JPH05501205A - 炭水化物性受容体を利用する診断用キットおよび診断方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 炭水化物受容体を利用する診断用キットおよび診断方法発明の背景 ある種の細菌の迅速な検出のための装置および技術はこの分野で公知である。例 えば、タンデム・イコン・ストレッゾＡ（Ｔａｎｄｅｍ　Ｉｃｏｎ　５ｔｒｅｐ 　Ａ）試験キットはストレプトコッカス抗原が試料から抽出され、そして膜に結 合される方法を利用する。比色試験は次に、抗体と複合した酵素を抗原に結合さ せ、次いで該酵素に対する基質を酵素と接触させることにより操作される。酵素 が存在する場合、基質は変色し、それにより試験が陽性であることを示す。これ は有用な技術であるけれども、より安価で、そしてより汎用性であり得る、より 長い可使寿命を存する試験に対する要求が存在する。

発明の要約 本発明は、不溶性基体と、該不溶性基体に結合された、細菌を吸着し得る炭水化 物受容体とからなる微生物を吸着するための診断用装置に関する。本発明はまた 、不溶性基体に結合された炭水化物受容体に試験すべき試料を接触させ、そして 前記試料中の微生物の前記基体に結合された炭水化物受容体への結合の程度を決 定することからなる試料中に特定の微生物の存在を検出する方法に関する。

炭水化物受容体が結合され得る種々の不溶性基体を使用することができる。該基 体は操作されるべき診断試験を妨害することなく炭水化物受容体に容易に結合し 得るべきである。可能な基体はガラス；薄層クロマトグラフィー材料例えばシリ カゲル：合成プラスチック材料例えばポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリプロ ピレンおよびポリエチレンを包含する。この基体は平板、ガラスピーズ、ラテッ クスビーズ、別の基体上の薄層、微量滴定プレート、ペトリ皿等の形態であって よい。基体はまた多孔性または非多孔性の膜またはフィルムの形態であってよい 。

上記基体に結合される炭水化物受容体は試験されるべき微生物に結合しなければ ならない。種々の病原性グラム陽性およびグラム陰性細菌ならびに病原性酵母ま たは菌類に選択的に結合する炭水化物受容体が本発明に関して利用され得る。特 に、病原性グラム陽性細菌例えばストレプトコッカス＜Ｓｔγｅｐｔｏｃｏｃｃ ｕｓ）およびスタフィロコッカスＣ３ｔａｐｈｙＬｏｃｏｃｃｕｓ）　、病原性 グラム陰性細菌例えばマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｒｘａ）　、シュード モナス（Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ）およびエスケリッチア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ ｉａ）ならびに病原性酵母例えばクリプトコツカスＣＣｒｙｐｔｏｃ。

ｃｃｕｓ）に結合する炭水化物受容体が本発明に従って利用され得ることが記載 され得る。

「炭水化物受容体Ｊという用語は、微生物に選択的に結合する炭水化物化合物ま たはある化合物の炭水化物部分を意味する。炭水化物受容体はわずかに１つだけ の糖単位を有していても、いくつかの糖単位を有していてもよい。

スルファチドに含まれる単糖単位ガラクトース３−スルフェートは炭水化物受容 体として機能し得る単一の糖の例である。三糖配列Ｇａ１ＮＡｃβ１−４Ｇａｌ もまた炭水化物受容体として機能し得る。三糖配列Ｇａｌβ１−４Ｇ１ｃβ１− ＩＣｅｒはクリプトコツカスのための炭水化物受容体として機能し得る。炭水化 物受容体として機能し得るその他の構造体はマイコプラズマ・ニューモニエＣＭ ｙｃｏｐＬａｓｒｒｒａ　ｐｎｅｕｒｎｏｎｉａｅ）に対するシアリルα（２− ３）ガラクトースβ（１−４）Ｎ−アセチルグルコサミンを包含する。

炭水化物受容体は硫酸化糖脂質例えばスルファチド、アシアロＧＭＩおよびアシ アロＧＭ２を包含する糖脂質の一部であってよい。

特に好ましい糖脂質はＧａ１（３ＳＯ４）β１末端基を含有するものである。

種々の細菌を結合する能力の試験された糖脂質は以下のものを包含する： 名称　構　造 α−ガラクトツルパラグロボシド Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１　４ＧｌｃＮＡｃβｌ−３Ｇａｌβ１−４ＧＩｃβ１ −グロボシド（ＧＬ４） ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌαｌ　４ＧａｌβＬ　４ＧＩｃβ１　１Ｃｅｒ−セ ル、セラミド。

大腸菌に結合する糖脂質は、次のものを含む。

各　構造 Ｎ〜グ】ノコ、！ルーＧＭ３　ＮｅｕＧｃ　ａ　２−３Ｇａｌβ１−４ＧＩＣβ １−ＩＣｅｒＮ−グ１１コノルノ了ノバラー　ＮｅｕＧｃ　ａ　２−３Ｇａｌ　 β１−４ＧＩｃＮＡｃβｌ−グｌ′Ｉｉ／Ｆ　３Ｇａｌβｌ−４ＧＩｃβ１−１ ｃｅｒこれら２種の糖脂質の犬！Ｉ、ｍへの結合は、キヨウガシマら（Ｋｙｏｇ ａｓｈｉｍａ　ｅｔ　ａｔ）により、参考文献としテココニ組み入れられる「ア ーチブス　才ブ　バイオケミストリー　アンド　バイオブイジックス（Ａｒｃｈ ｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅ−ｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　８ｉｏｐｈｉｃｓ）１ ２７０　、Ｎｏ、Ｉ、３３１−３９７　（１９８９年４月）に記載されている。

炭水化物受容体は、ラミニン、フェチュイン、ヒト繊毛性性１刺激ホルモン、ヒ ト血小板トロンポスボンジンのような糖蛋白質およびこれら糖蛋白質の誘導体の 一部であってよい。特に好ましい糖蛋白質は、シャル酸がα２−３結合したもの である。

構造３Ｇａ　１βｌ−４ＧＩｃβ１−１ｃｅｒを存する糖脂質ラクトシルセラミ ドは、酵母様菌クリプトコツカス・ネオフｔルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｅｏｃｅｕ ｓ　ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）に結合する０炭水化物受容体は、診断されるバクテ リアを炭水化物受容体に結合させる充分なｌおよび方法で基体に結合されるべき である。実際の観点から、炭水化物受容体は、基体の表面積当たりで通常少なく とも０．１　ｐｍｏｌ／　ｍｍ”、好ましくは少なくとも１　ｐｍｏｌ／　［ｌ ｌＩｍ”存在させる。基体上の炭水化物受容体の濃度の上限までは、炭水化物受 容体は基体の飽和密度まで結合することができる。ポリスチレン上のスルファチ ドの飽和密度は約３　ｐｍｏｌ／ｍｍ’　テある。炭水化物受容体は実質的に基 体の表面を完全に覆う分子単層として結合することができる。基体に結合する炭 水化物受容体の分子単層を越える使用は、物質を浪費する結果となり、また炭水 化物受容体の基体への結合を不十分にする。基体に結合する炭水化物受容体の密 度として好ましい範囲は０．１　ｐｍｏｌ／　ｍｍ’ないし炭水化物受容体の飽 和密度、より好ましくはｏ、ｉないし３　ｐｍｏｌ／　ｖａｏｎ”特定のバクテ リアへの炭水化物受容体の結合能力に依存するであろう。

炭水化物受容体は適当なノコ法の何れかで基体に結合されてよい。基体への炭水 化物受容体の結合に、共有または非共有（例えば疎水性）結合が使用されてよい 。例えば糖脂質の脂質部分は、炭水化物受容体すなわち糖またはグリコ基、微生 物への結合の有用性を残して、成る種のプラスチック基体に疎水的に結合するで あろう。代わりに、炭水化物受容体は基体に共有的に結合してよい。

イオン結合のような他の結合形式が使用されてもよい。

また炭水化物受容体は、粒子、例えば後に多孔質膜に埋め込むか結合させること により不動にされるラテックス粒子に結合されてもよい。ラテックス粒子は多孔 質膜の孔中に圧力で埋め込むことができるサイズであってよい。従って、例えば 、ラテックス粒子の平均粒子サイズは、上記多孔質膜の平均表面孔サイズとほぼ 同等であるか、それより僅かに小さくてよい。代わりに、粒子はスクリーンネッ ト等のような多孔性または液体透過性材料のいずれかに結合されてもよい。また 、結合剤のような物質も、該結合剤が炭水化物受容体の微生物への結合能力を干 渉しない限り、粒子を支持体に結合するのに使用してよい。他の具体例では、粒 子は、入口および出口を有するカラムのような容器に詰めてよく、それによって 試験されるサンプルと必要な診断薬を、該容器に通した時に粒子と接触させるこ とができる。

バクテリアの存在について種々のサンプルを本発明方法で試験することができる 。病気および／または感染の診断のために、感染されている恐れのある患者から の生体サンプルは通常、生理学的食塩水のような適当な溶液で希釈され、次いで この溶液が基体および炭水化物受容体を含む診断装置に接触させられる。試験さ れる患者の口腔内の病原体の存在について試験する時、綿棒または他の材料が患 者の口の内側で拭い取られ、この綿棒が無菌溶液中に置かれ、それによって綿棒 中のバクテリアは該捧から溶液中に放出される。この溶液は次いでバクテリアの 存在について試験される。喀痰、尿、唾液および血液のような体液中のバクテリ アについても試験可能である。

本発明は、他タイプのバクテリア例えば病院手術室、薬品および医療機器製造施 設、食品製造施設等のような特表千５−５０１２０５　（４） 無菌に保たれるべき環境で遭遇するバクテリアを試験するのにも作用であり得る 。そのような場所では、綿サンプルが患者の口から取られる場合と殆ど同じ方法 で、試験される面が綿で拭き取られ、その綿がバクテリアを開放するために無菌 溶液中に置かれる。次いでこの溶液は本発明の装置に接触され得る。

バクテリアを含むと推定される溶液は上記炭水化物受容体を含む基体に接触され る。好ましくは該溶液は、平衡となる迄またはその前まで例えば試験される微生 物に依存して１ないし９０分、より好ましくは５ないし６０分、口ないし４０℃ 、好ましくは４ないし３７℃の室温で基体に接触される。例えば、クロスポリジ ウム（Ｃ１ｏｓ−ｔｒｉｄｉｕｎ＋）にとっての好ましい温度は約４０℃である のに対し、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）にとっての好ましい温度は 約３７℃であるとみられる。正確な時間および温度条件は、正確に試験させるの に充分な程度にバクテリアを炭水化物受容体に吸着させるための充分な時間を与 えるように選択される。試験されるサンプルは、溶解され、および／または生理 学的食塩水のような種々の液体で希釈されてよい。

