【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
本発明は、一般式
（式中R1は低級アルキル基またはヒドロキシ低
級アルキル基を意味し、R2は水素原子またはア
シルオキシル基を意味する）で表されるグリチル
レチン酸誘導体およびその塩に関するものであ
る。
グリチルレチン酸およびその誘導体には抗アレ
ルギー作用、抗炎症作用、抗潰瘍作用等の薬理作
用があることが知られている。本発明者らは、微
生物による化合物の変換に着目し、更に化学的手
法を組み合せて新規なグリチルレチン酸誘導体を
製造し本発明を完成した。これらの新規誘導体に
は上記の如き薬理作用が期待されるほか、スタフ
イロコツカス アウレウスに対する抗菌活性が認
められ、医薬品としての用途が期待される。
本発明の化合物の製造法を反応式で例示する
と、次の如くである。
（式中R1は低級アルキル基またはヒドロキシ低
級アルキル基を意味し、R2は水素原子またはア
シルオキシル基を意味する）
グリチルレチン酸から後述の参考例に示すよう
にして、微生物変換と化学的手法を組み合せた方
法で調製したグリチルレチン酸のラクトン誘導体
（）を低級アルコール（メタノール、エタノー
ル、ｎ−プロパノール、ｎ−ブタノール等）中或
いはヒドロキシ低級アルコール（エチレングリコ
ール等）中で塩酸を触媒として数時間還流するこ
とにより３，４−セコオレアン−４（23），12−ジ
エン−11−オキソ−３，30−ジオイツク酸（また
はその7β−アセトキシ体）の３−メチルエステ
ル、３−エチルエステル、３−（２−ヒドロキシ
エチル）エステル等がそれぞれ効率良く得られ
る。生成物は、反応液を減圧濃縮した後水を添加
して析出せしめ、これを濾取することにより回収
できる。
本発明の原料として使用する化合物（）は次
式に示す反応で調製される。
（式中R2′は水素原子またはヒドロキシル基を意
味する）
すなわち、グリチルレチン酸（）にチヤイニ
ア アンチビオチカIFO 12246（Chainia antibio
−tica）の培養菌体を触媒としてリン酸緩衝液中
で好気的条件下に反応させるとＡ環の酸化的開裂
および７位のヒドロキシル化反応が起り、化合物
（）、（式中R2′は水素原子またはヒドロキシル
基）が生成す。本菌はこれを例えば培地Ａ（第１
表参照）を用いて、28℃で深部培養すると化合物
（）におけるＡ環の酸化的開裂反応と７位のヒ
ドロキシル化反応とを同時に行なう能力が現れ
る。また例えば培地Ｂ（第１表参照）を用いて28
℃で深部培養すると化合物（）におけるＡ環の
酸化的開裂反応が強く現われる。したがつてこの
性質を巧みに利用すれば化合物（）から所望の
化合物（）（式中R2′は水素原子またはヒドロキ
シル基）を有利に調製することが出来る。
生成した化合物（）は反応液から例えば酢酸
エチルまたは酢酸エチルとｎ−ブタノールの混合
溶媒等で抽出し、抽出物をシリカゲルカラムクロ
マトグラフイーに供する等の処理によりそれぞれ
単離精製することができる。
化合物（）をラクトン化し、化合物（）と
するには、化合物（）をピリジン中で無水酢酸
と処理するのが適当である。反応温度は室温付近
が適当であり、無水酢酸は化合物（）に対して
大過剰用いる。生成した化合物（）は反応液に
水を添加して析出させ単離することができる。
The present invention is based on the general formula (In the formula, R 1 means a lower alkyl group or a hydroxy lower alkyl group, and R 2 means a hydrogen atom or an acyloxyl group) and a salt thereof. Glycyrrhetinic acid and its derivatives are known to have pharmacological effects such as antiallergic, antiinflammatory, and antiulcer effects. The present inventors focused on the conversion of compounds by microorganisms and further combined chemical methods to produce a novel glycyrrhetinic acid derivative and completed the present invention. These new derivatives are expected to have the above-mentioned pharmacological effects, and have also been found to have antibacterial activity against Staphylococcus aureus, and are expected to be used as pharmaceuticals. The method for producing the compound of the present invention is illustrated by the following reaction formula. (In the formula, R 1 means a lower alkyl group or a hydroxy lower alkyl group, and R 2 means a hydrogen atom or an acyloxyl group.) From glycyrrhetinic acid, microbial conversion and chemical methods are used as shown in the reference examples below. A lactone derivative of glycyrrhetinic acid () prepared by a method combining the above is refluxed for several hours in a lower alcohol (methanol, ethanol, n-propanol, n-butanol, etc.) or a hydroxyl lower alcohol (ethylene glycol, etc.) using hydrochloric acid as a catalyst. By doing so, 3-methyl ester, 3-ethyl ester, 3-( 2-hydroxyethyl) ester and the like can be obtained efficiently. The product can be recovered by concentrating the reaction solution under reduced pressure, adding water to precipitate it, and collecting it by filtration. The compound () used as a raw material in the present invention is prepared by the reaction shown in the following formula. (In the formula, R 2 ' means a hydrogen atom or a hydroxyl group.) In other words, chainia antibiotica IFO 12246 is added to glycyrrhetinic acid ().
