セロール、ソルビトール等の糖アルコール、フマル酸、
クエン酸等の有機酸を使用することができる。これら炭
素源の培地への添加量は通常 0.1〜10%程度とするの
が好ましい。窒素源としては、例えば塩化アンモニウ
ム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸
のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸ア
ンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩、肉エキス、酵
母エキス、コーンスティーブリカー、カゼイン加水分解
物等の天然有機窒素源等を使用することができ、このう
ち有機窒素源は多くの場合、炭素源として兼用すること
ができる。窒素源の添加量は通常 0.1〜10%の範囲が
適当である。また無機塩類としては、例えばリン酸カリ
ウム、リン酸ナトリウム等のリン酸アルカリ金属、塩化
カリウム、塩化ナトリウム等の塩化アルカリ金属、硫酸
マグネシウム、硫酸第一鉄等の硫酸金属塩等を好適に使
用することができ、その使用量は通常 0.001〜1%の範
囲が適当である。微生物の培養は20〜40℃、とりわ
け28〜37℃、pH約5〜8、とりわけpH約6〜7.
5 で好気的条件下に実施するのが好ましい。培養時間は
概ね24〜72時間である。かくして得られる培養液、
該培養液から採取した微生物菌体は、酵素源として好適
に使用し得る。さらに、菌体処理物(例えば凍結乾燥菌
体、アセトン乾燥菌体、洗浄菌体、菌体磨砕物、菌体の
自己消化物、菌体の超音波処理物、菌体抽出物など)を
酵素源として用いることもできる。また、菌体あるいは
菌体処理物を、例えばポリアクリルアミドゲル法、含硫
多糖ゲル法(カラギーナンゲル法等)、アルギン酸ゲル
法、寒天ゲル法等の公知方法により固定化して使用する
こともできる。さらに、菌体抽出物から公知の方法を組
み合わせて精製取得した酵素も使用することができる。The medium for culturing the above-mentioned microorganism is not particularly limited as long as it can be used for culturing the microorganism. For example, as the carbon source, any of those that can be used by the above microorganisms can be used, and specifically, sugars such as glucose, fructose, sucrose, dextrin, glycerol, sugar alcohols such as sorbitol, fumaric acid,
Organic acids such as citric acid can be used. The amount of these carbon sources added to the medium is usually preferably about 0.1 to 10%. Examples of the nitrogen source include ammonium salts of inorganic acids such as ammonium chloride, ammonium sulfate and ammonium phosphate, ammonium salts of organic acids such as ammonium fumarate and ammonium citrate, meat extract, yeast extract, corn steep liquor and casein hydrolysis. It is possible to use natural organic nitrogen sources such as products, and in many cases, the organic nitrogen sources can also serve as carbon sources. The amount of the nitrogen source added is usually in the range of 0.1 to 10%. As the inorganic salts, for example, alkali metal phosphates such as potassium phosphate and sodium phosphate, alkali metal chlorides such as potassium chloride and sodium chloride, magnesium sulfate, and sulfate metal salts such as ferrous sulfate are preferably used. The amount used is usually 0.001 to 1%. The culturing of the microorganism is 20-40 ° C, especially 28-37 ° C, pH about 5-8, especially about pH 6-7.
Preference is given to carrying out under aerobic conditions at 5. The culture time is generally 24 to 72 hours. The culture solution thus obtained,
The microbial cells collected from the culture solution can be suitably used as an enzyme source. In addition, treated bacterial cells (eg freeze-dried bacterial cells, acetone-dried bacterial cells, washed bacterial cells, ground bacterial cells, autolyzed bacterial cells, ultrasonically treated bacterial cells, bacterial cell extracts, etc.) It can also be used as a source. In addition, the cells or treated cells may be immobilized by known methods such as polyacrylamide gel method, sulfur-containing polysaccharide gel method (carrageenan gel method, etc.), alginic acid gel method, agar gel method, etc. Furthermore, an enzyme purified and obtained from a bacterial cell extract by combining known methods can also be used.