バクテリアを炭水化物受容体に結合させるのに充分な時間、炭水化物受容体を含 む基体に溶液を接触させた後、基体は非結合物質を除くために洗浄される。

試験は次いで基体上の炭水化物受容体に結合したバクテリアの存在を調べるため に操作される。この目的を達成するための種々の試験は、酵素結合免疫吸着分析 （ＥＬ　Ｉ　Ｓ　Ａ　：　ｅｎｚｙｍｅ　１ｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂ ｅｎｔ　ａｓｓａｙ）、標識免疫検定（ｒａｄｒｏｉｒｎｒｎｕｎｅ　ａｓｓａ ｙ）　、直接または間接蛍光抗体試験（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ａｎｔｉｂｏ ｄｙ　ｔｅｓｔ）等のような技術分野で知られている。基本的に、炭水化物受容 体を含みそしてそれに結合したバクテリアを含むと推測される基体は、試験され るバクテリアと結合する物質に接触させられる。そのような物質には例えばバク テリアに対する抗体またはバクテリアに結合する炭水化物受容体が含まれる。

抗体または炭水化物受容体は、容易に検知可能な物質で“標識″され得る。例え ば抗体または炭水化物受容体は酵素、放射性物質または元素、または蛍光物質と 結合されてよい。抗体または炭水化物受容体が酵素と結合している場合、基体は その後、好ましくは酵素と接触して変色することにより陽性反応を示す酵素用の 基体に接触させられる。使用される抗体または炭水化物受容体は、バクテリアと 反応するが被覆された基体または基体に結合した炭水化物受容体とは反応しない ものであるべきであり、それにより偽陽性の判定が防止される。酵素または炭水 化物受容体が放射性標識されている場合には、基体上の放射活性が測定されるべ きである。酵素または炭水化物受容体が蛍光的に標識されることもまた可能であ る。この場合、処理された基体は、基体に結合した蛍光標識物質の存在を測定す るために紫外光にさらされるべきである。

一方で、試験は次の各段階を含んでいてよい（１）上記基体上に被覆された表面 を生じさせるべく基体上に炭水化物受容体を供給すること：（ｍ患者の体液また は組織抽出物と上記被覆基体表面とを接触させて、患者の体液または組織抽出物 中の微生物を上記覆基体表面に選択的に結合させること： （［ｍ段階（１［）における上記被覆表面に既に上記微生物が結合している場合 、段階（ＩＩ）後、上記微生物に対する第一抗体と上記被覆表面とを接触させて 上記第二抗体を上記被覆表面に結合させること；（ｍ段階（ＩＩＩ）における上 記被覆表面に既に上記第一抗体が結合している場合、段階（ＩＩＩ）後、上記第 一抗体と反応する酵素標識抗体と上記被覆表面とを接触させて上記抗素標識体酵 を上記被覆表面に結合させること；および （Ｖ）段階（ＩＶ）後、上記被覆基体と、上記被覆表面に結合した上記酵素標識 抗体の存在を指示する薬品（酵素標識指示薬）とを接触させること。

図面の簡単な説明 図１は薄層クロマトグラフィにより分離された糖脂質へのマイコプラズマ・ニュ ーモニエの結合を示す。糖脂質は、クロロホルム／メタノール／水中０．２５％ のＣａＣ１＝、６０・３５８で展開されたアルミニウム裏打シリカゲルＨＰＴＬ Ｃプレートでクロマトグラフィされる。

該プレートはプラスチックで被覆され、トリス−ＢＳＡ中で浸漬され、モして′ 物質及び方法（Ｍａｔｅｒｉａｌｓ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ＞　”に記載され たように１％ＢＳＡ及び２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７，８を含むＰＲＭ１１６ ４０中に懸濁化された（”Ｈ）−パルミテート標識マイコプラズマ・ごユーモニ エで、２５°Ｃで３時間保温される（図ＩＡ）か、または糖脂質を同定するため にオルシノール試薬で９Ｍされる（図ＩＢ）。

し〜ンａ、酸糖脂質の標準スルファチド（０，５μｇ）。

０Ｍ３　（２μｇ）、０Ｍ２　（２μｇ）、ＧＤｌａ　（２ｔｔｇ）、ＧＤｌｂ 　（２μｇ）、ＧＴｌｂ　（２μｇ）。

レーンｂ、中性標準ガラクトシルセラミド（４μｇ）。

ラクトシルセラミド（４μｇ）、グロボトリγオシルセラミド（２μｇ）及びグ ロポテトラオシルセラミド（２μｇ）。

レーンＣ及びＣＩ＋　スルファチド（２μｇ）、ｃａ（０，５μｇ’）及びｃＩ 　（０，１μｇ）：レーンｄ、セミノリビブド（２μｇ）。

レーンＣ，コレステロール３−スルフェート（２μｇ）：　シー２１１組織の湿 重量１００ｏ＋ｇからのヒト気管の酸性糖脂質； レーンｇ、ウシ赤血球の湿重量１００ｍｇからのモノシアロガングリオシド： レーンｈ、α２−３シアリルパラグロボシド（２μｇ）、　レーンｉ、ウシ赤血 球からのＩ−活性モノシアリルガングリオシド（２μｇ）。略語は脚注１及び表 １を参照。

図２は精製糖脂質へのマイコプラズマ・ニューモニエの結合を示す。補助脂質コ レステロール及びホスファチジルコリンのそれぞれ０．１　μｇを含む２５μｍ のメタノール中の脂質はポリビニルクロリド微量滴定プレートの平底ウェルで蒸 発される。ウェルは１％アルブミンで１時間ブロックされ、ＲＰＭＩ−ＢＳＡで ２回洗浄され、２５μｍの（”Ｈ）　−マイコプラズマ・ニューモニエ（約１０ ’ｃｐｍ）で２５℃において保温される。２時間後、ウェルを塩水で５回洗浄し 、プレートから切り出し、シンチレーションカウンターで定量された放射能を結 合する。対照実験において、生物体は非特異的結合を補正するためだけに補助脂 質で保温される（典型的には添加された全放射能の１％未満）。

マイコプラズマ・ニューモニエｔ＋＆ｉ；ｔＰＲＭ？−ＢＳＡ中、スルファチド （＊）、ラクトシルセラミド（■）、バラグロボンド（◆）およびコレステロー ルスルフェート、セラミドトリヘキソシト、グロボシド、ＧＭＩ、０Ｍ２または ０Ｍ３（○）で測定される。

ｒｙＪＳはスルファチドへのマイコプラズマ・ニューモニエのエネルギー及び温 度依存結合を示す。微量滴定ウェルはスルファチドで被覆され、図２で記載され たようにアルブミンでブロックされる。（”Ｈ）−マイコプラズマ・ニューモニ エの結合はＲＰＭＩ−ＢＳＡ中、４℃（■）で、２５°Ｃ（・）で、３７℃（ム ）で、及びＰＲＭｌ無しのＢＳＡ中３７℃（△）で２時［１定される。

図４は、硫酸デキストランによるスルファチドへのマイコプラズマ・ニューモニ エ結合の阻害を示す。多糖類は予め１μｇの精製スルファチドで被覆された微量 滴定ウェル中、２５μｌのＲＰＭＩ−ＢＳＡで連続的に希釈される。結合は、指 示された濃度のデキストラン（・）または硫酸デキストラン（ム）で２５μ！の （”Ｈ）−マイコプラズマ・ニューモニエを３７℃で２時間保温後に測定される 。

図５は、Ｗ　ｉ　Ｄ　ｒ腺癌細胞により合成されたスルファチドの同定を示す。

Ｗ　ｉ　Ｄ　ｒ細胞は、”物質及び方法′で記載されたように（”Ｓ　）〜スル フェートで代謝的にｆＩｉｆＩｍされる。中性の酸性脂質は、クロロホルム／メ タノール／水中０．２５％のＫＣ１，５：４：１　（図５Ａ）、またはクロロホ ルム／メタノール／アセトン／酢酸／水、　８：２：４・２：ｘ　＜図５Ｂ＞で 展開されたシリカゲル高性能薄層プレートでクロマトグラフィされる。脂質はオ ートラジオグラフィ（レーンａ）またはオルシノール試薬（レーンｂ−ｆ）によ り検出される。

図５Ａはｌ　Ｏ＠Ｗ　ｉ　Ｄ　ｒ細胞からの（”Ｓ）−標識酸性脂質（レーンａ ）、ＷｉＤｒ細胞の湿重量８０ｍｇからの中性脂質（レーンｂ）及び酸性脂質（ レーンＣ）を示す。オルシノール陽性スルファチド帯は矢印（←）により示され る。関連する糖脂質の移動は左端に示されているニスルアＴチド、Ｇ　Ｍ　３　 、　Ｇ　Ｍ　２　、　Ｇ　Ｍ　ｌ　、　Ｇ　Ｄ　１　ａ　。

ＧＤｌｂおよびＧＴｌｂ。

１１５Ｂは１（１’ＷｉＤｒ細胞からの［：”Ｓ）−標識酸性脂質（レーンａ＆ Ｃ）、ウシの脳スルファチド（レーンｂ）セミノリピッド（レーンｄ）、コレス テロール３−スルファチド（レーンｅ）及び中性糖脂質標準物で、上から下へＣ ＭＨ，ＣＤＨ，ＣＴＨ及びＧＬ４　（レーンｆ）を示す。略語は脚注１及び表１ を参照。

図６は固定化された糖タンパク質へのマイコプラズマ・ニューモニエ結合を示す 。（”Ｈ）−標識マイコプラズマ・ニューモニエ（６３０，Ｑ００Ｃ１１１１１ １５Ｘ１０’ＣＣＵ　）は３７℃で６０分間、ラミニン（・）、フェツイン（０ ）、ｈＣＧ（ＩＩ）またはトランスフェリン（ロ）で二重に被覆された微量滴定 ウェル中、指示された濃度で保温される。未結合の生物体を除去するための洗浄 後、結合されたマイコプラズマ・ニューモニエはシンチレーションカウントによ り測定される。被覆されていないウェルへの結合は、利用された放射能の３％で ある。