-tica) as a catalyst in a phosphate buffer under aerobic conditions, oxidative cleavage of the A ring and hydroxylation reaction at the 7-position occur, resulting in the compound (), (in the formula R 2 ' is a hydrogen atom or a hydroxyl group) is generated. This bacterium uses this, for example, in medium A (first
When the compound (see table) is incubated at 28°C in deep water, the ability to simultaneously carry out the oxidative cleavage reaction of the A ring and the hydroxylation reaction at the 7-position in compound () appears. Alternatively, for example, using medium B (see Table 1),
When cultured in deep water at ℃, the oxidative cleavage reaction of the A ring in compound () appears strongly. Therefore, by skillfully utilizing this property, a desired compound () (in the formula, R 2 ' is a hydrogen atom or a hydroxyl group) can be advantageously prepared from compound (). The produced compound () can be extracted from the reaction solution with, for example, ethyl acetate or a mixed solvent of ethyl acetate and n-butanol, and the extract can be isolated and purified by a treatment such as subjecting it to silica gel column chromatography. To lactonize compound () to give compound (), it is appropriate to treat compound () with acetic anhydride in pyridine. The reaction temperature is suitably around room temperature, and acetic anhydride is used in large excess relative to compound (). The generated compound () can be isolated by adding water to the reaction solution to precipitate it.
【表】
実施例
(イ) ３，４−セコオレアン−12−エン−11−オキ
ソ−４−ヒドロキシ−３，30−ジオイツク酸、
３，４−ラクトン（：R2が水素原子）250mg
をエタノール50mlに溶解し、これに濃塩酸0.1
mlを加え４時間還流した。放冷後反応液を減圧
濃縮し、濃縮液に徐々に水を加えてゆくと白色
の沈殿が生成してくるのでこれを濾別し、充分
水洗すると３，４−セコオレアン−４（23），12
−ジエン−11−オキソ−３，30ジオイツク酸３
−エチルエステル（Ｉ：R1がエチル基、R2が
水素原子）が無色粉末として248mg得られた。
この化合物の物性は次のとおりである。
(1) FD−Massスペクトル（ｍ／ｚ）512（M+）
(2) 1Hnmrスペクトル（CDCl3，90MHz）δppm
（TMS）
0.86，1.19，1.19，1.23，1.40，1.76（各々3H，
ｓ），4.08（2H，ｑ，−COOCH2 −），4.70，4.90
（各々1H，brs，Ｃ＝CH2 ）5.73（1H，ｓ，12位
Ｈ）
(ロ) 同様にして３，４−セコオレアン−12−エン
−11−オキソ−４−ヒドロキシ−３，30−ジオ
イツク酸３，４−ラクトン100mgを塩酸を触媒
としてメタノールと還流することにより３，４
−セコオレアン４（23），12−ジエン−11−オキ
ソ−３，30−ジオイツク酸３−メチルエステル
