JPH05500307A - Atherosclerotic plaque-specific antigen, antibodies thereto and uses thereof - Google Patents

Atherosclerotic plaque-specific antigen, antibodies thereto and uses thereof

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JPH05500307A
JPH05500307A JP2511540A JP51154090A JPH05500307A JP H05500307 A JPH05500307 A JP H05500307A JP 2511540 A JP2511540 A JP 2511540A JP 51154090 A JP51154090 A JP 51154090A JP H05500307 A JPH05500307 A JP H05500307A
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ベイゾカー
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]

アテローム動脈硬化性プラーク特異的抗原、本出願は、１９８９年７月３１日に 出願された、Ｕ、Ｓ、出願番号３８８、１２９の一部継続出願であって、先の出 願の内容は引用することによって本明細書に包含されるものとする。 アテローム動脈硬化症では、動脈管腔（内側通路）が、数層のプラーク（脂肪お よび線維性組織）により段階的に閉塞する。 アテローム動脈硬化症は、どのような動脈にも起こり得る。冠状動脈では心臓発 作の原因となり、脳動臘では卒中の原因となり、末梢動脈では脚、足の壊厄の原 因となる。 アテローム動脈硬化症は、現在、アメリカ合衆国およびその他の先進国を悩ませ ている最大の医学的問題の一つである。アメリカ合衆国では、約４千万の人々が アテローム動脈硬化症の危険に曝されている。しかしながら、本疾患の明かな兆 候を示しているものは、アメリカ合衆国においてたかだか６百万人にすぎない。 その他の人々は、病状が現われるまで、診断されないままであり、しかも最悪の 場合、最初の症状が心臓発作ないし卒中として現われることがある。心臓発作お よび卒中は、アメリカ合衆国における死亡原因の、それぞれ第１位、第３位を占 める。毎年、５０万人を越える人々が心臓発作で死に、しかもこれら患者の内の 相当数が何の前触れもなく息絶えるのである。 内皮とは、血液と動脈組織の間にあって、血管壁に血液成分が蓄積することのな いよう障壁として働く。主要な冠状動脈疾患および卒中と関連するものは、内皮 下におけるアテローム動脈硬化性病巣の形成である。従来から、このような病巣 の原因およびその検出については盛んな研究が行なわれてきた。 アテローム動脈硬化性病巣の形成においては、内皮傷害が第一段階と考えられて おり、これは、血液動態的負荷、高コレステロール血症、高血圧、免疫性複合疾 患によって引き起こされるようである。内皮傷害は、コレステロール蓄積と内皮 の肥厚、細胞増殖、結合組織線維形成を導く。傷害を受けた内皮細胞、内皮欠如 （ｎｏｎｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｉｒｅｄ）血管自腹においては、ＩｇＧや補体 因子Ｃ３の蓄積が観察されている。血液由来の単核性食細胞も、アテローム動脈 硬化性病巣における細胞集団の一部を形成する。プラーク形成のメカニズムは完 全には知られていない。 しかしながら、考えられうるメカニズムは次の通りである。すなわち、脂肪の蓄 積が、マクロファージの流入を招き、これに続いて、順に、Ｔ細胞、Ｂ細胞、抗 体産生が起こる。 ヒトのアテローム動脈硬化性プラークからは、様々な可溶性蛋白質が抽出されて いる。その中には、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＢＩＣ（Ｃ３）、アルファ１−ア ンチトリプシン、アルファ２−マクログロブリン、フィブリノーゲン、アルブミ ン、ＬＤＬ、　）ＩＤＬ、アルファ　−酸性糖蛋白質、β２−糖蛋白質、トラン スフェリン、セルロブラスミンがある。病的血管内膜にも、小量の組織結合性の 　ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＢＩＣが含まれることが判明した（　）Ｉｏｌｌｚｎｄｅ＋ 、　Ｗ。 ｅｔ　ｘｌ、、＾＋ｈｅ＋ｏ＋ｅｌｅ＋ｏ＋ｉ＋、　３４：３９１−４３５　（ １９８４）ｌ。病巣およびその周辺の内皮組織においてＩｇＧが検出されている ｉＰ！＋ｕｍ＋。 Ｄ、　ｅｌ　！＋、、　＾ｆｈｅｒｏｓｃｌｅ＋ｏ＋ｉｓ、　３８：２１１−２ １６　（１９８１）、　ＨＩＩＩＩＳＱ口。 Ｇ、ｅｔ　ｘｉ、、Ｅｘｐｅ＋１ｌｌＩｔｏｔｘｌ　！ｏｄ　Ｍｏ１ｅｃｏｌ！ ＋　Ｐａｔｈｏｌｏｇ７．　３４：２６４−２８０　（１９８１）、）ｌａ＋＋ ｎ５ｏｎ、Ｇ、＋１　！＋、、人ｃｔｘ　Ｐａｔｈ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。 １ｍｍｕ口ｏｆ、５ｃｘｎｄ、５ｅｃｔ、＾、９２：４２９−４３５　（１９８ ４）ｌ　、しかしながら、アテローム動脈硬化性組織およびその関連組織におけ る免疫グルプリンの起源、機能、結合特性については十分明確にされていない。 抗低密度リポ蛋白質（Ｌ　Ｄ　Ｌ）自己抗体が、血管性疾患を持つ患者において 高濃度であるという報告があるが、このことから、当該抗体は、何らかの点で、 アテローム動脈硬化症発症と関連を持つらしいことが判明した。しかしながら、 これら自己抗体とアテローム動脈硬化性プラークとの因果関係は確立されていな いｌｌ＋ｏｎｄ７．　Ｅ、　ｅｔ　！＋、、　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ＋　ｏｆＡｇ ｉｎｇ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、２９４１？−＋２３　（１９８５） ｌ　。 各種体液や組織における抗原性及び非抗原性物質の有無、および、その量に関し ては、従来から、広範な免疫アッセイが開発されている。全免疫グロブリンやＩ ｇＥ免疫アッセイについては、米国特許３．７２０．７６０．４．４４４．８７ ’ｌに記載されている。 ＩｇＧアロタイプ免疫アッセイについては、ロシア特許６４９．４３３に記載さ れている。ＥＬＩＳ＾免疫アッセイについては、Ｍａｇｇｉ。 らが記載しているｆＥｎ＋ｙｍｅ−ＩＩａｎｏｘ＋ｓａ７．　Ｂｏｅａ　Ｒａｊ ｏ口：　ＣＲＣＰｔｅｒＩｐｐ１７２−１７６　（１９８０））、しかしながら 、本発明以前には、アテローム動脈硬化性プラークの有無を決定する適当な免疫 アッセイは知られていなかった。 アテローム動脈硬化症は一般に拡散性疾患ではあるけれども、ヒト冠状アテロー ム動脈硬化症では、もっばらｌくイＩくス装置が行なわれる。なぜなら、主にプ ラーク形成の見られる部位が通常近位に分布しているからである。この結果、冠 状動脈直接バイパス術が、心筋血管再構成において、もつとも多用される処置法 となっている。大動脈・冠状動脈移植または内側乳房動脈移植が技術的標準とな り、長期的すぐれた効能を示している。 しかしながら、この長期の結果は、移植接合より遠位では、進行性アテローム動 脈硬化症によって危機に曝されることもある。 その他の症例では、疾患が遠位にあるために、手術不能である。 従来は、遠位の病巣は無視するか、特に好都合の場合においては、動脈内膜切除 術によって処置していたが、いずれの方法も、十分と言えるものではなかった。 アテローム動脈硬化症の診断、処置に用いられる従来の方法は、多く、侵襲的で 、高価であり、相当数の患者症例にたいして、その有効性は限られたものであっ た。本発明以前においては、アテローム動脈硬化性プラーク特異的抗原と特異的 に結合する抗体を用いるアテローム動脈硬化性プラークのラジオイメージング法 は、知られていなかった。もつとも、老化した静脈血栓を、放射性活性部分を標 識したフィブリン特異性モノクローナル抗体でラジオイメージングする方法は既 に報告されてはいたｌＲｏ＋ｅｎｂ＋ｏａｇｈ、　Ｓ、　ｅｔ　ｚｌ、、　Ｒｉ ｄｉｏｌｏｇ７ユ６２：５７５−５７７（ＦｅｂｒａｌｒＴ、１９８７Ｎ。 血小板にたいする放射標識モノクローナル抗体を用いて、血栓をラジオイメージ ングする方法は、最初にＰｅ１ｅｒ３　Ａ、らによッテ記載されたＪＢｒｉｌｉ ｓｈ　Ｍｅｄｉｃｘｌ　ｊｏｎｒｎａｌ、２９３：１５２５−１５２７（Ｄｅｅ ｅｍｂｅ＋、１９８６）ｌ　。金属性放射性核種によって標識された、ＤＴＰＡ −結合抗体については、Ｈｏｘｌｏｖｉｃｈ、　Ｄ、らによって記載された　（ ｊｏｎｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃｉｌ　Ｍｅｔｈｏｄ３　６５： １４７−１５７（１９８３）＋。 金属キレート化合物によるＩＩＭＲＩ、超音波、Ｘ線画像法については、米国特 許４．６４７．４４７に記載されている。さらに、金属キレート化合物の抗体結 合については、７１Ｉの４２行目に述べられている。常磁性ポリマーキレート化 合物で標識したモノクローナル抗体、および、ＮＭＲＩ法におけるその使用法に ついても記載されているｉｓｈ＋ｅｙｅ、Ｐ、ｅｔ　ｚｌ、、　Ｍａｇｎｓｔｉ ｃ　Ｒｅ＋ｏｏａｎｃｅｉｎ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、　３：３３６−３４０　（１ ９８６）及び［１＋ａｄ７．　Ｔ、ｅｌ　ａｌ、。 Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｉ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｓｏ＋１ｅ１７　ｏｒ　Ｍ！ｇｎｅｌ ｉｃ　Ｒｅ５ａｎｚｎｃｅ　ｉｎＭｅｄｉｃｉｎｅ、５ｅｃｏｎｄ　Ａｎｎｕａ ｌ　Ｍｅｅｔｉｎｇ、Ｓｏｂ、ｏｆ　ＭａｇｎｅｔｉｃＲｔｓｏｎａａｃｅ　ｉ ｎ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、　Ｉｎｃ、、　５ａｎＦ＋ａｎｃｉ＋ｃｏ、　ｐ、　１ ０゜（１９８３）、これは、Ｋｏｕ）ｃｈｅ＋、ｌ、ｅｔ　ａｌ、、Ｉ、Ｎｕｃ ｌ、Ｍｅｄ、、２５血管内レーザー伝導性光フアイバーを用いてヘマトポルフィ リ５０６−５１３　（１９８４）より引用）。 米国特許４，３４３．７３４　（Ｌｉｘｎ　ｅｔ　１１．）には、ガンマー力ル ホキシグルタミン酸（Ｇ　Ｌ　Ａ）特異的抗体が記載されている。これは、組織 を免疫蛍光染色するためにフルオレセインで標識することができる。これによっ て、組織中のＧＬＡの有無を決めることができる。ＧＬＡ特異的抗体は、カルシ ウム沈着を示す進行したアテローム動脈硬化性プラーク中のＧＬＡと結合する。 Ｌｉｘｎらの報告によれば、ＧＬＡは、カルシウム化していないプラークには見 られないが、心臓弁や、大動脈、また、プロトロンビン、凝固因子Ｖｌｌ、ＩＸ 、　Ｘ、　蛋白質Ｃ１蛋白賀Ｓのような循環性蛋白質にも見られる、という。し かしながら、ＬｉｘｎらのＧＬＡ結合性抗体は、アテローム動脈硬化性プラーク に選択的に結合しない。 本発明のアテローム動脈硬化性プラーク抗体は、非カルシウム化段階を含むあら ゆる段階のアテローム動脈硬化性プラークに結合するが、ＧＬＡとは選択的には 結合しない。 染色によるプラーク強調の考えは既に報告されているヒト遺体から摘出した心臓 、動脈組織におけるインビボ実験ょび、グリコジル化結合組織蛋白賀（Ｃａ＋ｔ ｉ＋＋、　Ｌ、に、　ａｎｄＷｉｌｓｕｍ、１．　Ｌ、、１．　Ｃｌ１ｎ、１ｎ ｖｅ＋ｔ、、　８７：１４３６　（１９８３）　）を含んでいる。この種の抗原 は、プラーク物質内に集中するとは言うものの、正常動脈および／またはその他 の正常組織の中にも見られる。ある種の抗原、および、それに対応するモノクロ ーナル抗体は、ワタナベのウサギ・モデルにおいて、初期には有望と思われたが 、ヒト病巣に応用して見ると、相応する結果をもたらさなかった（Ｓｈｉｈ、１ ．Ｌ、、ｅｔ　１＋、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。 Ｓｅｉ、、８７：１４３６　（＋９９０））　、特に、細胞外プラーク組織の散 在性マーカーを追求した場合はそうであった（Ｋｉｍｕ＋ｚ、Ｊ、、ｅｔａ１． 、Ｖｉｒｃｈｏｗｓ　人ｔＣｂ、、４１０（２）：　１５９　（１９８６））　 。 本発明は、インビトロ、インビボのいずれにおいても、アテローム動脈硬化性プ ラークの有無を決める、安価で、正確な方法を提供する。さらに、本発明は、ア テローム動脈硬化性プラークを持つ人の治療法を与える。この方法には、酵素治 療、レーザー治療も含まれる。最後に、本発明は、アテローム動脈硬化性プラー ク領域に薬剤を搬送する方法を提供する。 発明の要約 本発明は、アテローム動脈硬化性プラークの存在を示す精製抗原を提供する。こ の抗原は、２００．０ＯＧダルトンを越える分子量を有し、複雑な炭水化物構造 を持ち、かつ、アテローム動脈硬化性プラークの細胞外成分であるという特徴を 持つ。本発明はまた、精製抗原を提供する。この抗原は、ハイブリドーマＱ１０ Ｅ７によって産生されるモノクローナル抗体に選択的に結合するという特徴を持 つ。これら抗原は、その量が、アテローム動脈硬化症の進行にしたがって変化す るという特徴を持つ。本発明はさらに、これら抗原にたいする抗体、および、抗 原とその抗原にたいする抗体の両方の存在を検出する方法を与える。 また、アテローム動脈硬化症の治療法をも与える。 本発明はまた、血管中のアテローム動脈硬化性プラークの量を減退させる方法を 提供する。この方法は、次のものから成る。 ａ）アテローム動脈硬化性プラークをプラークと酵素前駆体の両方に特異的に結 合することのできる試薬と接触させることである。酵素前駆体の基質はアテロー ム動脈硬化性プラーク内の結合組織であり、この酵素は、切断されると、試薬が プラークに結合して試薬−プラーク複合体を形成するような条件下でプラークの 成分を溶解することができる；ｂ）試薬−プラーク複合体を酵素前駆体に接触さ せることであり、酵素前駆体が試薬に結合して酵素前駆体−試薬−プラーク複合 体を形成するような条件下で酵素前駆体にたいして試薬は特異的に結合する；Ｃ ）この酵素前駆体−試薬−プラーク複合体を酵素前駆体を特異的に切断すること のできる薬剤と接触させることであり、酵素がプラークを消化する条件下で酵素 前駆体が酵素に変換される。 本発明はさらに、下記の諸段階から成る診断分析法を提供する。すなわち、ａ） 患者の体質量指数（ｂｏｄ７　ｍａｓｓ　１ｎｄｅ！、ＢＭＩ）の値をめる。ｂ ）病態と関連のある抗原、もしくは、その他の血清ないし血漿検体、または、そ の抗原に結合する抗体の濃度をめる；ｃ）患者の体質量指数を、同じ患者の抗原 ないし抗体濃度にたいしてプロットする；ｄ）結果の数値を参考値と比較し、そ の結果が、参考値を越えているか否かを決め、それによって、病態の有無を明ら かにする。 図面の簡単な説明 第１図、Ｎ々の段階におけるアテローム動脈硬化性プラーク特異的抗原にたいす る抗体の発生、および、その抗原および、その抗原にたいする抗体のテストに用 いられる経路。 第２図、　ＤＥＡＥ　分画（予備的）−一自己抗体アツセイ点線は、各分画にお ける、正常血清にたいする、ＣＡＤ血清の結合量を表わす。実線は、０Ｄ２８ｏ における吸光度で測定した各分画における蛋白質量を表わす。鎖線は、０から　 １．ＱμＮｚＣｌまでのＮａＣｌ勾配を表わす。 第３図、　ＤＥＡＥ　分画（分析用）−一抗原捕捉アッセイ点線は、ハイブリド ーマ　１５Ｈ５によって産生されるモノクローナル抗体にたいする結合を以て測 定した各分画における自己抗原量を表わす。ここに示した結果は、その抗原にた いするペルオキシダーゼ複合抗体に関するもので、プレートを０Ｄ４５゜で読み とった。実線は、０Ｄ２８ｏにおける吸光度で測定した各分画における蛋白質量 を表わす。 鎖線は、０から　１．ＯＭ　ＮａＣｌ　までのＮｉＣｌ勾配を表わす。 第４図、アテローム動脈硬化性プラークの１５Ｈ５−抗原の大きさ測定 自己抗原と、４種のサイズ・マーカー（サイログロブリン（ａ）　、Ｉ　ｇＧ　 （ｂ）、オバルブミン（Ｃ）、ミオグロビン（ｄ））の混合物を、ＢｉｏＳｉ１ 分析用ＴＳＫ−４００カラムに通した。 自己抗原は、ペルオキシダーゼ標識１７１１３．　１５１１５との結合を以て検 出した。結合は、０Ｄ４５ｏにおける吸光度を測定して定量する。 茶５図、ＣＡＤ患者、３５才未満の正常人、３５才を越える正常人に対してアテ ローム動脈硬化性プラーク抗原に特異的に結合するＩｇＡレベル。 第６図、ＣＡＤ患者、３５才未満の正常人、３５才を越える正常人に対してラジ オイムノアッセイで定量したアテローム動脈硬化性プラーク抗原の濃度。 第７図、正常人の、年齢対アテローム動脈硬化性プラーク抗原レベル。 第８図９重篤なＣＡＤ患者、すなわち、閉塞が５０％を越える患者の、年齢対ア テローム動脈硬化性プラーク抗原レベル。 第９図、軽度のＣＡＤ患者の、年齢対アテローム動脈硬化性プラーク抗原レベル 。 第１０図、正常人の、年齢対アテローム動脈硬化性プラーク抗原と特異的に結合 するＩｇＧレベル。 第１１図１重篤なＣＡＤ患者、すなわち、閉塞が５０％を越える患者の、年齢対 アテローム動脈硬化性プラーク抗原と特異的に結合するＩｇＧレベル。 第１２図、軽度のＣＡＤ患者の、年齢対アテローム動脈硬化性プラーク抗原と特 異的に結合するＩｇＧレベル。 第１３図、正常人の、年齢対アテローム動脈硬化性プラーク抗原と特異的に結合 するＩｇＡレベル。 第１４図１重篤なＣＡＤ患者、すなわち、閉塞が５０％を越える患者の、年齢対 アテローム動脈硬化性プラーク抗原と特異的に結合するＩｇＡレベル。 第１５図、軽度なＣＡ　Ｄ　低音の、年齢対アテローム動脈硬化性プラーク抗原 と特異的に結合するＩｇＡレベル。 第１６因１ すなわち、正常を上回るヒトの百分率。 第１７図．各種年齢グループ対アテローム動脈硬化性プラーク抗原に特異的に結 合する抗体の陽性率。点棒はＩｇＧを、陰影棒はＩｇＡを表わす。 第１８図．各種年齢グループ対アテローム動脈硬化性プラーク抗原に特異的に結 合するＩｇＧ．、ＩｇＡのいずれか、または、その両方の陽性率。 第１９図．各種年齢グループ対抗体（Ｉ　ｇＧまたはＩｇＡ）または抗原の、い ずれかの陽性率。 第２０図，　ＣＰＰＡ−１カラムを備えたモノサッカライド分析用第２１図．　 ＣＰＰＡ−１カラムを備えた・モノサッカライド分析用Ｄｉｏｎｅｘ装置を用い た、７種の標準モノサブカライドのクロマトグラフィーブランクラン。純水に溶 解した１５　ｍＭ　Ｎｌ０Ｈ０第２　２　図．　ＣＰＰＡ−１カラムを備えたモ ノサッカライド分析用Ｄｉｏｎｅｘ装置を用いた、１５Ｈ５モノクローナル抗体 による自己抗原アフィニティー精製物のクロマトグラフィーブランクラン。 純水に溶解した１５　ｍＭ　ＮａＯＨ　０第２３図．ＩｇＧ＋Ａにたいする、体 質量指数（ＢＭＩ）のグラフ。各区画の数値を、９８％目（９８１ｈ　ｐｅｒｃ ｅｎｔｉｌｅ）でマークした。したがって、その区画の被検者の９８％はマーク した閾値よりも下ということになる。もし、ある被検者がその閾値よりも上であ るならば、その被検者はアテローム動脈硬化症にかかりやすいと言える。 第２４図．抗原にたいする、体質量指数（ＢＭＩ）のグラフ。 各区画の数値を、１００％目でマークした。したがって、その区画の被検者の１ ００％は、マークした閾値よりも下と０うことになる。もし、ある被検者がその 閾値よりも上であるならｉｆ、その被検者はアテローム動脈硬化症にかかりやす （１と言える。 第２５図．抗原結合阻害パーセント。抗原被覆微生物を各種希釈度のＣＡＤ血清 で前処理した後の、）１イブリドーマ１５Ｈ５。 １７１（３により産生される抗体にたいする結合の阻害。 第２６図．抗原結合阻害パーセント。抗原被覆マイクロウェルを種々の量のハイ ブリドーマ　１５）１５，　１７１１３により産生される抗体によって前処理し た後の、ＣＡＤ血清の結合阻害。 第２７図．ハイブリドーマｚ２Ｄ３．　ＱＩＯＥ７により産生される抗体によっ て認識されるアテローム動脈硬化性プラーク抗原を精製するための、方法１の模 式図。 第２８図．　ＣｓＣｌ分画１のＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー。Ｚ２Ｄ ３に結合する抗原物質を表わすピークは／蔦イブリドーマｚ２Ｄ３により産生さ れる抗体を用いてＥＬＩＳＡ法によって測定した。 第２９図．　ＣｓＣｌ分画４のＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー。Ｑ１０ Ｅ７に結合する抗原物質を表わすピークは／”ｌイブリドーマＱ１０Ｅ７により 産生される抗体を用いてＥＬＩＳＡ法によって測定した。 第３０図．プラーク特異的抗体フラグメントを用いてターゲットするプロ酵素に よるアテローム動脈硬化性プラークの酵素的減退の模式図。酵素前駆体は、 Ａ、二官能性抗体を表わす。 Ｂ、２２Ｄ３抗原に結合する二官能性抗原を表わす。 Ｃ１酵素活性を阻害するプロペプチド部分を含む酵素を表わす。 Ｄ、抗原・二官能性抗体・プロ酵素複合体を表わす。 Ｅ０組織プラスミノーゲン活性因子による処置によるプロペプチド切断後の複合 体、及び、プラーク融解を開始した酵素を表わす。 第３１図、ハイブリドーマｚ２Ｄ３により産生ずるモノクローナル抗体を使用す るウサギ大動脈の組織学的染色。ＡＢＣ免疫ペルオキシダーゼ法に従い、ヘマト キシリンでカウンター染色した。 Ａ、ウサギ組織写真に対応するマツプ Ｂ、剥離後のウサギ大動脈における、ｚ２Ｄ３モノクローナル抗体結合を示す写 真。 第３２図、進行したアテローム動脈硬化症患者のヒト冠状動脈の非固定５μ凍結 組織切片の、ＡＢＣ免疫パーオキシダーゼ法による免疫染色。ヘマトキシリンで カウンター染色した。倍率は２０倍。 Ａ、ｚ２Ｄ３モノクローナル抗体の組織学的染色像を示す。 Ｂ、非特異的ＩｇＭモノクローナル抗体の組織学的染色像を示す。 東３３図、初期アテローム動脈硬化症患者のヒト冠状動脈の非固定５μ凍結組織 切片の、ＡＢＣペルオキシダーゼ法による免疫染色。ヘマトキシリンでカウンタ ー染色した。倍率は２０倍。 Ａ、２２Ｄ３モノクローナル抗体の組織学的染色像を示す。 Ｂ、非特異的ＩｇＭモノクローナル抗体の組織学的染色像を示す。 第３４図、アテローム動脈硬化症患者のヒト冠状動脈の非固定５μ凍結組織切片 の、ＡＢＣパーオキシダーセ法による免疫染色。ヘマトキシリンでカウンター染 色した。倍率は２０倍。 Ａ、２２１）３モノクローナル抗体の組織学的染色像を示す。 Ｂ、　ＱＩＯＥ？モノクローナル抗体の組織学的染色像を示す。 Ｃ１非特異的１ｇＭモノクローナル抗体の組織学的染色像を示す。 第３５図、ウサギの未処置胸郭領域の大動脈切片ａと、同一ウサギのアテローム 動脈硬化性プラーク誘発のために剥離した大動脈切片すとの比較。ウサギを屠殺 する前に、耳静脈から１１１Ｉｎ−ＤＴＰＡ−４２Ｄ３モノクローナル抗体を注 入した。 Ａ、プラークの無い大動脈切片ａと、プラークのある大動脈切片すとの肉眼的形 態差を示す写真。 Ｂ、アテローム動脈硬化性プラークｂを含む大動脈領域において、１１１Ｉｎ− ＤＴＰＡ−２２Ｄ３の増加した結合を示すオートラジオグ本発明は、アテローム 動脈硬化性プラークの存在を示す精製抗原を与える。この抗原は、複雑な炭水化 物構造と、２００．０００ダルトンを越える分子量を有し、かつ、アテローム動 脈硬化性プラークの細胞外成分として存在するという特性を持つ。 この抗原は、平滑筋細胞によって合成される、または、該細胞中に存在するとい う特性を持つ。この抗原は、ハイブリドーマ１５Ｈ５（ＡＴＣＣ受託番号１１８ ９８３９　）の産生ずるモノクローナル抗体に選択的に結合することを利用して 、精製され、その特性が明らかにされてきている。この抗原はさらに、電荷が中 性であるという特性を持つ。また、第２２図に描くような、炭水化物プロフィー ルを持つという特性を持つ。　１５Ｈ５抗原は、レクチンに選択的に結合するこ とが確立されてきている。したがつて、コノモノノ特性はさらに、Ｃｏｎｘｙｘ ｌｉａ　ｅｎ＋ｉｔｏ＋ｍｉＩ＋Ｔ＋ｉｔｉ＋ａｍ　ｖｕ１ｇｉ＋ｉ＋、Ｌｅ口 ｓ　ｅｕｌｉｎｘ＋ｉｓ、Ｒｉｅｉｏｕ＋　ｃｏｍｍｏｎｉＩＩＴ＋ｉｔｉｅｕ ｍ　ｖｕ１ｇａ＋ｉ＋等のレクチンには結合するが、Ａ＋ａｅｈｉｓｂｙｐｑａ ＋ａ、Ｂｇａｄｅｉ＋ｘｅａ　ｓｉｍｐｌｉｃｉｔｏｌｉａ、Ｄｉｏｌｉｃｈｏ ＋　ｂｉ！ｌｏ＋ｏＩＩＧ１７ｅｉｎｅ　Ｍａｒ、　Ｌｉｍｕｌｕｓ　ｐｏ１７ ｐｈｅｎ＋＋＋、Ｐｔ＋ａｉｅｏｌｕ＋　ｖｕ１ｇｉ＋ｉ＋−Ｅ。 Ｐｈａ＋ｅｏｌｕ＋　ｖｕ１ｇａ＋ｉ＋−Ｌ、Ｐｉ＋ｕｍ　ｓｚｌｉｗｕｍ、５ ｏｐｈｏｙａ　１ｘｐｏｎｉｃａ。 Ｕ！ｅｘ　ｅｃ＋ｏｐ！ｅＳＩＵｌｃｘ　ｅｕ＋ｏｐａｅｕｓ、Ｙｉｅｉａ　ｖ ｉｌｌｏ＋ｘ等のレクチンには結合しないことで示される。 分子の特性を決定するもう一つの方法は、その分子にたいする各種酵素の作用を 調べることである。この　１５Ｈ５抗原の特性をさらに言うならば、蛋白質分解 酵素、デオキシリボヌクレアーゼ、リパーゼおよびリボヌクレアーゼによる分解 には抵抗性を示すが、α−アミラーゼ、β−アミラーゼおよびグルコアミラーゼ による分解には部分的感受性を示す。 １５Ｈ５−抗原が、アテローム動脈硬化性プラークとの関連が知られている分子 であるか否かを決めるために、その抗原について、アテローム動脈硬化性プラー クの既知の成分に特異的に結合する抗体にたいする結合度を定量した。この抗原 はさらに、アポリボ蛋白質、ヒト・コラーゲン、フィブロネクチン、ケラチン、 ラミニン、テナシンおよびビトロネクチンに結合する抗体にたいして非反応性で あるという特性を持つ。 本抗原のその他の特性には次のものがある。抗原を１時間沸騰させた後でも、バ イブリド−ｖ　１５Ｈ５（ＡＴＣＣ受託番号１１８９８４０　）の産生ずるモノ クローナル抗体にたいして反応性を示し、また、抗原を、燐酸緩衝溶液に溶解し た８Ｍ尿素で室温で２４時間処理した後、燐酸緩衝溶液に溶解した６Ｍ塩酸グア ニジンで室温で２４時間処理した後、２Ｍトリフルオロ酢酸で室温で３０分処理 した後、燐酸緩衝溶液に溶解した３、５Ｍ千オシアン酸ナトリウムで室温で８時 間処理した後、または、燐酸緩衝溶液に溶解した０、１９Ｍドデシル硫酸ナトリ ウムで室温で１時間処理した後でも、ハイブリドーマ１５Ｈ５（ＡＴＣＣ受託番 号ＨＢ９８４Ｇ　）の産生ずるモノクローナル抗体にたいして反応性を示す。 本発明はまた、アテローム動脈硬化症およびある種の正常組織と関連する抗原、 ないし、エピトープを提供する。この抗原は、バイブリド−７１７Ｈ３（人ＴＣ Ｃ受託番号ＨＢＩＧ１８９）産生のモノクローナル抗体に選択的に結合するとい う特性を持つ。 もう一つ別の抗原をも、本発明は提供する。この抗原は、アテローム動脈硬化性 プラーク結合組織およびプラーク平滑筋細胞によって合成される、または、該組 織および細胞中に存在するもノテ、バイブリド−７Ｘ２Ｄ３　（ＡＴＣＣ受託番 号ＨＢ９１１４０）、または、７、イブリド−７Ｘ２Ｄ３／３Ｅ５　（ＡＴＣＣ 受託番号Ｈ［ｌ　１０４８５）（７）産生ずるモノクローナル抗体に選択的に結 合する脂質含有性分子であるという特性を持つ。この抗原はさらに、アセトン処 理で破壊された組織学的染色法に使用できるという特性を持つ。 また、正常平滑筋細胞の存在を示す抗原も提供される。このような抗原の一つに 、ハイブリドーマＱＩＯＥ７　（ＡＴＣＣ受託番号１（ＢＩＱｉ８８）の産生ず るモノクローナル抗体に選択的に結合する特性を持つものがある。この抗原の分 子量は、１５０．０００ダルトンを越える。この抗原はさらに、正常平滑筋細胞 および動脈周辺正常結合組織によって合成される、または、その中に存在する、 という特性を持つ。 本発明の一つの実施態様では、上記抗原を、検出可能なマーカーで標識する。こ のマーカーは、当業者に既知の、どのマーカーであってもよい。しかしながら、 好ましい実施態様では、マーカーは酵素、常磁性イオン、ビオチン、蛍光団、発 色団、重金属、または、放射性同位元素である。イムノアッセイを含む多（の場 合において、好ましいマーカーは酵素であり、特に、ホースラディツシュ・ペル オキシダーゼまたはアルカリ・ホスファターゼが好ましい。 本発明はまた、精製抗体を提供する。この抗体はアテローム動脈硬化性プラーク 抗原または正常平滑筋細胞や結合組織と関連する抗原に、特異的に結合する。一 つの実施態様においては、本抗体は、検出可能なマーカーで標識される。使用す るマーカーの選択は、実施状態によって変わる。しかしながら、マーカーの選択 は、当業者であればすぐに決めることのできるものである。本発明の好ましい実 施態様では、マーカーは酵素、常磁性イオン、ビオチン、蛍光団、発色団、重金 属、または、放射性同位元素である。これら標識抗体は、アテローム動脈硬化性 プラークの存在を検出するために、組織学的適用にはもちろん、イムノアッセイ にも用いることができる。このような適用例においては、マーカーは酵素である ことが望ましく、また、その酵素はホースラディツシュ・ペルオキシダーゼまた はアルカリ・ホスファターゼであることがもっとも望ましい。 上に特定した抗体は、ポリクローナルでも、モノクローナルでもどちらでもよい が、モノクローナル抗体の方が、好ましい実施態様である。 本発明は、アテローム動脈硬化性プラーク抗原指向性のモノクローナル抗体を提 供するが、その抗体の中には、ハイブリドーマ１５Ｈ５（＾ＴＣＣ受託番号Ｈ［ １９８３９）の産生ずるモノクローナル抗体、バイブリド−？　２２Ｄ３　（Ａ ＴＣＣ受託番号１１８１０４１１５）　オヨヒＺ２Ｄ３／３Ｅ５　（＾ＴＣＣ受 託番号ＨＢＩ０４８５）の産生ずるモノクローナル抗体、すなわち、ＩｇＭであ る　ｚ２Ｄ３のクラス転換変種であるＩｇＧ。 さらに、２２Ｄ３１５Ｃ５（ＩｇＧｌ　のような、Ｚ２Ｄ３のその他の娘細胞系 統によって産生されるモノクローナル抗体、および、ハイブリドーマ１７１（３ （ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０１８９）によって産生されるモノクローナル抗体が 含まれる。ハイブリドーマＱＩＯＥ７　（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０１８ｇ＋に よって産生されるモノクローナル抗体は、正常動脈にたいして指向性を持つ。ハ イブリドーマ１５１１５゜２２Ｄ３．２２Ｄ３／３Ｅ５．１７Ｈ３，ＱＩＧＥ７ 　ハ、特許手続上）微生物ノ寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の要求条 項に従い、その条項に合致して寄託されている。すなわち、Ａｍｅｒｉｃａｎ　 Ｔ７ｐｓＣｕｒａｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴ　ＣＣ）　、１２３０１ 　Ｐｓｒｋｌｓｖｎ　Ｄｔｌｖｅ。 Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍｒｒ７１ｓｎｄ　２０８５２において、それぞれ、［ ＩＢ９８３９゜ＨＢ９４ｇＧ、　ＨＢ１０４８５．１ＴＢＩＱ１８９．　ＨＢ１ ０１８８という受託番号の下に寄託されている。 本発明は、組換えポリペプチドを提供する。このペプチドは、ｚ２０３．ｚ２Ｄ ３／３Ｅ５オヨヒ他ノ、２２［１３まタハＱ１０Ｅ７）［［ｌ！胞糸系統モノク ローナル抗体の超可変領域のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列から成る 。このようなポリペプチドはまた、組換え法以外の方法によっても入手できる。 例えば、蛋白賀分解性消化がそうである。 そのような組換えポリペプチドから成るキメラ抗体またはそのフラグメントも提 供される。特に、ヒトフレーム７−り領域と、ヒト抗体の定常領域のアミノ酸配 列から成るキメラ抗体が提供される。これによって、マウス２２Ｄ３．　Ｚ２Ｄ ３／３Ｅ５またはＱＩＯＥ７の超可変領域を「ヒト化」したり、非免疫原性にす ることができる。また、本発明は、部位特異的突然変異、特に、より以上の結合 性を与えるような、部位特異的突然変異によって得られるポリペプチド、キメラ 抗体、または、フラグメントを提供する。キメラ抗体のフラグメントとしては、 Ｆａｂ。 Ｆ（ｘｂ）２、Ｆ、、ＶＮ７ラグメントがある。 本発明はまた、固相の支持体に結合したアテローム動脈硬化性プラーク抗原、お よび、固相支持体に結合した、アテローム動脈硬化性プラーク抗原に特異的に結 合する抗体を提供する。 ある好ましい実施態様では、ハイブリドーマ　１５Ｈ５の産生ずるモノクローナ ル抗体は、固相の支持体に結合している。 