図７は固定化された糖タンパク質へのマイコプラズマ・ニューモニエ結合におけ るノイラミニダーゼ処理の効果を示す。微量滴定ウェルはフェツイン（・）、ｈ ＣＧ（■）またはｈＣＧのα−サブユニット（ム）で被覆され、そして酢酸ナト リウム緩衝液ｐＨ５，５中の０．０５０／鵬ｌのノイラミニダーゼ（白い記号） 、または緩衝液単独（黒い記号）で１６時間処理される。（”Ｈ）−標識マイコ プラズマ・ニューモニエ結合は′物質及び方法”で記載されたように測定される 。

図８は、マイコプラズマ・ニューモニエ接着を仲介するために提案されたヒト絨 毛性ゴナドトロピン（２３）のαサブユニット上のシアリル化オリゴ糖類の構造 を示す。２アンテナ性のオリゴ糖類は、本発明の結果に基づいた結合に必要とさ れる最小構造である。１アンテナ性のオリゴ糖類が高いＨ相方を存するマイコプ ラズマ・ニューモニエを結合しつるかどうかは公知ではない。

図９はヒト腺癌Ｗ　ｉ　Ｄ　ｒ細胞系へのマイコプラズマ・ニューモニエ接着の 阻害を示す。１３ｍ＋１のガラスカバースリップ上で成長するＷ　ｉ　Ｄ　ｒ細 胞への（１Ｈ〕　−マイコプラズマ・ニューモニエ接着は、”物質及び方法”に 記載されたように測定される。指示された濃度での硫酸デキストランまたは３″ −シアリルラクトースによる、または１００μｇ／−の硫酸デキストランと５ｍ Ｍの３′−シアリルラクトース（３°　ＳＬ＋Ｄ、Ｓ、’）による阻害は、阻害 剤無しのＲＰＭＩ／ＢＳＡ中で測定された対照結合に基づいて計算される。結果 は阻害パーセント（阻害剤無しの対照結合の測定のためのｎ＝８に対するｎ＝４ の平均±Ｓ、Ｄ、）として示される。

図１０は本発明を実施するための好ましい装置の断面図である。

発明の詳細な説明 ここで使用される用語″抗体″は多クローン性の抗体またはモノクロナール抗体 に関する。多クローン性の抗体が好ましいにもかかわらず、望ましい“抗原°に 適当な結合能力を有するモノクロナール抗体が代わりに置換されてもよい。

用語１体液”は、ヒトの液状生成物、例えば、唾液（ｓｐｕｔｕｍ、５ａｌｉｖ ａ）　、血漿、腹膜液、脳を髄液等のいずれにも関する。

ここで使用される用Ｎ”酵素で標識された抗体１は、酵素、例えば、アルカリホ スファターゼ、パーオキシダーゼ等で標識された抗体に関し、該抗体は以下で定 義されるように化学指示薬で反応することができる。

ここで使用される用語”酵素標識指示薬″は、好ましくは色の変化により、基質 の被覆表面に結合した酵素で標識された抗体の存在を示すための化学指示薬に関 する。

例えば、ｐ−二トロフェノールホスフェートは、酵素ア本発明の他の適用範囲は 、下記の詳細な説明から明らかになるだろう。しかし、本発明の好ましい具体例 を示している詳細な説明および特別な実施例は、実例としてのみ与えられると理 解されるべきであり、そのため、本発明の意図および範囲内での種々の変化およ び修正は、この詳細な説明からその分野の当業者に明らかとなるだろう。

実施例１ ）　４４Ｆ−０４０８およびＭ、５，０００．　ロフト７７Ｆ−０６３４）、フ コイジン（ｆｕｃｏｉ＋Ｈｎ）、フロミン酸（ｃｏｌｏｍｉｎｉｃ　ａｃｉｄ） 　（Ｂ、Ｃｏ１１）、ヒアルロネート（ｈｙａｌｕｒｏｎａｔｅ）、ジパルミト イルホスファチデルコリン（合成品）、コレステロール（品位Ｉ、９９％）、コ レステロール　３−スルヘート、およびウシ血漬アルブミン（Ａ７０３０脂肪酸 とグロブリンが無い）等は、シグマ社からであった。ウシの肺のヘパリン（１６ ０単位／■）は、アブジョン社からであった。ＲＰＭＩ　１６４０培地はビオフ ルイド（Ｂｆｏｆｌｕｊｄｓ）社から購入した。

糖脂質・−ウシの脳のスルファチド（ガラクトシルセラミドＩＩ−スルヘート） 、セラミドモノへキソシド（ｃｅｒａｍｉｄｅ　ｍｏｎｏｈｅｘｏｓｉｄｅ）、 セラミドトリヘキソシト（ｃｅｒａｍｉｄｅ　ｔｒｉｈｅｘａｓｉｄｅ）＋　グ ロボシド（ｇｌｏｂｏｓｆｄｅ）、およびガングリオシド（ｇａｎｇｌｉｏｓｉ ｄｅｓ）Ｇ　Ｍ　１およびＧＤｌａはスペルコ（Ｓｐｅｌｃｏ）社から取得した 。ラクトシルセラミドとグルコシルセラミドはカルビオケム（Ｃａｌｂｆｏｃｈ ｅｍ）社からであった。他の参考のガングリオシド類はバケム社（Ｂａｃｈｅｍ 、Ｉｎｃ、）からであった。セミノリビド（β−ガラクトシルアルキルアンルグ リセロール＝ＩＩ−スルヘート）は、前述したように、ウシ標本（ペルーフリー ズバイオロジカルス（Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）社から単 離した（ロバーツ、Ｄ、Ｄ、、ウニウェル、Ｕ、Ｍ、、リオツタ、Ｌ８人、、お よびギンスブルグ、Ｖ、、Ｃａｎｃｅｒ　ｌ？ｅｓ、。

４８．３３６７−３３７３　（１９８８））。ガラクトシルセラミド１６−スル ヘートは、前述のようにして、ガラクトシルセラミドの硫酸化により製造し５た （ロバート、Ｄ、Ｄ、、ラオ、Ｃ，Ｎ、、　リオブタ、Ｌ、Ａ、、グラルニック 、Ｈ，Ｒ，，およびギンスブルグ、　Ｖ、、　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋＋＋、、　２６１．６８７２−６８７７（１９８６））。硫 酸化したグルタ０）’／ルバラグｏポジｌ’　（ＩＶ’　−［３’　Ｓｏ、Ｇｌ ｅＡ］−ｎＬｃｏｓｅ＊　Ｃｅｒ）は、ヒト末梢神経から精製した（チョウ、Ｄ 、に、Ｈ，、イルアス、Ａ、Ａ、。

エバンス、Ｊ、Ｅ、、ニステロ、Ｃ０，クアルＬ／ス。

Ｒ，Ｈ，、およびジャンガルワラ、Ｆ、Ｂ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、肋！ムユ」彰ユ１ １７１７−１１７２５（１９８６））。ラクトシルセラミド−１１’　〜スルヘ ート、ＧＭ３．およびシアリルラクトフコベンタオンル−（Ｉｌ＋　）〜セラミ ドは、ヒトの腎臓から＃ｌ！２した （マーテンソブン、Ｅ、、Ｂｊｏｃｈｉｍ、、Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、　Ａｅｔａ。

Ｄ、、およびダブロースキ、Ｊ、、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０．、＝５３ １０−５３１９（１９８１））。α−がラクトシルパラグロボシド（ａ　−Ｇａ ｌａｃｔｏｓｙｌｐａｒａｇｌｏｈｏｓｉｄｅ）　（Ｗ　”　Ｇ　ａ　１　ｎ　 Ｌ　ｃ　Ｏｉ；ｅａｃｅｒ）とＪ−活性−ａＧＩａｓラクトイソオクタオンルセ ラミドをウサギの赤血球から精製した（ペルーフリーズ　バイオロジカルス（Ｐ ｅｌ−ＦｒｅｅｚＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）社）（ワタナベｌ　Ｋ、、ハコモリ 、Ｓ、、チルズ、Ｒ，Ａ、、およびフエイジ、Ｊ、、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ ｍ、。

影這４．３２２１−３２２８（１９７９））。ラクトイソオクタオシルセラミド は、後者の脂質をコーヒー豆−α−ガラクトシダーゼで処理することにより製造 した。Ｃ２−３−シアリルバラグロボシド（ＮｅｕＧｅ）、Ｃ２−３−シアリル ラクトネオへキサオシルセラミド、ＧＭ３　（ＮｅｕＧｃ）、および１−活性− ガングリオシドは、ウシの赤血球から製造した（ホタ士べ、に、、ボウエル、Ｍ 、Ｅ、、およびハコモリ、Ｓ、。　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２５４． ８２２３−８２２８（１９７９））、ａ　２−３−−シアリルバラグロボシド（ ＮｅｕＡＣ）は、０型−ヒト赤血球（アンド、ｓ、フン、に、。

イソベ１Ｍ、、　ナガイ、Ｙ、、およびヤマヵヮ、Ｔ、。

Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、７９，６２５−６３２（１９７６））、バラグロボシド とラクトネオヘキサオンルセラミドは、１００”Ｃで６０分間にわたる１Ｍギ酸 による各々のガングリオシドの脱シアル化（ｄｅｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ）によ り製造した。アシ７口（ａｓｊａｌｏ）　−Ｇ　Ｍ　１とアジアＤ−ＧＭ２は、 前述したようにして製造した（クリバニ／、Ｈ，Ｃ，，ロバート、Ｄ。

Ｄ６．　およびギンスブルク、　Ｖ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｊ、、８５．　６１５７−６１８１（１９８８））。

ラクト−Ｎ−ドリアオシルセラミドは、ウシ試験β−ガラクトシダーゼ（ベーリ ンガー　マンハイム社）でのバラグロボシドの消化により製造した。

ネオラクト系の＃！脂質の同定は、ノイラミニダーゼ−消化の前後に、モノクロ ナール抗体Ｍ　ｙ−２８で免疫染色することにより確定した（スビタルニク、Ｓ 、Ｌ、。

シュワルツ、Ｊ、Ｆ’、、マグナニ、Ｊ、Ｌ、、ｒｙバート。

１１）、Ｄ、、スビ９ル＝’）、Ｐ、Ｆ、、シビン、Ｃ，１，，およびギンスプ ルク、Ｖ、、Ｂｌｏｏｄ、６６、　３１９−３２６（１９８５））。

ガラクトシルセラミド　ＩＩ−スルヘート、ガラクトシルセラミド　ＩＩ−スル ヘート、コレステロールスルヘ−１・、グルコシルセラミド、ガラクトシルセラ ミド、ラクトシルセラミド、アシアロ（ａｓｉａｌｏ）　−〇　Ｍ　１　、およ びアシアロ−ＧＭ２の濃度は、乾燥型により決めた。