【0009】反応は、培養液、菌体または菌体処理物と
基質である式(I)で表わされる化合物を混合すること
によって行なわれる。培養後の菌体を含む培養液に基質
を加えて実施してもよく、また該培養液より得た菌体ま
たは該菌体処理物を基質に加えて反応させてもよい。基
質は概ね 0.01 〜5%、とりわけ 0.05 〜1%が好まし
い。反応媒体としては、水または緩衝液、例えばリン酸
緩衝液あるいはトリス塩酸緩衝液が用いられる。菌体ま
たはその処理物を用いる場合は、その使用量は、菌体ま
たはその処理物が有する、式(I)の化合物を式(II)
のレチノイン酸に変換する活性が 0.01 〜10ユニット
/ml(ただし、1ユニットは1時間に1mgのレチノイン
酸を生成する活性に対応する。)、好ましくは 0.5〜1
0ユニット/mlとなる量を加えればよく、酵素またはそ
の処理物を用いる場合は、その使用量は、酵素またはそ
の処理物が有する式(I)の化合物を式(II)のレチノ
イン酸に変換する活性が0.01〜10ユニット/ml、好ま
しくは0.5 〜10ユニット/mlとなる量を加えればよ
い。反応温度は概ね10〜50℃、とりわけ25℃〜4
0℃が好ましい。反応液のpHは5〜10、とりわけ6
〜9が好ましい。反応時間は1〜72時間、好ましくは
2〜18時間である。基質の式(I)で表わされる化合
物の水に対する溶解度を高めるために界面活性剤または
有機溶媒を反応系に添加すれば、反応時間の短縮、ある
いはレチノイン酸の蓄積量の増加を図ることができ、好
ましい。界面活性剤の例としては、臭化セチルピリミジ
ウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、ポリエチレ
ングリコール、p−イソオクチルフェニルエーテル(米
国、ロームアンドハース社製、商品名:トリトンX−1
00)等が挙げられ、反応液に対し、0.0001〜0.1 %程
度使用するのが好ましい。また、有機溶媒としてはメタ
ノール、アセトン、ジメチルスルホキシド(DMSO)
などの水溶性溶媒、あるいは酢酸エチル、クロロホル
ム、ヘキサン、トルエンなどの非水溶性溶媒を例示する
ことができ、反応液に対し、0.01〜1%程度使用するの
が好ましい。さらに酸化還元反応に関与することが知ら
れている補酵素、例えばニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド(酸化型)の存在下に本反応を実施すれば、反
応時間の短縮を図ることができ、好ましい。補酵素は概
ね基質と等モル量用いるのが好ましい。The reaction is carried out by mixing the culture solution, the bacterial cells or the treated product of the bacterial cells with the compound of the formula (I) which is the substrate. The culture may be carried out by adding a substrate to the culture solution containing the cultured cells, or the cells obtained from the culture solution or a treated product of the cells may be added to the substrate and reacted. The substrate content is generally 0.01 to 5%, preferably 0.05 to 1%. As the reaction medium, water or a buffer solution such as a phosphate buffer solution or a Tris-HCl buffer solution is used. In the case of using the bacterial cells or the processed products thereof, the amount of use is the compound of the formula (I)
Has an activity of converting into retinoic acid of 0.01 to 10 units / ml (1 unit corresponds to the activity of producing 1 mg of retinoic acid per hour), preferably 0.5 to 1
An amount of 0 unit / ml may be added. When an enzyme or a processed product thereof is used, the amount of the enzyme used is such that the compound of the formula (I) contained in the enzyme or the processed product thereof is converted into the retinoic acid of the formula (II). The activity to be added is 0.01 to 10 units / ml, preferably 0.5 to 10 units / ml. The reaction temperature is generally 10 to 50 ° C, especially 25 ° C to 4
0 ° C is preferred. The pH of the reaction solution is 5 to 10, especially 6
-9 are preferable. The reaction time is 1 to 72 hours, preferably 2 to 18 hours. If a surfactant or an organic solvent is added to the reaction system in order to increase the solubility of the compound represented by the formula (I) in water, the reaction time can be shortened or the amount of retinoic acid accumulated can be increased. ,preferable. Examples of the surfactant include cetyl pyrimidium bromide, cetyl trimethyl ammonium bromide, polyethylene glycol, p-isooctyl phenyl ether (trade name: Triton X-1 manufactured by Rohm and Haas Company, USA).