抗プラーク抗体、または、アテローム動脈硬化性プラーク抗原は、通常の方法に よって、不溶性の支持体に結合させることができる。抗体を、不溶性の支持体に 結合させる方法は、例えば、米国特許第３．５５１．５５５．３．５５３．３１ ０．４．０４８．２９８、ＲＥ−２９，４７４号に記載されている。吸着によっ て、抗体をポリスチレンに結合させるのは、例えば、米国特許第３．６４６．３ ４６．４、０９２．４［１８号に記載されている。抗原含有蛋白質を、各種不溶 性支持体に結合させることについては、米国特許第３．７２０．７６０号に記載 されている。 不溶性の支持体として、各種の材料を用いることができる。 その際、主な考慮の対象となるのは、抗プラーク抗体またはプラーク抗原の、表 面にたいする結合特性、抗プラーク抗体とプラーク抗原との結合反応にたいする 干渉の無いこと、または、その結合反応の有無・程度を調べるために用いられる 、その他の反応にたいする干渉の無いこと、である。この不溶性支持体としては 、有機、無機ポリマーを、天然であれ、合成であれ、用いることができる。適当 なポリマーの例としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリブチレン、ポリ （４−メチルブチレン）、ブチル・ゴム、シラスチック・ポリマー類、ポリエス テル類、ポリアミド類、セルロースおよびセルロース誘導体（酢酸セルロース、 ニトロセルロース等）、アクリレート類、メタクリレート類、ビニル・ポリマー 類（酢酸ポリビニル、塩化ポリビニル、塩化ポリビニリデン、弗化ポリビニル等 ）、ポリスチレンおよびスチレングラフトコポリマー類、レーヨン、ナイロン、 ポリビニルブチレート、ポリホルムアルデヒド、などがある。不溶性支持体とし て利用できるその他の材料としては、上記ポリマーのラテックス類、シリカ・ゲ ル、シリコン・ウェーファー類、ガラス、紙、不溶性蛋白質、金属類、半金属類 、金属酸化物、磁性材料、半導体材料、サーメット類、などを挙げることができ る。さらに、ゲルを形成する物質、例えば、ゼラチン類のような蛋白質、リポポ リサッカライド類、ケイ酸塩、アガロース、ポリアクリルアミド類、もしくは、 デキストラン類のようないくつかの水相を形成するポリマー類、ポリアルキレン ・グリコール類（２−３個の炭素原子を含むアルキレン）、または、表面活性剤 、例えば、燐脂質類、長鎖（１２−２４炭素原子）アルキル・アンモニウム塩等 のような、両性化合物がある。 ある診断用支持体は、ポリスチレン、スチレン・コポリマー類、または、ポリエ チレンないしポリプロピレンのようなポリオレフィン類、並びに、アクリレート およびメタクリレート・ポリマーおよびコポリマーから成る。抗プラーク試薬抗 体またはプラーク抗原は、吸着、イオン結合、ファンデルワールス吸着、静電結 合、または、その他の非共有結合によって、不溶性支持体に結合させることがで きる。あるいは、共有結合によって、不溶性の支持体に結合させることができる 。本性にとって特に有利な支持体は、多数のウェルを持つマイクロタイタープレ ートで構成される。ウェル表面、または、その中に挿入されるプラスチック・カ ップを、抗原ないし抗体の支持体としてもよい。もし定量のために、蛍光測定を しなければならないならば、マイクロタイタープレートないしウェル挿入体を、 光にたいして不透明にするとよい。なぜなら、それによって、あるウェルに与え られた励起光が、周辺ウェルの内容に届いたり、影響を及ぼｊ、たりすることが なくなるからである。 非共有結合法は、米国特許！　４，５２８，２６７号に記載されている。 抗体および抗原を不溶性支持体に共有的に結合させる方法は、１ｃｈｉ＋ｏ　Ｃ ｈｉｂａｔｘ　［１ｍｍｏｂｉｉｉ＋ｅｄ　ＥｎＢｌｌｌｅｉ、Ｈａｌｔｔｅｄ 　ＰｒｅｓｓＮｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９７８）］　およびＡ、Ｃｕａ＋ｒｅｃ＊ ＋ｘ　［Ｌ　Ｂｉｏ、　Ｃｈｅｍ、、２４５１３０５９　（１９７０）］　に記 載されている。この内容全体を、参照によって、ここに含めることとする。表面 を蛋白質でコートし、米国特許第４．２１１４１８号に記載されている方法を用 いて、抗体ないし抗原に結合させることができる。これは、結合剤として、例え ば、グルタルアルデヒドを用いて行なう。さらに別の方法として、ウェルを、ポ リエーテル・イソシアネートのような遊離イソシアネート基を有する層でコード 口、水溶液に溶解した抗体ないし抗原をこの上に付加することで、必要な結合が 行なわれる。さらにもう−法として、抗体ないし抗原を、ヒドロキシル化材料に 、臭化シアンを用いて、結合させることができる。 これについては、米国特許第３．７２０．７６０号に記載されている通りである 。 本発明はまた、ある生物学的試料において、アテローム動脈硬化性プラーク中に 存在し、かつ、アテローム動脈硬化性プラークの存在を示す抗原の検出法を提供 する。この方法は、その生物学的液体を、アテローム動脈硬化性プラーク抗原と 特異的に結合する抗体と、その抗体とその抗原が検出可能な複合体を形成するよ うな条件下に接触させ、こうして形成された複合体を検出し、これによって、そ の生物学的試料中の抗原を検出することから成る。 ある好ましい方法においては、生物学的試料は組織試料である。組織試料は、本 出願中に例示したものを含む、様々な組織学的技法を用いて使用することができ るが、このものだけに限定されない。 もう一つの実施態様では、生物学的試料は、生物学的液体である。生物学的液体 は、血液、血漿、または、血清から成ることが好ましい。さらに好ましい実施態 様においては、生物学的液体は、血清である。複合体検出をさらに助けるには、 アテローム動脈硬化性プラーク抗原に特異的に結合する抗体を、検出可能なマー カーで標識することが好ましい。マーカーの選択は、当業者には簡単に決めるこ とができる。本法のある実施態様においては、抗体は、モノクローナル抗体であ り、さらに好ましくは、このモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ１５８５　 （Ａ丁ＣＣ受託番号ＨＢ９８３９）によって産生されるものである。上記複合体 の検出をさらに助けるには、抗体は、固相支持体に結合していることが好ましい 。ある好ましい固相支持体として、不活性ポリマーで形成されるビーズがあり、 またもう一つの支持体として、マイクロウェルがある。 本発明はまた、ある生物学的液体試料において、アテローム動脈硬化性プラーク 中にあって、その存在を指示する抗原の濃度を定量する方法も提供する。この方 法は、ａ）固相の支持体を、過剰な、アテローム動脈硬化性プラーク抗原に特異 的に結合する抗体と、その抗体がその固相支持体表面に付着できるような条件下 に、接触させ、ｂ）未結合の抗体を除去し、Ｃ）得られた抗体の結合した固相支 持体を、生物学的液体試料と、試料中の抗原が結合抗体に結合し、それと複合体 を形成するような条件下に接触させ、ｄ）複合体に結合していない抗原を除去し 、ｅ）このように形成された複合体を、複合体中の抗原に特異的に結合する、過 剰な検出可能試薬と接触させ、抗体、抗原および検出可能試薬を含む第二の複合 体を形成し、ｆ）第二の複合体に結合していない検出可能試薬を除去し、ｇ）第 二の複合体中の検出可能試薬の濃度を定量し、ｈ）これによって、生物学的液体 中の抗原濃度を定量することから成る。 本法のある実施態様では、生物学的液体は、血液、血漿、または、血清から成る 。さらに好ましくは、生物学的液体は血清である。 ある実施態様では、固相の支持体は、不活性ポリマーで形成されるビーズであり 、また別の態様では、固相の支持体は、マイクロウェルである。 ある実施態様では、試薬は、検出可能なマーカーで標識されるが、■・−カーの 選択は、当業者なら決めることができる。 ある好ましい実施態様では、マーカーは、酵素、常磁性イオン、ビオチン、蛍光 団、発色団、重金属、または、放射性同位元素である。アテローム動脈硬化性プ ラーク抗原を検出することのできる試薬であれば何でも用いることができるが、 その試薬は、検出可能なマーカーで標識された抗体であることが好ましい。ここ でも、マーカーは、酵素、常磁性イオン、ビオチン、蛍光団、発色団、重金属、 または、放射性同位元素であることが好ましい。さらに好ましくば、マーカーは 、酵素であって、特に有効な酵素は、ホースラディツシュ・ペルオキシダーゼ、 または、アルカリ・ホスファターゼである。 本発明はまた、上記方法で、検出可能試薬が酵素で標識されており、手順（ｇ） が、第二の複合体を、その酵素にたいする特異的な基質と、その酵素がその基質 と反応して検出可能な産物を形成するような条件下で接触させることである方法 を提供する。 本発明が提供するもう一つのものは、生物学的試料において、アテローム動脈硬 化性プラーク中にあり、かつ、その存在を指示する抗原と特異的に複合体を形成 する抗体を検出する方法である。この方法は、その生物学的試料を、アテローム 動脈硬化性プラーク抗原と、その抗原が、その生物学的試料中の抗体と結合する ような条件下に接触させ、抗体に結合；また抗原を検出し、これによって、その 生物学的試料中の抗体を検出することから成る。 ある好ましい実施態様では、生物学的試料は組織試料である。 組織試料は、試料中に抗体の量を検出および定量するに当り、当業者には既知の 、どのような組織学的技法を用いてもよい。 この方法としては、本出願中の例示が含まれるが、これのみに限定されるもので はない。 上記の方法のある好ましい実施態様では、生物学的試料は、生物学的液体である 。ある好ましい実施態様では、生物学的液体は、血液、血漿、または、血清から 成る。さらに好ましくは、生物学的液体は、血清である。形成された複合体検出 を助けるには、抗原は、検出可能なマーカーで標識することが好ましい。 本発明のもう一つの実施態様では、抗原は、固相の支持体に結合される。これに よって、複合体を、生物学的液体からすぐに分離し、検出することができる。あ る好ましい実施態様では、固相支持体が、不活性ポリマーで形成されるビーズで あり、別の実施態様では、固相支持体はマイクロウニルである。 本発明はまた、ある生物学的液体試料において、アテローム動脈硬化性プラーク 中にあって、その存在を指示する抗原と特異的に複合体を形成する抗体の濃度を 定量する方法を提供する。 この方法は、ａ）固相支持体を、過剰な、アテローム動脈硬化性プラーク抗原と 、その抗原がその固相支持体表面に付着できるような条件下に接触させ、ｂ）未 結合の抗原を除去し、Ｃ）得られた抗原の結合した固相支持体を、生物学的液体 試料と、試料中の抗体が結合抗原に結合し、それと複合体を形成するような条件 下で接触させ、ｄ）複合体に結合していない抗体を除去し、ｅ）こうして形成さ れた複合体を、複合体中の抗体に特異的に結合する過剰の検出可能試薬と接触さ せ、抗原、抗体および検出可能試薬を含む第二の複合体を形成し、ｆ）第二の複 合体に結合しない検出薬を除去し、ｇ）第二の複合体中に存在する検出可能試薬 の濃度を定量し、ｈ）これによって、生物学的液体中の抗体濃度を定量すること から成る。 ある好ましい実施態様では、生物学的液体は、血液、血漿、または、血清から成 る。さらに好ましくは、生物学的液体は、血清である。 形成された複合体をさらによく検出するには、試薬が検出可能なマーカーで標識 されていることが好ましい。マーカーは、重金属、または、放射性同位元素であ る。さらに好ましくは、マーカーは、酵素である。もっとも好ましい実施態様は 、その酵素がホースラディツシュ・ペルオキシダーゼ、または、アルカリ・ホス ファターゼである場合である。 ｋ、配力法のもう一つの実施態様として、検出可能試薬が酵素で標識されており 、手順（ｇ）が、第二の複合体を、その酵素にたいする特異的な基質と、その酵 素がその基質と反応して検出可能な産物を形成するような条件下で接触させるこ とであるものがある。 本発明はまた、ある生物学的液体試料において、アテローム動脈硬化性プラーク 中にあって、その存在を指示する抗原の濃度を定量する方法を提供する。この方 法は、ａ）固相支持体を、所定量の、アテローム動脈硬化性プラーク抗原に特異 的に結合する抗体と、その抗体がその固相支持体表面に付着できるような条件下 に接触させ、ｂ）未結合の抗体を除去し、Ｃ）得られた抗体の結合した固相支持 体を、検出可能なマーカーで標識した、所定量の抗原、および、生物学的液体試 料と、抗原が固相支持体に結合した抗体に結合し、それと複合体を形成するよう な条件下で接触させ、ｄ）複合体に結合していない標識抗原を除去し、ｅ）固相 支持体に結合した標識抗原の濃度を定量し、ｆ）これによって、生物学的液体中 の抗原濃度を定量することから成る。 ある実施態様では、生物学的液体は、血液、血漿、または、血清から成る。しか しながら、現在好ましい生物学的液体は血清である。 ある好ましい固相支持体は、不活性ポリマーで形成されるビーズであり、別のも のでは、固相支持体はミクロウェルである。 不法のある実施態様では、検出可能なマーカーは、酵素、常磁性イオン、ビオチ ン、蛍光団、発色団、重金属、または、放射性同位元素である。好ましくは、マ ーカーは酵素である。さらに好ましくは、その酵素はホースラディツシュ・ペル オキシダーゼ、または、アルカリ・ホスファターゼである。 上記方法のもう一つの実施態様として、抗原が酵素で標識されており、手順（ｅ ）が、固相支持体に結合した標識抗原を、その酵素にたいして特異的な基質と、 その酵素がその基質と反応して検出可能な産物を形成するような条件下で接触さ せることであるものがある。 本発明はさらに、ある生物学的液体試料において、アテローム動脈硬化性プラー ク中にあって、その存在を指示する抗原の濃度を定量する方法提供する。この方 法は、ａ）固相支持体を、所定量の、アテローム動脈硬化性プラーク抗原に特異 的に結合する抗体と、その抗体がその支持体表面に付着できるような条件下に、 接触させ、ｂ）支持体に結合しない抗体を除去し、Ｃ）抗体の結合した固相支持 体を、生物学的液体試料と、その試料中の抗原が結合抗体に結合し、それと複合 体を形成するような条件下で接触させ、ｄ）複合体に結合していない抗原を除去 し、ｅ）こうして形成された複合体を、所定量の、検出可能なマーカーで標識し たプラーク抗原と、その標識抗原が、生物学的液体由来の抗原と、抗体への結合 を競合するような条件下で、接触させ、ｆ）固相支持体に結合しない標識抗原の 濃度を定量し、ｇ）これによって、生物学的液体中の抗原濃度を定量することか ら成る。 この方法のある実施態様では、生物学的液体は、血液、血漿、または、血清から 成る。好ましくは、生物学的液体は血清である。 ある実施態様では、固相支持体は、不活性ポリマーで形成されるビーズであり、 別のものでは、固相支持体はマイクロウェルである。 前述したように、マーカーの選択は、当業者であれば、容易に決めることができ る。しかしながら、ある好ましい実施態様では、マーカーは、酵素、常磁性イオ ン、ビオチン、蛍光団、発色団、重金属、または、放射性同位元素である。さら に好ましくは、マーカーは酵素である。多くの酵素が検出可能な産物を生成する けれども、好ましい酵素はホースラディツシュ・ペルオキシダーゼ、または、ア ルカリ・ホスファターゼである。 この方法のもう一つの実施態様として、抗原が酵素で標識されており、手順（ｆ ）が、固相支持体に結合していない標識抗原を除去し、これを、その酵素にたい して特異的な基質と、その酵素がその基質と反応して検出可能な産物を形成する ような条件下で接触させることであるものがある。 本発明が提供するもう一つの方法は、ある生物学的液体試料において、アテロー ム動脈硬化性プラーク中にあって、その存在を指示する抗原と特異的に複合体を 形成する抗体の濃度を定量する方法である。この方法は、ａ）固相支持体を、所 定量のアテローム動脈硬化性プラーク抗原と、その抗原がその支持体表面に付着 できるような条件下に、接触させ、ｂ）未結合の抗原を除去し、Ｃ）得られた、 抗原の結合した固相支持体を、所定量の、検出可能マーカーで標識した抗体、お よび、生物学的液体と、その抗体が、固相支持体に結合した抗原と結合し、それ と複合体を形成するような条件下で接触させ、ｄ）複合体に結合していない抗体 を除去し、ｅ）固相支持体に結合した標識抗体の濃度を定量し、ｆ）これによっ て、生物学的液体中の抗体濃度を定量することから成る。 本発明のある実施態様では、生物学的液体は、血液、血漿、または、血清から成 る。さらに好ましくは、生物学的液体は血清である。 ある好ましい実施態様では、固相支持体は、不活性ポリマーで形成されるビーズ であり、別のものでは、固相支持体はマイクロウェルである。 検出可能マーカーの選択は、当業者であれば、容易に決めることができる。しか しながら、検出可能マーカーは、酵素、常磁性イオン、ビオチン、蛍光団、発色 団、重金属、または、放射性同位元素であることが好ましい。さらに好ましくは 、マーカーは酵素であり、もっとも好ましくは、その酵素がホースラディツシュ ・ペルオキシダーゼ、または、アルカリ・ホスファターゼである。 この方法のもう一つの実施態様として、抗体が酵素で標識されており、手順（ｅ ）が、固相支持体から分離した標識抗体を、その酵素にたいして特異的な基質と 、その酵素がその基質と反応して検出可能な産物を形成するような条件下で接触 させることであるものがある。 本発明はさらに、ある生物学的液体試料において、アテローム動脈硬化性プラー ク中にあって、その存在を指示するアテローム動脈硬化性抗原と特異的に複合体 を形成する抗体の濃度を定量する方法を開示する。この方法は、ａ）固相支持体 を、所定量のアテローム動脈硬化性プラーク抗原と、その抗原がその支持体表面 に付着できるような条件下に、接触させ、ｂ）支持体に結合していない抗原を除 去し、Ｃ）抗原の結合した固相支持体を、生物学的液体試料と、試料中の抗体が 、結合抗原に結合し、それと複合体を形成するような条件下に、接触させ、ｄ） 複合体に結合していない抗体を除去し、ｅ）形成された複合体を、所定量の、検 出可能なマーカーで標識したプラーク抗体と、その標識抗体が、生物学的液体中 の抗体と、抗原への結合を競合するような条件下で、接触させ、ｆ）固相支持体 に結合していない標識抗体の濃度を定量し、ｇ）これによって、生物学的液体中 の抗体濃度を定量することから成る。 ある実施態様では、生物学的液体は、血液、血漿、または、血清から成る。しか しながら、好ましい生物学的液体は血清である。 固相支持体の選択は、当業者であれば容易に決めることができる。ある好ましい 方法では、固相支持体は、不活性ポリマーで形成されるビーズであり、別のもの では、固相支持体はマイクロウェルである。上記の方法に使用されるマーカーは 、当業者にとっては、単に選択の問題である。検出可能なマーカーは、酵素、常 磁性イオン、ビオチン、蛍光団、発色団、重金属、または、放射性同位元素であ ることが好ましい。さらに好ましくは、マーカーは酵素であり、もっとも好まし くは、その酵素がホースラディツシュ・ペルオキシダーゼ、または、アルカリ・ ホスファターゼである。 この方法のもう一つの実施態様として、抗体が酵素で標識されており、手順（ｆ ）が、固相支持体に結合していない標識抗原を除去し、その酵素にたいする特異 的な基質と、その酵素がその基質と反応して検出可能な産物を形成するような条 件下で接触させることであるものがある。 本発明はまた、アテローム動脈硬化症の進行を監視する方法を与える。この方法 は、患者の生物学的液体試料中にあるアテローム動脈硬化性プラーク抗原の量を 測定し、測定された量を、それ以前の時点で測定した量と比較することから成り 、抗原量の変化がアテローム動脈硬化性プラークの程度の変化を表わすものであ る。 本発明が提供するもう一つのものは、アテローム動脈硬化症治療の効能を監視す る方法である。この方法は、患者の生物学的液体試料中のアテローム動脈硬化性 プラーク抗原の量を測定し、それ以前の時点で測定した量と比較することから成 り、抗原量の変化がアテローム動脈硬化性プラークの程度の変化を表わすもので ある。 さらに本発明によって開示されるものは、アテローム動脈硬化性プラークを画像 化（ｉｍａｇｉｎｇ）するのに用いられる試薬である。この試薬は、検出可能な マーカーで標識された、アテローム動脈硬化性プラーク抗原に特異的に結合する 抗体から成る。本発明はまた、ある量の本試薬と、生理的に受容可能な搬送剤（ キャリアー）から成る組成物を提供する。 用いられる検出可能なマーカーは、当業者であれば、選択の問題である。マーカ ーは、放射性同位元素、Ｘ線に不透明の元素、常磁性イオン、または、常磁性イ オンのキレート化合物であることが好ましい。 放射性同位元素は、広く、医学で使用されており、当業者にはよく知られている 。現在好ましいとされているマーカーは、１−１２３．　１−１２５．　ｌ−１ ２８，ｌ−１３１，または、コバルト−５７，ガリウム−６７、インジウム−１ １１，インジウム−１１３ｍ、水銀＝１９７．セレン−７５，タリウム−２０１ ，テクネチウム−９９ｍ、鉛−２０３，ストロンチウム−８５，ストロンチウム −８７，ガリウム−６８，サマリウム−１５３，ユーロピウム−１７１，イッテ ルビウム−１６９，亜鉛−６２，レニウム−１８８，またはクロム−５１のキレ ート金属イオンそれらの混合物である。好ましくは、マーカーは、テクネチウム 、ヨー素、インジウム、または、それらにたいする金属イオンキレートである。 上に特定した方法のもう一つの実施態様では、マーカーは、常磁性イオンである 。常磁性イオンも広く医学で用いられている。そのようなマーカーの例には、ク ロム（■）、マンガン（ＩＩ）　、鉄（■）、鉄（■）、コバルト（■）、ニッ ケル（■）、銅（■）、プラセオジム（■）、ネオジム（■）、サマリウム（■ ）、ガドリニウム（■）、テルビウム（■）、ジスプロシウム（■）、ホルミウ ム（■）、エルビウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（■）、もしくは、それらの 混合物のキレート化された金属イオンである。 本発明はまた、アテローム動脈硬化性プラークを画像化する方法を提供する。こ の方法は、画像化するべきアテローム動脈硬化性プラークを、上記の、アテロー ム動脈硬化性プラーク抗原に特異的に結合する試薬と、その試薬がアテローム動 脈硬化性プラークに結合するような条件下で、接触させ、それに結合した試薬を 検出し、それによって、アテローム動脈硬化性ブラ−りを画像化することから成 る。 また、アテローム動脈硬化性プラークおよび周辺の正常組織を画像化する方法も 提供される。この方法は、画像化するべき正常血管腔を、正常内膜および・また は正常中膜と特異的に結合し、かつ、検出可能なマーカーで標識された抗体と接 触させ、アテローム動脈硬化性プラークと、上記の試薬とを、その試薬がアテロ ーム動脈硬化性プラークに結合するような条件下で接触させ、アテローム硬化性 プラークと周辺正常組織に結合した試薬を検出し、それによって、アテローム動 脈硬化性プラークと周辺正常組織を画像化することから成る。正常内膜および・ または正常中膜に特異的に結合する抗体は、精製抗体であって、これは、正常平 滑筋細胞および、動脈周囲の正常結合組織によって合成される、または、その中 に存在するという特性を持つ抗原に特異的に結合する。ある好ましい実施態様で は、抗体は、ハイブリドーマＱＩＯＥ７　（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢＩＧ１８８） によって産生されるモノクローナル抗体である。 本発明は、検出可能なマーカーで標識した抗体から成る、正常内膜および／また は中膜を画像化する上記の方法に用いられる試薬、並びに、画像化を実行するの に有効な量のその試薬と、生理的に受容可能な搬送剤とから成る組成物を提供す る。 アテローム動脈硬化性プラークを画像化するのに用いられる試薬について述べた ように、使用する検出用マーカーは、当業者には単なる選択の問題である。マー カーは、放射性同位元素、Ｘ線にたいして不透明な元素、常磁性イオン、または 、常磁性イオンのキレート化合物であることが好ましい。正常組織を画像化する のに用いられるマーカーは、前にアテローム動脈硬化性プラークに関して述べた ものと一致する。 本発明の提供するもう一つのものは、アテローム動脈硬化症の進行を監視する方 法である。この方法は、患者の血管中にある、アテローム動脈硬化性プラーク特 異的抗原の量を測定し、測定された量を、それ以前の時点で測定した量と比較す ることから成り、抗原量の変化は、アテローム動脈硬化性プラークの進度の変化 を示すものである。 さらに、アテローム動脈硬化症治療の効能を監視する方法が提供される。この方 法は、患者の血管中にある、アテローム動脈硬化性プラーク特異的抗原の量を測 定し、測定された量を、それ以前の時点で測定した量と比較することから成り、 抗原量の変化は、アテローム動脈硬化性プラークの程度の変化を示すものである 。 また、被検者のアテローム動脈硬化性プラークを画像化する方法も提供される。 その方法は、ａ）アテローム動脈硬化性プラークを含む血管壁を、プラーク画像 化用の上記試薬と接触させ、ｂ）アテローム動脈硬化性プラークに結合した試薬 を検出し、Ｃ）アテローム動脈硬化性プラークを画像化することから成る。 被検者のアテローム動脈硬化性プラークおよび周辺の正常組織を画像化する方法 は、画像化するべき正常血管腔を、正常内膜および／または中膜と特異的に結合 し、かつ、検出可能なマーカーで標識された抗体と、接触させ、画像化すべき、 アテローム動脈硬化性プラークと周辺領域を含む血管壁を、請求項１１８の試薬 と、その試薬がアテローム動脈硬化性プラークに結合するような条件下で接触さ せ、アテローム動脈硬化性プラークと周辺正常組織に結合した試薬を検出し、そ れによって、アテローム動脈硬化性プラークと周辺正常組織を画像化することか ら成る。ある好ましい実施態様では、正常内膜および／または中膜に特異的に結 合する抗体は、ハイブリドーマＱ１０Ｅ７（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢＩＱ１１１８ ）の産生ずるモノクローナル抗体である。 画像化は、当業者には既知の方法のいずれによって実行してもよい。この方法に は、Ｘ線、ＣＡＴスキャン、ＰＥＴスキャン、ＮＭＲＩおよび蛍光透視が含まれ るが、それのみに限定されるものではない。 プラーク除去の、もう−法として、酵素消化によるものがある。本発明は、アテ ローム動脈硬化性プラークの消化に使用される試薬を提供する。この試薬は、ア テローム動脈硬化性プラークの成分を消化することのできる酵素に結合した、ア テローム動脈硬化性プラークに特異的に結合する抗体を含む。そのような試薬の 一つは、ハイブリドーマｚ２Ｄ３ないし　２２Ｄ３／３Ｅ５、または、その他の 細胞系統によって産生されるモノクローナル抗体を含んで成り、また別のあるも のでは、１５Ｈ５ないし　１７Ｈ３モノクローナル抗体を含んで成る。 また別の試薬は、上記のキメラ抗体または、そのフラグメントを含んで成り、そ のフラグメントは、ハイブリドーマ２２Ｄ３または、２２Ｄ３／３Ｅ５によって 産生されるモノクローナル抗体の超可変領域のアミノ酸配列と実質的に同じアミ ノ酸配列を含む、組換えボリペチドを含む。さらに、この抗体は、ヒト・フレー ムワーク領域のアミノ酸配列と、ヒト抗体の定常領域のアミノ酸配列を含む。こ のようなキメラ抗体は、酵素または酵素前駆体（ｐｒｏｅｎｚｙｍｅ）に接合さ せた、遺伝子工学的処理したハイブリッド新分子（ｎｅｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）で あって、一部は抗体、一部は酵素であるようなものでもよい。キメラ抗体はまた 、三官能抗体であってもよい。三官能抗体は、通常、クアドローマ（ｑｕａｄｒ ｏｍａ）によって産生される。ある好ましい実施態様では、クアドローマは、ハ イブリドーマ細胞系統２２Ｄ３ないし　２２Ｄ３／３Ｅ５と、酵素に結合するモ ノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマとの融合から得られる。　酵素は、 プラークの成分を消化できるものならば、どのような酵素でもよい。ある好まし い実施態様では、その酵素は、蛋白質分解酵素、エラスターゼ、コラゲナーゼ、 もしくは、サラカリダーゼである。ある特に好ましい実施態様では、その酵素は 、線維芽細胞性コラゲナーゼ、ゼラチン分解酵素、多形核細胞性コラゲナーゼ、 顆粒細胞性コラゲナーゼ、ストロメリシシ（Ｓｔｒｏｍｅｌｙｓ　１ｎ）Ｉ、　 ストロメリンンＩＩ、または、エラスターゼである。 本発明は、また、アテローム動脈硬化性プラークの成分を消化するのに有効な量 の上記試薬と、生理的に受容可能な搬送剤とを含む組成物を提供する。 本発明は、血管中のアテローム動脈硬化性プラークの量を減退させる方法を提供 する。この方法は、そのアテローム動脈硬化性プラークを、上記のアテローム動 脈硬化性プラークを消化する試薬に、その試薬が、プラークの成分に結合し、そ れを消化することができるような条件及び量で接触させることから成る。 本発明はまた、血管におけるアテローム動脈硬化性プラークの量を減退させる方 法を提供する。この方法は、ａ）正常な血管腔を、正常内膜および／または中膜 に特異的に結合する、酵素の抑制因子（インヒビター）を結合させた抗体と、そ の抗体が正常内膜および／または中膜に結合するような条件下で接触させ、ｂ） アテローム動脈硬化性プラークを、アテローム動脈硬化性プラークを消化する試 薬と、その試薬が、アテローム動脈硬化性プラークに結合するような条件下で接 触させることから成る。正常内膜および／または中膜に特異的に結合する抗体は 、正常な動脈組織を、アテローム動脈硬化性プラークを消化することのできる酵 素から保護するのに用いられる試薬とじて提供される。アテローム動脈硬化性プ ラークを消化することのできる酵素の抑制因子に結合しているこの試薬は、合成 抗原、または、このような正常組織中に存在する抗原に結合する抗体を含む。こ の抗体は、例えば、ハイブリドーマＱ１［ＩＥ７の産生ずるモノクローナル抗体 であり、また、ハイブリドーマＱＩＯＥ７の産生ずるモノクローナル抗体の超可 変領域のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドで あり、または、その組み換えポリペプチドを含むキメラないしヒト化抗体もしく はそのフラグメントである。 本発明はさらに、血管中のアテローム動脈硬化性プラークの量を減退させる方法 を提供する。この方法は、ａ）アテローム動脈硬化性プラークを試薬と、その試 薬が、プラークに結合して試薬・プラーク複合体を形成するような条件下で接触 させ、ここで、その試薬は、プラークと、切断されると、酵素に変換され、その 酵素の基質は、アテローム動脈硬化性プラークにある結合組織であり、その酵素 は、プラークの成分を溶解することができる酵素前駆体の両方に特異的に結合す ることができ、ｂ）試薬・プラーク複合体を、試薬が特異的に結合する酵素前駆 体と、その酵素前駆体が、その試薬に結合して、酵素前駆体・試薬・プラーク複 合体を形成するような条件下で接触させ、Ｃ）この酵素前駆体・試薬・プラーク 複合体を、酵素前駆体を特異的に切断することのできる薬剤に接触させ酵素前駆 体は、酵素に、その酵素がプラークを消化できる条件下で変換されることから成 る。 本発明はさらに、血管中のアテローム動脈硬化性プラークの量を減退させる方法 を提供する。この方法は、ａ）アテローム動脈硬化性プラークを、アテローム動 脈硬化性プラークを消化できる上記のような試薬とその試薬がプラークに結合し て試薬・プラーク複合体を形成するような条件下で接触させ、ここで、その試薬 は、プラークと、切断されると、酵素に変換され、その酵素基質は、アテローム 動脈硬化性プラークにある結合組織であり、その酵素は、プラークの成分を溶解 することができる酵素前駆体の両方に特異的に結合し、ｂ）この酵素前駆体・試 薬・プラーク複合体を、酵素前駆体を特異的に切断し、酵素前駆体を、酵素に変 換することのできる薬剤と、その酵素が、プラークを消化できる条件下で接触さ せることから成る。 ある好ましい実施態様では、試薬は、三官能抗体である。この三官能抗体は、本 技術分野で既知のいずれの技法を用いて生成しても構わない。この技法の中には 、フラグメントの化学的結合、組換え遺伝子工学が含まれる。現在好ましい実施 態様においては、三官能抗体は、クアドローマによって産生される。 そのクアドローマは、ハイブリドーマ２２Ｄ３ないし２２Ｄ３／３Ｅ５、または 関連細胞系統によって産生されるモノクローナル抗体を含むハイブリドーマ細胞 系統と、酵素に結合するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマとの融合 から得られる。