【発明の詳細な説明】
〔発明の技術分野〕
本発明はリン酸誘導体の製造法に関し、更に詳
しくは、Ｎ−未保護ヌクレオシドを用いたオリゴ
（ポリ）ヌクレオチドの製造法に関する。
〔発明の技術的背景とその問題点〕
遺伝子工学の分野において、オリゴ（ポリ）ヌ
クレオチドは近年ますます重要な研究対象となつ
てきている。特に、インターフエロン処理細胞
［エー、ジー、ホバネシアン、アンド、アイ、エ
ム、ケール、ユアロ、ジエイ、バイオケム、（A.
G.Hovanessian and I.M.Kerr，Eur.J.
Biochem.），８４〜，149（1978）；ジエイ、ピー、
フアレル、ジー、シー、セン、エム、エフ、ドウ
ボイス、エル、ラツトナー、イー、スラツタリ、
アンド、ピー、レンギエル、プロク、ナトル、ア
カド、サイ、ユーエスエー（J.P.Farrer，G.C.
Sen，M.F.Dubois，L.Ratner，E.Slattery，and
P.Lengyel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA），７５〜，
5893（1978）；エル、エー、バール、バイロロジー
（L.A.Ball，Virology），９４〜，282（1979）］中、
二重鎖RNAの存在下で、（2′−5′）An合成酵素に
よりATPから得られた2′−5′結合オリゴアデニレ
ート（２−5As）は、インターフエロンの抗ウイ
ルス作用［レビユー：ピー、レンギエル、アニ
ユ、レブ、バイオケム．（Reviews：P.Lengyel，
Annu.Rev.Biochom.），５１〜，251（1982）；ジー、
シー、セン、プログ、ヌクレイツクアシツド・レ
ス、モル、バイオル．（G.C.Sen，Prog.Nucleic
Acid Res.Mol.Biol.），２７〜，105（1982）］及び
増殖抑制作用［アイ．グレツサー，アンド，エ
ム．トビイ，バイオケム．バイオフイズ．アクタ
（I.Gresser and M.Tovey，Biochem.Biophys.
Acta），516，231（1978）］の発現に関し、大きな
役割を果しており、生化学的に重要な物質であ
る。これらの物質の中で、トリマー
A2′P5′A2′P5′A（２−5Aコア）は、ナノモル
（nm）以下の濃度において、マウス脾臓細胞のコ
ンカナバリンＡで刺激されたDNAの合成を阻害
する｛エー．キムチ、エツチ．シユアー、アン
ド、エム．レベル、ネーチヤー（ロンドン）［A.
Kimchi，H.Shure，and M.Revel，Nature
（London）］，282〜，849（1979）｝のみならず、管内
の翻訳系及び哺乳動物の生細胞における蛋白生合
成をも阻害する｛ジエイ、イマイ、アンド、ピ
ー、エフ、トレンス、プロテイン、ヌクレイツク
アシツド、アンド、エンザイム（イン・ジヤパニ
ーズ）［J.Imai and P.F.Torrence，Protein，
Nucleic Acid，and Enzyme（in Japanese）］，
２８〜，801（1983）；アイ、エム、ケール、アンド、
アール、イー、ブラウン、プロク、ナトル、アカ
ド、サイ、ユーエスエー（I.M.Kerr and R.E.
Brown，Proc.Natl.Acad.Sci.USA），７５〜，256
（1978）；エル、エー、バール、アンド、シー、エ
ヌ、ホワイト、イビド、（L.A.Ball and C.N.
White，ibid.），７５〜，1167（1978）；ビー、アー
ル、ジー、ウイリアムス、アンド、アイ、エム、
ケール、ネーチヤー（ロンドン）［B.R.G.
Williams and I.M.Kerr，Nature（London）］，
276〜，88（1978）；エー、ジー、ホバネシアン、ジ
エイ、ウツド，イー、ミユアーズ、アンド、エ
ル、モンタニーア、プロク、ナトル、アカド、サ
イ、ユーエスエー（A.G.Hovanessian，J.Wood，
E.Meurs，and L.Montagnier，Proc.Natl.Acad.
Sci.USA），７６〜，3261（1979）｝
5′−Ｏ−トリホスフエート、即ち
ppp5′A2′p5′A2′p5′Aもまた、細胞外蛋白生合成
の強力なインヒビターとして作用する（同上参
照）。5′−Ｏ−モノホスフエート、即ち
p5′A2′p5′A2′p5′Aは、ppp5′A2′p5′A2′p5′Aの
阻
害作用と拮抗する［ピー、エフ、トレンス、ジエ
イ、イマイ、アンド、エム、アイ、ジヨンスト
ン、プロク、ナトル、アカド、サイ、ユーエスエ
ー（P.F.Torrence，J.Imai，and M.I.Johnston，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA），７８〜，5993（1981）］。
更に、最近の研究により、2′末端を人工ヌクレオ
シドで修飾した、ある種の２−5A類縁体は、生
物学的活性を著しく高めることが明らかになつた
ジエイ、イマイ、エム．アイ、ジヨンストン、ア
ンド、ピー、エフ、トレンス、ジエイ、バイオ
ル、ケム（J.Imai，M.I.Johnston，and P.F.
Torrence，J.Biol.Chem.），257〜，12739（1982）］
かくして、これらの研究により、生体内におけ
る限られた種類の誘導体および供給量に抗ずるべ
く、２−5A誘導体を多量に供給することができ、
しかもウイルス感染に対して新たな治療方法が期
待される各種の人工類縁体も供給することができ
る効果的な化学的合成方法の発展が望まれる。
２−5A類縁体をはじめとするオリゴヌクレオ
チドを化学的に合成するための基礎反応は、ヌク
レオシドのリン酸化である。この反応を容易に進
行させるには、下記反応式でそれぞれ示されるよ
うに求電子剤であるホスホリル化剤の活性化、あ
るいは求核剤のヌクレオシドの活性化の二つの方
法が原理的に考えられる。
【化】
【化】
従来、この核酸関連分野においては、長期間に
亘つて、強力なリン酸化能を有するホスホリル化
剤（リン酸化剤）の開発に目が向けられていた。
その結果、スルホン酸とリン酸との混合酸無水物
が見い出され、この試剤は、現在、ヌクレオチド
合成のために多用されている。
しかしながら、このホスホリル化剤を用いた場
合、作用が強力すぎるために、リン酸化はヌクレ
オシドの酸素原子（水酸基の酸素原子）上より
も、核酸塩基の窒素原子（アミノ基の窒素原子）
上でより速く進行するため、反応に際しては、予
め核酸塩基のアミノ基を保護する必要があつた。
また、反応に際しては、ホスホリル化剤又はヌク
レオシドのいずれかを過剰に用いなければなら
ず、しかも活性化に要するスルホン酸誘導体
（sulfonylchlorides，snlfonolides）が極めて高価
であるという欠点があつた［ミズノ、エト・アー
ル、ザ・シンセシス・アブ・ヌクレオシド、アン
ド、ヌクレオチド（Mizuno et al，The
Synthesis of Nucleosides and Nucleotides），
69−239（1977）；テナー、ジー、エム．，ジヤーナ
ル・オブ・ザ・アメリカン・ケミカル・ソサイテ
イ（Tener，G.M.，Journal of the American
Chemical Society），８３〜，159（1961）］
これに対し、ホスホロクロリデート又はｐ−ニ
トロフエニルホスフエート等の温和なホスホリル
化剤が見い出された。これらの試剤は安価である
という点で好ましい。
しかしながら、反応時間が長く、また強い反応
条件が必要とされ、しかも目的化合物の生成は低
収率であつた。
一方、次式：
【化】
（【式】PNP＝−C6H4−ｐ
−NO2）
等で示されるように、ｐ−ニトロフエノールを脱
離基として有するヌクレオチドと他のヌクレオチ
ドのナトリウムアルコキシドとを反応させて、イ
ンターヌクレオチドを合成する方法が知られてい
る［スカリツク・ブイ、エトアール、クロアチ
カ・ケミカ・アクタ（Skaric V.et al，Croatica
Chemica Acta），49，851（1977）］
しかし、この方法は、極めて強い反応条件が必
要とされ、また、ウラシルヌクレオシド又はチミ
ンヌクレオシドを用いた報告例があるのみで、こ
れら以外の核酸塩基を含むヌクレオシドについて
は全く報告がない。
〔発明の目的〕
本発明の目的は、上述した欠点を生じることな
く、ヌクレオシド又はヌクレオチドを容易かつ選
択的にリン酸化してリン酸誘導体を製造する方法
を提供することにあり、更に詳しくは、温和な条
件で容易にオリゴ（ポリ）ヌクレオチドを製造す
ることができる方法を提供することにある。
〔発明の概要〕
本発明者らは、次式：
【化】
で示されるように、窒素原子よりも酸素原子と大
きな親和性を示す金属を用いれば、メタルアルコ
キシドとメタルアミドの平衡がアルコキシド側に
ずれてＯ−選択的活性化が達成され、Ｏ−ホスホ
リル化体が選択的に得られるものと考えた。一般
に、結合解離エネルギーは原子間の親和性のひと
つの目安を与える。窒素に関するデータは現在の
ところ不明であるが、マグネシウムは窒素よりも
酸素に対してより大きな親和性をもつと考えられ
ている。
結合解離エネルギー（KJmol-1）
Mg−Ｏ：393.7±35
［ピー、ジエイ、ダグジギアン、エト、アー
ル、ザ・ジヤーナル・オブ・ケミカル・フイジク
ス（P.J.Dagdigian et al，The Journal of
Chomical Physics），62，1824（1975）；エー．
、ジー、ガイドン、ジソシエーシヨン・エナジ
ー、アンド、スペクトラ・オブ・ジアトミツクモ
レキユール（A.G.Gaydon，Dissociation
Energies and Spectra of Diatomic
Molecules），（1968）］
本発明者らは、以上の推察に基づき、ヌクレオ
シド又はヌクレオチドをグリニヤール試薬で処理
し、ついでこれをリン酸化することにより、本発
明を完成するに至つた。
本発明の製造方法は、2′又は3′位の水酸基がリ
ン酸エステル化されたヌクレオシドに、5′位に−
OMgX1基（X1はハロゲン原子を表す）を有する
ヌクレオシド、ヌクレオチド又はオリゴ（ポリ）
ヌクレオチドを反応させることを特徴とする2′→
5′結合又は3′→5′結合オリゴ（ポリ）ヌクレオチ
ドの製造法である。
本発明で用いられるヌクレオシドとは、リボヌ
クレオシド又はデオキシリボヌクレオシドを意味
する。
以下、ヌクレオシドとして、リボヌクレオシド
又はその誘導体を用いて2′−5′結合オリゴリボヌ
クレオチドを合成する場合につき、本反応を説明
することとするが、その他の水酸基含有化合物で
あつても本発明の方法により水酸基をリン酸化す
ることが可能である。
本反応においては、3′位及び5′位の水酸基を所
望の保護基で保護してなるリボヌクレオシドにグ
リニヤール試薬を作用せしめてマグネシウムアル
コキシドとすることにより2′位の水酸基を活性化
し、次いでホスホリル化剤を作用せしめる。本反
応の代表例は例えば、次式：
【化】
（式中、R2は炭素数１〜10のアルキル基又は
置換もしくは非置換アリール基を表し；R5及び
R6は同一でも異なつていてもよく、それぞれ水
酸基の保護基を表し；X2はハロゲン原子又は置
換もしくは非置換アリールオキシ基を表す）
で表される。上記反応はリボヌクレオシド又はデ
オキシリボヌクレオシドの3′位もしくは5′位の水
酸基のリン酸化等にも適用される。
式１〜〜２〜中、Ｂはアデニン（Ade）、グアニン
（Gua）又はこれらの誘導体のプリン塩基；シト
シン（Cyt）、ウラシル（Ura）、チミン（Thy）
又はこれらの誘導体のピリミジン塩基を表す。本
発明では、核酸塩基のアミノ基及びイミド基を保
護しなくとも、Ｏ−選択的にスルホリル化するこ
とができるため、Ｎ−未保護核酸塩基のヌクレオ
シドであつても水酸基のみを選択的にリン酸化す
ることができる。
また、式中、保護基R5及びR6は、それぞれ水
酸基を保護するための通常の保護基であれば格別
限定されない。R5としては、例えばMMTr〔ｐ−