他の４酸化した糖脂質は、ギーンによる染料−結合検定（キーン、Ｅ、　Ｌ、、 Ｊ、　１ｊｐｉｄ　Ｒｅｓ、、９．　３１９−３２７（１９６８））により、タ ダノーアリト・ミと、イシズヵ（タダノ〜了すトミ、に１．　およびイシズヵ、 １．．Ｊ、−ふＪ」−」−力は２２４．　１３６８−１．３７５（１９８３）） により改良したようにして測定しまた。表１に掲載した他の中性または酸性の糖 脂質の濃度は、標準試料と比較するオルシノール−染色度一層クロマトグラムの デンシトメーターにより測定した（クイックスカン、ヘレナ　ラボラドリース） 。

全ての糖脂質の純度は、中性と酸性の溶媒系で薄層クロマトグラフィーにより確 認した。

脂質は、正常のヒトの肺、気管、およびＷ　ｉ　Ｄ　ｒ細胞から抽出し、（クリ パン、Ｈ，Ｃ，、ロバ−ト、Ｄ。

Ｄ、、　およびギンスブルク、　Ｖ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、、鉄工６１５７−６１６１（１９８８）　ニスペネルホルム、Ｌ、。

およびフレッドマン、　Ｂｉｏｃｈｊｍ、　Ｂｉｏ　ｈｙｓ、　Ａｃｔａ、６１ ７゜９７−１０９（１９８０））　重炭酸塩型のＤＥ八へ−セファロースＬ陰イ オン交換クロマトグラフィーにより中性と酸性のフラクションに分離した。

ある種の実験のために、Ｗ　ｉ　Ｄ　ｒ細胞を［”Ｓ］−硫酸塩（ＩＣＮラジオ ケミカルス社）で代謝的に標識化した。標識化は、１０％胎児ウシ血清、１０％ ＲＰＭ１１６４０、および１００　ｕｃ　ｉ／ｍ　ｌ　［”Ｓ］−硫酸塩（全硫 酸塩濃度は８０μＭ）で、ハムスＦ１２培地中で４８時間にわたり行った。

Ｗ　ｉ　Ｄ　ｒ細胞内における細胞内プールでの［”Ｓｆ−硫）除塩の乎衡は、 ４時間以内に完全になる（イオツす、Ｒ，Ｖ、、Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉａｌ、 、９９．　４０３−４１７（１９８４））。

スルヘ−１・担体の濃度は、含硫黄アミノ酸の代謝によりそＩノでスルヘ−１・ 担体の薄い濃度による硫酸化で、細胞内硫酸塩プールの希釈を最少にするように 遺沢した（イオツォ、Ｒ，Ｖ、、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｌｌ、、　２６２． １８８８−１９ＱＯ（１９８７）　；ハムフリース、Ｄ、Ｅ、、シルバード、Ｃ １Ｋ、、　およびシルバー１−、　Ｊ、　Ｅ、、Ｊ、　Ｒｉａｌ、　Ｃｈｅｗ、 、　２５鉦３０５−３０８（１９８８））。か（して、これらの条件下で取り込 まれたスルヘートの特定活性は、培地中のそれと等しくなければならない。細胞 は、培地を除きそしてリン酸塩−緩衝塩水、ｐＨ７，３中の２．５ｍＭ　ＥＤＴ Ａを添加することにより、組織培養フラスコから移した。３７℃で６０分間培養 した後、細胞を遠心分離により集めそして上述のようにして抽出した。塩析した 脂質抽出物を、クロロホルム：メタノール二〇、２５ＫＣＩ水溶液（５：４・１ ）またはクロロホルム：メタノール：アセトン：酢酸：水（８：２・４　：　２ 　：　１）で展開する高速薄層クロマトグラフィーにより分析した。

標識化した硫酸化糖脂質は、オートラジオグラフィーにより可視化しそしてバン ドをかきとりそしてシンチレーシタン計数することにより定量した。組織抽出物 中の硫酸化した糖脂質は、高速薄層クロマトグラフィーで分離した脂質を　＋ｔ ｓエーフォン・ヴイレブランド因子（ｖａｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄ　ｆａｃｔｏ ｖ）（ロバート、Ｄ、Ｄ、、ウィリアムス、Ｓ、Ｂ、、グラルニック、Ｈ，Ｒ， ，およびギンスプルク、Ｖ、、Ｊ、Ｂｊｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、２６１．　３３０ ６−３３０９（１９８６））で染色して検出した。

有機体の生育と標識化−・−・継代培養数４−６の猛毒のＬユｎｅｕｍ旦ｉａｅ 　Ｍ　１２９株を生育し、前述（チャンドラ−、Ｄ、に、Ｆ、、コリール、Ａ、 Ｍ、およびパリレ。

Ｍ、Ｆ、、１ｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、、　３７−９４２（１９８２））　シ たように、　［”Ｈ］　ハＡｔミｆンｍ　（１２−１７Ｃｉ／　ミ＋Ｊモル、ニ ューイングランド　ヌクレア社、ボストン）で代謝的に標識化した。有機体を２ ６注射針に４回通過せしめ、そして　１％ウシ血清アルブミン（シグマ社、脂肪 酸無し）と２５ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７，３（ＲＰＭＩ−Ｂ　Ｓ　Ａ）を含有 する脱気したＲＰＭＩ　１６４０培地の約１１０７ｃｐ／ｍｌ中へけん濁した。

マイコプラズマ被覆（ｏｖｅ「１ａ）検定−他の細菌について詳細に記述しであ るようにして、Ｍ、ｎｅｕｍｏｎｉａｅを、薄層クロマトグラフィー上分離した 糖脂質に結合した（クリパン、Ｈ，Ｃ，、ロバート＋　Ｄ、Ｄ、、およびギンス ブルク、Ｖ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、８５．　６１５ ７−６１６１（１９８８）　；クリパン、Ｈ，Ｃ，、ギンスブルク。

■、およびロバーツ、　Ｄ、　Ｄ、、　Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

虹」頃ニエエ　虱４９３−４９６（１９８８））。

簡単に説明すると、クロロホルム：メタノール＝０゜２５％ＣａＣ１を水溶液（ ６０：３５：８）で、糖脂質をアルミニウムを基板にしたシリカゲル高速クロマ トグラフィー板（メルク、西独）展開により分離した。クロマトグラフィーの後 、板に０．１％ポリイソブチルメタクリレートを塗布し、食塩　１１０ｍＭ、Ｃ ａＣｌ５５ｍＭ１フエニルメタンスルホニルフルオライド　０゜２ｍＭ、および ウシ血清アルブミン１％を含有する０゜０５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７，６ （ＴＢＳ−ＢＳＡ）中に浸漬し、そして６０μｌ／ｃｍ！の　［”Ｈ］−標１し た　Ｍ、ｎｅｕｍａｎｉａｅ　（約１１０７ｃｐ／ｍｌのＲＰＭＩ−ＢＳＡ）で 、２５℃で３時間にわたり培養する。

その板を食塩　０．１５Ｍを含有する０、０１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７，２ （ＰＢＳ）中で静かに５回洗浄し、結合しなかった有機体を除き、乾燥し、そし てウルトロフィルム（Ｕｌｔｒｏｆｉｌｍ）　”Ｈ（２２０８−１９０）高速フ ィルム（ＬＫＢ）に２４時間暴露した。

糖脂質を、クロロホルム／メタノール１０，２５％ＣａＣ１，水溶液、６０　： 　３５’　：　８中で展開するアルミニウムを基板にしたシリカゲルＨＰＴＬＣ 板上クロマトグラフィーした。その板をプラスチックで被覆し、Ｔｒｉｓ−ＢＳ Ａ中に浸漬し、そして、材料と方法に記述したように（パネルＡ）、１％ＢＳＡ と２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７，３を含有するＲＰＭＩ　１８４０中にけん濁 した［”Ｈ］−パルミテート標識したＬ」旦憇旦ｉａｅを、２５℃で３時間培養 するか；糖脂質を同定するためにオルシノール試薬を散布する（）寸ネル−Ｂ） 　。

結果を図（Ｆｉｇｕｒｅ）１に示す。

レーンａ、酸性糖脂質標準スルファチド（０，５μｇ）。

ＧＭ３　（２μｇ）、０Ｍ２　（２ａｇ）、ＧＤＩ　ａ　Ｃ２ａｇ）、ＧＴｌｂ 　（２μｇ）； レーンｂ、中性標準ガラクトシルセラミド（４μｇ）。

ラクトシルセラミド（４μｇ）、グロボトリアオシルセラミド（２μｇ）、およ びグロポテトラオシルセラミド（２μｇ）　； レーンＣとＣ＋＋　スルファチド（２μｇ）＋　Ｃｔ　（０，５μｇ）およびＣ Ｉ　（０，１ａｇ）： レーンｄ、セミノリビド（２μｇ）； レーンｅ、コレステロールー３−スルヘート（２μｇ）；レーンｆ、生重量１０ ０ｍｇからのヒト気管酸性糖脂質； レーンｇ、生重量１００ｍｇからのウシ赤血球からのモノシアロガングリオシド ： レーンｈ、α２−３シアリルパラグロボシド（２μｇ）；レーンｉ、ウシー赤血 球からのＩ−活性モノシアリルガングリオシド（２μｇ）： 略語については、脚注１と表１を参照のこと。

Ｍ、ｎｅｕｍｏｎｉａｅに結合する能力を試験した糖脂質の結果を表工に示した 。

衣−−１ ４芸 スルフ７チド　＋３５０４１ スルファチド　１６ｓｏ４） ラクトノルスルファチド セミノリピド グルコンル七ル（ＣＭＨＩ ラクトノス・七ル（ＣＤＨＩ ラクト−Ｎ−）すｒオノルヤル ｒＸシクロＩノド ａ　−ガラクトシルバラグロ孝ノド ガラクトノルヤル　（Ｃｌｌ Ｓ０４−クルクロノノルバラグロボンドトリへえソンル士ル　（Ｃ：　Ｔ　Ｈ１ １〕ｊ口　に１Ｍ２ クロボノド　１ＧＬ４１ １７１口　１１ ＧｋＡ３　（ＮｅｕＧｃｊ １Ｍ２ Ｇ＆１ｔ ）１リルバラクロｌノド ノ１リルバ）クロ２ノド　（ＮｅｕＧｃ）ソｌリルネオラクトフコベノクオンル 士ルＣ＋　０１　ａ ＧＤ］ｂ 級澄　ＧＴｌｂ ＋　＋　＋　ノアジルネオラクトへキサオシル七ル＋　＋　＋　Ｉ−活性ノＹリ ルラクトイソ才りタオシルヤル＋＋＋　１−活性ラクトイソオクタオンル士ル十 　＋　＋　Ｉ−活ｆｆ　Ｇａ１ａ−ラクトイソｔクタオノルヤル＋ ＋＋　０負の結合　（−）は脂質４ｕｇへの結合が無いこと４峠　し、また正の 結合は脂Ｗ、ｏ、５μｇ未満　（＋＋＋ｌ、＋　、５ないし２ｕｇ　Ｄ＋）そし て２ないし４ａｇ（＋＋　への結合を示す。