プラークを効率的に消化するには、酵素前駆体は、顆粒細胞性コ ラゲナーゼ、線維芽細胞性コラゲナーゼ、または、ストロメリシンの酵素前駆体 であることが好ましい。手順（Ｃ）の薬剤は、プラスミンであることが好ましい 。プラスミンは、被検者を、組織プラスミノーゲン活性因子によって、プラスミ ノーゲンを切断してプラスミンに変えるような条件下で、処理することによって 得られる。 さて、アテローム動脈硬化性プラークの放射線治療に目を向けてみると、本発明 は、アテローム動脈硬化性プラークを消散するのに用いられる試薬を提供する。 この試薬は、プラーク消散性波長を有する放射線を吸収することができる発色団 に結合した、アテローム動脈硬化性プラークに特異的に結合する抗体を含むもの である。 本方法のある実施態様では、抗体は、モノクローナル抗体である。例えば、ハイ ブリドーマ　１５Ｈ５ないし　ｌ　７１１３によって生産されるようなものであ り、さらに好ましくは、そのモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ　Ｚ２Ｄ３ 　もしくはハイブリドーマＺ２Ｄ３／３Ｅ５または関連娘細胞系統によって生産 されるものである。また別の実施態様では、発色団が、約１９０　ａｍから約１ １００　ｎｍまでの波長を有する光を吸収する。このような発色団は、本技術分 野においてはよく知られている。したがって、発色団の選択は、当業者ならば、 容易に決定できる。好ましい実施態様は、発色団が７レオレセイン、ローダミン 、テトラサイクリン、または、ヘマトポルフィリンであるものである。 本発明はさらに、アテローム動脈硬化性プラークを消散するのに有効な量の上記 試薬と、生理的に受容可能な搬送剤を含む組成物を提供する。 本発明はアテローム動脈硬化プラーク性を消散する方法を与える。この方法は、 ａ）アテローム動脈硬化性プラークを、上記のアテローム６中中奉千尋硬化性プ ラークを消散するのに用いられる試薬の有効量と接触させ、試薬が、アテローム 動脈硬化性プラークと結合し、アテローム動脈硬化性プラーク・試薬複合体を形 成し、ｂ）得られた複合体を、プラーク消散性波長を有する放射線に、その光が 、アテローム動脈硬化性プラークを消散するに充分なほどのエネルギーとして発 色団に吸収されるような条件下で暴露することから成る。 本発明はさらに、血管中のアテローム動脈硬化性プラークを消散する方法を提供 する。この方法は、ａ）正常血管腔を、正常内膜および／または中膜に特異的に 結合し、プラーク消散性波長の放射線を反射することのできる部分を結合させた 抗体と接触させ、ｂ）アテローム動脈硬化性プラークを、上記のアテローム動脈 硬化性プラーク消散に用いられる試薬と、その試薬が、アテローム動脈硬化性プ ラークに結合するような条件下で接触させ、ｃ）アテローム動脈硬化性プラーク を、プラーク消散性波長を有する放射線に暴露し、これによって、プラークを消 散することから成る。 本方法の好ましい実施態様では、正常内膜および／または中腹に特異的に結合す る抗体は、ハイブリドーマＱＩＯＥ７　（ＡＴＣＣ受託番号１（８１０１８８） によって産生されるモノクローナル抗体である。 光を反射するための部分の選択は、当業者ならば、容易に決定できる。 本発明はまた、アテローム動脈硬化症治療に用いられる試薬を提供する。この試 薬は、アテローム動脈硬化症を治療するのに有効な薬剤に結合した、アテローム 動脈硬化性プラークに特異的に結合する抗体を含む。好ましい実施態様では、抗 体は、ハイブリドーマｚ２Ｄ３（＾ＴＣＣ受託番号１１８９８４０）によって産 生されるモノクローナル抗体である。この試薬は、被検者にたいする、アテロー ム動脈硬化症治療法において用いることができる。 その方法は、その被検者に、その試薬の、アテローム動脈硬化症を治療するのに 有効な量を投与することから成る。 さらに、本発明は、被検者にたいする、アテローム動脈硬化症治療法を提供する 。この方法は、ａ）その被検者に、正常内膜および／または中膜に特異的に結合 し、かつ、アテローム動脈硬化症治療に有効な薬剤の抑制剤を結合させた抗体を 投与しｂ）その被検者に、上記の試薬の、アテローム動脈硬化症を治療するのに 有効な量を投与することから成る。この方法の好ましい実施態様では、正常動脈 組織を、アテローム動脈硬化症治療に有効な薬剤から保護するのに使用される抗 体は、ハイブリドーマＱＩＯＥ７　ｆ人ＴＣＣ受託番号ＨＢ１０１８ｇ）によっ て産生されるモノクローナル抗体で、アテローム動脈硬化症治療に有効な薬剤の 抑制剤を結合させた抗体である。 本発明は、アテローム動脈硬化症治療法を提供する。この方法は、アテローム動 脈硬化性プラーク特異的抗原の合成をブロックすることから成る。アテローム動 脈硬化性プラーク抗原のブロックは、い（つかの方法で実行できよう。本方法の 一つの実施態様では、その抗原の合成を、その抗原をコードする核酸、すなわち 、その発現がその抗原の合成に関連する核酸に特異的に結合するアンチセンス核 酸を用いることによってブロックする。本方法の、また別の実施態様では、抗原 の合成を、その抗原の合成にかかわる酵素を抑制することによってブロックする 。 本発明はまた、アテローム動脈硬化症の治療法を提供する。 この方法は、抗体、例えば、自己抗体が、アテローム動脈硬化性抗体プラーク抗 原に結合するのをブロックすることから成る。 本方法は、当業者に既知の方法のいずれをも含むものである。 本方法のある実施態様は、自己抗体の抗原にたいする結合を、抗原を、過剰の抗 体に接触させることによって、ブロックすることから成る。本方法の、別の実施 態様は、自己抗体の抗原にたいする結合を、その自己抗体を、それに対して作ら れた、過剰の抗−イディオタイプ抗体に接触させることによってブロックするこ とから成る。 本発明はさらに、次の諸手類からなる診断分析法を提供する。 この方法は、ａ）患者の体質量示数（ｂｏｄｙ　ｍａｓｓｉｎｄｅｘ、ＢＭＩ） について値を得、ｂ）病状と関連する抗原、または、その他の血清ないし血漿の 分析対象、または、その抗原に特異的に結合する抗体の濃度についての値を得、 Ｃ）患者の体質量示数を、同一患者の抗原ないし抗体濃度にたいしてプロットし 、ｄ）得られた数値を、−組の参考数値と比較し、得られた数値が、参考数値を 越えており、したがって、病的状態の存在を示すものであるかどうかを調べるこ とから成る。本方法は、−膜性であって、患者が、癌やアテローム動脈硬化症の ような病的状態にたいする罹患性を有するかどうかを調べるにさいし、ただ、陽 性または陰性結果を示すにすぎない従来の方法に代わって使用することができる 。患者がアテローム動脈硬化症にたいする罹患性を有するかどうかを判断するに さいして、抗原が、アテローム動脈硬化性プラークによって合成される抗原であ るか、もしくは、プラーク中に存在する抗原であるか（第２４図）、または抗体 が、そのような抗原に特異的に結合する抗体である（第２３図）方法が好ましく は用いられる。 体質量示数（ＢＭ　Ｉ）は、患者の体重を、その身長２で割って得られる。 実験の詳細 実験の詳細の項は下記のように配置される。 ■、アテローム硬化性プラーク抗原の調製■、アテローム硬化性プラーク抗原の 特性決定■、抗体の単離・調製法 ■、イムノアッセー法 ■、抗体標識法 ■、アテローム硬硬化性プラー２像像 法■１織学的検査法 ■、アテローム硬化性プラーク治療法 ｒ、アテローム硬化性プラーク抗原の調製ＰＢＳ抽出アテローム硬化性プラーク 抗原の精製（可溶性付与） 組織の処理、抗原の可溶化は下記のようにして行なった。 １、死後２４時間以内のヒト遺体から、または、外科手術中に、アテローム硬化 性動脈を入手する。 ２、サンプルを摘出し、２０　ｍＭ燐酸バッフｙ　−Ｑ、　１５Ｍ　ＮａＣｌ／ ９Ｈ７、３１０，０２％ＮａＮａ　（ＰＢＳ）を何度も交換して洗浄し、血液成 分を除去する。 ３、病巣を、使用時まで、−８０℃で凍結する。 ４、病巣処理の準備が整ったならば、病巣を一８０℃のフリーザーから取り出し 、室温で解凍する。 ５、解凍した病巣を、冷却ＰＢＳですすぎ、正常動脈残留物から、アテローム硬 化性病巣を丁寧に剥離、保持する。動脈残留物は廃棄する。 ６、アテローム硬化性病巣を秤量し、記録する。 ７、鋭利な外科用鋏を用いて、病巣を、５ｘ５ｍｍの小片に刻む。それらの小片 を冷ＰＢＳ中で湿潤状態に保つ（ちょうど小片が覆われるに十分な量の溶液で） 。 ８、病巣フラグメントを、氷冷ＰＢＳ中でホモジエネートする。 この時、１ｇの病巣にたいし　５１の冷却ＰＢＳを加える（ポリトロン；２〜４ 分）。 ９、ホモジエネートを、１Ｇ−１５，００ＯＲＰＭ、　４℃で、３０分間遠心す る。上溝を保持し、脂質層は捨てる。 １０、ペレットを、冷却Ｐ　Ｂ　Ｓ　（５ｍｌ／ｇｍ）に再懸濁し、再びホモジ エネートする。 １１、手順９を繰り返し、両上清をプールする。 １２、その後さらに精製の残り手順を実行するのでないならば、プラーク上清を 分液し、−８０℃で凍結する。 （アフィニティー精製） 未精製ないし一部精製プラーク、または、血清抗原を、１５Ｈ５抗体と結合した 樹脂と、室温（Ｒ，Ｔ、）で、２時間混合（バッチ法）するか、または、樹脂の カラムに、約１　ｍｉ／ａｉｎの流速で流し、かつ、流出物を、再び、同じカラ ムに流したＣカラム法）。サンプル、樹脂のすべてを、１０ｍＭ　Ｎ暑ＰＯ４／ ＋５０ｍＭＮｉＣｌ／ｐｆ（７，２（ＰＢＳ）で平衡させた。 サンプルを負荷させてから、樹脂を、ＰＢＳで十分に洗浄し、次に、ｐｌ？２． ：＋の　Ｏ，ｔＶグリシン、または、ＰＢＳに溶解した３、　５Ｍ　ＮｇＳＣＮ を加えて、結合抗原を遊離した。分画を収集し、４℃のＰＢＳ中で透析し、ＥＬ ＩＳＡによって抗原の反応性をテストした。該当する試験管をプール保存し、そ の後の特性決定試験に備えた。 モノクロナール抗体アフィニティー会クロマトグラフィーマトリックスの調製 モノクロナール抗体１５Ｈ５ないし　２２Ｄ３を含むマウス腹水を、０．４５μ フイルターに通過させ、次に、ＨＰＬＣゲルろ過により分画した。腹水１０ｍ１ を　Ｂｉｏ−Ｇｅｔ　ＴＳＫ−４００カラム（６００！２１．５１１１゜Ｂｉｏ −Ｒｘｄ　）に加え、０．１Ｍ燐酸ナトリウム　ｐ［１７，［ｌで溶出した。 ＩｇＭに対して適当なサイズの分画をプールした。 抗体の、Ａｆｌｉ−Ｇｅｔ樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　）にたいする結合は、１ｍｌ のパック・ゲルにたいして、１ｍｇの抗体となるように、ｐＦ［７で、０１Ｍ　 ｃｐｏ４ｔ＜ツフア−の存在下で行なった。ゲルの調製、抗体結合（室温で４時 間）、洗浄、エタノールアミンによるブロックは、メーカーの仕様の通りに実施 した。 陽性血清・血漿から得た抗原のアフィニティー精製下記の方法は、１５Ｈ５Ａｂ ゲルによる、抗原アフィニティー精製の、一段階法である。 １、１５Ｈ５Ａｂゲル、７５ｍ１を、１０ｍＭ　ＰＢＳ　ｐＨ７，０，３２，５ ｍｌ　に懸濁する。最終容量は４０ｍ１゜抗原捕捉アッセー法で、強陽性と判定 された血清ないし血漿の　８０　μｌを、４０ｍ１の１５Ｈ５抗体ゲルに注入す る。 ２、振とう器上で、室温で、４時間静かに撹拌し、次に、４℃で、−晩連続撹拌 する。 ３、３０００　ＲＰＩＪで、１０分間遠心する。上清を捨てる。１５Ｈ５人ｂゲ ルを１０ｍＭ　ＰＢＳ　ｐＨ１，０（４０ｍｌ／回）で、３回洗浄する。 ４、２０ｍ１の０．１１塩酸グリシン、ｐｌ（２，５を、１５Ｈ５抗体ゲルに加 え、振とう器上で、室温で２分間よく混合する。これは、抗原を、１５Ｈ５Ａｈ ゲルから分離するためである。 ５、３００ＯＲＰＭで、１０分間遠心する。上清を収集し、ただちにそれを、２ ｍｌの、トリス塩酸ｐＨ８，２５バツフアーで中和する。 ６、精製Ａｇ液を、ＩＧｍＭ　ＰＢＳ　ｐ［Ｔ　７．Ｑにたいして、４℃で、− 晩透析する（一度バッファーを変える）。 ｚ２［１３，０１０ｇ７　ｔｉ［）Ｗｌ（アテローム硬化性プラークのホモジエ ネート化方法１ われわれは、ヒト、サル、ブタ、および、ウサギのアテローム硬化性プラークに 見られた、特定の細胞外抗原の単離法及び特性決定（キャラクタリゼーション） について報告する。 ブラークーマトリックス−特異的抗原（２２Ｄ３　Ａｇ　）は、その特定モノク ロナール抗体、ｚ２Ｄ３が、アテローム硬化性ヒト冠状動脈について、免疫組織 学的にスクリーンしたところ陽性とされたことにより発見された。２２０３抗体 は、プラークマトリックスを染めるが、正常動脈は染めない。この抗体を産生ず るハイブリドーマプログラムに使用された免疫源は、モノクロナール抗体１５１ １５によって、ヒト・プラーク・ホモジェネートから得られたアフィニティー精 製材料である。　１５Ｈ５抗体は、正常平滑筋細胞及びプラーク由来平滑筋細胞 の産生ずる炭水化物性自己抗原を認識する （ＬｘＩｌｌｉｘｉｅｒｅ、ＩＪ、、ら、Ａｔｂｅ＋ｏ＋ｃｌｅｒｏａｉ＋　（ １＋ｅｌｔｎｄ）　７４　（１−２）１２５　（１９８８）　）。 この　２２Ｄ３抗体を、さらに、各種のヒト組織にたいしてスクリーニングした 。このために、５μの、未固定凍結組織切片を用いた（Ｇ息１ｅｎｏｆｆ、　Ｅ 、、ら、未発表結果）。病気のヒト冠状動脈および大動脈のプラークはすべて陽 性であった。膵臓線維筋細胞、卵巣の局所細胞塊、皮脂腺の例外を除いては、正 常組織はすべて、この抗体に染まらなかった（第７表）。染色される正常組織は 、細胞外には表出せず、細胞質ゾルに限局していた。 逆に、アテローム硬化性プラーク内部の染色性の大部分は、プラークの平滑筋細 胞の細胞質ゾルの染色の他に、結合組織基質全体を通じて、細胞外的に広く表出 した。線維性脂肪病巣においては、マクロファージ関連領域は、結合組織のみの 領域、および／または、平滑筋細胞関連の領域はど、染色度は強くなかった。マ クロファージ自体は、Ｚ２Ｄ３抗体では染色されなかった。 ２２部３抗体はまた、マカク猿、ワタナベ兎、ニューシーラント白兎、コレステ ロール血症豚のアテローム硬化性プラークを染色した（新鮮な摘出サンプルを、 冷却通常生食液にて洗浄し、ただちに凍結する。５μ切片をクリオスタットで調 製し、ゼラチンでコートしたスライド上に置いた。固定は行なわなかった。 ＡＢＣ免疫パーオキシダーゼ法を、メーカーの処方にならって行なった（Ｖｅｃ ｔｏｒ、Ｂｕ＋ｌｉｎｇａｍｓ、ＣＡ）　）　。サル＜７）組織ノ場合ニは、病 巣発達のいくつかの段階について調べた。１年を越える期間に渡り２％コレステ ロール食で飼育されたサルのプラークは、　２２部３抗体で染色された。しかし ながら、もつと具味あるのは次の観察である。すなわち、はんの数カ月しかコレ ステロール食で飼育されていないサルでも、初期の脂肪線条の下部において、２ ２部３抗体は、動脈壁の患部領域の弾性線維層の直下にある中層の平滑筋細胞の 細胞質やその細胞直近周辺を染色したことである。これは、この初期病巣にたい するマクロファージ及びリンパ球の双方の移動に対応する時間順序内に現われた ものである（Ｐｘｐａｅｘ、Ｉ、、ら　５ｃｉｅｎｃｅ　２３４：１５７３　（ １９８６））　。時期的にそれより少し後に、平滑筋細胞が、弾性線維層を貫通 し、脂肪線条領域に移行するのが観察された。 水溶条件下での、２２Ｄ３プラーク抗原を単離・精製しようとする試みはすべて 、概して言うと、不成功であった。免疫組織化学法で用いられる凍結組織切片の 有機溶媒による固定は、染色性の完全消失を招くという観察結果に基づき、プラ ーク組織から、有機溶媒によって、抗原を抽出する方法を行なった（Ｍａ＋ｎｄ ｘ、１．　＊ｎｄ　Ｒｏ＋３　Ｒ，、Ａｒｊｅ＋１ｏｓｅｌｅｒｏｓｉ＋　１０ （２）：１６４及び１７８　（１９９０））。 抽出抗原をさらに、一連のクロマトグラフィー操作によって精製した。この操作 には、ゲルによるサイズふるい分け、イオン交換クロマトグラフィー、薄層クロ マトグラフィーが含まれる。新鮮プラークを、正常動脈残留物から剥離し、冷却 通常生食液で洗浄した。次に、このプラークを２ｘ４ｍｍフラグメントに刻み、 凍結乾燥して小さなフレークとした（これは遊離水分をできるだけ除去するため ）。フレークを、Ｏ，Ｃ，Ｔ、培地（Ｍｉｌｅ＋　Ｌａｂ＋、、　Ｅｌｋａｈａ ｒｌ、ＩＮ　）に包埋し、ブロックとし、ただちに、凍結した。凍結組織塊を、 組織切片用クリオスタットに装着し、５μ組織切片を薄切した。この組織切片を 、ガラス・ビーカー中で、１０部のアセトニトリルと混合した。このガラス・ビ ーカーを、緊密に覆い、内容物を、室温で、１８〜２４時間活発に撹拌した。次 に、撹拌した内容物を、２０．０Ｈｇで、４℃で１時間遠心し、沈澱を捨てた。 アセトニトリル液を、０．２２μのナイロン・フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ 、　Ｂｅｄｆｏ＋ｄ、　ＭＡ）でろ過すると、薄く黄味を帯びた上清が得られた 。 ＥＬＩＳＡイムノアッセーを用いて、抗原内容物について、各種クロマトグラフ ィー分画を調べた。 ゲル７濾過クロマトグラフイー 抗原液中のアセトニトリルを蒸発させ、残余を、１００％エタノールに再び溶解 した。次に、この黄味がかった液を、１００ｍ１の上清当り　１ｇの活性炭と混 合し、得られたスラリーを、室温で１時間撹拌した。次に、このスラリーを、０ ．２２μのフィルターでろ過し、澄明な液を得た。次に、この液を、エタノール で平衡させた、脂質親和性セファデックスＬＨ６０ｆｓｉｇｌｌｌａ、Ｓｔ。 Ｌｏａｉ３　ＭＯ）で充填したＣ２６／１００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ。 Ｐｉ＋ｅａＮｖｘ７．　Ｎｌ）に通液して、サイズ分けをした。抗原陽性分画を プールした。 イオン交換クロマトグラフィーは、Ｍｏｎｏ　Ｑ　ＨＰＬＣカラム（Ｐｈａｒｍ ａｃｉａ　）を用い、Ｍａｃ＋＋ｏｎの方法にならって行なった（１．Ｅ、　Ｍ ａｎｓｉｏｎ、Ｂ、Ｒｏｓｅｎｇ＋ｅｎ、Ｌ、Ｓｖｃｎｏｅｒｈｏｌｍ、Ｉ。 Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ７３２２．４６５　（１９８５））　６ただし、溶 媒として、メタノールの代わりにエタノールを用いた。Ｘ２Ｄ３抗原を、非結合 の、ボイド容積におけるＨＰＬＣカラムに通した。 薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ） ＴＬＣは、Ｗｈａｔｍａｎ　ＬＫ２直線性にセルロース・プレート（Ｃａｂ　＄ ４８２５−６２０）を用いて行なった。このプレートを半分に切り、５ｘｌＯｃ ｍプレートを２枚得た。ｚ２Ｄ３抗原を含む分画を、ガラス毛細管を用いて、プ レートに、ル−ンあたり１−１０　ｕＬ塗布した。（サンプルを、ル−ン当り、 　０．５ｕＬ分液を多数回塗布し、１回ごとに、ヘアー・ドライア−で乾燥した 。）次に、この塗布したプレートを、移動層（クロロポルム、メタノール、氷酢 酸及び水を、容量比、２５：１５：４＋２で混合したもの）を含む容器中に置い た。移動層が、プレートのトップから約３ｍｍになったら、プレートを取り出し 、室温で空気乾燥した。各種ＴＬＣ操作から得たプレートを、個々に、沃素染色 法、または、Ｚ２Ｄ３抗体を用いた免疫パーオキシダーゼ染色法によって染色し た。沃素染色法は、蓋をしたガラス容器に、沃素の結晶を投入し、次に、３７℃ で１０−３０分間インキユーヘートシて、沃素蒸気を発生させた。乾燥したＴＬ Ｃプレートを、この容器に投じた。沃素反応斑が、所期の濃さに達したら、プレ ートを取り出し、点検した。移動層の上端に単一スポットが観察された。ｚ２Ｄ ３抗体と、陰性コントロール抗体を用いた免疫パーオキシダーゼ染色法で二つの プレートを処理した結果、これが、ｚ２Ｄ３抗原であることが確認された。 ＴＬＣ上での、Ｚ２Ｄ３抗原の、免疫パーオキシダーゼ検出上記で得た、２枚の 乾燥プレートを、０．２％カゼイン１５０ｍＭトリスーＨＣｌ／１５０　ｍＭ　 ＮｌＣｌバッファー（Ｔ　Ｂ　Ｓ）　、　ｐｉ（７，６中に４５分間装いてブロ ックした。次に、１枚のプレートを、カゼイン・バッファー中に、２２Ｄ３１ｇ Ｍ　ＭＡｂを５μｇ／ｒｎＬで溶解した溶液に入れ、静かに撹拌しながら、室温 で、１８時間インキユベートシた。もう１枚のプレートは、抗体の陰性コントロ ール液でインキュベートした。未結合抗体は、１回当り１５分の洗浄を３回行な って除去した。次に、洗浄したプレートを、ヤギ抗マウス ＩｇＭ・ホースラディツシュ・パーオキシダーゼ結合体（抱合体）（Ｔｉｇｅ、 Ｂｕ Atherosclerotic Plaque Specific Antigen, this application was filed on July 31, 1989. This is a partial continuation of U.S. application number 388 and 129, which was filed earlier. The contents of the application are incorporated herein by reference. In atherosclerosis, the lumen (inner passageway) of an artery is covered with several layers of plaque (fatty and and fibrous tissue). Atherosclerosis can occur in any artery. Cardiac origin in coronary arteries In the brain, it can cause stroke, and in the peripheral arteries, it can cause damage to the legs and feet. cause Atherosclerosis currently plagues the United States and other developed countries. It is one of the biggest medical problems facing the world. In the United States, approximately 40 million people At risk of atherosclerosis. However, there are obvious signs of this disease. Only 6 million people in the United States exhibit symptoms. Others remain undiagnosed until the disease appears, and even worse. In some cases, the first symptoms may appear as a heart attack or stroke. heart attack Stroke and stroke are the first and third leading causes of death in the United States, respectively. Melt. Each year, more than 500,000 people die from heart attacks, and among these patients A considerable number of them die without any warning. The endothelium is located between the blood and the arterial tissue and prevents blood components from accumulating on the blood vessel wall. Acts as a barrier. The endothelium is associated with major coronary artery disease and stroke. The formation of atherosclerotic lesions at the bottom. Traditionally, such lesions Extensive research has been conducted into the causes and detection of this. Endothelial injury is considered to be the first step in the formation of atherosclerotic lesions. This is associated with hemodynamic load, hypercholesterolemia, hypertension, and complex immune disorders. It appears to be caused by disease. Endothelial injury is caused by cholesterol accumulation and endothelial damage. leads to thickening, cell proliferation, and connective tissue fibrosis. Damaged endothelial cells, lack of endothelium (nonendothelialized) In blood vessels, IgG and complement Accumulation of factor C3 has been observed. Blood-derived mononuclear phagocytes also attack atherosclerotic arteries. Forms part of the cell population in sclerotic lesions. The mechanism of plaque formation is unknown to all. However, a possible mechanism is as follows. In other words, fat storage This leads to the influx of macrophages, which are followed by T cells, B cells, and anti-inflammatory cells. Body production occurs. Various soluble proteins have been extracted from human atherosclerotic plaques. There is. Among them are IgA, IgG, IgM, BIC (C3), alpha 1-alpha antitrypsin, alpha 2-macroglobulin, fibrinogen, albumin ) IDL, alpha-acid glycoprotein, β2-glycoprotein, trans Contains spherin and celluloblasmin. Pathological intima also contains a small amount of tissue-binding It was found that IgG, IgA, and BIC were included ()Iollznde+ , W. et xl,, ^+he+o+ele+o+i+, 34:391-435 ( 1984) l. IgG has been detected in the lesion and surrounding endothelial tissue iP! +um+. D, el! +,, ^fheroscle+o+is, 38:211-2 16 (1981), HIIISQ mouth. G, et xi,, Expe+1llItotxl! od Mo1ecol! + Patholog7. 34:264-280 (1981), )la++ n5on, G, +1! +,, Human ctx Path, Microbiol. 1mmu mouth of, 5cxnd, 5ect, ^, 92:429-435 (198 4) l, however, in atherosclerotic tissues and related tissues. The origin, function, and binding properties of immunogupulins are not well defined. Anti-low-density lipoprotein (LDL) autoantibodies are associated with vascular disease in patients with vascular disease. There are reports that the antibody is at a high concentration, but this suggests that the antibody is It was found that there seems to be a relationship with the development of atherosclerosis. however, The causal relationship between these autoantibodies and atherosclerotic plaques has not been established. Ill+ond7. E, et! ＋、、　Mechanism+　ofAg ing and Development, 2941? -+23 (1985) l. Regarding the presence or absence of antigenic and non-antigenic substances in various body fluids and tissues, and their amounts. A wide range of immunoassays have been developed in the past. Total immunoglobulin and I For gE immunoassays, see US Pat. 720. 760. 4. 444. 87 'l is described. For IgG allotype immunoassay, Russian patent 649. 