CH3OC6H4（C6H5）2Ｃ〕，DMTr〔（ｐ−CH3OC6
H4）2C6H5Ｃ〕等が好ましく、最も好ましくは
MMTrである。R6としては、例えばTBDMS（ｔ
−C4H9（CH3）2Si），（C2H5）3Si，（C6H5）2CH3Si，
CH3CO，C6H5CO等が好ましく、更に好ましく
はシリル系保護基である。
グリニヤール試薬としては、例えば、次式：
R1MgX1
（式中、R1は炭素数１〜９のアルキル基を表
し；Ｘはハロゲン原子を表す）
で示される化合物が挙げられる。R1のアルキル
基としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イ
ソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、sec−ブ
チル、tert−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチ
ル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチ
ル、ｎ−ノニル等が例示されるが、最も好ましく
はtert−ブチルである。またX1のハロゲン原子と
しては、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が例
示されるが、最も好ましくは塩素原子である。
なお、本発明においては、R1がアリール基で
あるグリニヤール試薬を用いてもよい。ここでア
リール基としては、例えばC6H5−、ｏ−CH3C6
H4−、ｐ−CH3C6H4−、２，６−〔（CH3）3Ｃ〕2
C6H3−、
ｐ−CH3OC6H4−、２−ナフチル等が挙げら
れる。
以上に掲げたグリニヤール試薬の具体例として
は、例えば、CH3MgBr，CH3MgＩ，C2H5Mg
Br，ｉ−C3H7MgCl，ｉ−C3H7MgBr，ｎ−C49
MgCl，ｔ−C4H9MgCl，C6H5MgBr，２，４，６
−（CH3）3C6H2MgCl等が挙げられるが、この中
では、ｔ−C4H9MgCl，C6H5MgBr，２，４，６
−（CH3）3C6H2MgBrが好ましい。
ホスホリル化剤としては、例えば、次式：
（R2Ｏ）2POX2
（式中、R2及びX2はそれぞれ前記と同義であ
る）
で示される化合物が挙げられる。R2の炭素数１
〜10のアルキル基としては、例えばメチル基，エ
チル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−
ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−
ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、
ｎ−ノニル基、ｎ−デシル基等が挙げられるが、
メチル基、エチル基が最も好ましい。R2の置換
もしくは非置換アリール基としては、例えば
ｏ−ClC6H4−、C6H5−、ｐ−NO2C6H4−、２
−Cl−４−NO2C6H3−等が挙げられるが、C6H5
−、及びｏ−ClC6H4−が好ましい。X2のハロゲ
ン原子としては、例えば塩素原子、フツ素原子等
が挙げられるが、塩素原子が最も好ましい。X2
の置換もしくは非置換アリールオキシ基として
は、例えば、
ｏ−ClC6H4Ｏ−、ｐ−NO2C6H4Ｏ−、２，４
−（NO2）2C6H6Ｏ−、２−Cl−４−NO2C6H3−
等が挙げられるが、２−Cl−４−NO2C6H3−Ｏ
−、Ｐ−NO2C6H4Ｏ−、２，４−（NO2）2C6H3
Ｏ−等が好ましい。ホスホリル化剤の具体例とし
ては、例えば、（C2H5Ｏ）2POCl、
（C2H5Ｏ）2PO（OC6H3−２，４−NO2）、（ｏ−
ClC6H4Ｏ）2POCl、
（ｏ−ClC6H4Ｏ）2PO（OC6H3−２−Cl−４−
NO2）、
（C2H5Ｏ）2PO（OC6H4−ｐ−NO2）、
（C2H5Ｏ）2PO（OC6H3−２−Cl−４−NO2
（C6H5Ｏ）2POCl，（C6H5Ｏ）2PO（OC6H4−ｐ−
NO2）、
（C6H5Ｏ）2PO（OC6H3−２，４−（NO2）2）、
（C6H5Ｏ）2PO（OC6H3−２−Cl−４−NO2）、
（ｏ−ClC6H4Ｏ）（ｐ−NO2−C6H4Ｏ）POCl
等が挙げられるが、これらの中では、（C2H5Ｏ）2
POCl、
（C6H5Ｏ）2POCl、（ｏ−ClC6H4Ｏ）2POCl、
（C2H5Ｏ）2PO（OC6H3−２−Cl−４−NO2）、
（C6H5Ｏ）2PO（OC6H3−２−Cl−４−NO2）、
（C2H5Ｏ）2PO（OC6H3−２，４−（NO2）2）、
（ｏ−ClC6H4Ｏ）（ｐ−NO2−C6H4Ｏ）POCl、
（C6H5Ｏ）2PO（OC6H3−２，４−（NO2）2）等
が好ましい。
本反応では、溶媒中で行われる。使用可能な溶
媒としては、例えばテトラヒドロフラン
（THF）、エーテル（ジエチルエーテル）、ジメト
キシエタン等のエーテル系溶媒；ジメチルホルム
アミド（DMF）等のアミド系溶媒；ジクロロメ
タン等のハロゲン化炭化水素系溶媒である。
本反応では、まず反応系にグリニヤール試薬を
加え、数分〜数十分間反応せしめた後、生成した
マグネシウムアルコキシドを単離することなく更
にホスホリル化剤を加えて目的化合物を得ること
ができる。グリニヤール試薬の使用量はヌクレオ
シドの水酸基１当量に対して、通常１〜２等量で
ある。またホスホリル化剤の使用量はヌクレオシ
ドの水酸基１等量に対して、通常１〜1.4当量、
好ましくは1.1〜1.2当量である。反応温度は通常
０〜60℃、好ましくは15〜25℃であり、反応時間
（上記２つの反応を合わせた合計時間）は通常0.5
〜24時間、好ましくは１〜６時間である。
以上の反応が終了した後は、例えば、反応混合
液から目的物を抽出し、これを乾燥後、濃縮し
て、得られた残渣をカラムクロマトグラフイーに
付することによりトリエステル体が得られる。
次に、本発明では、上記反応より得られたトリ
エステル体２〜に所望のグリニヤール試薬で処理し
たボヌクレオシド３〜（マグネシウムアルコキシ
ド）を作用させる。本反応の代表例は、例えば、
次式：
【化】
で表される。本反応では、前記反応で得られるト
リエステル体２〜を単離精製することなく第二のリ
ボヌクレオシド成分３〜と反応させることができる
が、このトリエステル体２〜は第二のリボヌクレオ
シド成分３〜のホスホリル化剤として作用する。こ
こで、この第二のリボヌクレオシド成分とは、前
記反応と同様にグリニヤール試薬で処理した所望
のリボヌクレオシド３〜であり、該リボヌクレオシ
ド３〜は前記反応の最終産物であるトリエステル体
２〜のリン酸基１当量に対して通常0.7〜1.4当量、
好ましくは0.9〜1.2当量加えられる。本反応は、
前記と同様の溶媒中で行われ、反応温度は通常15
〜60℃、好ましくは25〜30℃であり、反応時間は
通常１〜30時間、好ましくは1.5〜24時間である。
この反応によりリン酸誘導体であるインターヌク
レオチドが得られるが、該物質は前記の如き常法
に従い単離することができる。なお、本発明で得
られたリン酸誘導体を更に後述する反応に供する
ためには、保護基R5を脱離することが必要であ
る。R5がMMTrもしくはDMTr等のトリチル系
保護基である場合、酢酸、モノクロロ酢酸、ジク
ロロ酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、
臭化亜鉛等を用いることにより脱保護することが
できる。
本発明の方法によれば、上記２つのいずれの反
応工程においても核酸塩基を保護する必要がな
く、また第一及び第二のヌクレオシド成分とホス
ホリル化剤を反応系に順次加えるだけで三成分を
連結することができるため、迅速かつ簡便なイン
ターヌクレオチド結合形成法が提供される。
本発明は、更にもう一つの工程を負荷すること
ができる。即ち、化合物４〜の5′−０脱保護体５〜に
グリニヤール試薬を作用せしめ、しかる後再び前
記化合物２〜の如き活性化リン酸エステルをホスホ
リル化剤として作用せしめる。本反応の代表例
は、例えば、次式：
【化】
で表される。本反応は、前記第一工程における反
応とほぼ同一の条件下で行うことができる。ま
た、第二の工程を更に繰り返すことにより、オリ
ゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを合成する
ことができる。
化合物６〜を脱保護化し、トリリボヌクレオシド
ホスフエートを得るには、保護基R2，R5及びR6
の種類に応じて、従来公知の方法を適宜採用する
ことができる。しかしながら、R5がトリチル系
保護基、R6がシリル系保護基、R2が炭化水素基
である化合物６〜を脱保護化するには、以下の如き
新規方法によることが好ましい。
即ち、まず前記の如き酢酸系化合物でR5基を
脱離する。次いで、１，１，３，３−テトラメチ
ルグアニジウム、シン−４−ニトロベンズアルド
キシメート（NBO）［シー、ビー、リーズ、アー
ル、シー、テイツトマス、アンド、エル、ヨー、
テトラヘドロンレター（C.B.Reese，R.C.
Titmas，and L.Yau，Tetrahedron Lett.），
2727（1978）参照］と、通常H2Ｏ−ジオキサン
（１：１、体積比）等の溶媒中、例えば25〜28℃
で18〜22時間反応させる。しかる後、アンモニア
等のアミン系塩基と、例えば25〜28℃で２〜３時
間反応させることによりR2基を脱離する。最後
に、フツ化テトラブチルアンモニウム
（TBAF）、フツ化水素酸、フツ化水素−ピリジ
ン錯体などと、通常16〜20時間反応させてR6基
を脱離する。これにより、次式：
【式】
で示されるトリリボヌクレオシドジホスフエート
が得られる。なお、前記式４〜で示される化合物に
あつても、上記方法により脱保護化してジリボヌ
クレオシドホスフエートを得ることができる。
さて、本発明により前記トリリボヌクレオシド
ジホスフエート６〜が得られるが、この化合物を更
に5′末端においてモノリン酸化するには、例えば
以下の如き方法を用いることができる。
【化】
【化】
上記反応においては、まず式６〜における保護基
R5を脱離してなる化合物８〜を亜リン酸化剤
（R7Ｏ）2PX3の三級アミンの存在下で処理す
る。この亜リン酸化剤において、R7としては、
例えばトリクロロエチル、エチル、メチル、フエ
ニル、ｏ−クロロフエニル、ｐ−クロロフエニル
等が挙げられるが、これらの中ではトリクロロエ
チル基が最も好ましい。また、X3としては、例
えば塩素原子、ｐ−ニトロフエノキシ基等が挙げ
られるが、塩素原子が最も好ましい。一方、三級
アミンとしては、２，６−ルチジン、ピリジン、
イミダゾール、トリエチルアミン、ジイソプロピ
ルエチルアミン等が挙げられるが、好ましくは
２，６−ルチジン、イミダゾール、ジイソプロピ
ルエチルアミンである。この反応は、通常アミン
自身又はテトラヒドロフラン、ジクロロメタン等
の溶媒中、例えば−78℃で１〜２時間行われる。
次いで、得られた化合物を酸化剤で処理し、化
合物９〜とする。ここで用いられる酸化剤として
は、例えばヨウ素、二酸化窒素、メタクロロ安息
香酸等が挙げられるが、好ましくはヨウ素、二酸
化窒素である。この反応は、通常水、テトラヒド
ロフラン、ジクロロメタン等の溶媒中、例えば25
〜28℃の温度範囲内で10〜20分間行われる。
最後に、得られた化合物９〜を還元剤で処理し、
化合物１０〜とする。ここで用いられる還元剤とし
ては、例えば亜鉛−銅合金、亜鉛−銀合金等が挙
げられる。この反応は、通常Ｎ，Ｎ−ジメチルホ
ルムアミド等の溶媒中、例えば55〜60℃の温度範
囲内で１〜６時間行われる。
以上の反応で得られた化合物１０〜の保護基R2
及びR6を脱離する方法は前記と同様である。こ
の脱保護化により次式に示す5′−Ｏ−モノホスフ
エート１１〜が得られる。
【化】
なお、5′−Ｏ−モノホスフエート１１〜から5′−
Ｏ−トリホスフエート１２〜を得るには、公知の方
法によつて行うことができる［エツチ、サワイ、
テイ。シバタ、アンド、エム。オーノ、テトラヘ
ドロンレター（H.Sawai，T.Shibata，and M.