−固相結合分析−マイクロ力価プレーｈ　（Ｆａｌｃｏｎ　３９１−　Ｂｅｃｔ ｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に固定化された精製された糖脂質−の１…ｕｆｆｉ ｏｎｉａｅの結合を上記したように測定した（Ｋ。

ａｎ、　Ｂ、Ｃ，、Ｇｉｎｓｂｕｒｇ、　Ｖ、及びＲｏｂｅｒｔ＋ｑ、　Ｄ、Ｄ 、、Ａｒｃｈ、　ｌ″″ｃｈｅｗ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、、２６０．４９３−４９ ６　ｆｉ９ａａｌ）　、精製糖脂質−補助脂質コレステロ−・ル及びホスファチ ジルコリンの−・ノ０．１ｕｇを含むメタノール２５　ｔｔ　ｌ中に連続的に− 釈した。溶液を蒸発により乾燥した後、ウェルをＴＢニー　ＳＡで充填し、１時 間後に空にし、　ＲＰＭＩ−ＢＳＡで濯ぎ、−して［３Ｈ］−Ｍ、旺紐虹駐ど２ ５μｍ　（ＲＰＭＩ−ＢＳＡ約１０ｃｐＩＩＩ／ｍｌ　）を培養した６３７℃に て２時間（他に言及し−い限り）の培養の後に、ウェルを生理的食塩水で５回− 浄しそして結合したＩｎ　ｅ　ｕ　ｍ　ｏ　ｎ　ｉ　ａ　ｅをアクアゾル中での ン壬し−ション＝１数により定量した。阻害研究のため、種りの多糖類をマイク ロ力価ウェル中の　ＲＰＭＩ−ＢＳＡ　２５ｕ　ｌ　ｉｍ連綺的に希釈し続いて ［”Ｈ］−Ｍ、　ｎｅｕｍｏｎｉａｅ２５　ｕｌを添加した７６ ↓ｌ−硲至」乞ヱ／−三エユＸ？ＪＩＪｉ、−ガラス被覆スリップ十の細胞・＼ のｉ”Ｈ］−１Ｊ、　ｎｅｕｍｏｎｉａｅの接着を一北記した方法のｆｆｆｇに より測定した（　Ｃｈａｎｄｌｅｒ、　Ｄ、に、Ｆ、、　Ｇｏｌｌｉｅｒ。

ＡＭ、及びＢａｒｉｌｅ、　＆１．Ｆ、、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、、　 ３７−９４２　（１９８２１）、　Ｎｉ１）ｒヒト結腸腺癌（ＡＴｃｃ　ＣＣＬ 　２１８１　をＥａｇｌｅｆｉ小必須培地において１０％ウシ胎児血清ＩＢｉｏ ｆｌυ１ｄｓ）とともに５％ＣＯ２雰囲気中で３７℃にて成長させた。細胞をト リプシンで除去しそして２４−ウェル組織培養プレート中の１２ｍｍ円形グラス カバースリップの上に置きそして３日の間成長させた。対照カバースリップを細 胞無しの培地中で予備培養した。カバースリップを血涜無し培地中で洗浄しその 後ＲＰＭＴ−ＢＳＡ中で１５分の間培養した。培地を除去しそしでＲＰ１４Ｉ− ＢＳＡ　Ｏ、５■１中に！！濁さノまた標識化Ｌｌ巳１１讃０旧鱈を各々のウェ ルに加えた。プレー１−を揺りテーブル上で６０分間３７℃にて培養した。

カベ−スリップを生理的食塩水中に６回浸漬することにＪニリ洗浄し７そして結 合した放射性細菌をシンチレーション計数により測定した。阻害研究のために、 阻害剤を、細菌をカバースリップに加える前に、（」」ヱｕｍｏｎｉａｅに加え た。

結　果 ｍ−ビー１ラフ＜二ュＯＦ　”ゴ）　１１．　ｎｅｕｍｏｎｉａｅ（７）Ｌ−薄 層クロマトグラフィーで解析された種々の糖脂質を用いたげＨ］−標識化υｎｅ ｕｍｏｎｉａｅの培養を、有機組織の糖質結合特異性を決定するのに使用した。

オルシノール試薬で目に見えるようにされた同様の薄層プレート（Ｆｉｇ、　Ｉ Ｂ）との比較で、オートラジオグラフィー（ＦｉｇＩＡ）により示すように、Ｍ 、　ｒＢ４１Ｈ１ｏｎｉａｅは真正のスルファチドに禽欲に結合し、該糖脂質１ １００ｎを検出しくレーンＣ，ｌ、そしてヒト気管の酸性脂質フラクション中で スルファチドと同じ程度の移動度をもつ糖脂質と結合した（レー　ンｆ）。この 気管糖脂質は　１２″′■−標識化されたｖａｎ　１ｆｉｌｌｅｈｒａｎｄ　ｆ ａｃｔｏｒ　（Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｄ、Ｄ、、Ｗｉｌ、１ｉａｗ、Ｓ。

Ｂ、、　Ｇｒａｌｎｉｃｋ、　Ｈ，Ｒ，及びＧｉｎｓｂｕｒｇ、　Ｖ、、　Ｊ、 Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、。

２６１、３３（１５−３３（１９（１９８６）　）を用いてその特異的な染色に よりスルファチドであることを確認した。またスルファチドはヒト肺脂質中での 検出したが気管におけるよりもより低い水Ｉであった。またＭ、　ｎｅｕ＋ｍｏ ｎｉａｅはラクトシルスルファチド及びセミノ？ノビドを含む他のスルフェート 化糖脂質にも結合し、この脂質はスルファチドとして同じ末端Ｇａｌ　！３ＳＯ ，１β１−残基、及び末端スルフェートがガラクＩ・−スの６位に結合している スルファチドの異性体を含む。興味あることに、Ｍ、　ｎｅｕｓ＋ｏｎｉａｅは また大量のラクトジルセラミドと結合しそしてより少ない量でグリコジルセラミ ド、バラグロボシド、ラクトドリアオシルセラミド及びａ−ガラクトシルバラグ ロボシドとも結合するが、他の中性の糖脂質とは結合しないＣ表■〕。Ｃ２−３ 〜シアリルバラグロボシド、■−活性モノシアリルガングリオシドを含む他の酸 性糖脂質とも、あるいはガングリオシドＧＭ３、　ＧＭ２、ＧＭｌ、ＧＤｌａ、 　ＧＤｌｂ、及びＧＴｌｂとも結合しないことを検出した。加えて、Ｍ、　ｎｅ ｕｍｏｎｉａｅは、グルクロン酸の３位に結合された末端スルフェートを何する ところの、大量のコレステロールスルフェートともまたはスルフェート化グルク ロノシルパラグロボシドとも結合しないので、スルフェートそれ自体は結合のた めに充分では無い。

マイクロ力　プレートにおいて　イされた　２　へのＭ、　ｎｅｕｍｏｎｉａｅ の　Ａの　−マイクロ力価プレート上に吸着された精製糖脂質へのＭ、　ｎｅｕ ｍｏｎｉａｅの結合を、結合特異性を明確にするためにさらに調べた。スルファ チドへの結合は鋭敏でありかつ用量−依存である（　Ｆｉｇ、２参照）。１１． 　ＨＢｏｎｉａｅはラクトシルセラミド及びバラグロボシドに弱く結合し、一方 、各ウェルにつきｌＯＬＬｇで試験されたコレステロールスルフェートまたは他 の糖脂質への結合は検出されず、オーバーレイ分析より得られたデータと一致す る。スルファチドへのＭ、　ｎｅｕｍｏｎｉａｅの結合はエネルギー及び温度の 両方に依存する（　Ｆｉｇ、３参照）。３７℃で最大結合の半分のためにスルフ ァチド約０．２５μｇが必要であった。結合活性は２５℃で約１１５倍により低 くそして４℃で最小であった。またＬｎｅｕｍｏｎｉａｅは栄養不足培地（ＲＰ ＭＩ無しのＴｒｉｓ−ＢＳＡ）において３７℃で、４℃で得られたものに匹敵す る結合活性でもって、貧弱に結合した（　Ｆｉｇ、３参照）、これらの結果は、 最大の結合が起きるためにはＭ、　ｎｅｕｓｏｎｉａｅはエネルギー及び生理学 的温度を必要とすることを示唆している。

実施例２ マウスのエンジェルプレス　ホルム　スワーム腫瘍（Ｂｎｇｅｌｂｒｅｔｈ　Ｈ ｏ１ｍ　Ｓｗａｒｍ　ｔｕｍｏｒ　）から精製されたラミニンは、ドクター　ラ ンス　リフツタ（Ｄｒ、　Ｌａｎｃｅ　Ｌｉｃｔｔａ）、ＮＣ１，ＮＩＨによっ て提供された。トロンポスボンジンは、トロンビン−免疫化人間血小板から精製 された〔ロパーツ、ディー、ディ＋、（Ｒｏｂｅｒｔｓ、　Ｄ、Ｄ、　）　。

ハヴアースティック、ディー、エム、（Ｈａｖｅｒｓｔｉｃｋ、　Ｄ。

Ｍ、）、ディキット、ブイ、エム、（Ｄｊｘｉｔ、　Ｖ、Ｍ、　）　、フレイザ ー、ダブリュ、エイ、（Ｆｒａｚｉｅｒ、　Ｗ、Ａ、　）　＋　サントロ、ニス 、エイ、（Ｓａｎｔｏｒｏ、　Ｓ−Ａ、　）及びジンスバーグ、ブイ、（Ｇｉｎ ｓｂｕｒｇ、　Ｖ、）　、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、２６０．９４０５ 〜９４１１　（１９８５）　）。人間良策フィブロネクチンは、コルラボラティ プ　リサーチ、インコーホレーテッド（Ｃａｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅ ａｒｃｈ、　Ｉｎｃ、）製であったａ人間絨毛膜ゴナドトロピン（ｈＣＧ）’及 び精製アルファサブユニットは、ドクター　ブルーチェ　ワイントロープ及びベ ーター　ギブス（Ｄｒｓ、　Ｂｒｕｃｈｅ　ａｎｄ　Ｐｅｔｅｒ　Ｇｙｖｅｓ　 ）　、　Ｎ　ＩＤＤＫ、ＮＩＨによって提供された。殆どの他のプロティン、デ キストランスルフェートＭｒ　５０００００及びノイラミニダーゼ〔クロストリ ジウム　パーフリンゲンス（Ｃｈｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎ ｓ）　、　タイプ■〕は、シグマ（Ｓｉｇｍａ　）から入手された。