433 It is. For ELIS^ immunoassays, Maggi. fEn+yme-IIanox+sa7. et al. Boea Raj o: CRCPterIpp172-176 (1980)), however , prior to the present invention, there were no suitable immunization methods to determine the presence or absence of atherosclerotic plaques. The assay was unknown. Although atherosclerosis is generally a diffuse disease, human coronary atherosclerosis In cases of arteriosclerosis, treatment is most often performed. Mainly because This is because the sites where lark formation is observed are usually distributed proximally. As a result, the crown Direct arterial bypass is the most frequently used procedure for myocardial vascular reconstruction. It becomes. Aortic/coronary artery grafting or medial mammary artery grafting has become the technical standard. It has shown excellent long-term efficacy. However, this long-term outcome may result in progressive atherosclerosis distal to the graft junction. It may also be at risk due to atherosclerosis. In other cases, the disease is so distal that it is inoperable. Traditionally, distal lesions are ignored or, in especially favorable cases, treated with endarterectomy. The condition had been treated by surgical techniques, but none of these methods could be said to be sufficient. Traditional methods used to diagnose and treat atherosclerosis are often invasive and , are expensive and have limited effectiveness in a significant number of patient cases. Ta. Prior to the present invention, atherosclerotic plaque-specific antigens and Radioimaging of atherosclerotic plaques using antibodies that bind to was unknown. However, aging venous thrombi can be targeted with radioactive moieties. Radioimaging methods using fibrin-specific monoclonal antibodies have already been developed. lRo+enb+oagh, S, et zl, Ri diolog7U 62:575-577 (FebralT, 1987N. Radioimaging of thrombi using radiolabeled monoclonal antibodies directed against platelets The method of sh　Medicxl　jonrnal, 293:1525-1527(Dee embe+, 1986)l. DTPA labeled with metal radionuclide -binding antibodies as described by Hoxlovich, D. et al. Jonnal of Immunologicil Method 3 65: 147-157 (1983)+. Regarding IIMRI, ultrasound, and X-ray imaging methods using metal chelate compounds, Allow 4. 647. 447. Furthermore, antibody binding of metal chelate compounds The case is mentioned in line 42 of 71I. paramagnetic polymer chelation Monoclonal antibodies labeled with compounds and their use in NMRI methods ish+eye, P, etzl, Magnsti, which is also described c Re+ooancein Medicine, 3:336-340 (1 986) and [1+ad7. T, el al,. Procedure of the So+1e17 or M! gnel ic Re5anznce inMedicine, 5econd Annaa l　Meeting, Sob, of　MagneticRtsonaace　i n　Medicine, Inc., 5anF+anci+co, p, 1 0゜(1983), this is Kou)che+,l,etal,,I,Nuc Med, 25 Intravascular laser-conducting optical fibers for hematoporphyte (quoted from Li 506-513 (1984)). U.S. Patent 4,343. 734 (Lixn et 11. ) has a gamma power Hoxyglutamic acid (GLA) specific antibodies have been described. This is an organization can be labeled with fluorescein for immunofluorescence staining. By this The presence or absence of GLA in the tissue can be determined by GLA-specific antibodies are binds to GLA in advanced atherosclerotic plaques exhibiting tumor deposition. According to a report by Lixn et al., GLA is not found in non-calcified plaque. However, heart valves, aorta, prothrombin, coagulation factors Vll, IX It is said that it is also found in circulating proteins such as protein C1, protein S, and X. death However, the GLA-binding antibody of Lixn et al. Do not selectively bind to. The atherosclerotic plaque antibodies of the present invention can be applied to atherosclerotic plaques that binds to atherosclerotic plaques at all stages, but selectively to GLA. Not combined. The idea of plaque enhancement by staining has already been reported in hearts removed from human cadavers. , in vivo experiments in arterial tissues showed that glycosylated connective tissue proteins (Ca+t i++, L, and Wilsum, 1. L,,1. Cl1n, 1n ve+t, 87:1436 (1983)). this type of antigen Although concentrated within plaque material, normal arteries and/or other It is also found in normal tissue. Certain antigens and their monochrome counterparts Although the null antibody initially appeared promising in Watanabe's rabbit model, , when applied to human lesions, did not yield corresponding results (Shih, 1 ．． L,, et 1+,, Proc, Natl, Acad. Sei, 87:1436 (+990)), especially the dissemination of extracellular plaque tissue. This was the case when pursuing sex markers (Kimu+z, J,, eta1. , Virchows TCb, 410(2): 159 (1986)) . The present invention provides a method for treating atherosclerotic plaques both in vitro and in vivo. To provide an inexpensive and accurate method for determining the presence or absence of larks. Furthermore, the present invention provides Provides a treatment for people with teloma atherosclerotic plaques. This method includes enzyme treatment. This includes medical treatment and laser treatment. Finally, the present invention provides a method for treating atherosclerotic plaques. provides a method for delivering drugs to a medical area. Summary of the invention The present invention provides purified antigens indicative of the presence of atherosclerotic plaques. child The antigen of 200. Complex carbohydrate structure with molecular weight exceeding 0OG Daltons and is an extracellular component of atherosclerotic plaques. have The invention also provides purified antigens. This antigen is hybridoma Q10 It has the characteristic of selectively binding to monoclonal antibodies produced by E7. Two. The amounts of these antigens change as atherosclerosis progresses. It has the characteristic of The present invention further provides antibodies against these antigens and antibodies against these antigens. provides a method for detecting the presence of both an antigen and antibodies directed against that antigen. It also provides a treatment for atherosclerosis. The invention also provides methods for reducing the amount of atherosclerotic plaque in blood vessels. provide. This method consists of: a) specifically binds atherosclerotic plaques to both plaque and zymogens; The first step is to contact the reagent with a reagent that can be combined with the other reagent. The substrate for the zymogen is atherosclerosis. connective tissue within atherosclerotic plaques, and when this enzyme is cut, the reagent Plaques are removed under conditions such that they bind to plaques and form reagent-plaque complexes. b) contacting the reagent-plaque complex with the zymogen; The zymogen binds to the reagent and forms a zymogen-reagent-plaque complex. The reagent binds specifically to the zymogen under conditions such that it forms a zymogen; C ) This zymogen-reagent-plaque complex is separated by specifically cleaving the zymogen. The enzyme is exposed to an agent that allows the enzyme to digest the plaque under conditions that allow the enzyme to digest the plaque. The precursor is converted to an enzyme. The present invention further provides a diagnostic assay comprising the following steps. That is, a) Calculate the patient's body mass index (BOD7 mass 1nde!, BMI). b ) Antigens related to pathological conditions, or other serum or plasma samples, or c) determine the concentration of antibodies that bind to the same patient's antigen; c) determine the patient's body mass index; or plot against antibody concentration; d) Compare the resulting values with reference values; Determine whether the result exceeds the reference value and thereby clarify the presence or absence of a pathological condition. I'll do it. Brief description of the drawing Figure 1. Atherosclerotic plaque-specific antigens at stages N. used for the development of antibodies against antigens and for testing antibodies against that antigen. The route you can take. Figure 2, DEAE fractionation (preliminary) - autoantibody assay dotted line indicates each fraction. It represents the amount of binding of CAD serum to normal serum. The solid line is 0D28o represents the amount of protein in each fraction measured by absorbance at . The chain line is from 0 1. Represents the NaCl gradient up to QμNzCl. Figure 3, DEAE fractionation (for analysis) - one antigen capture assay dotted line indicates hybrid Measured by binding to monoclonal antibodies produced by the marketer 15H5. It represents the amount of autoantigen in each fraction determined. The results shown here are based on the antigen. For peroxidase-conjugated antibodies, read the plate at 0D45°. I took it. The solid line represents the amount of protein in each fraction measured by absorbance at 0D28o. represents. The dashed line is from 0 to 1. Represents the NiCl gradient up to OM NaCl. Figure 4. Measurement of the size of 15H5-antigen in atherosclerotic plaques. Self-antigen and four size markers (thyroglobulin (a), IgG (b), ovalbumin (C), myoglobin (d)) was added to BioSi1 It was passed through an analytical TSK-400 column. The autoantigen was peroxidase labeled 17113. Tested by combining with 15115 I put it out. Binding is quantified by measuring absorbance at 0D45o. Char 5, CAD patients, normal people under 35 years old, normal people over 35 years old IgA levels that specifically bind to loamic atherosclerotic plaque antigens. Figure 6. Radiotherapy for CAD patients, normal people under 35 years old, and normal people over 35 years old. Atherosclerotic plaque antigen concentration quantified by immunoassay. Figure 7. Atherosclerotic plaque antigen levels versus age in normal subjects. Figure 8.9 Age versus age of patients with severe CAD, i.e. patients with >50% occlusion Teloma atherosclerotic plaque antigen levels. Figure 9. Atherosclerotic plaque antigen levels versus age in patients with mild CAD. . Figure 10. Specific binding to atherosclerotic plaque antigen versus age in normal humans. IgG levels. Figure 11.1 Severe CAD patients, i.e. patients with more than 50% occlusion, versus age. IgG levels that specifically bind atherosclerotic plaque antigens. Figure 12. Age versus atherosclerotic plaque antigen and characteristics of patients with mild CAD. Differentially binding IgG levels. Figure 13. Specific binding to atherosclerotic plaque antigen versus age in normal humans. IgA level. Figure 14.1 Severe CAD patients, i.e. patients with more than 50% occlusion, versus age. IgA levels that specifically bind atherosclerotic plaque antigens. Figure 15, mild CA D low tone, age versus atherosclerotic plaque antigen IgA levels that specifically bind to. 16th cause 1 i.e. the percentage of humans above normal. Figure 17. specifically binds to atherosclerotic plaque antigens for various age groups. Positive rate of matching antibodies. Dotted bars represent IgG and shaded bars represent IgA. Figure 18. specifically binds to atherosclerotic plaque antigens for various age groups. IgG. , IgA, or both. Figure 19. Various age group antibodies (IgG or IgA) or antigens Positive rate of either. Figure 20, Figure 21 for monosaccharide analysis with CPPA-1 column. 　 Using a Dionex instrument for monosaccharide analysis equipped with a CPPA-1 column Chromatography blank run of seven standard monosubcalides. Dissolved in pure water 15mM Nl0H0 Figure 2. Model equipped with CPPA-1 column 15H5 monoclonal antibody using Dionex instrument for nosaccharide analysis Chromatographic blank run of autoantigen affinity purified product. 15mM NaOH dissolved in pure water Figure 23. body for IgG+A Graph of mass index (BMI). The numerical value of each section is 98% (981h perc) marked with ``entile''. Therefore, 98% of the subjects in that section are marked This means that it is below the threshold value. If a subject is above that threshold, If so, it can be said that the subject is susceptible to atherosclerosis. Figure 24. Graph of body mass index (BMI) against antigen. The value for each section was marked at 100%. Therefore, one of the subjects in that section 00% means 0 below the marked threshold. If a subject If it is above the threshold, the subject is susceptible to atherosclerosis. (It can be said that it is 1. Figure 25. Percent inhibition of antigen binding. CAD serum with various dilutions of antigen-coated microorganisms ) 1 hybridoma 15H5 after pretreatment with. Inhibition of binding to antibodies produced by 171 (3). Figure 26. Percent inhibition of antigen binding. Antigen-coated microwells were coated with various amounts of Pretreated with antibodies produced by Brydoma 15) 15, 17113. Inhibition of binding of CAD serum after treatment. Figure 27. Hybridoma z2D3. 　By the antibody produced by QIOE7 A model of method 1 for purifying atherosclerotic plaque antigens recognized by Formula diagram. Figure 28. DEAE ion exchange chromatography of CsCl fraction 1. Z2D The peak representing the antigenic substance binding to 3 is produced by /tsuta hybridoma z2D3. It was measured by ELISA method using the antibody. Figure 29. DEAE ion exchange chromatography of CsCl fraction 4. Q10 The peak representing the antigenic substance binding to E7 was It was measured by ELISA using the produced antibodies. Figure 30. Targeting proenzymes using plaque-specific antibody fragments Schematic representation of enzymatic attenuation of atherosclerotic plaques. The enzyme precursor is A, represents a bifunctional antibody. B, represents a bifunctional antigen that binds to the 22D3 antigen. Represents an enzyme containing a propeptide moiety that inhibits C1 enzyme activity. D, represents antigen/bifunctional antibody/proenzyme complex. Complexation after propeptide cleavage by treatment with E0 tissue plasminogen activator body and the enzyme that initiated plaque lysis. Figure 31. Using monoclonal antibodies produced by hybridoma z2D3. Histological staining of rabbit aorta. According to the ABC immunoperoxidase method, hematopoiet Counter-stained with xylin. A, Map corresponding to the rabbit tissue photo B, Photograph showing z2D3 monoclonal antibody binding in rabbit aorta after detachment. true. Figure 32. Non-fixed 5μ freezing of human coronary artery from a patient with advanced atherosclerosis. Immunostaining of tissue sections by ABC immunoperoxidase method. with hematoxylin Counter stained. The magnification is 20x. A, Histological staining image of z2D3 monoclonal antibody is shown. B shows a histological staining image of a non-specific IgM monoclonal antibody. East Figure 33, unfixed 5μ frozen tissue of human coronary artery from a patient with early atherosclerosis. Immunostaining of sections by ABC peroxidase method. Counter with hematoxylin - Dyed. The magnification is 20x. A, Histological staining image of 22D3 monoclonal antibody is shown. B shows a histological staining image of a non-specific IgM monoclonal antibody. Figure 34. Unfixed 5μ frozen tissue section of human coronary artery from a patient with atherosclerosis. Immunostaining by ABC peroxidase method. Counter stain with hematoxylin It was colored. The magnification is 20x. A, 221) Histological staining image of 3 monoclonal antibodies is shown. B. QIOE? A histological staining image of a monoclonal antibody is shown. A histological staining image of C1 non-specific 1gM monoclonal antibody is shown. Figure 35: Aorta section a of untreated thoracic region of a rabbit and atheroma of the same rabbit Comparison with aortic sections dissected to induce atherosclerotic plaque. slaughter