Ohno，Tetrahedron Lett.），4573（1979）；エ
フ、クラマー、エツチ、シヤラー、アンド、エツ
チ、エー、スターブ、ケム、バー、（F.Cramer，
H.Schaller，and H.A.Staab，Chem.Ber.），
９４〜，1612（1961）；エツチ、シヤラー、エツチ、
エー、スターブ、アンド、エフ、クラマー、イビ
ド、（H.Schaller，H.A.Staab，and F.Gramer，
ibid.），９４〜，1621（1961）；エフ、クラマー、ア
ンド、エツチ、ニユーロホエフアー、イビド、
（F.Cramer and H.Neunohoeffer，ibid.），
９５〜，1664（1962）；デー、イー、ホアード、アン
ド、デー、ジー、オツトー、ジエイ、アム、ケ
ム、ソク、（D.E.Hoard and D.G.Ott，J.Am.
Chem.Soc.），８７〜，1785（1965）］
〔発明の効果〕
本発明のリン酸誘導体の製造法によれば、以下
に示す利点が得られる。
(1) すべての核酸塩基についてアミノ基の保護を
必要としないため、安価なＮ−未保護ヌクレオ
シドを使用することができる。
(2) 第一発明において、二官能性ホスホリル化剤
を用いることにより、第一のヌクレオシドとの
反応で第二のヌクレオシドアルコキシドとの縮
合に活性な中間体を生成し得る。また、この中
間体は、第二発明において、第三のヌクレオシ
ドを付加せしめるためのホスホリル化剤として
使用することができる。したがつて、インター
ヌクレオチド結合形成のために従来法で汎用さ
れる塩化スルホニル、スルホニルアミドなどの
高価な縮合剤を必要としない。
(3) その結果、従来法によるチミジンあるいはグ
アノシンのホスホリル化で繁々見られる副反応
（核酸塩基部へのスルホニル化）の懸念が無い。
(4) (2)に述べた活性合成中間体は精製する必要が
ない。すなわちインターヌクレオチド結合形成
反応はすべて同一フラスコ内で行うことができ
る。従来のトリエステル法が合成中間体である
ヌクレオシド−リン酸ジエステル体の精製を不
可欠としたのに対し、実験操作が簡便である。
(5) 任意の核酸塩基を有する各種のオリゴもしく
はポリヌクレオチドの人工類縁体を製造するこ
とができる。
以上のような利点を有する本発明のリン酸化方
法は、例えば、核酸化学、とくに遺伝子工学、
有機合成化学、農薬化学の分野において、
遺伝子操作を目的としたオリゴあるいはポリヌク
レオチドの合成、有機金属錯体を用いる有機合
成反応、とくに触媒反応の触媒の配位子としての
リン酸化合物の合成、リンを含む有効な農薬の
合成手段として有用である。
〔発明の実施例〕
実施例 １
活性リン酸エステル２の合成
3′−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−5′−Ｏ−
ｐ−メトキシトリチルアデノシン１〜（1.17ｇ，
1.79mmol）のTHF（15ml）溶液に、0.58M塩化
ｔ−ブチルマグネシウムのTHF溶液（3.10ml、
1.79mmol）を室温（18℃）で加えた。同温度で
５分間攪拌した後、反応混合物を、アルゴンガス
下で15分間かけて18℃にてｏ−クロロフエニル
ｐ−ニトロフエニルホスホロクロリデート（0.62
ｇ，1.79mmol）のTHF（10ml）溶液に加えた。
混合物を更に２時間18℃で攪拌した。この溶液を
更に精製することなく、インターヌクレオチド結
合形成用のホスホリル化剤として用いた。
ｏ−クロロフエニル 3′−Ｏ−ｔ−ブチルジメ
チルシリルアデニリル（2′→5′）−2′，3′−Ｏ−ビ
ス（ｔ−ブチルジメチルシリル）アデノシン５〜
＜DMFの添加＞
2′，3′−Ｏ−ビス（ｔ−ブチルジメチルシリ
ル）アデノシン（0.799ｇ，1.61mmol）のTHF
（８ml）溶液に、室温（18℃）で0.58M塩化ｔ−
ブチルマグネシウムのTHF溶液（2.78ml，
1.61mmol）を加えた。５分間攪拌後、この溶液
に前記反応で得られた活性リン酸エステル２の
THF溶液（28ml，1.79mmol）を加え、しかる後
同温度でDMF（６ml）を加えた。室温で12時間攪
拌した後、反応混合物をジクロロメタン（150ml）
で希釈し、飽和食塩水（100ml）に注いだ。得ら
れた乳濁状混合物を遠心分離し（2000rpm×
5mim）、水層をジクロロメタン（50ml×２，30
ml×２）で抽出した。合せた有機層を硫酸マグネ
シウム上で乾燥、濃縮し、得られた黄色ゴム状物
（3.2ｇ）をジクロロメタン（50ml）に溶かした。
この溶液に18℃でジクロロ酢酸（４ml）を加え、
混合物を２時間攪拌した。反応混合物にジクロロ
メタン（50ml）と飽和NaHCO3水（50ml）との
混合液を加えた。水層をジクロロメタン（30ml×
２）で抽出した。合せた有機層を飽和NaHCO3
水（30ml）及び飽和食塩水（30ml）で洗い、硫酸
マグネシウム上で乾燥した。濃縮して得られたゴ
ム状物（2.5ｇ）をシリカゲル（30ｇ）カラムク
ロマトグラフイー（直径2.5cm×長さ20cm）に供
した。メタノール−クロロホルム（１：50〜１：
20）で溶出し、非晶質の標題化合物（1.18ｇ，70
％、ジアステレオマー１：１混合物）を得た。
Rf（MeOH＝CHCl3＝１：10，SiO2）＝0.31
1HNMR（CDCl3）第１図参照
IR（CHCl3）3500，3400（NH2），1290（Ｐ＝Ｏ）
cm-1
UV（MeOH）λnax＝260.1nm
HPLC〔ODS（Develosil）5μ，H2Ｏ−MeOH＝
１：10，260nm，１mlmim-1，12℃〕
TR＝22.45，24.31mim
Anal.Calcd for C44H70ClN10O10PSi3：Ｃ，
50.34；Ｈ，6.72；Ｎ，13.34.Found：Ｃ，49.76；
Ｈ，6.65；Ｎ，13.48.
＜Ｎ，Ｎ，N′，N′−テトラメチルエチレンジ
アミンの添加＞
DMFの代わりにＮ，Ｎ，N′，N′−テトラメチ
ルエチレンジアミン（グリニヤール試薬に対して
６当量）を用いたこと以外は、上記と同様に反応
を行つた。室温（14℃）で96時間攪拌した後、同
様の操作及び精製により標題化合物を76％の収率
で得た。
ジ−ｏ−クロロフエニル 3′−Ｏ−ｔ−ブチル
ジメチルシリルアデニリル（2′→5′）−3′−Ｏ−
ｔ−ブチルジメチルシリルアデニリル−（2′→
5′）−2′，3′−Ｏ−ビス（ｔ−ブチルジメチルシ
リル）アデノシン８〜
減圧下（１mmHg，50℃）P2O5上で乾燥し、室
温で48時間、モレキユラーシーブ4A粉末（300mg
以下）のTHF溶液中で保存した前記反応生成物
のジヌクレオシドホスフエート５（1.15ｇ，
1.09mmol）のTHF溶液（10ml）に、25℃で
0.65M塩化ｔ−ブチルマグネシウムのTHF溶液
（2.4ml，1.56mmol）を加え、混合物を５分間攪
拌した。この混合物に前記反応で得た活性化リン
酸エステル２（1.65mmol）のTHF（26ml）溶液を
加え、しかる後25℃でDMF（６ml）を加えた。不
均一な混合物を室温で34時間攪拌した後、クロロ
ホルム（300ml）、1.3Mアンモニア−塩化アンモ
ニウム緩衝液（PH10，150ml）及びEDTA・2Na
水溶液（0.3M，150ml）を加えた。得られた乳濁
状混合物を遠心分離（3000rpm×5mim）した。
水層をクロロホルム（80ml×３）で抽出した。合
せた有機層をEDTA・2Na水溶液（100ml）及び
飽和食塩水（50ml）で洗い、硫酸マグネシウム上
で乾燥した。濃縮してゴム状物（3.4ｇ）を得、
これをジクロロメタン（160ml）に溶かし、ジク
ロロ酢酸（８ml）を０℃で溶液に加えた。２時間
攪拌した後、混合物に飽和NaHCO3水（160ml）
を加えた。有機層を飽和NaHCO3水（40ml×２）
及び飽和食塩水（40ml）で洗つた。硫酸マグネシ
ウム上で乾燥した後、有機層を蒸発させてゴム状
物（2.6ｇ）を得た。溶出液として水−メタノー
ル（１：６〜１：30）を用い、ODSゲル（富士
デビソン(株)製Q3，30〜50μ，80ｇ）のカラムクロ
マトグラフイー（2.5×50cm）に付して、標題化
合物を非晶質として63％の収率（1.10ｇ、ジアス
テレオマー混合物）で得た。出発物質を11％
（127mg）回収した。
Rf（MeOH：CHCl3＝１：８，SiO2）＝0.4
（H2Ｏ：MeOH＝１：20、二回展開、ODS）
＝0.23
1HNMR（CDCl3）第２図参照3480，3400，
3320（NH2），1290（Ｐ＝Ｏ）cm-1
UV（MeOH）λnax＝260.5nm
HPLC〔ODS（Develosil）5μ，H2Ｏ−MeOH＝
１：75，260nm，１mlmim-1，12℃〕
TR＝16.58，17.78，18.91，20.45mim
Anal，Calcd for C66H99Cl2N15O16P2Si4：Ｃ，
49.43；Ｈ，6.22；Ｎ，13.10，Found：Ｃ，
49.41；Ｈ，6.23；Ｎ，12.99、
実施例 ２
ｏ−クロロフエニル 3′−Ｏ−ｔ−ブチルジメ
チルシリルアデニリル（2′→5′）−2′，3′−Ｏ−
ビス（ｔ−ブチルジメチルシリル）シチジン５〜
2′，3′−Ｏ−ビス（ｔ−ブチルジメチルシリ
ル）シチジン（736mg，1.56mmol）のTHF（２
ml）溶液へ0.26M塩化ｔ−ブチルマグネシウムの
THF溶液（６ml，1.56mmol）を25℃で加え、５
分間攪拌した後、活性トリエステル２〜
（1.53mmol）のTHF（10ml）溶液を加えた。そこ
へDMF（５ml）を加え、25℃で16時間攪拌した。
反応混合物をジクロロメタン（30ml）と飽和食塩
水（90ml）の混合物に注いだ。生じた乳濁状物を
遠心分離で分けた。水層をジクロロメタン（30ml
×３）で抽出し、合せた有機層を硫酸マグネシウ
ム上で乾燥、濃縮した。得た残渣をジクロロメタ
ン（25ml）に溶かし、ジクロロ酢酸（３ml）を加
え25℃にて２時間攪拌した。反応混合物を飽和
NaHCO3水（30ml）で中和し、有機層を飽和食
塩水（10ml×２）で洗い、硫酸マグネシウム上で
乾燥した。除媒して得た残渣をシリカゲルカラム
クロマトグラフイー（３×20cm）に供し、メタノ
ール−クロロホルム（１：15〜１：10）で溶出
し、標題化合物（1.01ｇ，63％）を得た。また出
発物質を11％回収した。
ジ−ｏ−クロロフエニル 3′−Ｏ−ｔ−ブチル
ジメチルシリルアデニリル（2′→5′）−3′−Ｏ−
ｔ−ブチルジメチルシリルアルデニリル−
（2′→5′）−2′，3′−Ｏ−ビス（ｔ−ブチルジメ
チルシリル）シチジン８〜
実施例１で述べた方法で乾燥した3′−Ｏ−ｔ−
ブチルジメチルシリルアデニリル−（2′→5′）−2′
，
3′−Ｏ−ビス（ｔ−ブチルジメチルシリル）シチ
ジン５〜（1.0ｇ，1mmol）のTHF（６ml）溶液へ
0.26M塩化ｔ−ブチルマグネシウムのTHF溶液
（3.85ml，1mmol）を25℃で加え、５分間攪拌し
た後、活性トリエステル２〜（1mmol）のTHF
（10ml）溶液を加え14時間攪拌した。反応混合物
をジクロロメタン（30ml）と飽和食塩水（90ml）
の混合物に注ぎ、生じた乳濁状物を遠心分離で分
けた。水層をジクロロメタン（30ml×３）で抽出
し、合せた有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥し
濃縮した。得た残渣をジクロロメタン（25ml）に
溶かし、ジクロロ酢酸（３ml）を加え25℃にて２
時間攪拌した。反応混合物を飽和NaHCO3水
（30ml）で中和し、有機層を飽和食塩水（10ml）
で洗い、硫酸マグネシウム上で乾燥した。除媒し
て得た油状物をシリカゲルカラムクロマトグラフ
イー（３×25cm）に供し、メタノール−クロロホ
ルム（１：５〜１：２）で溶出し、標題化合物
（363mgｇ，23％）を得た。
実施例 ３
ｏ−クロロフエニル 3′−Ｏ−ｔ−ブチルジメ
チルシリルアデニリル（2′→5′）−2′，3′−Ｏ−
ビス（ｔ−ブチルジメチルシリル）グアノシン
５〜
2′，3′−Ｏ−ビス（ｔ−ブチルジメチルシリ
ル）グアノシン（798mg，1.52mmol）のTHF（２
ml）溶液へ0.26M塩化ｔ−ブチルマグネシウムの
THF溶液（11.7ml，3.04mmol）を25℃で加え、
５分間攪拌した後、活性トリエステル２〜
（1.52mmol）のTHF（10ml）溶液を加えた。そこ
へDMF（５ml）を加え25℃で24時間攪拌した。反
応混合物をジクロロメタン（30ml）と飽和食塩水
（90ml）の混合物に注いだ。生じた乳濁状物を遠