人、間の乳からの６′−シアリルラクトースは、ドクター　ダヴイッド　スミス （Ｄｒ、　Ｄａｖｉｄ　Ｓｍ１ｔｈ　）　、デパートメント　オブ　バイオケミ ストリー　アンド　ニュートリジョン（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｂｉｏｃ ｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　ＮｕｔｒｉｔｉＯｎ）、ヴアージニア　ポリテクニ ック　インスティチュート　アンド　スデイト　ユニヴアーシティー（Ｖｉｒｇ ｉｎｉａ　Ｐｏ１ｙｔｅｃｈｎｉｃ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ａｎｄ　５ｔａｔｅ 　Ｕｎｊｖｅｒｓｉｔｙ　）によって提供された。３′−シアリルラクトースは 、人間の乳から又は牛の初乳から得られるシアリルラクトース異性体混合物〔ボ エリンジャー　マンハイム　バイオケミカルズ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎ ｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）　）から単離された。

３′−シアリルラクトースへの６′−シアリルラクトースの混入は、ＡＳ−６カ ラム〔ジオネックス　コーポレーション（Ｄｉｏｎｅｘ　Ｃａｒｐ、）　＋サニ ーヴエイル（５ｕｎｎｙｖａｌｅ　）　、　ＣＡ）上でのアニオン交換クロマト グラフィーによって決定された如く２％未満であった。

牛のフェチュイン（シグマ）５００ｍｇからのオリゴサツカライドは、フラボバ クテリウム　メニンゴセプチカム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｆｕｍ　ｍｅｎｉｎ ｇｏｓｅｐｔｆｃｕｍ）　（ボエリンジャー　マンハイム）〔クレソチン、エイ 、エル（Ｔａｒｅｎｔｉｎｏ、　Ａ、Ｌ、　）　、ゴメズ２　シー、エム、（Ｇ ｏＩｌｅｚ、　Ｃ，Ｍ、　）及びプラマー、アール、エイチ、（Ｐｌｕｍｍｅｒ 、　Ｒ，Ｈ，）　。

Ｊｒ、、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、２４．４６６５−４６７１　（１９８５）　）から 得られるペプチド−Ｎ（Ｎ−アセチルグルコサミニル）アスパラギンアミダーゼ Ｆ、２０単位とともに１０ｍＭβ−メルカブトエタノール、１ｍＭ、ＥＤＴＡ及 び０，１ｒｎ、Ｍフェニルメタン・スルホニルフルオリドを含むｐＨ８，６の０ ２Ｍ鱗酸チェリウム中での温浸−によって放出された。、７スバラギ〕結合オリ ゴナシカライドの疋棗的除ｊ５のために、フ４千ユイン１０ｒｎｇを３７℃で４ ８時１司、酵素１０単位とともに温浸し、た。Ｎ−Ｍｉ合蔗糖の完全、Ｉよ放出 は、ＳＤＳゲル電気泳動〔タ！７ン介）、エイ、エル、ゴメズ。

ソー、エム、及びプラマー、アール　エイヂ、　、　Ｊｒ、、Ｂｉｏｃｈｅｍ、 、２４．４６６５−４６７１　（１９８５’）　）においてプロティンの移動を 変化させることによって達成された。続く酵素処理において、プロディンをエタ ノールを用いて沈澱させ、次いでフェチュイン５００ｍｇから放出されたオリゴ サツカライドをｐＨ５で５０ｍＭピリジニウムアセテ−１・中でセファデックス Ｇ−２５により脱塩して、オリゴサツカライド３０ｍｇを得た。このオリゴサツ カライド（］、３３２ｇを、コンカナバリ：／Ａセファロースの２５ｍ１カラム 上で分別した。三階角状のすリボサツカライドは空孔容積中に溶出され、次いで 二階角状のフラクシヨン（０，５ｍｇ）がメチル−ａ−Ｄ−ゲルコンド２０ｍＭ を用いて溶出された。このオリゴサツカライドをゲル濾過ｌを用いて脱塩し、次 いで凍結真空乾燥１ノた４、ンアジル酔は周期的な酸−レゾルシノール分析（ａ ｃｉｄ−ｒｅｓｏｒｃｉｎｏｌ　ａｓｓａｙ　）　（ジターディアン、ジー、ダ ブリュ、（Ｊ。

ｕｒｄｉａｎ、　Ｇ、Ｗ、）　、　ディー：／、エル、（Ｄｅａｎ、　Ｌ、　） 及びローゼマン、ジェイ、（Ｒｏｓｅ＋＋＋ａｎ、　Ｊ、　）　、　Ｊ、　Ｂｉ ｏｌ、　Ｃｈｅｍ、。

２４６、４３０−４３５　（１９７１）　）によって決定し、次いで炭水化物組 成物をジオネプクスＡＳ−６カラムＬでのアニオン交換クロマトグラフィーによ っ〔決定した〔バーディにム、アール、（Ｈａｒｄｙ、　Ｍ、Ｒ，）　、タシ″ ｊンセンド、アール、アール、（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ、　Ｒ，Ｒ，）及びり−、ク ワイ。−。

（Ｌｅｓ、Ｙ、Ｃ，）　、Ａｎａｌｙｔ、Ｂｉｏｃｈｅｎ、、１’７１１．５４ −６２　（１９８８））　、　Ｅ−触角状及び二階角状フラクシフンは、各々オ リゴサツカライド１モル当たり〕アリル酸３６２モル及び１゜９モルを含んでい た。′）オネックスＡ　Ｓ　−６カラムＬでの５０ｍＭＮａＯＨと１１００ｒｎ 酢酸ヲートリウムに関するアニオン交換クロマトグラフィーによるシアリルオリ ゴサブカライドの分析によって、二階角状オリゴサブカライドは定量的にフンカ ナバ１１ンＡカラムＪ−に結合し、そしてこの二階角状フラクションは三階角状 オリゴナツカライドを含まないということがｇ＆認された。二階角状フラクショ ンは、人間トランスフェリン及びｈＣＧのα−サブ、ユニットからペプチド−Ｎ 　（Ｎ−’アセチルグルコサミニル）アスパラギンアミダーゼＦを使用して放出 された真正な二階角状ジシアリルオリゴザブカライドと同一の浩留時間でＡｓ− ６Ａカラム上で三重ピークとして溶出した〔クレソチン、エイ、エル、ゴメズ、 シー、エム、及びブラマー、アール、エイチ、　、　Ｊｒ、、Ｂｉｏｃｈｅｍ６ ，２４．４６６５−４６７１　（１９８５）　）。

フェチュインからの〇−結合オリゴサッカライドは、ＩＭ、ＮａＢＨ，，０，０ ５Ｍ、ＮａＯＨ中で４５℃、１６時間フェチュインプロナーゼ−抵抗性グリコペ プチド２０ｍｇをアルカリ性ボロハイドライド分解することによって放出される 〔エツジ、エイ、ニス、ビー（Ｅｄｇｅ。

Ａ、Ｓ、Ｂ、　）及びスピロ　アール　ジー（Ｓｐｉｒｏ、　Ｒ，Ｇ、　）　。

Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、２６２．１６１３５−１６１４１　（１９８７ ）　）　、還元されたシアリルオリゴサブカライドは、ｐＨ５で５０ｍＭピリジ ニウムアセテートを用いて溶出されるバイオゲルＰ−４（−４００メツシユ）上 でのゲル濾過によって精製された。ヘキソース及びンアジル酸は、各々フェノー ル−硫酸分析〔ダボイス、エム、（Ｄｕｂｏｉｓ、　Ｍ。）、ギレスケーイ、エ ーイ、（Ｇｉｌｉｅｓ、Ｋ、Ａ、）　、ハミルトン、ジエイ。

ケイ、（Ｈａｌｌｉｌｔｏｎ、　、１、Ｋ７）、レバース７　ビー、エイ、　（ Ｒｅｂｓｒｓ、　Ｐ、Ａ、）及びスミス、エフ、（Ｓ１ｉｔｈ、　Ｆ、　）　、 　Ａｎａｌｙｔ、、　Ｃｈｅｍ、、２８，３５０−３５６　（１９５６）　）及 び１ノゾルシノ一ル分析Ｃジコーディアン、ジー、ダブリコ、、デイーン。

ニル、及びローゼマン、ジエイ。、　Ｊ、　Ｒｉａｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２４６ 、４３０−４３５　（１９７１）　）を使用Ｉ２゜て決定し５た。

１５０ｍＭ、ＮａＣｌ、１ｍＭ、ＣａＣ１＊及び０゜０１９６ＮａＮ、を含むｐ Ｈ７，４のｏ−ｏＩＭ燐酸すトリウムに溶解したグリコプロティンを、４’Ｃで １６時間イン計コベーンヨン”ζることによりグラスデック（）丁刀ノコン（Ｆ ａｌｃｏｎ＞　３９１２ポリ塩Ｃビ；ル９６ウエルミクロ滴定板）−１−に吸着 させた。イノ６０ン２　リムービ・ウェル　フレーｔ’　ｔ＋ｍｍｕ＋ｏｎ　２ 　ｈｅｍｏｖｅａｗｅｉｉ　ｐｉａｔｅＪｘはファルコン１００７細菌学用ポリ スチレンも幾つかの実験において使用した。非結合プロティンを除去し、次いで ウェルをトリス−ＢＳＡを用いて充填し、次いで室温で３０分間インキュベーシ ョンした。ウェルを、ｐＨ７，３で２５ｍＭ、ＨＥＰＥＳ及び１％牛血清アルブ ミン〔ングマ無脂肪酸（Ｓｉｇｍａ　ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄ　ｆｒｅｅ　）　） を含むＲＰＭ１１６４０を用いて濯いだ。〔２Ｈ〕パルミテート［チャンドラ− 、ディニーケイ　エフ、（Ｃｈａｎｄｌｅｒ。