a rabbit Inject 111In-DTPA-42D3 monoclonal antibody into the ear vein before I entered. A, Macroscopic shapes of aortic section A without plaque and aortic section A with plaque. A photo showing the difference in attitude. B, In the aortic region containing atherosclerotic plaque b, 111In- Autoradiographs showing increased binding of DTPA-22D3 Provides purified antigen indicative of the presence of atherosclerotic plaques. This antigen is a complex carbohydrate object structure, 200. It has a molecular weight exceeding 1,000 daltons and has atherosclerotic activity. It has the property of existing as an extracellular component of hardening plaque. This antigen is synthesized by or present in smooth muscle cells. It has the characteristic of This antigen is derived from hybridoma 15H5 (ATCC accession number 118 Utilizing the ability to selectively bind to the monoclonal antibody produced by 9839) , has been purified and its properties have been clarified. This antigen also has a neutral charge. It has the characteristic of being sexual. Also, the carbohydrate profile as depicted in Figure 22 It has the characteristic of having a 15H5 antigen selectively binds to lectin has been established. Therefore, the conomonono property is further defined as Conxyx lia en+ito+miI+T+iti+am vu1gi+i+, Le mouth s eulinx+is, Rieiou+commoniIIT+itieu It binds to lectins such as mvu1ga+i+, but A+aehisbypqa +a, Bgadei+xea simplicitolia, Diolicho ＋　bi! lo+oIIG17eine Mar, Limulus po17 phen+++, Pt+aieolu+vu1gi+i+-E. Pha+eolu+vu1ga+i+-L, Pi+um szliwum, 5 ophoya 1xponica. U! ex ec+op! eSIUlcx eu+opaeus, Yieia v It is shown that it does not bind to lectins such as illo+x. Another way to determine the properties of a molecule is to determine the action of various enzymes on the molecule. It's about investigating. To further describe the characteristics of this 15H5 antigen, protein degradation Degradation by enzymes, deoxyribonucleases, lipases and ribonucleases shows resistance to α-amylase, β-amylase and glucoamylase. shows partial susceptibility to degradation by 15H5-antigen is a molecule known to be associated with atherosclerotic plaques for that antigen to determine whether atherosclerotic plaque The degree of binding to antibodies that specifically bind to known components of the protein was quantified. this antigen Furthermore, apoliboprotein, human collagen, fibronectin, keratin, Non-reactive with antibodies that bind laminin, tenascin and vitronectin It has the characteristic of being. Other properties of the antigen include: Even after boiling the antigen for 1 hour, the Production of Ibrid-v 15H5 (ATCC Accession No. 1189840) It shows reactivity with clonal antibodies and also dissolves the antigen in phosphate buffer solution. After treatment with 8M urea for 24 hours at room temperature, 6M guar hydrochloride dissolved in phosphate buffer solution was added. After treatment with Nidine for 24 hours at room temperature, treatment with 2M trifluoroacetic acid for 30 minutes at room temperature. After 8 hours at room temperature with 3.5 M sodium ocyanate dissolved in phosphate buffer solution. 0.19M sodium dodecyl sulfate dissolved in phosphate buffer solution Hybridoma 15H5 (ATCC Accession No. It shows reactivity with the monoclonal antibody produced by No. HB984G). The invention also provides antigens associated with atherosclerosis and certain normal tissues, or provide an epitope. This antigen is hybrid-717H3 (human TC C accession number HBIG189) which selectively binds to monoclonal antibodies produced by It has the characteristic of Another antigen is also provided by the invention. This antigen is associated with atherosclerotic Synthesized by or associated with plaque connective tissue and plaque smooth muscle cells Bibrid-7X2D3 (ATCC Accession No. No. HB91140), or 7, Ibrid-7X2D3/3E5 (ATCC Accession number H[l　10485) (7) Selectively binds to the produced monoclonal antibody. It has the property of being a lipid-containing molecule. This antigen was further treated with acetone. It has the characteristic that it can be used in histological staining methods that have been destroyed by physical processing. Also provided are antigens indicative of the presence of normal smooth muscle cells. One such antigen is , produced by hybridoma QIOE7 (ATCC accession number 1 (BIQi88)) Some monoclonal antibodies have the property of selectively binding to certain monoclonal antibodies. of this antigen The molecular weight is 150. Over 000 Daltons. This antigen is further expressed in normal smooth muscle cells. and synthesized by or present in the normal connective tissue surrounding arteries; It has the characteristic of In one embodiment of the invention, the antigen is labeled with a detectable marker. child The marker can be any marker known to those skilled in the art. however, In preferred embodiments, markers include enzymes, paramagnetic ions, biotin, fluorophores, fluorescent A chromophore, a heavy metal, or a radioactive isotope. In many cases, including immunoassays, In this case, the preferred marker is an enzyme, especially Oxidase or alkaline phosphatase are preferred. The invention also provides purified antibodies. This antibody is associated with atherosclerotic plaques. It specifically binds to antigens or antigens associated with normal smooth muscle cells and connective tissue. one In one embodiment, the antibody is labeled with a detectable marker. use The selection of markers to use will vary depending on implementation. However, marker selection can be readily determined by a person skilled in the art. Preferred embodiments of the present invention In embodiments, markers include enzymes, paramagnetic ions, biotin, fluorophores, chromophores, heavy metals. genus or radioactive isotope. These labeled antibodies are associated with atherosclerotic Immunoassay as well as histological applications to detect the presence of plaques It can also be used for In such applications, the marker is an enzyme Preferably, the enzyme is horseradish peroxidase or Most preferably, it is alkaline phosphatase. The antibodies specified above can be either polyclonal or monoclonal. However, monoclonal antibodies are a preferred embodiment. The present invention provides monoclonal antibodies directed against atherosclerotic plaque antigens. However, some of the antibodies include hybridoma 15H5 (^TCC accession number H[ 19839), a monoclonal antibody produced by Bibrid? 22D3 (A TCC accession number 118104115) Oyohi Z2D3/3E5 (^TCC accession number The monoclonal antibody produced with the accession number HBI0485) is an IgM antibody. IgG is a class switching variant of z2D3. Additionally, other daughter cell lines of Z2D3, such as 22D315C5 (IgGl) Monoclonal antibodies produced by the strain and hybridoma 171 (3 (ATCC accession number HB10189) included. Hybridoma QIOE7 (ATCC accession number HB1018g+) The monoclonal antibodies thus produced are directed against normal arteries. C Ibridoma 15115°22D3. 22D3/3E5. 17H3, QIGE7 c. Patent Procedures) Requirements of the Budapest Treaty on International Recognition of Deposit of Microorganisms It has been deposited pursuant to and in accordance with its terms. That is, American T7ps Curare Co11ection (AT CC), 12301 Psrklsvn Dtlve. Rockville, Mrr71snd 20852, respectively. IB9839°HB94gG, HB10485. 1TBIQ189. HB1 It has been deposited under accession number 0188. The invention provides recombinant polypeptides. This peptide is z203. z2D 3/3E5 Oyohi et al., 22 [13 mataha Q10E7) [[l! Cytophyte lineage monoku Consists of substantially the same amino acid sequence as the hypervariable region of local antibodies . Such polypeptides can also be obtained by methods other than recombinant. For example, proteolytic digestion. Chimeric antibodies or fragments thereof comprising such recombinant polypeptides are also provided. Served. In particular, the amino acid sequence of the human frame 7 region and the constant region of human antibodies. A chimeric antibody consisting of a sequence is provided. This causes mouse 22D3. Z2D 3/3E5 or QIOE7 hypervariable regions can be “humanized” or made non-immunogenic. can be done. The present invention also provides site-directed mutagenesis, particularly for more binding Chimera, a polypeptide obtained by site-directed mutagenesis that confers sex Provide antibodies or fragments. As chimeric antibody fragments, Fab. There are F(xb)2, F,, VN7 fragments. The present invention also provides atherosclerotic plaque antigens attached to solid supports. and specifically bind to atherosclerotic plaque antigens bound to a solid support. Provide antibodies that match. In a preferred embodiment, the monoclonal hybridoma 15H5 producing The antibody is attached to a solid support. Anti-plaque antibodies, or atherosclerotic plaque antigens, can be produced using conventional methods. Therefore, it can be bound to an insoluble support. Antibodies on an insoluble support The method of coupling is described, for example, in U.S. Patent No. 3. 551. 555. 3. 553. 31 0. 4. 048. 298, RE-29,474. By adsorption The binding of antibodies to polystyrene is described, for example, in US Patent No. 3. 646. 3 46. 4,092. 4 [Described in No. 18. Various types of insoluble antigen-containing proteins For attachment to sexual supports, see US Pat. 720. Described in issue 760 has been done. Various materials can be used as the insoluble support. In this case, the main consideration is the presence of anti-plaque antibodies or plaque antigens. Binding properties to surfaces and binding reactions between anti-plaque antibodies and plaque antigens Used to check the absence of interference or the presence/extent of binding reactions. , no interference with other reactions. This insoluble support is , organic, and inorganic polymers, whether natural or synthetic, can be used. suitable Examples of polymers include polyethylene, polypropylene, polybutylene, and polypropylene. (4-methylbutylene), butyl rubber, silicone polymers, polyester cells, polyamides, cellulose and cellulose derivatives (cellulose acetate, (nitrocellulose, etc.), acrylates, methacrylates, vinyl polymers (polyvinyl acetate, polyvinyl chloride, polyvinylidene chloride, polyvinyl fluoride, etc.) ), polystyrene and styrene graft copolymers, rayon, nylon, Examples include polyvinyl butyrate and polyformaldehyde. as an insoluble support Other materials that can be used include latexes of the above polymers, silica gels, etc. metals, silicon wafers, glass, paper, insoluble proteins, metals, metalloids , metal oxides, magnetic materials, semiconductor materials, cermets, etc. Ru. In addition, substances that form gels, such as proteins such as gelatins, lipopolymer saccharides, silicates, agarose, polyacrylamides, or Polymers that form some aqueous phases, such as dextrans, polyalkylenes ・Glycols (alkylene containing 2-3 carbon atoms) or surfactants , e.g., phospholipids, long chain (12-24 carbon atoms) alkyl ammonium salts, etc. There are amphoteric compounds such as Some diagnostic supports are polystyrene, styrene copolymers, or polyester. Polyolefins such as tyrene or polypropylene, and acrylates and methacrylate polymers and copolymers. anti plaque reagent anti Body or plaque antigens can be absorbed by adsorption, ionic bonding, van der Waals adsorption, and electrostatic binding. or other non-covalent bonds to an insoluble support. Wear. Alternatively, it can be attached to an insoluble support by covalent bonding. . A particularly advantageous support for this purpose is a microtiter plate with a large number of wells. Consists of plastic cover inserted into the well surface or into it. The support may also be used as a support for antigens or antibodies. For quantitation, fluorescence measurement If you must, use a microtiter plate or well insert. It is best to make it opaque to light. Because it gives a well The excitation light emitted may reach or affect the contents of the surrounding wells. Because it will disappear. The non-covalent bonding method is a US patent! It is described in No. 4,528,267. A method for covalently binding antibodies and antigens to an insoluble support is 1chi+oC hibatx [1mmobiii+ed EnBllei, Halted Press New York (1978)] and A, Cua+rec* +x [L Bio, Chem, 24513059 (1970)] It is listed. The entire contents of which are incorporated herein by reference. surface coated with protein, as described in U.S. Patent No. 4. Using the method described in No. 211418 It can be bound to antibodies or antigens. This is used as a binder, e.g. For example, use glutaraldehyde. Yet another method is to Coded with a layer containing free isocyanate groups such as riether isocyanate By adding antibodies or antigens dissolved in an aqueous solution onto this, the necessary binding is achieved. It is done. In yet another method, antibodies or antigens can be added to hydroxylated materials. , cyanogen bromide. This is discussed in U.S. Patent No. 3. 