が無色粉末として94mg得られた。この化合物の
物性は次の通りである。
(1) FD−Massスペクトル（ｍ／ｚ）498（M+）
(2) 1Hnmrスペクトル（CDCl3，90MHz）δppm
（TMS）
0.86，1.18，1.18，1.24，1.40，1.76（各々3H，
ｓ），3.62（3H，ｓ，−COOCH3 ），4.70，4.90
（各々1H，brs，Ｃ＝CH2 ）5.74（1H，ｓ，12位
Ｈ）
(3) 13Cnmrスペクトル（CDCl3）δppm（TMS）
174.4（ｓ，C3位），146.6（ｓ，C4位），128.3（ｄ，
C12位），169.5（ｓ，C13位），114.2（ｔ，C23位 Ｃ
＝CH2 ），182.4（ｓ，C30位）
(ハ) 同様にして３，４−セコオレアン−12−エン
−11−オキソ−４−ヒドロキシ−３，30−ジオ
イツク酸３，４−ラクトン100mgを塩酸を触媒
としてｎ−プロパノールと還流することにより
３，４−セコオレアン−４（23），12−ジエン−
11−オキソ−３，30−ジオイツク酸３−ｎ−プ
ロピルエステルが無色粉末として60mg得られ
た。この化合物の物性は次の通りである。
(1) FD−MaSSスペクトル（ｍ／ｚ）526（M+）
(2) 1Hnmrスペクトル（CDCl3，90MHz）δppm
（TMS）
0.87，1.19，1.19，1.24，1.41，1.77（各々3H，
ｓ），3.99（2H，ｔ，−COOCH2 −），4.71，4.91
（各々1H，brs，Ｃ＝CH2 ），5.74（1H，ｓ，12位
Ｈ）
(ニ) 同様にして３，４−セコオレアン−12−エン
−11−オキソ−４−ヒドロキシ−３，30−ジオ
イツク酸３，４−ラクトン100mgを塩酸を触媒
としてｎ−ブタノールと還流するとにより３，
４−セコオレアン−４（23），12−ジエン−11−
オキソ−３，30−ジオイツク酸３−ｎ−ブチル
エステルが無色粉末として101mg得られた。こ
の化合物の物性は次の通りである。
(1) FD−Massスペクトル（ｍ／ｚ）540（M+）
(2) 1Hnmrスペクトル（CDCl3，90MHz）δppm
（TMS）
0.86，1.18，1.18，1.24，1.40，1.76（各々3H，
ｓ），4.02（2H，ｔ，−COOCH2 −），4.70，4.90
（各々1H，brs，Ｃ＝CH2 ）5.73（1H，ｓ，12位−
Ｈ）
(ホ) 同様にして３，４−セコオレアン−12−エン
−11−オキソ−４−ヒドロキシ−３，30−ジオ
イツク酸３，４−ラクトン200mgを塩酸を触媒
としてエチレングリコールと120〜130℃に加熱
することにより３，４−セコオレアン−４
（23），12−ジエン−11−オキソ−３，30−ジオ
イツク酸３−（２−ヒドロキシエチル）エステ
ル（Ｉ：R1が２−ヒドロキシエチル基、R2が
水素原子）が無色粉末として45mg得られた。こ
の化合物の物性は次の通りである。
(1) FD−Massスペクトル（ｍ／ｚ）528（M+）
(2) 1Hnmrスペクトル（CDCl3，9MHz）δppm
（TMS）
0.86，1.18，1.18，1.24，1.41，1.76（各々3H，
ｓ），3.77，4.13（各々2H，ｍ，−COOCH2CH2
OH），4.70，4.90（各々1H，brs，Ｃ＝CH2 ），
5.73（1H，ｓ，12位Ｈ）
(ヘ) 同様にして３，４−セコオレアン−12−エン
−11−オキソ−４，7β−ジヒドロキシ−３，
30−ジオイツク酸３，４−ラクトン７−アセテ
ート（：R2がアセトキシル基）260mgを塩酸
を触媒としてメタノールと還流することにより
３，４−セコオレアン−４（23），12−ジエン−
11−オキソ−7β−ヒドロキシ−３，30−ジオ
イツク酸７−アセテート
３−メチルエステルが無色粉末として230mg
得られた。この化合物の物性は次の通りであ
る。
(1) FD−Massスペクトル（ｍ／ｚ）556（M+）
(2) 1Hnmrスペクトル（CDCl3，90MHz）δppm
（TMS）
0.86，1.19，1.24，1.29，1.47，1.75（各々3H，
ｓ），2.02（3H，ｓ，−OCOCCH3 ），3.62（3H，
ｓ，COOCH3 ）4.71，4.93（各々1H，brs，Ｃ＝
CH2），5.28（1H，ｍ，７位Ｈ），5.78（1H，ｓ，
12位Ｈ）
３ 13Cnmrスペクトル（CDCl3）δppm（TMS）
174.0（ｓ，C3位），144.5（ｓ，C4位），73.0（ｄ，
C7）位），128.5（ｄ，C12位），169.0（ｓ，C13位），
115.2（ｔ，C23位 Ｃ＝CH2 ）181.6（ｓ，C30位）
(ト) 同様にして３，４−セコオレアン−12−エン
−11−オキソ−４，7β−ジヒドロキシ−３，
30−ジオイツク酸３，４−ラクトン７−アセテ
ート160mgを塩酸を触媒としてエタノールと還