心分離で分けた。水層をジクロロメタン（30ml×
３）で抽出し、合せた有機層を硫酸マグネシウム
上で乾燥、濃縮した。得た残渣をジクロロメタン
（30ml）に溶かし、ジクロロ酢酸（3.5ml）を加え
25℃にて２時間攪拌した。反応混合物を飽和
NaHCO3水（40ml）で中和し、有機層を飽和食
塩水（10ml×２）で洗い、硫酸マグネシウム上で
乾燥した。除媒して得た残渣をシリカゲルカラム
クロマトグラフイー（60ｇ，３×20cm）に供し、
メタノール−クロロホルム（１：４〜１：２）で
溶出し標題化合物（794ｇ，49％）を得た。また
出発物質を27％回収した。
ジ−ｏ−クロロフエニル 3′−Ｏ−ｔ−ブチル
ジメチルシリルアデニリル（2′→5′）−3′−Ｏ−
ｔ−ブチルジメチルシリルアルデニリル−
（2′→5′）−2′，3′−Ｏ−ビス（ｔ−ブチルジメ
チルシリル）グアノシン８〜
実施例１で述べた方法で乾燥した3′−Ｏ−ｔ−
ブチルジメチルシリルアデニリル−（2′→5′）−2′
，
3′−Ｏ−ビス（ｔ−ブチルジメチルシリル）グア
ノシン５〜（1.07ｇ，1mmol）のTHF（2.6ml）溶
液へ0.26M塩化ｔ−ブチルマグネシウムのTHF
溶液（7.69ml，2mmol）を25℃で加え、５分間攪
拌した後、活性トリエステル２（1mmol）の
THF（10ml）溶液を加え、20時間攪拌した。反応
混合物をジクロロメタン（30ml）と飽和食塩水
（90ml）の混合物に注ぎ、生じた乳濁状物を遠心
分離で分けた。水層をジクロロメタン（30ml×
３）で抽出し、合せた有機層を硫酸マグネシウム
上で乾燥し濃縮した。得た残渣をジクロロメタン
（25ml）に溶かし、ジクロロ酢酸（３ml）を加え、
25℃にて２時間攪拌した。反応混合物を飽和
NaHCO3水（30ml）で中和し、有機層を飽和食
塩水（10ml）で洗い、硫酸マグネシウム上で乾燥
した。除媒して得た油状物をシリカゲルカラムク
ロマトグラフイー（３×25cm）に供し、メタノー
ル−クロロホルム（１：４〜１：２）で溶出し、
標題化合物（502mgｇ，31％）を得た。
実施例 ４
ｏ−クロロフエニル 3′−Ｏ−ｔ−ブチルジメ
チルシリルアデニリル（2′→5′）−2′，3′−Ｏ−
ビス（ｔ−ブチルジメチルシリル）ウリジン５〜
2′，3′−Ｏ−ビス（ｔ−ブチルジメチルシリ
ル）ウリジン（723mg，1.53mmol）のTHF（２
ml）溶液へ0.26M塩化ｔ−ブチルマグネシウムの
THF溶液（11.76ml，3.06mmol）を21℃で加え、
５分間攪拌した後、活性トリエステル２
（1.53mmol）のTHF（10ml）溶液を加えた。そこ
へDMF（５ml）を加え25℃で21時間攪拌した。反
応混合物をジクロロメタン（30ml）と飽和食塩水
（90ml）の混合物に注いだ。生じた乳濁状物を遠
心分離で分けた。水層をジクロロメタン（30ml×
３）で抽出し、合せた有機層を硫酸マグネシウム
上で乾燥、濃縮した。得た残渣をジクロロメタン
（25ml）に溶かし、ジクロロ酢酸（３ml）を加え
25℃にて２時間攪拌した。反応混合物を飽和
NaHCO3水（30ml）で中和し、有機層を飽和食
塩水（10ml×２）で洗い、硫酸マグネシウム上で
乾燥した。除媒して得た残渣をシリカゲルカラム
クロマトグラフイー（３×20cm）に供し、メタノ
ール−クロロホルム（１：６〜１：３）で溶出
し、標題化合物（534ｇ，52％）を得た。また出
発原料を27％回収した。
ジ−ｏ−クロロフエニル 3′−Ｏ−ｔ−ブチル
ジメチルシリルアデニリル（2′→5′）−3′−Ｏ−
ｔ−ブチルジメチルシリルアルデニリル−
（2′→5′）−2′，3′−Ｏ−ビス（ｔ−ブチルジメ
チルシリル）ウリジン８〜
実施例１で述べた方法で乾燥した3′−Ｏ−ｔ−
ブチルジメチルシリルアデニリル−（2′→5′）−2′
，
3′−Ｏ−ビス（ｔ−ブチルジメチルシリル）ウリ
ジン５〜（1.03ｇ，1mmol）のTHF（2.5ml）溶液
へ0.26M塩化ｔ−ブチルマグネシウムのTHF溶
液（7.69ml，2mmol）を25℃で加え、５分間攪拌
した後、活性トリエステル２（1mmol）のTHF
（10ml）溶液を加え20時間攪拌した。反応混合物
をジクロロメタン（30ml）と飽和食塩水（90ml）
の混合物に注ぎ、生じた乳濁状物を遠心分離で分
けた。水層をジクロロメタン（30ml×３）で抽出
し、合せた有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥
し、濃縮した。得た残渣をジクロロメタン（25
ml）に溶かし、ジクロロ酢酸（３ml）を加え25℃
にて２時間攪拌した。反応混合物を飽和
NaHCO3水（30ml）で中和し、有機層を飽和食
塩水（10ml）で洗い、硫酸マグネシウム上で乾燥
した。除媒して得た油状物をシリカゲルカラムク
ロマトグラフイー（３×25cm）に供しメタノール
−クロロホルム（１：６〜１：２）で溶出し、標
題化合物（458mgｇ，29％）を得た。
参考例 １
ジ−ｏ−クロロフエニル 5′−Ｏ−ビス（２，
２，２−トリクロロエチル）ホスホリル−3′−
Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリルアデニリル−
（2′→5′）−3′−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル
アデニリル−（2′→5′）−2′，3′−Ｏ−ビス（ｔ
−ブチルジメチルシリル）アデノシン１０〜
実施例１で得られたトリヌクレオシドホスフエ
ート８〜（320.4mg，0.20mmol）及び２，６−ルチ
ジン（128.6mg，1.20mmol）のTHF（３ml）溶液
に−78℃でビス（２，２，２−トリクロロエチ
ル）ホスホロクロリデート（123μl，0.60mmol）
を加えた。同温度で１時間攪拌した後、混合物を
エーテル（10ml）と飽和NaHCO3水（１：５，
６ml）とで希釈した。混合物に室温でヨウ素
（0.22ｇ，0.90mmol）のエーテル溶液（５ml）を
加えた。15分間攪拌した後、混合物を0.5MNa2
S2O4溶液（10ml）と振盪した。分離した水層を
ジクロロメタン（10ml×２）で抽出した。合せた
有機層を飽和食塩水（５ml）で洗い、硫酸マグネ
シウム上で乾燥し、濃縮してゴム状物（0.60ｇ）
を得た。シリカゲルカラムクロマトグラフイー
（12ｇ，1.2×18cm）に供し、メタノール−酢酸エ
チル（１：60−１：50）とメタノール−クロロホ
ルム（１：10）とで溶出して、標題化合物
（312.6mg，80％）を得た。
Rr（MeOH：CHCl3＝１：10）＝0.38
IR（CHCl3）3500，3400（NH2），1290（Ｐ＝Ｏ）
cm-1
UV（MeOH）λnax＝259.7nm
1HNMR（CDCl3）第３図参照
Anal，Calcd for C70H102Cl8N15O19P3Si4：
Ｃ，43.19；Ｈ，5.28；Ｎ，10.79.Found：
Ｃ，42.38；Ｈ，5.19；Ｎ，10.88。
参考例 ２
A2′p5′A2′p5′A（２−5Aコア、７〜）の合成
0.3M1，１，３，３−テトラメチルグアニジウ
ムシン−４−ニトロアルドキシメート（1.5ml）
を含む、実施例１で得られたトリヌクレオシドジ
ホスフエート８〜（13.5mg，8.42μmol）の水−ジオ
キサン（１：１）溶液を、室温（30℃）で16時間
攪拌した。混合物を蒸発乾固し、28％アンモニア
溶液（0.5ml）とジオキサン（0.5ml）とを加え
た。室温で10時間攪拌した後、混合物を濃縮して
少量化（１ml）し、水（10ml）で希釈した。溶液
をエーテル（10ml）で洗い、Dowex50W×８（ピ
リジニウム型）カラム（15ml，2.5×５cm）に供
し、水−エタノール（20＋100ml）で溶出した。
溶出液を蒸発乾固し、そこに1Mフツ化テトラブ
チルアンモニウムのTHF（１ml）溶液を加え、混
合物を室温で36時間攪拌した。除媒した後、残渣
をエーテルで洗い、しかる後水に溶かした。この
溶液をDEAEセルロース（HCO3 -型）DE−52カ
ラム（2.5×25cm）に供し、直線型勾配の0.01〜
0.3M炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液
（PH7.6）で溶出した。２−5Aコアがトリエチル
アンモニウム塩として得られた。（204OD260，75
％）
UV（Et3NH+・HCO3 -buffer，PH7.6）λnax＝
258.5nm
HPLC〔ODS（Develosil）5μ，0.1M KH2PO4
＋0.005M ｎ−C4H9NBr／MeOH＝75：25、
260nm，１mlmim-1，40℃〕TR＝11.96mim
Paper electrophoresis（Et3NH+・HCO3 -
buffer，PH7.6 900V）Rn＝0.69（5′−AMP＝1.00）
参考例 ３
pA2′p5′A2′p5′A１１〜の合成
実施例１で得られたトリヌクレオシドジホスフ
エート８〜（78.0mg，40μmol）、亜鉛−銅合金
（310mg，4.80mmol）及びアセチルアセトン
（0.40ml，4.00mmol）のDMF（1.5ml）混合物を60
℃で4.5時間激しく攪拌した。青緑色の混合物を
メタノール（40ml）で希釈した。残つた金属を
去し、液に水（20ml）とChelex100樹脂（NH4
＋型、30ml）とを加えた。１時間攪拌した後、生
じた沈澱物にメタノール（100ml）を加え過し、
更に樹脂をメタノール（50ml）で洗つた。液及
び洗液にｎ−ブタノールとアセトニトリルを加え
て共沸蒸留し、濃縮してゴム状物を得た。残渣を
0.3M1，１，３，３−テトラメチルグアニジウム
シン−４−ニトロアルドキシメートを含む水−
ジオキサン（１：１）（10ml）溶液に溶かし、室
温（26℃）で18時間攪拌した。混合物を水（40
ml）で希釈し、エーテル（30ml×２）で洗い、水
層に28％アンモニア溶液（４ml）を加えた。室温
で３時間攪拌後、混合物をエーテル（50ml×２）
で洗い、ｎ−ブタノールとアセトニトリルで共沸
蒸留し、油状物を得た。これに1Mフツ化テトラ
ブチルアンモニウムのTHF（12ml）溶液を加え
た。室温で16時間攪拌後、標準物質としてATP
を用い、高速液体クロマトグラフイーにより、ト
リマーが65％の収率で得られていることが判明し
た。
反応混合物を蒸発してゴム状物を得、水で希釈
した。この溶液をDEAEセルロース（HCO3 -型）
DE−52カラム（2.5×25cm）に供し、直線型勾配
の0.01〜0.4M炭酸水素トリエチルアンモニウム
緩衝液（PH7.6）で溶出した。トリヌクレオチド
がトリエチルアンモニウム塩として得られた
（740OD260単位、50％）。
pA2′p5′A2′p5′A１１〜の酵素分解
上記反応生成物のトリヌクレオチド
（4.78OD260）及びアルカリホスフアターゼ（0.24
単位）を含む30mMトリス塩酸緩衝液（PH８，
100μl）を3.5時間、37℃に保つた。反応液を紙
電気泳動に供したところ、生成物として
A2′p5′A2′p5′A７〜のみが確認された。
上記反応生成物のトリヌクレオチド
（5.96OD260）及びヘビ毒ホスフアターゼ（0.6単
位）を含む30mMトリス塩酸緩衝液並びに3mM
塩化マグネシウム溶液の等量混合液（100μl）を
14時間、37℃に保つた。反応液を紙電気泳動に
供したところ、生成物として5′−AMPのみが確
認された。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION [Technical Field of the Invention] The present invention relates to a method for producing phosphoric acid derivatives, and more particularly to a method for producing oligo(poly)nucleotides using N-unprotected nucleosides. [Technical background of the invention and its problems] In the field of genetic engineering, oligo(poly)nucleotides have recently become an increasingly important research subject. In particular, interferon-treated cells [ A.