00) and the like, and it is preferable to use about 0.0001 to 0.1% of the reaction liquid. Further, as the organic solvent, methanol, acetone, dimethyl sulfoxide (DMSO)
Examples thereof include water-soluble solvents such as or non-water-soluble solvents such as ethyl acetate, chloroform, hexane, and toluene, and it is preferable to use about 0.01 to 1% of the reaction solution. Further, it is preferable to carry out this reaction in the presence of a coenzyme known to be involved in the redox reaction, for example, nicotinamide adenine dinucleotide (oxidized form), because the reaction time can be shortened. The coenzyme is preferably used in an approximately equimolar amount with the substrate.
【0010】反応後、反応液または培養液からの生成物
の分離・精製は、通常の公知方法、例えば溶媒抽出、カ
ラムクロマトグラフィー、蒸留等により行なえばよく、
菌体等を用いる場合には、例えば遠心分離により反応媒
体から分離すればよい。After the reaction, separation / purification of the product from the reaction solution or the culture solution may be carried out by an ordinary known method such as solvent extraction, column chromatography, distillation and the like.
When bacterial cells or the like are used, they may be separated from the reaction medium by centrifugation, for example.
【0011】[0011]
【実施例】以下、実施例により、本発明を説明するが、
本発明はこれら実施例に限られるものではない。実施例1
ポテトスターチ2%、脱脂大豆粉2%、グルコース1
%、KH2 PO4 0.1%、MgSO4 ・7H2 O 0.05
%、アデカノールLG109 0.05 %を含むFI培地1
00ml(pH7.2 )を4本の500ml容振盪フラスコに
入れ、121℃で15分間滅菌した。この培地にアスコ
キィタ・エスピー(Ascochytasp.)FI-1
3 (FERM P-12307)を1白金耳接種し、28℃で6
6時間振盪培養した。得られた培養液のpHを7.5 に調
整後、それぞれのフラスコにレチノール、レチナール、
レチニル酢酸、またはレチニルパルミチン酸のアセトン
溶液(100mg/ml)2mlを別々に添加し、28℃でさ
らに66時間培養した。反応液を3000rpm 、10分間遠
心分離処理に付し、それぞれ85mlのろ液を得た。それ
ぞれの反応ろ液のpHを1NのNaOHで10に調整
後、25mlのn−ヘキサンで未反応の基質を抽出した。
次いで、それぞれの水層80mlに4NのHClを加えて
pHを2以下に再調整し、25mlのn−ヘキサンで再抽
出した。得られたn−ヘキサン抽出液を遮光下で減圧濃
縮し、黄色の粗粉末を得た。これらの粗粉末のレチノイ
ン酸含量を下記の高速液体クロマトグラフィー(HPL
C)を用いて測定した結果、それぞれの基質から得られ
たレチノイン酸量は、レチノールから113mg、レチナ
ールから118mg、レチニル酢酸から83mg、レチニル
パルミチン酸から43mgであった。EXAMPLES The present invention will be described below with reference to examples.
The present invention is not limited to these examples.Example 1
2% potato starch, 2% defatted soy flour, 1 glucose
%, KH2POFour 0.1%, MgSOFour・ 7H2O 0.05
%, FI medium 1 containing 0.05% of Adecanol LG109
Add 00 ml (pH 7.2) to four 500 ml shake flasks.
It was put in and sterilized at 121 ° C. for 15 minutes. Asco on this medium
Kita SP (Ascochytasp. ) FI-1
3 (FERM P-12307) was inoculated with 1 platinum loop and 6 at 28 ℃
The cells were shake-cultured for 6 hours. Adjust the pH of the resulting culture to 7.5.