流することにより３，４−セコオレアン−４
（23），12−ジエン−11−オキソ−7β−ヒドロ
キシ−３，30−ジオイツク酸７−アセテート３
−エチルエステルが無色粉末として166mg得ら
れた。この化合物の物性は次の通りである。
(1) FD−Massスペクトル（ｍ／ｚ）570（M+）
(2)1Hnmrスペクトル（CDCl3、90MHz）δppm
（TMS）0.86，1.20，1.23，1.30，1.48，1.76（各々
3H，ｓ），2.02（3H，ｓ，−OCOCH3 ），4.08（2H，
ｑ，−COO−CH2 −），4.72，4.94（各々1H，brs，
Ｃ＝CH2 ），5.28（1H，ｍ，７位Ｈ），5.79（1H，
ｓ，12位Ｈ）
参考例
培地Ａをを100ml含んだ500ml溶坂口フラスコに
チヤイニア アンチビオチカIFO12246を斜面培
養から接種し、28℃で４日間振盪培養して種培養
液とした。この種培養液を培地Ｂを100mlずつ含
んだ坂口フラスコ55本にそれぞれ2.0mlずつ接種
し、28℃で３日間振盪培養した。本培養液を遠心
分離して集めた菌体にPH7.5の0.1Mリン酸緩衝液
を加えて全体容量をを4.0とした。
本液にツイーン80を8.0mlとグリチルレチン酸
を2.00ｇ添加し、充分撹拌した後100mlずつ40本
の坂口フラスコに分注し、28℃で20時間振盪反応
した。反応終了後反応液を一括して回収し、PHを
4.0〜4.5に調製し、反応生成物を酢酸エチル3.0
で抽出した。抽出液は充分水洗した後減圧濃縮し
濃縮物1.8ｇを得た。これをシリカゲルカラムク
ロマトグラフイーにかけ（展開溶媒、ベンゼン／
酢酸エチル／酢酸＝10／10／１）、反応生成物の
分離を行ない、更にメタノールと水から再結晶す
ることにより、３，４−セコオレアン−12−エン
−11−オキソ−４−ヒドロキシ−３，30−ジオイ
ツク酸（：R2′＝Ｈ）を無色の結晶性粉末とし
て1.14ｇ得た。融点289〜304℃（分解）
また前記と同様にして調製したチヤイニア ア
ンチビオチカIFD12246の種培養液を、培地Ａを
100mlずつ含んだ坂口フラスコ60本にそれぞれ2.0
mlずつ接種し28℃で１日間振盪培養した。本培養
液を遠心分離して集めた菌体にPH7.0の0.1Mリン
酸緩衝液を加えて全体容量を6.0とした。
本液にグリチルレチン酸を6.00ｇ添加し、充分
撹拌した後100mlずつ60本の坂口フラスコに分注
し、28℃で24時間振盪反応した。反応終了後反応
液をを一括して回収しPH4.0〜4.5に調製し、反応
生成物を酢酸エチルとｎ−ブタノールの比が４対
１の混合溶媒6.0で抽出した。抽出液は充分水
洗した後減圧濃縮し、濃縮物5.9ｇを得た。
これをシリカゲルカラムクロマトグラフイーに
かけ（展開溶媒、ベンゼン／酢酸エチル／酢酸＝
８／12／１）、反応生成物の分離を行ない、更に
エタノールと水から再結晶することにより３，４
−セコオレアン−12−エン−11−オキソ−４−ヒ
ドロキシ−３，30−ジオイツク酸（：R2′＝Ｈ）
を無色結晶性粉末として0.38ｇおよび３，４−セ
コオレアン−12−エン−11−オキソ−４，7β−
ジヒドロキシ−３，30−ジオイツク酸（：
R2′＝OH）を無色板状晶として3.44ｇ得た。融点
296〜310℃（分解）
上述の如くして得た化合物（R2′＝Ｈ）1.00
ｇに乾燥ピリジンを6.7mlと無水酢酸を6.7ml添加
し、28℃で１日間放置した。反応終了後反応液に
徐々に水を加えてゆくこと無色の結晶性の沈殿が
生成してくるのでこれを濾取し充分水洗すること
により３，４−セコオレアン−12−エン−11−オ
キソ−４−ヒドロキシ−３，30−ジオイツク酸
３，４−ラクトン（：R2＝Ｈ）を無色結晶性
粉末として0.95ｇを得た。融点266〜270℃
またこれと同様の方法で一般式（）におい
て、R2がヒドロキシル基の化合物1.00ｇから３，
４−セコオレアン−12−エン−11−オキソ−４，
7β−ジヒドロキシ−３，30−ジオイツク酸３，
４−ラクトン７−アセテート（：R2＝
OCOCH3）を無色結晶性粉末として1.02ｇ得た。
融点214〜220℃ [Table] Example (a) 3,4-secoolean-12-ene-11-oxo-4-hydroxy-3,30-dioyscinic acid,
3,4-lactone ( R2 is hydrogen atom) 250mg
Dissolve in 50 ml of ethanol and add 0.1 ml of concentrated hydrochloric acid to this.