720. As stated in No. 760. The present invention also provides methods for detecting antigens present in and indicative of the presence of atherosclerotic plaques in a biological sample. This method involves directing the biological fluid to an antibody that specifically binds an atherosclerotic plaque antigen, such that the antibody and the antigen form a detectable complex. the complex thus formed is detected, thereby allowing its detection. consists of detecting antigens in biological samples. In certain preferred methods, the biological sample is a tissue sample. Tissue samples can be used using a variety of histological techniques, including those exemplified in this application. However, it is not limited to this. In another embodiment, the biological sample is a biological fluid. Preferably, the biological fluid consists of blood, plasma or serum. Further preferred embodiments In some cases, the biological fluid is serum. To further aid in complex detection, antibodies that specifically bind to atherosclerotic plaque antigens can be combined with a detectable marker. Preferably, it is marked with a car. The selection of markers is an easy decision for those skilled in the art. I can do it. In some embodiments of the method, the antibody is a monoclonal antibody. More preferably, the monoclonal antibody is produced by hybridoma 1585 (ACCC accession number HB9839). To further aid in the detection of the complex, the antibody is preferably attached to a solid support. One preferred solid phase support is beads made of inert polymers, and another is microwells. The present invention also provides a method for quantifying the concentration of an antigen present in and indicative of the presence of atherosclerotic plaque in a biological fluid sample. This person The method comprises: a) contacting a solid support with an excess of an antibody that specifically binds an atherosclerotic plaque antigen under conditions that allow the antibody to adhere to the surface of the solid support; , b) removing unbound antibody, and C) removing the resulting antibody-bound solid phase support. contacting the support with a biological fluid sample under conditions such that the antigen in the sample binds to and forms a complex with the bound antibody; d) removing antigen that is not bound to the complex; e) subjecting the complex thus formed to a supernatant which specifically binds to the antigen in the complex; contacting excess detectable reagent to form a second complex comprising the antibody, antigen, and detectable reagent; f) removing detectable reagent that is not bound to the second complex; h) thereby determining the antigen concentration in the biological fluid. In some embodiments of the method, the biological fluid consists of blood, plasma, or serum. More preferably, the biological fluid is serum. In one embodiment, the solid phase support is a bead formed of an inert polymer, and in another embodiment, the solid phase support is a microwell. In some embodiments, the reagent is labeled with a detectable marker, the selection of which can be determined by one of ordinary skill in the art. In certain preferred embodiments, the marker is an enzyme, a paramagnetic ion, biotin, a fluorophore, a chromophore, a heavy metal, or a radioisotope. atherosclerotic plaque Although any reagent that can detect the Lark antigen can be used, the reagent is preferably an antibody labeled with a detectable marker. Again, the marker is preferably an enzyme, a paramagnetic ion, biotin, a fluorophore, a chromophore, a heavy metal, or a radioisotope. More preferably, the marker is an enzyme, and particularly effective enzymes are horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. The present invention also provides the above method, wherein the detectable reagent is labeled with an enzyme, and step (g) comprises reacting the second complex with a specific substrate for the enzyme and the enzyme reacting with the substrate. and forming a detectable product under conditions. Another thing provided by the present invention is that atherosclerosis is detected in biological samples. This method detects antibodies that are present in susceptible plaques and that specifically form complexes with antigens that indicate their presence. This method involves contacting the biological sample with an atherosclerotic plaque antigen under conditions such that the antigen binds to the antibody in the biological sample, binding to the antibody; and detecting the antigen. and thereby detect antibodies in the biological sample. In certain preferred embodiments, the biological sample is a tissue sample. The tissue sample may be prepared using any histological technique known to those skilled in the art to detect and quantify the amount of antibody in the sample. This method includes, but is not limited to, the examples in this application. There isn't. In certain preferred embodiments of the above method, the biological sample is a biological fluid. In certain preferred embodiments, the biological fluid consists of blood, plasma, or serum. More preferably, the biological fluid is serum. To aid in detection of the complexes formed, the antigen is preferably labeled with a detectable marker. In another embodiment of the invention, the antigen is attached to a solid support. to this Thus, the complex can be readily separated from the biological fluid and detected. a In a preferred embodiment, the solid support is a bead formed of an inert polymer; in another embodiment, the solid support is microunyl. The present invention also provides a method for quantifying, in a biological fluid sample, the concentration of an antibody specifically complexed with an antigen indicative of the presence of an atherosclerotic plaque. This method involves a) contacting a solid support with an excess of atherosclerotic plaque antigen under conditions that allow the antigen to adhere to the solid support surface; and b) contacting the unbound antigen with an excess of atherosclerotic plaque antigen. C) contacting the resulting antigen-bound solid phase support with a biological fluid sample under conditions such that antibodies in the sample bind to and form a complex with the bound antigen; d) remove any antibodies not bound to the complex, and e) remove the antibody thus formed. The complex is contacted with an excess of a detectable reagent that specifically binds to the antibody in the complex. f) forming a second complex comprising an antigen, an antibody and a detectable reagent; g) determining the concentration of detectable reagent present in the second complex; and h) thereby determining the antibody concentration in the biological fluid. In certain preferred embodiments, the biological fluid consists of blood, plasma, or serum. Ru. More preferably, the biological fluid is serum. To better detect the complexes formed, the reagents are preferably labeled with a detectable marker. Markers are heavy metals or radioactive isotopes. Ru. More preferably, the marker is an enzyme. A most preferred embodiment is that the enzyme is horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. This is the case with fatase. k. In another embodiment of the distribution method, the detectable reagent is labeled with an enzyme and step (g) comprises combining the second complex with a substrate specific for the enzyme and a substrate specific for the enzyme. contacting the substrate under conditions such that the element reacts with its substrate to form a detectable product. There is something that is. The present invention also provides a method for quantifying the concentration of an antigen present in and indicative of the presence of atherosclerotic plaque in a biological fluid sample. This person The method comprises: a) contacting a solid support with a predetermined amount of an antibody that specifically binds to an atherosclerotic plaque antigen under conditions that allow the antibody to adhere to the surface of the solid support; b) removing unbound antibody; and C) injecting the resulting antibody-bound solid phase support with a predetermined amount of antigen labeled with a detectable marker and a biological fluid sample. d) removing the labeled antigen that is not bound to the complex, and e) contacting the solid phase with the antibody under conditions such that the antigen binds to and forms a complex with the antibody bound to the solid support; f) determining the concentration of labeled antigen bound to the support; and thereby determining the antigen concentration in the biological fluid. In some embodiments, the biological fluid consists of blood, plasma, or serum. deer However, the currently preferred biological fluid is serum. One preferred solid phase support is a bead formed of an inert polymer; In this case, the solid support is a microwell. In some embodiments of the law, the detectable marker is an enzyme, a paramagnetic ion, a biotinylated fluorophores, chromophores, heavy metals, or radioactive isotopes. Preferably, The enzyme is the enzyme. More preferably, the enzyme is a horseradish perl. Oxidase or alkaline phosphatase. In another embodiment of the above method, the antigen is labeled with an enzyme, and step (e) comprises connecting the labeled antigen bound to the solid support with a substrate specific for the enzyme, and the enzyme is labeled with the substrate. contact under conditions such that it reacts with the product to form a detectable product. There is something about being able to do something. The present invention further provides for atherosclerotic plaque in certain biological fluid samples. A method for quantifying the concentration of an antigen indicative of its presence in a microorganism is provided. This person The method comprises: a) contacting a solid support with a predetermined amount of an antibody that specifically binds an atherosclerotic plaque antigen under conditions that allow the antibody to adhere to the surface of the support; b) C) remove the antibody that is not bound to the support; and C) transfer the antibody-bound solid support to a biological fluid sample such that the antigen in the sample binds to and forms a complex with the bound antibody. d) removing antigen not bound to the complex; and e) labeling the complex thus formed with a predetermined amount of a detectable marker. (f) Quantifying the concentration of the labeled antigen that does not bind to the solid support; and g) thereby quantifying the antigen concentration in biological fluids. Consists of In some embodiments of this method, the biological fluid consists of blood, plasma, or serum. Preferably the biological fluid is serum. In some embodiments, the solid support is a bead formed of an inert polymer; in another, the solid support is a microwell. As mentioned above, marker selection can be easily determined by one skilled in the art. Ru. However, in certain preferred embodiments, the marker is an enzyme, a paramagnetic ion biotin, fluorophores, chromophores, heavy metals, or radioactive isotopes. Sara Preferably, the marker is an enzyme. Although many enzymes produce detectable products, the preferred enzyme is horseradish peroxidase or Lucali phosphatase. In another embodiment of this method, the antigen is labeled with an enzyme and step (f) removes the labeled antigen that is not bound to the solid support and makes it suitable for the enzyme. In some cases, the enzyme is contacted with a specific substrate under conditions such that the enzyme reacts with the substrate to form a detectable product. Another method provided by the present invention is to detect atherogenesis in a biological fluid sample. This method quantifies the concentration of antibodies that specifically form complexes with antigens that indicate the presence of atherosclerotic plaques. This method involves a) contacting a solid support with a predetermined amount of atherosclerotic plaque antigen under conditions that allow the antigen to adhere to the surface of the support, and b) removing unbound antigen. and C) the resulting antigen-bound solid phase support is injected with a predetermined amount of an antibody labeled with a detectable marker, or When the biological fluid and its antibodies bind to the antigen bound to the solid support, d) remove unbound antibody to the solid support, e) quantify the concentration of the labeled antibody bound to the solid support, and f) thereby The method consists of quantifying the antibody concentration in a biological fluid. In some embodiments of the invention, the biological fluid consists of blood, plasma, or serum. Ru. More preferably, the biological fluid is serum. In certain preferred embodiments, the solid support is a bead formed of an inert polymer; in another, the solid support is a microwell. The choice of detectable marker can be easily determined by one of ordinary skill in the art. deer However, it is preferred that the detectable marker is an enzyme, a paramagnetic ion, biotin, a fluorophore, a chromophore, a heavy metal, or a radioisotope. More preferably, the marker is an enzyme, most preferably the enzyme is horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. In another embodiment of this method, the antibody is labeled with an enzyme, and step (e) comprises exposing the labeled antibody, separated from the solid support, to a substrate specific for the enzyme; In some cases, contact is made under conditions such that the substance reacts with the substance to form a detectable product. The present invention further provides for atherosclerotic plaque in certain biological fluid samples. Disclosed are methods for quantifying the concentration of antibodies in a blood cell that specifically complex with an atherosclerotic antigen indicative of its presence. This method involves a) contacting a solid support with a predetermined amount of atherosclerotic plaque antigen under conditions that allow the antigen to adhere to the surface of the support; and b) binding the atherosclerotic plaque antigen to the support. Exclude antigens that are not present. c) contacting the antigen-bound solid phase support with a biological fluid sample under conditions such that antibodies in the sample bind to and form a complex with the bound antigen; ) remove any unbound antibody to the complex; e) remove a predetermined amount of the formed complex; f) contacting a plaque antibody labeled with a recognizable marker with the labeled antibody under conditions such that the labeled antibody competes for binding to the antigen with the antibody in the biological fluid; and f) binding to a solid support. g) thereby determining the concentration of the antibody in the biological fluid. In some embodiments, the biological fluid consists of blood, plasma, or serum. deer However, a preferred biological fluid is serum. The choice of solid phase support can be easily determined by one skilled in the art. In one preferred method, the solid support is a bead formed of an inert polymer; in another, the solid support is a microwell. The markers used in the above method are simply a matter of choice for the person skilled in the art. Detectable markers can be enzymes, paramagnetic ions, biotin, fluorophores, chromophores, heavy metals, or radioisotopes. It is preferable that More preferably the marker is an enzyme, most preferably In most cases, the enzyme is horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. In another embodiment of this method, the antibody is labeled with an enzyme and step (f) removes the labeled antigen that is not bound to the solid support and provides a specific substrate for the enzyme and its Conditions under which the enzyme reacts with its substrate to form a detectable product There are some things that should be contacted under the condition. The invention also provides a method of monitoring the progression of atherosclerosis. This method consists of measuring the amount of atherosclerotic plaque antigen in a biological fluid sample of a patient and comparing the measured amount with the amount measured at an earlier time point, determining the amount of antigen. The changes represent changes in the degree of atherosclerotic plaque. Ru. Another aspect of the present invention provides for monitoring the efficacy of atherosclerosis treatment. This is a method to This method consists of measuring the amount of atherosclerotic plaque antigen in a patient's biological fluid sample and comparing it to the amount measured at an earlier time point. Therefore, changes in the amount of antigen indicate changes in the extent of atherosclerotic plaque. Further disclosed by the present invention are reagents for use in imaging atherosclerotic plaques. This reagent consists of an antibody that specifically binds to an atherosclerotic plaque antigen, labeled with a detectable marker. The invention also provides a composition comprising an amount of the reagent and a physiologically acceptable carrier. The detectable marker used is a matter of choice for the person skilled in the art. marker - is a radioactive isotope, an element opaque to X-rays, a paramagnetic ion, or a paramagnetic ion. A chelate compound of 1 is preferable. Radioactive isotopes are widely used in medicine and are well known to those skilled in the art. Currently preferred markers are 1-123. 