After preparation, retinol, retinal,
Acetone of retinyl acetic acid or retinyl palmitic acid
Add 2 ml of the solution (100 mg / ml) separately and store at 28 ° C.
Furthermore, it was cultured for 66 hours. React the reaction solution at 3000 rpm for 10 minutes
By subjecting to heart separation treatment, 85 ml of filtrate was obtained. It
Adjust the pH of each reaction filtrate to 10 with 1N NaOH.
After that, the unreacted substrate was extracted with 25 ml of n-hexane.
Then add 4N HCl to 80 ml of each water layer
Readjust the pH to below 2 and re-extract with 25 ml of n-hexane.
I put it out. The obtained n-hexane extract was concentrated under reduced pressure in the dark.
It was compressed to obtain a yellow crude powder. These coarse powder retinois
The acid content was measured by the following high performance liquid chromatography (HPL
As a result of measurement using C),
The amount of retinoic acid was 113 mg from retinol and retina
From 118 mg, retinyl acetic acid from 83 mg, retinyl
It was 43 mg from palmitic acid.
【0012】HPLCの測定条件
カラム:ZORBAX SIL,4.6 mm×15cm
移動相:ヘキサン/アセトン/クロロホルム(7:2:
1)
流速 :0.6 ml/分
検出 :UV345nm
温度 :25℃
上記条件下での基質およびレチノイン酸の保持時間を次
に示す。
レチノイン酸:4.8 分
レチニルパルミチン酸:2.8 分
レチニル酢酸:3.3 分
レチナール:3.8 分
レチノール:6.0 分HPLC measurement conditions Column: ZORBAX SIL, 4.6 mm × 15 cm Mobile phase: Hexane / acetone / chloroform (7: 2:
1) Flow rate: 0.6 ml / min Detection: UV345 nm Temperature: 25 ° C. The retention times of the substrate and retinoic acid under the above conditions are shown below. Retinoic acid: 4.8 minutes Retinyl palmitate: 2.8 minutes Retinyl acetic acid: 3.3 minutes Retinal: 3.8 minutes Retinol: 6.0 minutes
【0013】実施例2
グルコース 1.5%、酵母エキス 0.5%、ペプトン 0.5
%、肉エキス 0.5%、脱脂大豆粉1%、グリセロール
1.5%を含むAK培地100ml(pH7.2 )を500ml
容振盪フラスコに入れ、121℃で15分間滅菌した。
この培地にストレプトマイセス・テスタセウス(Str
eptomyces testaceus)ATCC 2
1469株を1白金耳接種し、28℃で66時間振盪培養し
た。得られた培養液から3000 rpm、10分間の遠心分離
操作で菌体を分離し、これを 0.1Mリン酸緩衝液(pH
7.5 )50mlに再懸濁した。菌懸濁液を10mlずつ4本
の250ml容振盪フラスコに分注し、それぞれのフラス
コにレチノール、レチナール、レチニル酢酸またはレチ
ニルパルミチン酸のアセトン溶液(40mg/ml) 0.5ml
を別々に添加して、28℃で6時間培養した。反応液を
3000 rpm、10分間の遠心分離処理に付し、それぞれ9
mlのろ液を得た。それぞれのろ液のpHを1NのNaO
Hで10に調整後、3mlのn−ヘキサンで未反応の基質
を抽出した。次いで、それぞれの水層8.5 mlのpHを4
NのHClで 1.5に再調整し、5mlのn−ヘキサンで再
抽出した。n−ヘキサン抽出液を遮光下で減圧濃縮し、
得らた黄色の粗粉末に含まれるレチノイン酸量を実施例
1に記載されたHPLC測定条件にて定量した。その結
果、レチノールから11mg、レチナールから12mg、レ
チニル酢酸から2mg、およびレチニルパルミチン酸から
1mgのレチノイン酸が得られた。[0013]Example 2
Glucose 1.5%, yeast extract 0.5%, peptone 0.5
%, Meat extract 0.5%, defatted soybean powder 1%, glycerol
500 ml of 100 ml of AK medium (pH 7.2) containing 1.5%
It was placed in a shake flask and sterilized at 121 ° C. for 15 minutes.