ml was added and refluxed for 4 hours. After cooling, the reaction solution was concentrated under reduced pressure, and water was gradually added to the concentrated solution. A white precipitate was formed, which was filtered and washed thoroughly with water to obtain 3,4-secooleane-4 (23), 12
-diene-11-oxo-3,30 dioxic acid 3
248 mg of -ethyl ester (I: R 1 is an ethyl group, R 2 is a hydrogen atom) was obtained as a colorless powder.
The physical properties of this compound are as follows. (1) FD-Mass spectrum (m/z) 512 (M + ) (2) 1 Hnmr spectrum (CDCl 3 , 90MHz) δppm
(TMS) 0.86, 1.19, 1.19, 1.23, 1.40, 1.76 (3H, respectively
s), 4.08 (2H, q, −COO CH 2 −), 4.70, 4.90
(1H, brs, C= CH 2 respectively) 5.73 (1H, s, H at the 12th position) By refluxing 100 mg of acid 3,4-lactone with methanol using hydrochloric acid as a catalyst, 3,4-lactone
-Sequooleane 4(23),12-diene-11-oxo-3,30-dioic acid 3-methyl ester was obtained as a colorless powder in an amount of 94 mg. The physical properties of this compound are as follows. (1) FD-Mass spectrum (m/z) 498 (M + ) (2) 1 Hnmr spectrum (CDCl 3 , 90MHz) δppm
(TMS) 0.86, 1.18, 1.18, 1.24, 1.40, 1.76 (3H, respectively
s), 3.62 (3H, s, -COO CH 3 ), 4.70, 4.90
(1H, brs, C = CH 2 respectively) 5.74 (1H, s, H at 12th position) (3) 13 Cnmr spectrum (CDCl 3 ) δppm (TMS) 174.4 (s, C 3rd position), 146.6 (s, C 4 ), 128.3(d,
C 12th place), 169.5 (s, C 13th place), 114.2 (t, C 23rd place C)
= CH 2 ), 182.4 (s, C 30th position) (c) In the same manner, 100 mg of 3,4-secoolean-12-ene-11-oxo-4-hydroxy-3,30-dioytuccinic acid 3,4-lactone was added. By refluxing with n-propanol using hydrochloric acid as a catalyst, 3,4-secooleane-4(23),12-diene-
60 mg of 11-oxo-3,30-dioic acid 3-n-propyl ester was obtained as a colorless powder. The physical properties of this compound are as follows. (1) FD-MaSS spectrum (m/z) 526 (M + ) (2) 1 Hnmr spectrum (CDCl 3 , 90MHz) δppm
(TMS) 0.87, 1.19, 1.19, 1.24, 1.41, 1.77 (3H, respectively
s), 3.99 (2H, t, -COO CH 2 -), 4.71, 4.91
(1H, brs, C= CH 2 respectively), 5.74 (1H, s, H at position 12) (d) Similarly, 3,4-secoolean-12-ene-11-oxo-4-hydroxy-3,30- When 100 mg of dioic acid 3,4-lactone is refluxed with n-butanol using hydrochloric acid as a catalyst, 3,