ＤＫ、Ｐ、　）　、コうイア−２エイ、エム、（Ｃｏｌｌｉｅｒ、　Ａ、Ｍ。

）及びバリル、エム、エフ、（Ｂａｒｉｌｅ、　Ｍ、Ｆ、）　、Ｉｎｆｅｃｔ、 Ｉｍｍｕｎ、、３５，９３７−９４２　（１９８２）　）を用いて標識されたエ ム。

ブノイモニア株ＭＩ２９を、２６番針を４回通過させることによってＲＰ　Ｍ　 Ｉ　−Ｂ　Ｓ　Ａ中に分散させ、次いでこの分散液５０μｍをつエルに塗布した 。３７℃で６０分間インキ１、ベーションし７た後、ウェルを生理食塩水を用い て５回濯ぎ、次いでプロチインに結合された６１朧化ゴム、ブノイモニアをＹタ アソール（Ａｑ＋Ｊａｓｏｌ　）中でシンチレーシ３ン計数する工とによって定 員し１．。

イ：ノギクベーション研究のプＪめに、ＲＰＭＩ−ＢＳＡ２５　ノ１１中の蔗糖 をラミニン（１０Ｍｇ／ｍｌ）、続いて〔５Ｈ〕　−エム、ブ７ノイモ二丁２５ μｍを塗布した前記ウェルに添加した。結合は、各剛害剤漉度にお（′ｌＩるト リブリケートの及び阻害剤が存在しないラミージー塗布及び非塗布ウェルの内方 に関１．５て決定された。幾つかの実験において、吸着されたプロティンはノイ ラミニダーゼを用いて予備処理した。プロティンの吸着及びトリス−ＢＳＡ中で のインキュベーション後、前記ウェルを１５０ｍＭ、ＮａＣ１，５ｍＭ、ＣａＣ １ｚ　、１ｍｇ／ｍ１牛血清アルブミン及び１ｍＭフェニルメタンスルホニルフ ルオリドを含むｐＨ５，５の５０ｍＭ酢酸ナトリウムを用いて３回濯いだ。ウェ ルを、２０℃で一晩、同−緩衝剤中又は酵素を含まない緩衝剤中で０．０５単位 ／ｍ１ノイラミニダーゼを用いてインキュベーションした。

ウェルを、トリス−ＢＳＡを用いて３回濯ぎ、次いで結合しているエム、ブノイ モニアを上記の如く決定した。

ノイラミニダーゼを用いた分解の前後の固定化プロティンへに対するモノクロー ナル抗体Ｍｙ−２１１（ドクター　カート　シヴイン（Ｄｒ、　Ｃｕｒｔ　Ｃｊ ｖｉｎ）　、ジョーンズホプキンズ　オンコロジー　センター（Ｊｏｈｎｓ　Ｈ ｏｐｋｊｎｓ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ　Ｃｅｎｔｅｒ　）　、バルチモア、ＭＤによ って提供された〕は、トリス−ＢＳＡ中の１：１０００希釈腹水液を使用して決 定された。室温で２時間インキュベージタン後、トリス−ＢＳＡを用いてウェル を３回洗浄した。

結合抗体は、ヨードケン法〔フラカー、ビー、ジェイ。

（Ｆｒａｋｅｒ、　Ｐ、　Ｊ、　）及びスペック、ジェイ、ジー、（Ｓｐｅｃｋ 、　Ｊ、Ｃ，）　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍ ｍｕｎ、、８０，８４９−８５７　（１９７８）　）によって１１６１を用いて 標識化された山羊抗−マウスＩｇＭ（キーケガード（Ｋｊｒｋｅｇａａｒｄ）及 びベリー（Ｐｅｒｒｙ　）　）を用いて検出された。

Ｗ　ｉ　Ｄ　ｒ細胞に対するエム、ツノイモニア接着ガラスカバースリット上の Ｗ　ｉ　Ｄ　ｒ細胞に対する標識化エム、ブノイモニアの接着は、添付紙〔クリ ヴアン。

エッチ、シー、（Ｋｒｉｖａｎ、　Ｈ，Ｃ，）　、オル））、ｘル、ディー　（ Ｏｌｓｏｎ、　Ｌ、Ｄ、　）　、バリル、エム、エフ、（Ｂａｒｊｌｅ。

Ｍ、Ｆ、）、　ギンスブルグ、ブイ、（Ｇｊｎｓｂｕｇ、　Ｖ、　）及びロパー ツ、ディー、ディー、（Ｒｏｂｅｒｔｓ、　Ｄ、Ｄ、　）　）　ニ記載の如く決 定された。インキュベーション研究のために、デキストランスルフェート及び３ ′−シアリルラクトースをＲＰＭＩ−ＢＳＡに溶解し、次いでＮａＯＨを用いて ｐＨを７．４に調整した。阻害剤を、培地又はトリス−ＢＳＡ中で予備インキュ ベーションしたブランクのオーバースリップの結合Ｗ　ｉ　Ｄ　ｒ細胞とともに 洗浄されたカバースリップを含むウェルに添加した。標識化エム。

プノイモニアを即座に添加し、次いで３７℃で６０分間ゆっくり振震しながらイ ンキュベージタンした。生理食塩水中に６回浸漬することにより前記カバースリ ップを洗浄後、結合したエム、ブノイモニアをアクアソール中でシンチレーショ ン計数することによって決定した。

結果 ラミニン、フェチュイン及びｈＣＧを包含する幾つかのグリコプロティンは、プ ラスチック上に吸着される場合にはエム、プノイモニアの投与量依存性及び飽和 性吸着を支持する（図６参照）。典型的には、添加されたエム、ブノイモニアの ２０ないし６０％が、飽和プロティン濃度において前記ウェルに結合した。非塗 布ウェルに対する不特定結合は、用いられた全放射能の０．３なり）し３％であ った。ガラス基材に対するエム、ブノイモニア結合【フェルドナー、ジエイ、（ Ｆｅｌｄｎｅｒ、　Ｊ、　）　、ブレット、ダブリュ（Ｂｒｅｄｔ、　Ｗ、　） 及びラジン、ニス、（Ｒａｚｉｎ、　Ｓ、　）　、　Ｉｎｆｅｃｔ、　１ｍｍｕ ｎ、、３１，１０７−１１３　（１９８１）　）エッチ、シー３．オルソン、エ ル、ディー、ノ（ジル、エム、エフ８．ギンスブルグ、ブイ、及びロノく−ツ、 ディー、ディー、）について報告された如く、結合はエネルギー依存性であり、 且つグルコースを有しないトリス−アルブミン緩衝剤中では結合は全（検出され なかった。

しかしながら、殆どのプロティンは本分析においては不活性である（図６及び表 Ｉ）。エム、ブノイモニア接着を促進するための幾つかのプロティンの相対活性 は、投与量応答曲線を比較することによって評価され、そして表■に要約されて いる。

表　１１ プラスチック上に吸着された糖タンパク質に結合スルマイコプラズマ・ニューモ ニエ タンパク質　相対的結合活性１ ＰＮＧアーゼ　Ｆ−処理　フェチュイン　０．０９ｈＣＧ　Ｏ，７ ｈＣＧα−サブユニット　０．８ ヒト血小板トロンポスボンジン　０．　７ヒト型ＭＭグリコホリン　０．０６ ヒトα１−酸糖タンパク質　０．０３ ニワトリオボムコイド　＜０．０１ ヒトトランスフエリン　＜０．０１ ヒトプラズマフイブリノゲン　＜０．０１ヒトプラズマフイブロネクチン　＜０ ．０１ウシ血清アルブミン　＜０．０１ １標識［”Ｈ］−マイコプラズマ・ニューモニエの結合は０．００６ないし２μ ｇの各タンパク質で被覆されたポリ塩化ビニル微小滴定ウェルについて測定した 。タンパク質の相対的結合活性は標識されたマイコプラズマ・ニューモニエ（典 型的には総量の１０ないし３０％が添加された）の最大結合の半分を与えるのに 必要とされるタンパク質の量により決定し、そしてそれは、おのおのの実験にお いて正の対照として含まれおよび１．０の値を割り当てたフェチュインに関して 表される。結果はおのおののタンパク質に対する２または３の実験の平均値であ る。

タンパク質ラミニン、フェチュイン、ｌ・ロンボスボンジン、ｈＣＧ、およびｈ ＣＧのα−サブユニットは同様の活性を有しモして１０ｎｇ未満の糖タンパク質 で被覆されたウェルへの接着を促進する。グリコホリンおよびα１−酸糖タンパ ク質は弱い活性である一方、他のタンパク質は本質的に不活性であり、試験した 最も高い水準（１−５μｇ／ウェル）にて加えたマイコプラズマ・ニューモニエ の１０％未満の結合を促進する。

また吸着タンパク質へのマイコプラズマ・ニューモニエ接着のための基質どして 、免疫２微小滴定プレーＦ・および細菌学用ポリスチレンを試した。結合が使用 プラスチックにより変化するけれども、活性種タンパク質および不活性糖タンパ ク質間の差異はすべて三種のプラスチックを用いて一貫して観察した。従って活 性の相違は多分活性種タンパク質の選択的吸着の人為結果ではない。

Ｎ〜デグリコシレ−１・化されたフェチュインは分析においてマイコプラズマ・ ニューモニエの接着におけるフェチュインの〇−結合シアリジルリゴ糖の役割を 調査するため試験される（表ＩＩ）、タンパク質は高濃度においてマイコプラズ マ・ニューモニエの接着を促進するが、そのままのフェチュインよりもおおよそ １０倍以下の活性である。グリコホリンの低い活性（表１１）もまた〇−結合オ リゴ糖槍玉α２３結合ンアル酸はＮ−結合オリゴ槍玉のものと同様には活性化し ていないことを提案している。

吸着タンパク質のノイラミニダーゼ処理（第７図）または吸着前の溶液中の、ノ イラミニダーゼを用いた前処理（結果は図示せず。）がすべての結合活性を止め るように、活性種タンパク質との結合はシアル酸を必要とする。

また数種の不活性糖タンパク質はシアル酸を含むが、ヒトトランスフェリン〔ス ビックｌｃ、ｌ／＜ヤード、Ｂ１、フォーネット、Ｂ、、ストレッカー、Ｇ、、 ボーケージ９ト、Ｓ、およびモントロイル、Ｊ　、（５ｐｉｋ、　Ｇ、　、　Ｂ ａｙａｒｄ。

Ｂ、、Ｆｏｕｒｎｅｔ、Ｂ、、５ｔｒｅｅｋｅｒ、Ｇ、、Ｂｏｕｑｕｅｌｅｔ、 Ｓ、ａｎｄ　Ｍｏｎｔｒｅｕｉｌ、Ｊ、）、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、、５０，２９ ６−２９９（１９７５））、　フィブリノーゲン〔タウンセンド。