1-125. l-1 28, l-131, or cobalt-57, gallium-67, indium-1 11, Indium - 113m, Mercury = 197. Selenium-75, thallium-201, technetium-99m, lead-203, strontium-85, strontium-87, gallium-68, samarium-153, europium-171, itte Sharpness of rubium-169, zinc-62, rhenium-188, or chromium-51 metal ions and their mixture. Preferably, the marker is technetium, iodine, indium, or a metal ion chelate thereof. In another embodiment of the method specified above, the marker is a paramagnetic ion. Paramagnetic ions are also widely used in medicine. Examples of such markers include ROM (), manganese (II), iron (), iron (), cobalt (), nickel Kel (), copper (), praseodymium (), neodymium (), samarium (), gadolinium (), terbium (), dysprosium (), holmiu chelated metal ions of aluminum (), erbium (III), ytterbium (), or mixtures thereof. The invention also provides methods of imaging atherosclerotic plaques. child The method described above is to image atherosclerotic plaques. A reagent that specifically binds to atherosclerotic plaque antigen and a reagent that specifically binds to atherosclerotic plaque antigen. The method consists of contacting and detecting the reagent bound to the atherosclerotic plaque under conditions such that it binds to the atherosclerotic plaque, thereby imaging the atherosclerotic plaque. Ru. Also provided are methods of imaging atherosclerotic plaques and surrounding normal tissue. This method combines the normal vascular lumen to be imaged with normal intima and/or binds specifically to normal media and comes in contact with an antibody labeled with a detectable marker. the atherosclerotic plaque and the reagent described above. the atherosclerotic plaque and detect the reagent bound to the atherosclerotic plaque and surrounding normal tissue, thereby inhibiting atherosclerotic plaque. It consists of imaging the atherosclerotic plaque and surrounding normal tissue. An antibody that specifically binds to normal intima and/or normal media is a purified antibody, which It specifically binds to antigens that have the property of being synthesized by or present in smooth muscle cells and the normal connective tissue surrounding arteries. In one preferred embodiment The antibody is a monoclonal antibody produced by hybridoma QIOE7 (ATCC accession number HBIG188). The present invention provides a method for treating normal intima and/or provides reagents for use in the above-described methods of imaging the media, as well as compositions comprising an effective amount of the reagents to perform the imaging and a physiologically acceptable carrier. Ru. As discussed with respect to the reagents used to image atherosclerotic plaques, the detectable marker used is simply a matter of choice for those skilled in the art. Mar Preferably, the car is a radioisotope, an element opaque to X-rays, a paramagnetic ion, or a chelate compound of a paramagnetic ion. The markers used to image normal tissue are consistent with those previously described for atherosclerotic plaques. Another provision of the present invention is a method for monitoring the progression of atherosclerosis. It is the law. This method identifies atherosclerotic plaques in a patient's blood vessels. Measure the amount of foreign antigen and compare the amount measured with the amount measured at an earlier time. A change in the amount of antigen indicates a change in the progress of atherosclerotic plaque. Additionally, methods are provided for monitoring the efficacy of atherosclerosis treatment. This person The method measures the amount of atherosclerotic plaque-specific antigen in a patient's blood vessels. The method consists of determining the amount of antigen and comparing the amount measured with the amount measured at an earlier time point, with changes in the amount of antigen indicating changes in the extent of atherosclerotic plaque. Also provided is a method of imaging an atherosclerotic plaque in a subject. The method comprises: a) contacting a blood vessel wall containing an atherosclerotic plaque with the reagent described above for plaque imaging; b) detecting the reagent bound to the atherosclerotic plaque; and C) detecting the atherosclerotic plaque. It consists of imaging. A method for imaging an atherosclerotic plaque and surrounding normal tissue in a subject is a method that specifically binds and detects the normal vascular lumen to be imaged with normal intima and/or media. 119. The vessel wall, including the atherosclerotic plaque and surrounding area, to be contacted and imaged with the antibody labeled with the marker, comprising: the reagent of claim 118; and conditions such that the reagent binds to the atherosclerotic plaque. touched under to detect reagents bound to atherosclerotic plaques and surrounding normal tissue. This allows imaging of atherosclerotic plaques and surrounding normal tissue. It consists of In certain preferred embodiments, the cells specifically bind to normal intima and/or media. The matching antibody is a monoclonal antibody produced by hybridoma Q10E7 (ATCC accession number HBIQ1118). Imaging may be performed by any method known to those skilled in the art. This method includes X-rays, CAT scans, PET scans, NMRI and fluoroscopy. However, it is not limited to only that. Another method of plaque removal is by enzymatic digestion. The present invention Provides reagents for use in digesting loamy atherosclerotic plaque. This reagent is An enzyme-linked enzyme that can digest components of telosclerotic plaque Contains antibodies that specifically bind to teloma atherosclerotic plaques. One such reagent comprises monoclonal antibodies produced by hybridoma z2D3 or 22D3/3E5, or other cell lines; 15H5 to 17H3 monoclonal antibodies. Another reagent comprises a chimeric antibody or fragment thereof as described above; The fragment has substantially the same amino acid sequence as the hypervariable region of the monoclonal antibody produced by hybridoma 22D3 or 22D3/3E5. recombinant voripetides containing amino acid sequences. Furthermore, this antibody Contains the amino acid sequence of the human antibody constant region and the amino acid sequence of the human antibody constant region. child Chimeric antibodies such as It may also be a genetically engineered hybrid neomolecule that is partly an antibody and partly an enzyme. Chimeric antibodies may also be trifunctional antibodies. Trifunctional antibodies are usually produced by quadromas. In a preferred embodiment, the quadroma is Hybridoma cell lines 22D3 to 22D3/3E5 and enzyme-binding molecules Obtained from fusion with a hybridoma that secretes noclonal antibodies. The enzyme may be any enzyme that can digest the components of plaque. certain preference In some embodiments, the enzyme is a proteolytic enzyme, elastase, collagenase, or salacalidase. In certain particularly preferred embodiments, the enzyme is fibroblastic collagenase, gelatinolytic enzyme, polymorphonuclear collagenase, granulocytic collagenase, Stromelys 1n I, stromelin II, or elastase. The present invention also provides compositions comprising an amount of the reagent described above and a physiologically acceptable carrier agent to digest components of atherosclerotic plaque. The present invention provides methods for reducing the amount of atherosclerotic plaque in blood vessels. This method removes the atherosclerotic plaque from the atherosclerotic plaque. A reagent that digests atherosclerotic plaque binds to components of the plaque and The method consists of contacting the target under conditions and in an amount such that it can be digested. The present invention also provides methods for reducing the amount of atherosclerotic plaque in blood vessels. provide law. This method involves a) a normal vascular lumen, an antibody conjugated with an enzyme inhibitor that specifically binds to the normal intima and/or media; b) contact the atherosclerotic plaque under conditions such that the antibody binds to normal intima and/or media; The drug and its reagents are contacted under conditions such that they bind to atherosclerotic plaques. Consists of touching. Antibodies that specifically bind to normal intima and/or media target normal arterial tissue as enzymes capable of digesting atherosclerotic plaque. It is provided as a reagent used to protect against the elements. atherosclerotic plaque This reagent coupled to an inhibitor of an enzyme capable of digesting lark includes synthetic antigens or antibodies that bind to antigens present in such normal tissues. child The antibody is, for example, a monoclonal antibody produced by hybridoma Q1[IE7, and a monoclonal antibody produced by hybridoma QIOE7. A recombinant polypeptide containing substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence of the variable region, or a chimeric or humanized antibody containing the recombinant polypeptide. is its fragment. The invention further provides a method of reducing the amount of atherosclerotic plaque in a blood vessel. This method involves a) treating an atherosclerotic plaque with a reagent; The drug is contacted with the plaque under conditions such that it binds to the plaque and forms a reagent-plaque complex, where the reagent is cleaved with the plaque and converted to an enzyme, the substrate of which is A connective tissue found in atherosclerotic plaques whose enzymes specifically bind to both pro-enzymes that can dissolve components of the plaque. b) The reagent-plaque complex can be separated from the enzyme precursor to which the reagent specifically binds, and the enzyme precursor binds to the reagent to form the enzyme precursor-reagent-plaque complex. C) This zymogen-reagent-plaque complex is brought into contact with a drug that can specifically cleave the zymogen, and the zymogen is converted into an enzyme. It consists of an enzyme that is converted under conditions that allow it to digest plaque. Ru. The invention further provides a method of reducing the amount of atherosclerotic plaque in a blood vessel. This method a) removes atherosclerotic plaque from atherosclerotic plaque; The atherosclerotic plaque is contacted with a digestible reagent as described above under conditions such that the reagent binds to the plaque and forms a reagent-plaque complex, where the reagent is cleaved from the plaque. The enzyme is converted into an enzyme whose enzyme substrate is atherosclerotic plaque, the connective tissue present in the atherosclerotic plaque, and the enzyme binds specifically to both the proenzyme, which can dissolve components of the plaque, and b. ) This enzyme precursor/reagent The enzyme precursor of the drug-plaque complex is specifically cleaved and the enzyme precursor is converted into an enzyme. The enzyme is brought into contact with a drug capable of oxidizing plaque under conditions that allow it to digest plaque. consists of making. In certain preferred embodiments, the reagent is a trifunctional antibody. This trifunctional antibody may be produced using any technique known in the art. These techniques include chemical conjugation of fragments, recombinant genetic engineering. In a currently preferred embodiment, trifunctional antibodies are produced by quadromas. The quadromas are obtained from the fusion of hybridomas 22D3 to 22D3/3E5, or hybridoma cell lines containing monoclonal antibodies produced by related cell lines, with hybridomas that secrete monoclonal antibodies that bind to the enzyme. To efficiently digest plaque, zymogens require granulocytic components. Preferably, it is a zymogenase of collagenase, fibroblastic collagenase, or stromelysin. Preferably, the agent in step (C) is plasmin. Plasmin induces plasmid activation in the subject by tissue plasminogen activator. It is obtained by treatment under conditions that cleave nogen and convert it to plasmin. Turning now to radiotherapy of atherosclerotic plaques, the present invention provides reagents for use in resolving atherosclerotic plaques. The reagent contains an antibody that specifically binds to atherosclerotic plaques, conjugated to a chromophore that is capable of absorbing radiation with plaque-dissipating wavelengths. It is. In some embodiments of the method, the antibody is a monoclonal antibody. For example, high It is like that produced by Brydoma 15H5 or l 7113. More preferably, the monoclonal antibody is one produced by hybridoma Z2D3 or hybridoma Z2D3/3E5 or related daughter cell lines. In yet another embodiment, the chromophore is from about 190 am to about 1 Absorbs light with wavelengths up to 100 nm. Such chromophores are It is well known in the field. Accordingly, the choice of chromophore can be easily determined by one of ordinary skill in the art. Preferred embodiments are those in which the chromophore is 7-reorecein, rhodamine, tetracycline, or