Streptomyces testaceus (Str
eptomyces testaceus) ATCC 2
1 platinum loop was inoculated with 1469 strain and cultured at 28 ° C for 66 hours with shaking.
It was Centrifugation from the obtained culture solution at 3000 rpm for 10 minutes
The cells were separated by the operation, and 0.1M phosphate buffer solution (pH
7.5) Resuspended in 50 ml. Four bacterial suspensions of 10 ml each
Dispense into a 250 ml shake flask of
Retinol, retinal, retinyl acetic acid or retin
Nylpalmitic acid acetone solution (40mg / ml) 0.5ml
Were added separately and cultured at 28 ° C. for 6 hours. The reaction solution
Centrifuge at 3000 rpm for 10 minutes, each 9
ml of filtrate was obtained. Adjust the pH of each filtrate to 1N NaO
After adjusting to 10 with H, unreacted substrate with 3 ml of n-hexane
Was extracted. Then add 8.5 ml of each aqueous layer to pH 4
Re-adjust to 1.5 with N HCl and re-add with 5 ml n-hexane.
Extracted. The n-hexane extract was concentrated under reduced pressure in the dark,
Example of the amount of retinoic acid contained in the obtained yellow crude powder
It was quantified under the HPLC measurement conditions described in 1. That conclusion
Fruit, 11 mg from retinol, 12 mg from retinal,
2 mg from tinylacetic acid and from retinyl palmitate
1 mg of retinoic acid was obtained.
【0014】実施例3
ストレプトマイセス・コエルレオルビダス(Stre
ptomyces coeruleorubidus)A
TCC 13740株、またはアミコラタ・オートトロフィカ
(Amycolata autotrophica)I
FO 12743株をAK培地(25ml/250ml容フラス
コ、それぞれ4本)で、モナスカス・エスピー(Mon
ascus sp.)F-308株(FERM P-12308)、
シゾフィラム・コミュネ(Schizophyllum
commune)IFO 6505 株またはコレトトリカ
ム・アトラメンタリウム(Colletotrichu
m atramentarium)IFO 5256 株をF
I培地(25ml/250ml容フラスコ、それぞれ4本)
で28℃、66時間培養し、それぞれにレチノール、レ
チナール、レチニル酢酸またはレチニルパルミチン酸の
アセトン溶液(50mg/ml)1mlを加えて、28℃でさ
らに66時間培養した。反応液から遠心分離操作で菌体
を除去し、実施例1または実施例2に記載された方法に
従ってレチノイン酸を分離精製した。各基質から変換さ
れたレチノイン酸量を次表に示した。[0014]Example 3
Streptomyces coelre Orbidas (Stre
ptomyces coeruleorubidus) A
TCC 13740 strain, or Amicorata autotrophia
(Amycola autotropica) I
FO 12743 strain was added to AK medium (25 ml / 250 ml frass
Monascus SP (4 each)Mon
ascus sp. ) F-308 strain (FERM P-12308),
Schizophyllum Commune (Schizophyllum
commune) IFO 6505 strain or Colletotrica
Mu Atlamentarium (Colletotrichu
m atramentarium) IFO 5256 shares
Medium I (25 ml / 250 ml flask, 4 bottles each)
Incubate at 28 ° C for 66 hours at 60 ° C.
Of tinal, retinyl acetic acid or retinyl palmitate
Add 1 ml of acetone solution (50 mg / ml) at 28 ° C.
Furthermore, it was cultured for 66 hours. Cells can be centrifuged from the reaction solution.
Was removed and the method described in Example 1 or Example 2 was used.
Therefore, retinoic acid was separated and purified. Converted from each substrate
The amount of retinoic acid obtained is shown in the following table.