4-Sequoolean-4(23),12-diene-11-
101 mg of oxo-3,30-dioic acid 3-n-butyl ester was obtained as a colorless powder. The physical properties of this compound are as follows. (1) FD-Mass spectrum (m/z) 540 (M + ) (2) 1 Hnmr spectrum (CDCl 3 , 90MHz) δppm
(TMS) 0.86, 1.18, 1.18, 1.24, 1.40, 1.76 (3H, respectively
s), 4.02 (2H, t, -COO CH 2 -), 4.70, 4.90
(1H, brs, C = CH 2 ) 5.73 (1H, s, 12th position -
H) (E) In the same manner, 200 mg of 3,4-lactone 3,4-secoolean-12-ene-11-oxo-4-hydroxy-3,30-dioic acid was mixed with ethylene glycol using hydrochloric acid as a catalyst at 120 to 130°C. 3,4-Secooleane-4 by heating to
(23), 12-diene-11-oxo-3,30-dioic acid 3-(2-hydroxyethyl) ester (I: R 1 is 2-hydroxyethyl group, R 2 is hydrogen atom) 45 mg as colorless powder Obtained. The physical properties of this compound are as follows. (1) FD-Mass spectrum (m/z) 528 (M + ) (2) 1 Hnmr spectrum (CDCl 3 , 9MHz) δppm
(TMS) 0.86, 1.18, 1.18, 1.24, 1.41, 1.76 (3H, respectively
s), 3.77, 4.13 (respectively 2H, m, −COO CH 2 CH 2
OH), 4.70, 4.90 (1H, brs, C = CH 2 ),
5.73 (1H, s, H at position 12) (f) Similarly, 3,4-secoolean-12-ene-11-oxo-4,7β-dihydroxy-3,
3,4-Secooleane-4(23),12 - diene-
230 mg of 11-oxo-7β-hydroxy-3,30-diotuccinic acid 7-acetate 3-methyl ester as colorless powder
Obtained. The physical properties of this compound are as follows. (1) FD-Mass spectrum (m/z) 556 (M + ) (2) 1 Hnmr spectrum (CDCl 3 , 90MHz) δppm
(TMS) 0.86, 1.19, 1.24, 1.29, 1.47, 1.75 (3H, respectively
s), 2.02 (3H, s, -OCOC CH 3 ), 3.62 (3H,
s, COO CH 3 ) 4.71, 4.93 (1H, brs, C= respectively
CH 2 ), 5.28 (1H, m, H at 7th position), 5.78 (1H, s,
12th position H) 3 13 Cnmr spectrum (CDCl 3 ) δppm (TMS) 174.0 (s, C 3rd position), 144.5 (s, C 4th position), 73.0 (d,
C 7th place), 128.5 (d, C 12th place), 169.0 (s, C 13th place),
115.2 (t, C 23rd position C= CH 2 ) 181.6 (s, C 30th position) (g) Similarly, 3,4-secoolean-12-ene-11-oxo-4,7β-dihydroxy-3,
3,4-Secooleane-4 was obtained by refluxing 160 mg of 30-diotuccinic acid 3,4-lactone 7-acetate with ethanol using hydrochloric acid as a catalyst.