Ｒ，Ｒ，、ヒリカー、Ｅ、、Ｌｌ、Ｙ−Ｔ、、　ライン。

Ｒ，Ａ、、ベル、Ｗ、Ｒ，およびり−、　Ｙ、　Ｃ，＋　（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ、 　Ｒ，Ｒ，）ｆｉｌ　１ｉｋｅｒ、　Ｂ、　、　Ｌｉ、　Ｙ−Ｔ２．Ｌａ１ｎｅ 、Ｒ，Ａ、、Ｂｅ１ｌ、Ｗ、Ｒ。

ａｎｄ　Ｌｅｅ、Ｙ、Ｃ，）、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５７．９７０４− ９７１０　（１９８２））、およびプラズマフィブリネクチン〔タカサキ、Ｓ、 、ヤマシタ、に、、スズキ１　Ｋ、およびコバタ、Ａ、、Ｊよりｉ１且り、ｅｍ 、Ｔｏｋｙｏ、ｓｓ、１５８７−１５９４　（１９８０））において報告された 連鎖はα２−６からガラクトースを除外している。ｈＣＧ　（エンド−１Ｙ、、 ヤマシタ、に、。

タチバナ、Ｙ、、Ｉ−−ジョー、Ｓ、およびコノ（夕、Ａ、。

Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｔｏｋｙｏ、８５，６６９−６７９（１，９７９））およ び大多数のＮ−結合フエチュリンオリゴ糖にルソン、Ｂ、、ノルデン、Ｎ、Ｅ、 およびスヴエンソン、　Ｓ　、　、（Ｎｉ１ｓｓｏｎ、　Ｂ、　、　Ｎｏｒｄｅ ｎ、　Ｎ、　Ｅ、　、および５ｖｅｎｓｓｏｎ、Ｓ、）、Ｊ、−Ｂ　ｉ　ｏ上− Ｂｉｏｃｈｅｍ±」−５−ｒｙ、２５４．４５４５−４５５３　（１９７９）； タカサキ　３．およびコバタ、Ａ　、乱ユニ」−に、□−□−１と（ンセンド、 Ｒ，，Ｒ，，）１−ディ、Ｍ、Ｒ１１ウオング。

Ｔ、Ｃ，およびり−、Ｙ、Ｃ，（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ、Ｒ，Ｒ１，Ｈａｒｄｙ、　 Ｍ。

Ｒ，、Ｗｏｎ（２，Ｔ、Ｃ，ａｎｄ　Ｌ、ｅｅ、Ｙ、Ｃ，）　Ｂ　ｉ　ｏ　ｃ　 ｈ　ｅｍ　ｉ　ｓ　−（工ｚ、２．．５．５７１６−５７２５　（１９８６）’ ｌにおける連鎖はα２−３である。従って、マイコプラズマ・−Ｑ　：ｙ。

−モニエの表面成長したシート培地−２の赤血球接着についての従来の研究と一 致して、固定化種タンノ（り質の標識マイコプラズマ・ニューモニエの結合はα ２−３結自シアル酸につき特異的であると思われる。　ｈＣＧを除いて、すべて の活性種タンパク質はその糖構造において広範に不均質性を存するかまたは部分 的に特徴付けらねた構造のみを存する。ｈＣＧは両方のサブユ、′−ット」二番 二モノ−＝およびビーアンテナ（ａｎｔｅｎｎａｒｙ）アスクくラギン結合オリ ゴ糖〔エンド−１Ｙ１．ヤマシタ、に、７　タチバナ、Ｙ、、トージａ　−、Ｓ 、およびコバタ、Ａ、、止ユＢｉｏｃｈｅｍ、丁」ｋ、ｙｏ、８５，６６９−６ ７９（１９７９）、ミズオチ、Ｔ　およびコバタ、Ａ、、旦上に４個の〇−結合 オリゴ糖（ゲスラー、Ｍ、Ｊ、、マイス、Ｔ、、ガイ。Ｒ，Ｄ、、およびバール 、ｏ、ｐ。

、　（Ｋｅｓｓｌｅｒ、Ｍ、Ｊ、、Ｍｉｓｅ、Ｔ、、Ｇｈａｉ、Ｒ，Ｄ、、ａｎ ｄ　Ｂａｈｌ、Ｏ，Ｐ、）Ｊ　。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５４．７９０９−７９１４（１９７９））のみを含む 。ｈＣＧのσ−サブユニットはｖイ：１プラズマ・ニューモニエ並びに完全タン パク質と結合するので（表１１１および第７図）、β−サブユニット１゜の〇− 結合糖質は結合を必要とし７ない。従って、α２−３−結合シアル酸とビアンテ ナ（ｔ＋１ａｎｔｅｎｎａｒｙ）アスパラギン結合された炭水化物はマイコプラ ズマ・ニコーモ、−工の結合に十分である。

実施例３ 通常、上述した様々なバクテリアに示したのと同様の方法がフコシラシラロー０ Ｍ１．アシアロ−ＧＭＩおよびアシアロ−０Ｍ２に見出されたＧ　ａ　Ｉ　ＮＡ 　ｃβ１−４Ｇａｉ配列への結合に対するそれらの活性に対して試験される。結 果を以下の表に示す。

微生物　結合９ 本バクテリアはバクテリア性過剰線量分析によって、糖スフィンゴ脂質への結合 を試験される。Ｇａ１Ｎａｃβ−４Ｇａｌ配列を含む糖スフィンゴ脂質の少なく とも２μｇへの、プラス（＋）は結合を示し、（−）は非結合を示す。

実施例４ 以下の予見的な例は第１０図に示すように本発明を実行するのに好ましい方法を 構成する。大腸菌（Ｂ、ｃｏｌｉ）〔マンら（Ｍａｎｅｔａｌ）、Ｊ、ＣＩ　ｉ ｎ、Ｍｉｃｂ、、２５゜４０１−４０６　（１９８７）によって示された方法で 調整されたものであり、全ての内容は参考文献で具体化されている。〕と結合す る炭水化物受容体を塗布したラテックス粒子＝１を容器：３中に支持された多孔 膜：２に固定する。粒子は粒子に接触できる大腸菌に十分に結合できる量で存在 するが、膜が「詰まる」またはその多孔性が壊れることのないような量にする。

大腸菌含有の懸濁した液体試料を膜の上部に注ぎそして該ラテックス粒子に通過 させておよび大腸菌が存在するならばラテックス粒子上の炭水化物受容体に吸着 する該多孔膜を通す。

大腸菌に対して標識された抗体（例えば酵素に結合させた抗体）を含有する溶液 はそれで該ラテックス粒子を通過しそして鼓膜を通る。洗液を該ラテックス粒子 に通過させおよび鼓膜を通して全ての未結合の標識抗体を膜から離す。標識が酵 素の場合、該酵素に対する基質はそれゆえＩ＃膜に接触する。抗体に結合した酵 素が鼓膜中でラテックス粒子に結合した場合、酵素基質は微生物の存在を示して 変色するであろう。標識が蛍光性または放射性材料である場合、他の適当な試験 が標識された抗体の存在を検出するのに使用される。

ト− ン 中 ！１１ 門中 率１へ慟 １、−ｈミ ロｎＱ 国際調査報告 １剛Ｃ□＋１（（ミ止噸＾Ｃし１（Ｉ□□０デ１Ｎｏ■］−ｆｆｉ／１ＫＱｎ／ Ｍ７０ノ。

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Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．不溶性基体と、 該不溶性基体に固定化された、微生物を吸着し得る炭水化物受容体と、 該炭水化物受容体に結合された微生物の存在を検出するための標識化試薬 とからなる微生物の存在を検出するための診断用キット。
2. ２．前記炭水化物受容体がラテックス粒子に結合されている請求項１記載のキッ ト。
3. ３．前記基体がポリ塩化ビニルおよびポリスチレンからなる群から選択されるプ ラスチック材料である請求項１記載のキット。
4. ４．前記基体がラテックスビーズであり、そして該ラテックスビーズが多孔性膜 に固定化されている請求項１記載のキット。
5. ５．前記炭水化物受容体が糖脂質に保持されている請求項１記載のキット。
6. ６．前記炭水化物受容体が糖タンパク質に保持されている請求項１記載のキット 。
7. ７．前記炭水化物受容体がα２−３−結合シアル酸を存する糖タンパク質に保持 されている請求項１記載のキット。
8. ８．前記炭水化物受容体がラミニン、フェツイン、ヒト繊毛膜ゴナドトロピン、 ヒト血小板トロンボスボンジンおよびそれらの誘導体からなる群から選択される 糖タンパク質である請求項１記載のキット。
9. ９．前記炭水化物受容体がスルファチド、アシアロＧＭ１およびアシアロＧＭ２ からなる群から選択される糖脂質である請求項１記載のキット。
10. １０．前記炭水化物受容体が前記基体に結合した硫酸化糖脂質およびα２−３− 結合シアル酸を有する糖タンパク賛からなる群から選択され、そして前記炭水化 物受容体がマイコプラズマ・ニューモニエを吸着し得る、試料中にマイコプラズ マ・ニューモニエの存在を試験するための請求項１記載のキット。
11. １１．前記標識化試薬が、酸素、放射性物質または蛍光物質で標識されている抗 体または炭水化物受容体である請求項１記載のキット。
12. １２．前記微生物に対する第１抗体および該第１抗体に対する標識された第２抗 体を含有する請求項１記載のキット。
13. １３．不溶性基体に固定化された炭水化物受容体に試験すべき試料を接触させ； そして 前記試料中の微生物の前記炭水化物受容体への結合の程度を標識化試薬の使用に より決定することからなる試料中に特定の微生物の存在を検出する方法。
14. １４．前記微生物がマイコプラズマ・ニューモニエである請求項１３記載の方法 。
15. １５．前記試料が体液である請求項１３記載の方法。
16. １６．前記結合の程度が吸着された細菌を抗体−酵素複合体と接触させることに より測定される請求項１３記載の方法。
17. １７．前記結合の程度が吸着された細菌を炭水化物受容体−酵素複合体と接触さ せることにより測定される請求項１３記載の方法。
18. １８．前記結合の種皮が酵素結合イムノソルベントアッセイ（エリザ）試験によ り決定される請求項１３記載の方法。
19. １９．前記炭水化物受容体が多孔性膜中に埋封されたラテックス粒子に結合され ており、試験すべき試料を溶液中で前記ラテックス粒子そして前記多孔性膜中を 通過させ、その後に標識化試薬を吸着された微生物と接触させて該微生物の存在 を検出する請求項１３記載の方法。