G. Hovanessian and IM Kerr, Eur.J.
Biochem.), 84-, 149 (1978);
Fuerel, G., C., Sen., M., F., Doubois, L., Rattner, E., Slattari,
And, P, Lengyel, Prok, Natl, Akado, Sai, USA (JPFarrer, GC
Sen, M.F.Dubois, L. Ratner, E. Slattery, and
P.Lengyel, Proc.Natl.Acad.Sci.USA ), 75~,
5893 (1978); LA Ball, Virology , 94-, 282 ( 1979 )],
In the presence of double-stranded RNA, 2'-5'-linked oligoadenylates (2-5As) obtained from ATP by (2'-5')An synthase are responsible for the antiviral effects of interferon [Review]. :P, Lengyel, Anyu, Rev, Biochem. (Reviews: P.Lengyel,
Annu.Rev.Biochom.), 51-, 251 (1982);
Sea, Sen, Prog, Nucleotsacaid Res, Mol, Biol. (GCSen, Prog.Nucleic
Acid Res.Mol.Biol.), 27-, 105 (1982)] and growth inhibitory effect [I. Gretzser, &M. Tobii, Biochem. Biophys. Acta (I.Gresser and M.Tovey, Biochem.Biophys.
Acta), 516, 231 (1978)], and is a biochemically important substance. Among these substances, trimmer
A2′P5′A2′P5′A (2-5A core) inhibits concanavalin A-stimulated DNA synthesis in mouse splenocytes at subnanomolar (nm) concentrations {A. Kimchi, naughty. Schuur, &M. Level, Nature (London) [A.
Kimchi, H. Shure, and M. Revel, Nature
(London)], 282-, 849 (1979)}, but also inhibits the intraluminal translation system and protein biosynthesis in living mammalian cells . Nucleic acid, and, enzyme (in Japanese) [J.Imai and PFTorrence, Protein,
Nucleic Acid, and Enzyme (in Japanese)]
28-, 801 (1983); I, M., Kale, &.
IMKerr and RE
Brown, Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 75-, 256
(1978); LA Ball and CN
White, ibid. ), 75-, 1167 (1978); B. R., G., Williams, &.
Kale, Nathya (London) [BRG
Williams and IM Kerr, Nature (London) ],
276-, 88 (1978) ;
E. Meurs, and L. Montagnier, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA), 76-, 3261 (1979)} 5'-O-triphosphate, i.e.
ppp5′A2′p5′A2′p5′A also acts as a potent inhibitor of extracellular protein biosynthesis (see above). 5′-O-monophosphate, i.e.
p5′A2′p5′A2′p5′A antagonizes the inhibitory effect of ppp5′A2′p5′A2′p5′A [ P. , Natol, Akado, Sai, USA (PFTorrence, J.Imai, and MIJohnston,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 78-, 5993 (1981)].
Furthermore, recent research has revealed that certain 2-5A analogs whose 2' ends are modified with artificial nucleosides significantly enhance biological activity. J.Imai, MIJohnston, and PF
Torrence, J. Biol. Chem. ), 257-, 12739 (1982)] Thus, these studies have led to the provision of large amounts of 2-5A derivatives in order to overcome the limited variety and supply amount of the derivatives in vivo. can,
Furthermore, it is desired to develop effective chemical synthesis methods that can supply various artificial analogues that are expected to provide new therapeutic methods for viral infections. The basic reaction for chemically synthesizing oligonucleotides including 2-5A analogs is phosphorylation of nucleosides. In order to facilitate this reaction, two methods can be considered in principle: activation of the phosphorylating agent, which is an electrophile, or activation of a nucleoside, which is a nucleophile, as shown in the reaction formulas below. . [C] [C] In the nucleic acid-related field, attention has been focused on the development of phosphorylating agents (phosphorylating agents) having strong phosphorylation ability for a long time.
As a result, a mixed acid anhydride of sulfonic acid and phosphoric acid was discovered, and this reagent is currently widely used for nucleotide synthesis. However, when this phosphorylating agent is used, its action is too strong, and phosphorylation occurs on the nitrogen atom of the nucleobase (the nitrogen atom of the amino group) rather than on the oxygen atom of the nucleoside (the oxygen atom of the hydroxyl group).
In order for the reaction to proceed faster, it was necessary to protect the amino group of the nucleobase in advance.
Additionally, in the reaction, either the phosphorylating agent or the nucleoside had to be used in excess, and the sulfonic acid derivatives (sulfonylchlorides, snlfonolides) required for activation were extremely expensive [Mizuno, ethos.・R, The Synthesis of Nucleosides, And, Nucleotides (Mizuno et al, The
Synthesis of Nucleosides and Nucleotides),
69-239 (1977); Tenner, G.M. , Journal of the American Chemical Society (Tener, GM, Journal of the American
Chemical Society), 83-, 159 (1961)] In contrast, mild phosphorylating agents such as phosphorochloridate or p-nitrophenyl phosphate were discovered. These reagents are preferred because they are inexpensive. However, the reaction time was long and strong reaction conditions were required, and the yield of the target compound was low. On the other hand, as shown by the following formula: ([Formula] PNP=-C 6 H 4 -p -NO 2 ), sodium alkoxides of nucleotides having p-nitrophenol as a leaving group and other nucleotides A method of synthesizing internucleotides by reacting with [Skaric V. et al, Croatica Chemica Acta] is known.
Chemica Acta), 49 , 851 (1977)] However, this method requires extremely strong reaction conditions, and there are only reports using uracil nucleoside or thymine nucleoside; There are no reports regarding nucleosides. [Object of the Invention] An object of the present invention is to provide a method for easily and selectively phosphorylating nucleosides or nucleotides to produce phosphoric acid derivatives without causing the above-mentioned drawbacks. The object of the present invention is to provide a method by which oligo(poly)nucleotides can be easily produced under mild conditions. [Summary of the Invention] As shown by the following formula: It was thought that O-selective activation was achieved due to the shift, and that an O-phosphorylated product was selectively obtained. Generally, bond dissociation energy provides one measure of the affinity between atoms. Data regarding nitrogen are currently unknown, but magnesium is believed to have a greater affinity for oxygen than nitrogen. Bond dissociation energy (KJmol -1 ) Mg-O: 393.7±35 [PJ Dagdigian et al, The Journal of Chemical Physics
Chomical Physics), 62 , 1824 (1975); A.
, AGGaydon, Dissociation Energy
Energies and Spectra of Diatomic
Molecules), (1968)] Based on the above speculation, the present inventors completed the present invention by treating a nucleoside or nucleotide with a Grignard reagent and then phosphorylating it. In the production method of the present invention, a nucleoside in which the hydroxyl group at the 2' or 3' position is phosphoric acid esterified,
Nucleoside, nucleotide or oligo(poly) having OMgX 1 group (X 1 represents a halogen atom)
2′→ characterized by reacting nucleotides
This is a method for producing 5′-linked or 3′→5′-linked oligo(poly)nucleotides. Nucleoside used in the present invention means ribonucleoside or deoxyribonucleoside. Hereinafter, this reaction will be explained in the case where a 2'-5' linked oligoribonucleotide is synthesized using a ribonucleoside or its derivative as a nucleoside, but the present invention also applies to other hydroxyl group-containing compounds. It is possible to phosphorylate a hydroxyl group by a method. In this reaction, the hydroxyl group at the 2'-position is activated by reacting a Grignard reagent with a ribonucleoside formed by protecting the hydroxyl groups at the 3'- and 5'-positions with a desired protecting group to form magnesium alkoxide, and then the hydroxyl group at the 2'-position is activated. Let the curing agent act. A typical example of this reaction is, for example, the following formula: [In the formula, R 2 represents an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms or a substituted or unsubstituted aryl group; R 5 and
R 6 may be the same or different and each represents a hydroxyl protecting group; X 2 represents a halogen atom or a substituted or unsubstituted aryloxy group. The above reaction is also applicable to phosphorylation of the 3'- or 5'-position hydroxyl group of ribonucleosides or deoxyribonucleosides. In formulas 1 to 2, B is a purine base of adenine (Ade), guanine (Gua) or a derivative thereof; cytosine (Cyt), uracil (Ura), thymine (Thy)
or represents a pyrimidine base of these derivatives. In the present invention, O-selective sulforylation can be performed without protecting the amino group and imide group of the nucleobase, so even if the nucleoside is an N-unprotected nucleobase, only the hydroxyl group can be selectively phosphorylated. Can be oxidized. Furthermore, in the formula, the protecting groups R 5 and R 6 are not particularly limited as long as they are ordinary protecting groups for protecting a hydroxyl group. As R 5 , for example, MMTr[p-
CH 3 OC 6 H 4 (C 6 H 5 ) 2 C], DMTr [(p-CH 3 OC 6
H 4 ) 2 C 6 H 5 C], and most preferably
It is MMTr. As R 6 , for example, TBDMS (t
−C 4 H 9 (CH 3 ) 2 Si), (C 2 H 5 ) 3 Si, (C 6 H 5 ) 2 CH 3 Si,
CH 3 CO, C 6 H 5 CO and the like are preferred, and silyl protecting groups are more preferred. Examples of Grignard reagents include compounds represented by the following formula: R 1 M g X 1 (wherein R 1 represents an alkyl group having 1 to 9 carbon atoms; X represents a halogen atom). Examples of the alkyl group for R1 include methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, n-hexyl, n-heptyl, n-octyl, Examples include n-nonyl, but tert-butyl is most preferred. Further, examples of the halogen atom for X 1 include a chlorine atom, a bromine atom, an iodine atom, and the like, but a chlorine atom is most preferred. In addition, in the present invention, a Grignard reagent in which R 1 is an aryl group may be used. Here, the aryl group includes, for example , C6H5- , o- CH3C6
H 4 −, p-CH 3 C 6 H 4 −, 2,6- [(CH 3 ) 3 C] 2
Examples thereof include C6H3- , p- CH3OC6H4- , 2-naphthyl, and the like. Specific examples of the Grignard reagents listed above include CH 3 M g Br, CH 3 M g I, C 2 H 5 M g
Br, i-C 3 H 7 M g Cl, i-C 3 H 7 M g Br, n-C 49
M g Cl, t-C 4 H 9 M g Cl, C 6 H 5 M g Br, 2, 4, 6
-(CH 3 ) 3 C 6 H 2 M g Cl, etc., among which t-C 4 H 9 M g Cl, C 6 H 5 M g Br, 2,4,6
- ( CH3 ) 3C6H2MgBr is preferred . Examples of the phosphorylating agent include compounds represented by the following formula: (R 2 O) 2 POX 2 (wherein R 2 and X 2 are each as defined above). Number of carbons in R 2 is 1
-10 alkyl groups include, for example, methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, n-
Butyl group, t-butyl group, n-pentyl group, n-
hexyl group, n-heptyl group, n-octyl group,
Examples include n-nonyl group, n-decyl group, etc.