【0015】[0015]
【表1】 [Table 1]
【0016】[0016]
【発明の効果】本発明によれば、工業的に安価に入手可
能なレチノール、レチナール、レチニル酢酸またはレチ
ニルパルミチン酸から、抗ガン作用あるいは抗老化作用
としての医薬、または栄養剤として有用なレチノイン酸
を微生物を用いて安価に収率よく製造することが可能と
なる。INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, retinol, retinal, retinyl acetic acid, or retinyl palmitic acid, which are industrially available at low cost, are used as drugs or nutritional agents having an anti-cancer action or an anti-aging action, or retinoin useful as a nutritional supplement. It becomes possible to inexpensively produce an acid with good yield using a microorganism.
─────────────────────────────────────────────────────
─────────────────────────────────────────────────── ───
【手続補正書】[Procedure amendment]
【提出日】平成3年9月18日[Submission date] September 18, 1991
【手続補正2】[Procedure Amendment 2]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】0008[Correction target item name] 0008
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction content]
【0008】 上記微生物を培養する培地は特に限定
されす、微生物の培養に用い得るものであればよい。例
えば、炭素源としては、上記微生物の利用可能なもので
あればいずれも使用でき、具体的には、グルコース、フ
ルクトース、シュクロース、デキストリン等の糖類、グ
リセロール、ソルビトール等の糖アルコール、フマル
酸、クエン酸等の有機酸を使用することができる。これ
ら炭素源の培地への添加量は通常0.1〜10%程度と
するのが好ましい。窒素源としては、例えば塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無
機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン
酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩、肉エキ
ス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加
水分解物等の天然有機窒素源等を使用することができ、
このうち有機窒素源は多くの場合、炭素源として兼用す
ることができる。窒素源の添加量は通常0.1〜10%
の範囲が適当である。また無機塩類としては、例えばリ
ン酸カリウム、リン酸ナトリウム等のリン酸アルカリ金
属、塩化カリウム、塩化ナトリウム等の塩化アルカリ金
属、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄等の硫酸金属塩等を
好適に使用することができ、その使用量は通常0.00
1〜1%の範囲が適当である。微生物の培養は20〜4
0℃、とりわけ28〜37℃、pH約5〜8、とりわけ
pH約6〜7.5で好気的条件下に実施するのが好まし
い。培養時間は概ね24〜72時間である。かくして得
られる培養液、該培養液から採取した微生物菌体は、酵
素源として好適に使用し得る。さらに、菌体処理物(例
えば凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、洗浄菌体、菌体
磨砕物、菌体の自己消化物、菌体の超音波処理物、菌体
抽出物など)を酵素源として用いることもできる。ま
た、菌体あるいは菌体処理物を、例えばポリアクリルア
ミドゲル法、含硫多糖ゲル法(カラギーナンゲル法
等)、アルギン酸ゲル法、寒天ゲル法等の公知方法によ
り固定化して使用することもできる。さらに、菌体抽出
物から公知の方法を組み合わせて精製取得した酵素も使
用することができる。The medium for culturing the above-mentioned microorganism is not particularly limited as long as it can be used for culturing the microorganism. For example, as the carbon source, any of those that can be used by the above microorganisms can be used, and specifically, sugars such as glucose, fructose, sucrose, dextrin, glycerol, sugar alcohols such as sorbitol, fumaric acid, Organic acids such as citric acid can be used. The amount of these carbon sources added to the medium is usually preferably about 0.1 to 10%. As the nitrogen source, such as ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium salts of inorganic acids such as ammonium phosphate, ammonium fumarate, ammonium salts of organic acids such as ammonium citrate, meat extract, yeast extract, corn tea flop liquor, casein hydrolyzate A natural organic nitrogen source such as a decomposed product can be used,
Of these, in many cases, the organic nitrogen source can also serve as the carbon source. Addition amount of nitrogen source is usually 0.1-10%
The range is appropriate. As the inorganic salts, for example, alkali metal phosphates such as potassium phosphate and sodium phosphate, alkali metal chlorides such as potassium chloride and sodium chloride, magnesium sulfate, and sulfate metal salts such as ferrous sulfate are preferably used. The amount used is usually 0.00
A range of 1 to 1% is suitable. Culture of microorganisms is 20-4
Preference is given to carrying out under aerobic conditions at 0 ° C., especially 28-37 ° C., pH about 5-8, especially pH about 6-7.5. The culture time is generally 24 to 72 hours. The culture solution thus obtained and the microbial cells collected from the culture solution can be suitably used as an enzyme source. In addition, treated bacterial cells (eg freeze-dried bacterial cells, acetone-dried bacterial cells, washed bacterial cells, ground bacterial cells, autolyzed bacterial cells, ultrasonically treated bacterial cells, bacterial cell extracts, etc.) It can also be used as a source. In addition, the cells or treated cells may be immobilized by known methods such as polyacrylamide gel method, sulfur-containing polysaccharide gel method (carrageenan gel method, etc.), alginic acid gel method, agar gel method, etc. Furthermore, an enzyme purified and obtained from a bacterial cell extract by combining known methods can also be used.