(23), 12-diene-11-oxo-7β-hydroxy-3,30-diotuccinic acid 7-acetate 3
-166 mg of ethyl ester was obtained as a colorless powder. The physical properties of this compound are as follows. (1) FD-Mass spectrum (m/z) 570 (M + ) (2) 1 Hnmr spectrum (CDCl 3 , 90MHz) δppm
(TMS) 0.86, 1.20, 1.23, 1.30, 1.48, 1.76 (each
3H, s), 2.02 (3H, s, -OCO CH 3 ), 4.08 (2H,
q, −COO− CH 2 −), 4.72, 4.94 (1H, brs, respectively
C= CH 2 ), 5.28 (1H, m, H at 7th position), 5.79 (1H,
s, 12th H) Reference Example A 500 ml Sakaguchi flask containing 100 ml of medium A was inoculated with Chiainia antibiotica IFO12246 from a slant culture, and cultured with shaking at 28°C for 4 days to obtain a seed culture. 2.0 ml of this seed culture solution was inoculated into 55 Sakaguchi flasks each containing 100 ml of medium B, and cultured with shaking at 28° C. for 3 days. The main culture solution was centrifuged and 0.1M phosphate buffer of PH7.5 was added to the collected bacterial cells to bring the total volume to 4.0. To this solution were added 8.0 ml of Tween 80 and 2.00 g of glycyrrhetinic acid, and after thorough stirring, the mixture was dispensed into 40 Sakaguchi flasks in 100 ml portions and reacted with shaking at 28° C. for 20 hours. After the reaction is complete, collect the reaction solution all at once and adjust the pH.
4.0 to 4.5 and the reaction product to ethyl acetate 3.0
Extracted with. The extract was thoroughly washed with water and then concentrated under reduced pressure to obtain 1.8 g of a concentrate. This was subjected to silica gel column chromatography (developing solvent, benzene/
3,4-secoolean-12-ene-11-oxo-4-hydroxy-3 was obtained by separating the reaction product and recrystallizing it from methanol and water. , 30-Diotsuccinic acid (:R 2 '=H) was obtained as a colorless crystalline powder in an amount of 1.14 g. Melting point: 289-304°C (decomposed) In addition, a seed culture of Chiainia antibiotica IFD12246 prepared in the same manner as above was mixed with medium A.
2.0 each for 60 Sakaguchi flasks containing 100 ml each.
ml each was inoculated and cultured with shaking at 28°C for 1 day. The main culture solution was centrifuged and 0.1M phosphate buffer of PH7.0 was added to the collected bacterial cells to make the total volume 6.0. 6.00 g of glycyrrhetinic acid was added to this solution, and after thorough stirring, the mixture was dispensed into 60 Sakaguchi flasks in 100 ml portions, and reacted with shaking at 28° C. for 24 hours. After the reaction was completed, the reaction solution was collected all at once and the pH was adjusted to 4.0 to 4.5, and the reaction product was extracted with a mixed solvent of 6.0 ethyl acetate and n-butanol in a ratio of 4:1. The extract was thoroughly washed with water and then concentrated under reduced pressure to obtain 5.9 g of a concentrate. This was subjected to silica gel column chromatography (developing solvent, benzene/ethyl acetate/acetic acid =
8/12/1), the reaction product was separated and further recrystallized from ethanol and water to obtain 3,4
-Sequoolean-12-ene-11-oxo-4-hydroxy-3,30-dioic acid (:R 2 ′=H)
0.38 g as a colorless crystalline powder and 3,4-secoolean-12-ene-11-oxo-4,7β-
Dihydroxy-3,30-dioic acid (:
3.44 g of R 2 '=OH) was obtained as colorless plate crystals. melting point
296-310°C (decomposition) Compound obtained as above (R 2 ′=H) 1.00
6.7 ml of dry pyridine and 6.7 ml of acetic anhydride were added to the mixture, and the mixture was left at 28°C for 1 day. After the reaction is completed, water is gradually added to the reaction solution. A colorless crystalline precipitate is formed, which is collected by filtration and thoroughly washed with water to obtain 3,4-secoolean-12-ene-11-oxo- 0.95 g of 4-hydroxy-3,30-dioic acid 3,4-lactone (:R 2 =H) was obtained as a colorless crystalline powder. Melting point: 266-270°C In a similar manner, in the general formula (), from 1.00 g of a compound in which R 2 is a hydroxyl group, 3,
4-sequoolean-12-ene-11-oxo-4,
7β-dihydroxy-3,30-dioitsucic acid 3,
4-lactone 7-acetate (:R 2 =
1.02 g of OCOCH 3 ) was obtained as a colorless crystalline powder.
Melting point 214-220℃