Most preferred are methyl group and ethyl group. Examples of the substituted or unsubstituted aryl group for R2 include o- ClC6H4- , C6H5- , p - NO2C6H4- , 2
-Cl-4-NO 2 C 6 H 3 - etc., but C 6 H 5
-, and o- ClC6H4- are preferred . Examples of the halogen atom for X 2 include a chlorine atom and a fluorine atom, and a chlorine atom is most preferred. X2
Examples of the substituted or unsubstituted aryloxy group include o - ClC6H4O- , p - NO2C6H4O- , 2,4
- ( NO2 ) 2C6H6O- , 2 - Cl -4 - NO2C6H3-
etc., but 2-Cl-4-NO 2 C 6 H 3 -O
-, P - NO2C6H4O- , 2,4- ( NO2 ) 2C6H3
O- etc. are preferred. Specific examples of phosphorylating agents include ( C2H5O ) 2POCl , ( C2H5O ) 2PO ( OC6H3-2,4 - NO2 ), ( o-
ClC 6 H 4 O) 2 POCl, (o-ClC 6 H 4 O) 2 PO(OC 6 H 3 -2-Cl-4-
NO 2 ), (C 2 H 5 O) 2 PO (OC 6 H 4 -p-NO 2 ), (C 2 H 5 O) 2 PO (OC 6 H 3 -2-Cl-4-NO 2 (C 6 H 5 O) 2 POCl, (C 6 H 5 O) 2 PO (OC 6 H 4 -p-
NO2 ), ( C6H5O ) 2PO ( OC6H3-2,4- ( NO2 ) 2 ) , ( C6H5O ) 2PO ( OC6H3-2 - Cl-4 -NO2 ), (o- ClC6H4O )(p- NO2 -C6H4O ) POCl
Among these, (C 2 H 5 O) 2
POCl, (C 6 H 5 O) 2 POCl, (o-ClC 6 H 4 O) 2 POCl, (C 2 H 5 O) 2 PO(OC 6 H 3 -2-Cl-4-NO 2 ), ( C6H5O ) 2PO ( OC6H3-2 - Cl- 4 - NO2 ), (C2H5O) 2PO ( OC6H3-2,4- ( NO2 ) 2 ) , (o-ClC6H4O ) (p- NO2 - C6H4O ) POCl , ( C6H5O ) 2PO ( OC6H3-2,4- ( NO2 ) 2 ), etc. preferable. This reaction is carried out in a solvent. Usable solvents include, for example, ether solvents such as tetrahydrofuran (THF), ether (diethyl ether), and dimethoxyethane; amide solvents such as dimethylformamide (DMF); and halogenated hydrocarbon solvents such as dichloromethane. In this reaction, a Grignard reagent is first added to the reaction system, the reaction is allowed to proceed for several minutes to several tens of minutes, and then a phosphorylating agent is added without isolating the produced magnesium alkoxide to obtain the target compound. The amount of Grignard reagent used is usually 1 to 2 equivalents per 1 equivalent of the hydroxyl group of the nucleoside. The amount of the phosphorylating agent used is usually 1 to 1.4 equivalents per equivalent of the hydroxyl group of the nucleoside.
Preferably it is 1.1 to 1.2 equivalents. The reaction temperature is usually 0 to 60°C, preferably 15 to 25°C, and the reaction time (total time of the above two reactions) is usually 0.5
~24 hours, preferably 1 to 6 hours. After the above reaction is completed, the triester compound can be obtained by, for example, extracting the target product from the reaction mixture, drying and concentrating it, and subjecting the resulting residue to column chromatography. . Next, in the present invention, the triester body 2~ obtained from the above reaction is reacted with a bonucleoside 3~ (magnesium alkoxide) treated with a desired Grignard reagent. A typical example of this reaction is, for example,
It is represented by the following formula: In this reaction, triester form 2~ obtained in the above reaction can be reacted with second ribonucleoside component 3~ without isolation and purification; Acts as a phosphorylating agent for 3~. Here, the second ribonucleoside component is the desired ribonucleoside 3~ treated with the Grignard reagent in the same manner as in the above reaction, and the ribonucleoside 3~ is the final product of the above reaction, the triester body 2~ Usually 0.7 to 1.4 equivalents per equivalent of phosphoric acid group,
Preferably 0.9 to 1.2 equivalents are added. This reaction is
It is carried out in the same solvent as above, and the reaction temperature is usually 15
The temperature is ~60°C, preferably 25-30°C, and the reaction time is usually 1-30 hours, preferably 1.5-24 hours.
This reaction yields an internucleotide, which is a phosphoric acid derivative, and this substance can be isolated according to conventional methods as described above. In addition, in order to further subject the phosphoric acid derivative obtained in the present invention to the reaction described later, it is necessary to remove the protecting group R 5 . When R 5 is a trityl protecting group such as MMTr or DMTr, acetic acid, monochloroacetic acid, dichloroacetic acid, trichloroacetic acid, trifluoroacetic acid,
Deprotection can be performed using zinc bromide or the like. According to the method of the present invention, there is no need to protect the nucleic acid base in either of the two reaction steps described above, and the three components can be prepared by simply adding the first and second nucleoside components and the phosphorylation agent to the reaction system in sequence. This provides a rapid and convenient method for forming internucleotide bonds. The present invention can be loaded with yet another step. That is, a Grignard reagent is allowed to act on the 5'-0 deprotected product 5- of compound 4-, and then an activated phosphoric acid ester such as the compound 2- is again allowed to act as a phosphorylating agent. A typical example of this reaction is represented by the following formula: This reaction can be carried out under substantially the same conditions as the reaction in the first step. Furthermore, oligonucleotides or polynucleotides can be synthesized by further repeating the second step. To deprotect compounds 6~ to obtain triribonucleoside phosphates, the protecting groups R 2 , R 5 and R 6 are
Depending on the type, conventionally known methods can be adopted as appropriate. However, in order to deprotect compounds 6~ in which R 5 is a trityl-based protecting group, R 6 is a silyl-based protecting group, and R 2 is a hydrocarbon group, it is preferable to use the following new method. That is, first, the R 5 group is eliminated using an acetic acid compound as described above. Then, 1,1,3,3-tetramethylguanidium, syn -4-nitrobenzaldoximate (NBO) [C.
Tetrahedron Letter (CBReese, RC
Titmas, and L. Yau, Tetrahedron Lett. ),
2727 (1978)] and usually in a solvent such as H 2 O-dioxane (1:1, volume ratio), e.g. at 25-28°C.
Incubate for 18 to 22 hours. Thereafter, the R 2 group is eliminated by reacting with an amine base such as ammonia at, for example, 25 to 28°C for 2 to 3 hours. Finally, the R6 group is eliminated by reacting with tetrabutylammonium fluoride (TBAF), hydrofluoric acid, hydrogen fluoride-pyridine complex, etc. for usually 16 to 20 hours. This gives a triribonucleoside diphosphate represented by the following formula: [Formula]. Note that even in the case of the compounds represented by formulas 4 to 4 above, diribonucleoside phosphates can be obtained by deprotection using the above method. Now, the triribonucleoside diphosphates 6 to 6 can be obtained according to the present invention, and in order to further monophosphorylate this compound at the 5' end, the following method can be used, for example. [Chemical structure] [Chemical structure] In the above reaction, first, the protecting group in formula 6~
Compounds 8~ formed by eliminating R 5 are treated in the presence of a tertiary amine, a phosphite oxidizing agent (R 7 O) 2 PX 3 . In this phosphorous oxidizing agent, R 7 is:
Examples include trichloroethyl, ethyl, methyl, phenyl, o-chlorophenyl, p-chlorophenyl, and the like, and among these, trichloroethyl is the most preferred. Moreover, examples of X 3 include a chlorine atom, a p-nitrophenoxy group, and the like, but a chlorine atom is most preferable. On the other hand, tertiary amines include 2,6-lutidine, pyridine,
Examples include imidazole, triethylamine, diisopropylethylamine, and preferably 2,6-lutidine, imidazole, and diisopropylethylamine. This reaction is usually carried out in the amine itself or in a solvent such as tetrahydrofuran or dichloromethane at, for example, -78°C for 1 to 2 hours. Next, the obtained compounds are treated with an oxidizing agent to give compounds 9-. Examples of the oxidizing agent used here include iodine, nitrogen dioxide, metachlorobenzoic acid, etc., but iodine and nitrogen dioxide are preferable. This reaction is usually carried out in a solvent such as water, tetrahydrofuran, dichloromethane, etc.
It is carried out for 10-20 minutes within a temperature range of ~28 °C. Finally, the obtained compounds 9~ are treated with a reducing agent,
Compound 10~ Examples of the reducing agent used here include zinc-copper alloy, zinc-silver alloy, and the like. This reaction is usually carried out in a solvent such as N,N-dimethylformamide at a temperature of, for example, 55 to 60°C for 1 to 6 hours. Protecting group R 2 of compound 10 ~ obtained by the above reaction
The method for eliminating R 6 and R 6 is the same as described above. By this deprotection, 5'-O-monophosphates 11~ shown in the following formula are obtained. [Chemical formula] In addition, from 5'-O-monophosphate 11 to 5'-
O-triphosphates 12~ can be obtained by known methods [Etsch, Sawai,
Tei. Shibata, And, M. Ohno, Tetrahedron Letter (H.Sawai, T.Shibata, and M.
Ohno, Tetrahedron Lett. ), 4573 (1979) ;
H.Schaller, and HAStaab, Chem.Ber. ),
94~, 1612 (1961); Etsuchi, Shearer, Etsuchi,
H. Schaller, HAStaab, and F. Gramer,
ibid.), 94-, 1621 (1961) ;
(F. Cramer and H. Neunohoeffer, ibid. ),
95~, 1664 (1962); DEHoard and DGOtt, J.Am.