Claims (2)
またはCH2 OCOC15H31を示し、二重結合構造は全
てトランス型である。)で表わされるレチノイド類を式
(II) 【化2】 (式中、二重結合構造は全てトランス型である。)で表
わされるレチノイン酸に変換する能力を有する微生物の
培養物またはその処理物と式(I)の化合物とを反応せ
しめ、反応混合物から式(II)で示されるレチノイン酸
を取得することを特徴とするレチノイン酸の製造法。1. Formula (I): (In the formula, R is CH 2 OH, CHO, CH 2 OCOCH 3
Or CH 2 OCOC 15 H 31 is shown, and all double bond structures are trans type. ) Are represented by the formula (II): (In the formula, all double bond structures are in the trans form.) A culture of a microorganism having the ability to convert to retinoic acid represented by the formula or a treated product thereof is reacted with a compound of the formula (I) to obtain a compound from the reaction mixture. A method for producing retinoic acid, which comprises obtaining retinoic acid represented by the formula (II).
で表わされるレチノイン酸に変換する能力を有する微生
物がストレプトマイセス属(Streptomyce
s) 、アミコラタ属(Amycolata)、モナスカ
ス属(Monascus)、シゾフィラム属(Schi
zophyllum)、アスコキィタ属(Ascoch
yta)、コレトトリカム属(Colletotric
hum)からなる群より選ばれる微生物である請求項1
記載のレチノイン酸の製造法。2. A compound represented by the formula (I) is represented by the formula (II):
The microorganism having the ability to be converted to retinoic acid is represented by the genus Streptomyces.
s), Amikorata genus (Amycolata), Monascus genus (Monascus), Schizophyllum genera (Schi
zophyllum ), genus Ascoch
yta ), the genus Colletotricum ( Coletotric )
hum ) is a microorganism selected from the group consisting of
A method for producing the retinoic acid described.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP17471591A JPH0591A (en) | 1991-06-20 | 1991-06-20 | Production of retinoic acid |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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JP17471591A JPH0591A (en) | 1991-06-20 | 1991-06-20 | Production of retinoic acid |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0591A true JPH0591A (en) | 1993-01-08 |
Family
ID=15983386
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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JP17471591A Pending JPH0591A (en) | 1991-06-20 | 1991-06-20 | Production of retinoic acid |
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Country | Link |
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JP (1) | JPH0591A (en) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112501216A (en) * | 2020-12-17 | 2021-03-16 | 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 | Method for efficiently producing tretinoin from green algae |
-
1991
- 1991-06-20 JP JP17471591A patent/JPH0591A/en active Pending
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112501216A (en) * | 2020-12-17 | 2021-03-16 | 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 | Method for efficiently producing tretinoin from green algae |
CN112501216B (en) * | 2020-12-17 | 2023-04-11 | 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 | Method for efficiently producing tretinoin from green algae |
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