Chem.Soc.), 87-, 1785 (1965)] [Effects of the Invention] According to the method for producing phosphoric acid derivatives of the present invention, the following advantages can be obtained. (1) Since protection of the amino groups of all nucleobases is not required, inexpensive N-unprotected nucleosides can be used. (2) In the first invention, by using a bifunctional phosphorylating agent, the reaction with the first nucleoside can produce an intermediate active for condensation with the second nucleoside alkoxide. Moreover, this intermediate can be used as a phosphorylating agent for adding a third nucleoside in the second invention. Therefore, expensive condensing agents such as sulfonyl chloride and sulfonylamide, which are commonly used in conventional methods, are not required for internucleotide bond formation. (3) As a result, there is no concern about side reactions (sulfonylation to the nucleobase moiety) that are often observed in the phosphorylation of thymidine or guanosine by conventional methods. (4) The active synthetic intermediates mentioned in (2) do not need to be purified. That is, all internucleotide bond forming reactions can be performed within the same flask. Unlike the conventional triester method, which required purification of the nucleoside phosphoric acid diester as a synthetic intermediate, the experimental procedure is simple. (5) Artificial analogs of various oligos or polynucleotides having arbitrary nucleobases can be produced. The phosphorylation method of the present invention having the above-mentioned advantages can be applied, for example, to nucleic acid chemistry, particularly genetic engineering,
In the fields of organic synthetic chemistry and agrochemical chemistry,
Useful for the synthesis of oligo or polynucleotides for the purpose of genetic manipulation, organic synthesis reactions using organometallic complexes, especially the synthesis of phosphoric acid compounds as ligands for catalysts in catalytic reactions, and as a means of synthesizing effective agricultural chemicals containing phosphorus. It is. [Examples of the invention] Example 1 Synthesis of active phosphoric acid ester 2 3'-O-t-butyldimethylsilyl-5'-O-
p-methoxytrityladenosine 1~ (1.17g,
A solution of 0.58 M t-butylmagnesium chloride in THF (3.10 ml,
1.79 mmol) was added at room temperature (18°C). After stirring at the same temperature for 5 minutes, the reaction mixture was stirred at 18° C. for 15 minutes under argon gas.
p-Nitrophenyl phosphorochloridate (0.62
g, 1.79 mmol) in THF (10 ml).
The mixture was stirred for a further 2 hours at 18°C. This solution was used as a phosphorylating agent for internucleotide bond formation without further purification. o-chlorophenyl 3'-O-t-butyldimethylsilyladenylyl (2'→5')-2',3'-O-bis(t-butyldimethylsilyl)adenosine 5~ <Addition of DMF>2',3'-O-bis(t-butyldimethylsilyl)adenosine (0.799g, 1.61mmol) in THF
(8 ml) solution at room temperature (18°C) with 0.58 M t-chloride.
Butylmagnesium THF solution (2.78ml,
1.61 mmol) was added. After stirring for 5 minutes, the active phosphoric acid ester 2 obtained in the above reaction was added to this solution.
A THF solution (28 ml, 1.79 mmol) was added, followed by DMF (6 ml) at the same temperature. After stirring at room temperature for 12 hours, the reaction mixture was dissolved in dichloromethane (150 ml).
and poured into saturated saline (100ml). The resulting emulsified mixture was centrifuged (2000 rpm
5mim), and dichloromethane (50ml x 2,30ml).
ml×2). The combined organic layers were dried over magnesium sulfate and concentrated, and the resulting yellow gum (3.2 g) was dissolved in dichloromethane (50 ml).
Dichloroacetic acid (4 ml) was added to this solution at 18°C,
The mixture was stirred for 2 hours. A mixture of dichloromethane (50ml) and saturated aqueous NaHCO3 (50ml) was added to the reaction mixture. The aqueous layer was dichloromethane (30ml×
2). Saturate the combined organic layers with NaHCO3
It was washed with water (30 ml) and saturated brine (30 ml) and dried over magnesium sulfate. The gummy material (2.5 g) obtained by concentration was subjected to silica gel (30 g) column chromatography (diameter 2.5 cm x length 20 cm). Methanol-chloroform (1:50-1:
20), the amorphous title compound (1.18 g, 70
%, a 1:1 mixture of diastereomers). Rf (MeOH=CHCl 3 =1:10, SiO 2 )=0.31 1 HNMR (CDCl 3 ) See Figure 1 IR (CHCl 3 ) 3500, 3400 (NH 2 ), 1290 (P=O)
cm -1 UV (MeOH) λ nax = 260.1 nm HPLC [ODS (Develosil) 5 μ, H 2 O-MeOH =
1:10, 260nm, 1mlmim -1 , 12℃] T R = 22.45, 24.31mim Anal.Calcd for C 44 H 70 ClN 10 O 10 PSi 3 :C,
50.34; H, 6.72; N, 13.34.Found: C, 49.76;
H, 6.65; N, 13.48. <Addition of N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine> Instead of DMF, add N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine (6 equivalents to Grignard reagent). ) was used, but the reaction was carried out in the same manner as above. After stirring at room temperature (14°C) for 96 hours, the title compound was obtained in a yield of 76% by similar operations and purification. Di-o-chlorophenyl 3'-O-t-butyldimethylsilyladenylyl (2'→5')-3'-O-
t-Butyldimethylsilyladenylyl-(2'→
5') -2',3'-O-bis(t-butyldimethylsilyl)adenosine 8 ~ Dry over P2O5 under reduced pressure (1 mmH g , 50 °C) and sieve with molecular sieves at room temperature for 48 h. 4A powder (300mg
dinucleoside phosphate 5 (1.15 g,
1.09 mmol) in THF solution (10 ml) at 25 °C.
A 0.65M solution of t-butylmagnesium chloride in THF (2.4ml, 1.56mmol) was added and the mixture was stirred for 5 minutes. A THF (26 ml) solution of activated phosphoric acid ester 2 (1.65 mmol) obtained in the above reaction was added to this mixture, and then DMF (6 ml) was added at 25°C. After stirring the heterogeneous mixture at room temperature for 34 hours, chloroform (300 ml), 1.3 M ammonia-ammonium chloride buffer (PH10, 150 ml) and EDTA.2Na
Aqueous solution (0.3M, 150ml) was added. The resulting emulsified mixture was centrifuged (3000 rpm x 5 mm).
The aqueous layer was extracted with chloroform (80ml x 3). The combined organic layers were washed with EDTA/2Na aqueous solution (100 ml) and saturated brine (50 ml), and dried over magnesium sulfate. Concentrate to obtain a rubbery substance (3.4 g),
This was dissolved in dichloromethane (160ml) and dichloroacetic acid (8ml) was added to the solution at 0°C. After stirring for 2 hours, the mixture was added with saturated NaHCO 3 water (160 ml).
added. Saturate the organic layer with NaHCO3 water (40 ml x 2)
and washed with saturated saline (40 ml). After drying over magnesium sulfate, the organic layer was evaporated to give a gum (2.6 g). Using water-methanol (1:6-1:30) as the eluent, column chromatography (2.5 x 50 cm) was performed on ODS gel (Fuji Davison Co., Ltd. Q3, 30-50 μ, 80 g). The title compound was obtained as amorphous in 63% yield (1.10 g, diastereomeric mixture). 11% starting material
(127 mg) was recovered. R f (MeOH:CHCl 3 = 1:8, SiO 2 ) = 0.4 (H 2 O: MeOH = 1:20, expanded twice, ODS)
=0.23 1 HNMR (CDCl 3 ) See Figure 2 3480, 3400,
3320 (NH 2 ), 1290 (P=O) cm -1 UV (MeOH) λ nax = 260.5 nm HPLC [ODS (Developosil) 5μ, H 2 O-MeOH=
1:75, 260nm, 1mlmim -1 , 12℃] T R = 16.58, 17.78, 18.91, 20.45mim Anal, Calcd for C 66 H 99 Cl 2 N 15 O 16 P 2 Si 4 :C,
49.43;H, 6.22;N, 13.10, Found:C,
49.41; H, 6.23; N, 12.99, Example 2 o-chlorophenyl 3'-O-t-butyldimethylsilyladenylyl (2'→5')-2',3'-O-
Bis(t-butyldimethylsilyl)cytidine 5-2′,3′-O-bis(t-butyldimethylsilyl)cytidine (736 mg, 1.56 mmol) in THF (2
ml) of 0.26M t-butylmagnesium chloride to the solution
Add THF solution (6 ml, 1.56 mmol) at 25°C,
After stirring for a minute, the active triester 2~
(1.53 mmol) in THF (10 ml) was added. DMF (5 ml) was added thereto, and the mixture was stirred at 25°C for 16 hours.
The reaction mixture was poured into a mixture of dichloromethane (30ml) and saturated brine (90ml). The resulting emulsion was separated by centrifugation. Drain the aqueous layer in dichloromethane (30 ml).
x3), and the combined organic layers were dried over magnesium sulfate and concentrated. The obtained residue was dissolved in dichloromethane (25 ml), dichloroacetic acid (3 ml) was added, and the mixture was stirred at 25°C for 2 hours. Saturate the reaction mixture
It was neutralized with NaHCO3 water (30 ml), and the organic layer was washed with saturated brine (10 ml x 2) and dried over magnesium sulfate. The residue obtained by removing the solvent was subjected to silica gel column chromatography (3 x 20 cm) and eluted with methanol-chloroform (1:15 to 1:10) to obtain the title compound (1.01 g, 63%). Also, 11% of starting material was recovered. Di-o-chlorophenyl 3'-O-t-butyldimethylsilyladenylyl (2'→5')-3'-O-
t-Butyldimethylsilylaldenyl-
(2′→5′)-2′,3′-O-bis(t-butyldimethylsilyl)cytidine 8~ 3′-O-t-
Butyldimethylsilyladenylyl-(2′→5′)-2′
，
To a solution of 3'-O-bis(t-butyldimethylsilyl)cytidine 5~ (1.0 g, 1 mmol) in THF (6 ml)
A THF solution (3.85 ml, 1 mmol) of 0.26 M t-butylmagnesium chloride was added at 25°C, and after stirring for 5 minutes, active triester 2 ~ (1 mmol) in THF was added.
(10ml) solution was added and stirred for 14 hours. The reaction mixture was dichloromethane (30ml) and saturated brine (90ml).
mixture and the resulting emulsion was separated by centrifugation. The aqueous layer was extracted with dichloromethane (30ml x 3), and the combined organic layers were dried over magnesium sulfate and concentrated. The obtained residue was dissolved in dichloromethane (25 ml), dichloroacetic acid (3 ml) was added, and the mixture was heated at 25°C for 2 hours.
Stir for hours. The reaction mixture was neutralized with saturated NaHCO3 water (30 ml) and the organic layer was dissolved in saturated brine (10 ml).
and dried over magnesium sulfate. The oil obtained by removing the solvent was subjected to silica gel column chromatography (3 x 25 cm) and eluted with methanol-chloroform (1:5 to 1:2) to obtain the title compound (363 mg, 23%). Example 3 o-chlorophenyl 3'-O-t-butyldimethylsilyladenylyl (2'→5')-2',3'-O-
Bis(t-butyldimethylsilyl)guanosine 5-2′,3′-O-bis(t-butyldimethylsilyl)guanosine (798 mg, 1.52 mmol) in THF (2
ml) of 0.26M t-butylmagnesium chloride to the solution
Add THF solution (11.7ml, 3.04mmol) at 25℃,
After stirring for 5 minutes, the active triester 2~
(1.52 mmol) in THF (10 ml) was added. DMF (5 ml) was added thereto and stirred at 25°C for 24 hours. The reaction mixture was poured into a mixture of dichloromethane (30ml) and saturated brine (90ml). The resulting emulsion was separated by centrifugation. The aqueous layer was dichloromethane (30ml×
3), and the combined organic layers were dried over magnesium sulfate and concentrated. Dissolve the obtained residue in dichloromethane (30 ml) and add dichloroacetic acid (3.5 ml).
The mixture was stirred at 25°C for 2 hours. Saturate the reaction mixture
It was neutralized with NaHCO3 water (40 ml), and the organic layer was washed with saturated brine (10 ml x 2) and dried over magnesium sulfate. The residue obtained by removing the solvent was subjected to silica gel column chromatography (60 g, 3 x 20 cm),
Elution with methanol-chloroform (1:4 to 1:2) gave the title compound (794 g, 49%). Also, 27% of the starting material was recovered. Di-o-chlorophenyl 3'-O-t-butyldimethylsilyladenylyl (2'→5')-3'-O-
t-Butyldimethylsilylaldenyl-
(2′→5′)-2′,3′-O-bis(t-butyldimethylsilyl)guanosine 8~ 3′-O-t-
Butyldimethylsilyladenylyl-(2′→5′)-2′
，
To a solution of 3'-O-bis(t-butyldimethylsilyl)guanosine 5~(1.07 g, 1 mmol) in THF (2.6 ml) was added 0.26 M t-butylmagnesium chloride in THF.
The solution (7.69 ml, 2 mmol) was added at 25°C, stirred for 5 minutes, and then the active triester 2 (1 mmol) was added.
A THF (10 ml) solution was added and stirred for 20 hours. The reaction mixture was poured into a mixture of dichloromethane (30 ml) and saturated saline (90 ml), and the resulting emulsion was separated by centrifugation. The aqueous layer was dichloromethane (30ml×
3), and the combined organic layers were dried over magnesium sulfate and concentrated. The obtained residue was dissolved in dichloromethane (25 ml), dichloroacetic acid (3 ml) was added,
The mixture was stirred at 25°C for 2 hours. Saturate the reaction mixture
Neutralized with aqueous NaHCO 3 (30 ml), the organic layer was washed with saturated brine (10 ml) and dried over magnesium sulfate. The oil obtained by removing the solvent was subjected to silica gel column chromatography (3 x 25 cm) and eluted with methanol-chloroform (1:4 to 1:2).
The title compound (502mg, 31%) was obtained. Example 4 o-chlorophenyl 3'-O-t-butyldimethylsilyladenylyl (2'→5')-2',3'-O-
Bis(t-butyldimethylsilyl)uridine 5-2′,3′-O-bis(t-butyldimethylsilyl)uridine (723 mg, 1.53 mmol) in THF (2
ml) of 0.26M t-butylmagnesium chloride to the solution
THF solution (11.76ml, 3.06mmol) was added at 21℃,
After stirring for 5 minutes, the activated triester 2
(1.53 mmol) in THF (10 ml) was added. DMF (5 ml) was added thereto and stirred at 25°C for 21 hours. The reaction mixture was poured into a mixture of dichloromethane (30ml) and saturated brine (90ml). The resulting emulsion was separated by centrifugation. The aqueous layer was dichloromethane (30ml×
3), and the combined organic layers were dried over magnesium sulfate and concentrated. Dissolve the obtained residue in dichloromethane (25 ml) and add dichloroacetic acid (3 ml).
The mixture was stirred at 25°C for 2 hours. Saturate the reaction mixture
It was neutralized with NaHCO3 water (30 ml), and the organic layer was washed with saturated brine (10 ml x 2) and dried over magnesium sulfate. The residue obtained by removing the solvent was subjected to silica gel column chromatography (3 x 20 cm) and eluted with methanol-chloroform (1:6 to 1:3) to obtain the title compound (534 g, 52%). Also, 27% of the starting material was recovered. Di-o-chlorophenyl 3'-O-t-butyldimethylsilyladenylyl (2'→5')-3'-O-
t-Butyldimethylsilylaldenyl-
(2′→5′)-2′,3′-O-bis(t-butyldimethylsilyl)uridine 8~ 3′-O-t-
Butyldimethylsilyladenylyl-(2′→5′)-2′
，
To a THF (2.5 ml) solution of 3'-O-bis(t-butyldimethylsilyl)uridine 5~ (1.03 g, 1 mmol) was added a THF solution (7.69 ml, 2 mmol) of 0.26 M t-butylmagnesium chloride at 25°C. After stirring for 5 minutes, active triester 2 (1 mmol) in THF
(10ml) solution was added and stirred for 20 hours. The reaction mixture was dichloromethane (30ml) and saturated brine (90ml).
mixture and the resulting emulsion was separated by centrifugation. The aqueous layer was extracted with dichloromethane (30ml x 3) and the combined organic layers were dried over magnesium sulfate and concentrated. The obtained residue was dissolved in dichloromethane (25
ml), add dichloroacetic acid (3 ml) and stir at 25°C.
The mixture was stirred for 2 hours. Saturate the reaction mixture
Neutralized with aqueous NaHCO 3 (30 ml), the organic layer was washed with saturated brine (10 ml) and dried over magnesium sulfate. The oil obtained by removing the solvent was subjected to silica gel column chromatography (3 x 25 cm) and eluted with methanol-chloroform (1:6 to 1:2) to obtain the title compound (458 mg, 29%). Reference example 1 Di-o-chlorophenyl 5'-O-bis(2,
2,2-trichloroethyl)phosphoryl-3'-
O-t-butyldimethylsilyladenylyl-
(2′→5′)-3′-O-t-butyldimethylsilyladenylyl-(2′→5′)-2′,3′-O-bis(t
-butyldimethylsilyl)adenosine 10~ To a solution of trinucleoside phosphate 8~ (320.4 mg, 0.20 mmol) obtained in Example 1 and 2,6-lutidine (128.6 mg, 1.20 mmol) in THF (3 ml) -78 Bis(2,2,2-trichloroethyl)phosphorochloridate (123 μl, 0.60 mmol) at °C
added. After stirring for 1 hour at the same temperature, the mixture was mixed with ether (10 ml) and saturated NaHCO 3 water (1:5,
6 ml). A solution of iodine (0.22 g, 0.90 mmol) in ether (5 ml) was added to the mixture at room temperature. After stirring for 15 minutes, the mixture was diluted with 0.5MNa2
Shake with S2O4 solution ( 10ml ). The separated aqueous layer was extracted with dichloromethane (10ml x 2). The combined organic layers were washed with saturated brine (5 ml), dried over magnesium sulfate, and concentrated to a gum (0.60 g).
I got it. The title compound (312.6 mg, 80 cm) was subjected to silica gel column chromatography (12 g, 1.2 x 18 cm) and eluted with methanol-ethyl acetate (1:60-1:50) and methanol-chloroform (1:10). %) was obtained. R r (MeOH:CHCl 3 = 1:10) = 0.38 IR (CHCl 3 ) 3500, 3400 (NH 2 ), 1290 (P=O)
cm -1 UV (MeOH) λ nax = 259.7nm 1 HNMR (CDCl 3 ) See Figure 3 Anal, Calcd for C 70 H 102 Cl 8 N 15 O 19 P 3 Si 4 :
C, 43.19; H, 5.28; N, 10.79.Found: C, 42.38; H, 5.19; N, 10.88. Reference example 2 Synthesis of A2'p5'A2'p5'A (2-5A core, 7~) 0.3M1,1,3,3-tetramethylguanidiniumcin-4-nitroaldoximate (1.5ml)
A water-dioxane (1:1) solution of the trinucleoside diphosphate 8~ (13.5 mg, 8.42 μmol) obtained in Example 1 containing the following was stirred at room temperature (30° C.) for 16 hours. The mixture was evaporated to dryness and 28% ammonia solution (0.5ml) and dioxane (0.5ml) were added. After stirring at room temperature for 10 hours, the mixture was concentrated to a small volume (1 ml) and diluted with water (10 ml). The solution was washed with ether (10 ml) and applied to a Dowex 50W x 8 (pyridinium type) column (15 ml, 2.5 x 5 cm) and eluted with water-ethanol (20+100 ml).
The eluate was evaporated to dryness, a 1M solution of tetrabutylammonium fluoride in THF (1 ml) was added thereto, and the mixture was stirred at room temperature for 36 hours. After removing the solvent, the residue was washed with ether and then dissolved in water. This solution was applied to a DEAE cellulose (HCO 3 -type ) DE-52 column (2.5 x 25 cm) with a linear gradient of 0.01 to
Elution was performed with 0.3M triethylammonium bicarbonate buffer (PH7.6). 2-5A core was obtained as triethylammonium salt. (204OD 260 , 75
%) UV (Et 3 NH +・HCO 3 - buffer, PH7.6) λ nax =
258.5nm HPLC [ODS (Develosil) 5μ, 0.1M KH 2 PO 4
+0.005M n-C 4 H 9 NBr/MeOH=75:25,
260nm, 1mlmim -1 , 40℃〕 TR = 11.96mim Paper electrophoresis (Et 3 NH +・HCO 3 -
buffer, PH7.6 900V) R n =0.69 (5'-AMP=1.00) Reference example 3 Synthesis of pA2'p5'A2'p5'A11~ Trinucleoside diphosphate 8~ (78.0 60 mg, 40 μmol), a mixture of zinc-copper alloy (310 mg, 4.80 mmol) and acetylacetone (0.40 ml, 4.00 mmol) in DMF (1.5 ml).
Stir vigorously for 4.5 hours at °C. The blue-green mixture was diluted with methanol (40ml). Remove the remaining metal and add water (20 ml) and Chelex 100 resin (NH 4
+ type, 30ml) was added. After stirring for 1 hour, methanol (100 ml) was added to the resulting precipitate and filtered.
The resin was further washed with methanol (50ml). N-butanol and acetonitrile were added to the liquid and washing liquid, and azeotropic distillation was carried out to obtain a rubbery substance. residue
0.3M1,1,3,3-tetramethylguanidium
Water containing syn -4-nitroaldoximate
The mixture was dissolved in dioxane (1:1) (10 ml) and stirred at room temperature (26°C) for 18 hours. Add the mixture to water (40
ml), washed with ether (30 ml x 2), and 28% ammonia solution (4 ml) was added to the aqueous layer. After stirring at room temperature for 3 hours, the mixture was diluted with ether (50 ml x 2).
and azeotropic distillation with n-butanol and acetonitrile to obtain an oil. To this was added a solution of 1M tetrabutylammonium fluoride in THF (12 ml). After stirring for 16 hours at room temperature, ATP was added as a standard.
The trimer was found to be obtained in 65% yield using high performance liquid chromatography. The reaction mixture was evaporated to give a gum and diluted with water. This solution is DEAE cellulose ( HCO3 - type)
It was applied to a DE-52 column (2.5 x 25 cm) and eluted with a linear gradient of 0.01 to 0.4M triethylammonium hydrogen carbonate buffer (PH7.6). The trinucleotide was obtained as triethylammonium salt (740OD 260 units, 50%). Enzymatic decomposition of pA2'p5'A2'p5'A11 ~ Trinucleotide (4.78OD 260 ) of the above reaction product and alkaline phosphatase (0.24
30mM Tris-HCl buffer (PH8,
100 μl) was kept at 37°C for 3.5 hours. When the reaction solution was subjected to paper electrophoresis, the product was
Only A2′p5′A2′p5′A7～ was confirmed. 30mM Tris-HCl buffer containing the above reaction product trinucleotide (5.96OD 260 ) and snake venom phosphatase (0.6 units) and 3mM
Equal volume mixture (100 μl) of magnesium chloride solution
Keep at 37°C for 14 hours. When the reaction solution was subjected to paper electrophoresis, only 5'-AMP was confirmed as a product.
【図面の簡単な説明】[Brief explanation of drawings]
第１図は実施例１で得られたジヌクレオシドホ
スフエートのNMRスペクトル図、第２図は同実
施例で得られたトリヌクレオシドジホスフエート
のNMRスペクトル図、第３図は参考例１で得ら
れた5′−Ｏ−モノホスフエート中間体のNMRス
ペクトル図である。
Figure 1 is an NMR spectrum diagram of the dinucleoside phosphate obtained in Example 1, Figure 2 is an NMR spectrum diagram of trinucleoside diphosphate obtained in the same example, and Figure 3 is an NMR spectrum diagram of the trinucleoside diphosphate obtained in Example 1. FIG. 2 is an NMR spectrum diagram of a 5′-O-monophosphate intermediate obtained by