hematoporphyrin. The present invention further provides a composition comprising an amount of the above reagent and a physiologically acceptable carrier agent effective to dissolve atherosclerotic plaque. The present invention provides a method for resolving atherosclerotic plaque. This method a) converts the atherosclerotic plaque into the atherosclerotic plaque described above. contact with an effective amount of the reagent used to dissipate the atherosclerotic plaque, the reagent binds to the atherosclerotic plaque and forms an atherosclerotic plaque-reagent complex. b) exposing the resulting complex to radiation having a plaque-dissipating wavelength, the light being emitted with sufficient energy to dissipate the atherosclerotic plaque; It consists of exposure under conditions such that it is absorbed by the chromophore. The invention further provides a method of dissolving atherosclerotic plaque in a blood vessel. The method comprises: a) contacting a normal vascular lumen with an antibody conjugated with a moiety that specifically binds to normal intima and/or media and is capable of reflecting radiation at plaque-dissipating wavelengths; and b) Atherosclerotic plaques can be treated with the reagents used for atherosclerotic plaque resolution and the reagents used to resolve atherosclerotic plaques. c) exposing the atherosclerotic plaque to radiation having a plaque-dissipating wavelength, thereby causing the plaque to dissipate; Consists of dispersing. In a preferred embodiment of the method, the protein that specifically binds to the normal intima and/or mid-intima The antibody is a monoclonal antibody produced by the hybridoma QIOE7 (ATCC Accession No. 1 (810188)). The selection of the moiety for reflecting light can be readily determined by one skilled in the art. Provides a reagent used in the treatment of arteriosclerosis. The drug comprises an antibody that specifically binds to atherosclerotic plaques, conjugated to an agent effective to treat atherosclerosis. In a preferred embodiment, anti- The body was produced by hybridoma z2D3 (^TCC accession number 1189840). It is a monoclonal antibody produced. This reagent is used to treat atheropathy in patients. can be used in arteriosclerosis treatment methods. The method comprises administering to the subject an amount of the reagent effective to treat atherosclerosis. Furthermore, the present invention provides a method for treating atherosclerosis in a subject. This method comprises: a) administering to the subject an antibody that specifically binds to normal intima and/or media and is conjugated with an inhibitor of a drug effective in treating atherosclerosis; b) ) administering to the subject an amount of the reagent described above effective to treat atherosclerosis. In a preferred embodiment of this method, normal arterial tissue is protected against anti-inflammatory agents used to protect normal arterial tissue from agents effective in treating atherosclerosis. The body was produced by hybridoma QIOE7 (TCC accession number HB1018g). It is a monoclonal antibody produced in the arteriosclerosis process, and is an antibody conjugated with an inhibitor of a drug effective in the treatment of atherosclerosis. The present invention provides a method for treating atherosclerosis. This method is used to treat atherosclerosis. It consists of blocking the synthesis of atherosclerotic plaque-specific antigens. atherosclerosis Blocking of a atherosclerotic plaque antigen may be accomplished in several ways. In one embodiment of the method, synthesis of the antigen is inhibited by a nucleic acid encoding the antigen, i.e., expression of which inhibits the synthesis of the antigen. antisense nuclei that specifically bind to nucleic acids related to Block by using acid. In yet another embodiment of the method, synthesis of an antigen is blocked by inhibiting an enzyme involved in the synthesis of the antigen. The invention also provides methods for treating atherosclerosis. This method allows antibodies, e.g. autoantibodies, to be used to target atherosclerotic antibody plaques. consists of blocking the binding to the original. The methods include any of those known to those skilled in the art. In some embodiments of the method, binding of autoantibodies to antigen is reduced by reducing the binding of autoantibodies to antigen by It consists of blocking by making contact with the body. Another embodiment of the method includes binding of an autoantibody to an antigen by directing the autoantibody to the antigen. blocked by contacting with excess anti-idiotypic antibody It consists of The present invention further provides a diagnostic assay comprising the following steps: This method a) obtains a value for the patient's body mass index (BMI) and b) determines the antigen associated with the disease state or other serum or plasma analyte or specific for that antigen. Obtain a value for the concentration of binding antibody, C) Plot the patient's body mass reading against the antigen or antibody concentration for the same patient, and d) Compare the obtained value with the − set of reference values and calculate the obtained value. It is important to check whether the value obtained exceeds the reference value and therefore indicates the presence of a pathological condition. It consists of The method is - membranous and only positive in determining whether a patient has a susceptibility to a pathological condition such as cancer or atherosclerosis. It can be used in place of traditional methods that only give positive or negative results. In determining whether a patient has a susceptibility to atherosclerosis, the antigen is an antigen synthesized by atherosclerotic plaque. or the antigen present in the plaque (Figure 24), or the antibody is one that specifically binds to such an antigen (Figure 23) is preferably used. Body mass index (BMI) is obtained by dividing the patient's weight by his height. Experiment Details The Experiment Details section is arranged as follows. , preparation of atherosclerotic plaque antigens, characterization of atherosclerotic plaque antigens, antibody isolation and preparation methods, immunoassay methods, antibody labeling methods, atherosclerotic plaque 2 imaging method 1 histological examination method, atheroma Atherosclerotic Plaque Treatment Method r. Preparation of Atherosclerotic Plaque Antigen PBS Extraction Atherosclerotic Plaque Antigen Purification (Improving Solubility) Tissue processing and antigen solubilization were performed as follows. 1. Obtain atherosclerotic arteries from human cadavers within 24 hours after death or during surgery. 2. Extract the sample, wash it with 20 mM phosphate buffer Y-Q, 15M NaCl/9H7, 310.02% NaNa (PBS) many times, and remove the blood composition. Remove minutes. 3. Freeze the lesions at -80°C until use. 4. When preparations for treatment of the lesions are complete, remove the lesions from the -80°C freezer and thaw at room temperature. 5. Rinse the thawed lesion with cold PBS to separate atherosclerosis from normal arterial remnants. Carefully exfoliate and maintain the inflammatory lesions. Discard arterial residue. 6. Weigh and record atherosclerotic lesions. 7. Using sharp surgical scissors, chop the lesion into 5 x 5 mm pieces. Keep the pieces moist in cold PBS (with just enough solution to cover the pieces). 8. Homogenize the focal fragments in ice-cold PBS. At this time, 51 portions of cold PBS is added to 1 g of the lesion (Polytron; 2-4 minutes). 9. Centrifuge the homogenate at 1G-15,00ORPM for 30 minutes at 4℃. Ru. Retain the upper groove and discard the lipid layer. 10. Resuspend the pellet in cold PBS (5 ml/gm) and homogenize again. Enate. 11. Repeat step 9 and pool both supernatants. 12. Aliquot the plaque supernatant and freeze at -80°C unless you then perform the remaining steps of purification. (Affinity purification) Unpurified or partially purified plaque or serum antigen is mixed with a resin bound to 15H5 antibody for 2 hours at room temperature (R,T) (batch method), or a resin column is used. at a flow rate of approximately 1 mi/ain, and the effluent was drained again into the same column. C column method). All samples and resin were equilibrated with 10mM NPO4/+50mM NiCl/pf (7,2 (PBS). After loading the sample, the resin was washed thoroughly with PBS and then pl?2 ．． : + O, tV glycine or 3, 5M NgSCN dissolved in PBS was added to release bound antigen. Fractions were collected, dialyzed in PBS at 4 °C, and EL Antigen reactivity was tested by ISA. Save the relevant test tubes in a pool and prepared for subsequent characterization testing. Preparation of monoclonal antibody affinity chromatography matrix Mouse ascites containing monoclonal antibodies 15H5 to 22D3 was mixed with 0. 45μ It was passed through a filter and then fractionated by HPLC gel filtration. Ascites 10ml Bio-Get TSK-400 column (600!21. 5111゜Bio -Rxd) plus 0. Eluted with 1M sodium phosphate p[17,[l]. Fractions of appropriate size for IgM were pooled. Binding of antibody to Afli-Get resin (Bio-Rad) was performed using 1 ml of pF[7, 01M The test was carried out in the presence of cpo4t<Tshua. Gel preparation, antibody binding (4 hours at room temperature) ), washing, and blocking with ethanolamine were performed according to the manufacturer's specifications. did. Affinity purification of antigens obtained from positive serum/plasma The following method uses 15H5Ab. A one-step method of gel-based antigen affinity purification. 1, 15H5Ab gel, 75ml, 10mM PBS pH 7,0,32,5 Suspend in ml. Final volume was 40ml1゜ Antigen capture assay determined to be strong positive Inject 80 μl of the serum or plasma into a 40 ml 15H5 antibody gel. Ru. 2. Gently stir for 4 hours at room temperature on a shaker, then continuously stir for -night at 4°C. do. 3. Centrifuge at 3000 RPIJ for 10 minutes. Discard the supernatant. 15H 5 people b game Wash the tube three times with 10 mM PBS pH 1,0 (40 ml/time). 4, 20m1 0. 11 Glycine hydrochloride, pl(2,5) was added to the 15H5 antibody gel. Mix well for 2 minutes at room temperature on a shaker. This converts the antigen into 15H5Ah This is to separate it from the gel. 5. Centrifuge at 300 ORPM for 10 minutes. Collect the supernatant and immediately transfer it to Neutralize with ml of Tris-HCl pH 8.25 buffer. 6. The purified Ag solution was added to IGmM PBS p[T7. For Q, at 4°C, - Dialyze overnight (change buffer once). z2[13,010g7ti[)Wl (atherosclerotic plaque homogiene Nating method 1 We have shown that atherosclerotic plaques in humans, monkeys, pigs, and rabbits Isolation methods and characterization of specific extracellular antigens found Report on. Braaku matrix-specific antigen (22D3Ag) The Ronal antibody, z2D3, has been shown to be effective in immunohistochemistry in atherosclerotic human coronary arteries. It was discovered when a scientific screen was performed and the result was positive. 2203 antibody stains the plaque matrix but not normal arteries. does not produce this antibody The immunogen used in the hybridoma program was monoclonal antibody 151 Affinity sperm obtained from human plaque homogenates by 15 It is a manufacturing material. 15H5 antibody is used to target normal smooth muscle cells and plaque-derived smooth muscle cells. Recognizes carbohydrate autoantigens produced by (LxIllixiere, IJ,, et al., Atbe+o+cleroai+( 1+eltnd) 74 (1-2) 125 (1988)). This 22D3 antibody was further screened against various human tissues. . For this, 5μ, unfixed frozen tissue sections were used (G breath 1enoff, E , et al., unpublished results). All diseased human coronary artery and aortic plaques are positive. It was sex. With the exception of pancreatic fibromyocytes, local cell masses of the ovary, and sebaceous glands, All normal tissues were not stained by this antibody (Table 7). The normal tissue that is stained is It was not expressed outside the cell and was confined to the cytosol. Conversely, most of the staining within atherosclerotic plaques is caused by plaque smooth muscle fibers. In addition to staining the cytosol of the cyst, it is widely expressed extracellularly throughout the connective tissue matrix. did. In fibrofatty lesions, macrophage-associated areas are comprised of only connective tissue. The intensity of staining was not strong in areas and/or areas associated with smooth muscle cells. Ma Clophages themselves were not stained with the Z2D3 antibody. The 22 part 3 antibody has also been tested in macaque monkeys, Watanabe rabbits, New Sealant white rabbits, and Cholesta. Atherosclerotic plaques of pigs with rollemia were stained (freshly excised samples were Wash with cooled normal saline and freeze immediately. Examine 5μ sections with a cryostat. prepared and placed on gelatin-coated slides. No fixation was performed. The ABC immunoperoxidase method was performed according to the manufacturer's instructions (Vec tor, Bu+lingams, CA)). Monkey<7) In case of tissue, disease Several stages of nest development were investigated. 2% cholesterol over a period of over 1 year Plaques from monkeys fed a roll diet were stained with the 22 part 3 antibody. but However, the following observation is particularly interesting. In other words, this is only a few months old. Even in monkeys not fed a sterol diet, 2 The 2 part 3 antibody targets smooth muscle cells in the medial layer of the arterial wall just below the elastic fiber layer in the affected area. This is the staining of the cytoplasm and its immediate surroundings. This is due to this initial lesion. appeared within a time sequence corresponding to the migration of both macrophages and lymphocytes to (Pxpaex, I, et al. 5science 234:1573 ( 1986)). Slightly later, smooth muscle cells penetrate the elastic fiber layer. However, it was observed to migrate to the fatty streak area. All attempts to isolate and purify 22D3 plaque antigen under aqueous conditions , generally speaking, was unsuccessful. Frozen tissue sections used in immunohistochemistry Based on the observation that fixation with organic solvents leads to complete loss of staining, we decided to We performed a method of extracting antigens from arch tissue using an organic solvent (Ma + nd x, 1. *nd Ro+3 R,, Arje+1oselerosi+10 (2):164 and 178 (1990)). The extracted antigen was further purified by a series of chromatographic operations. This operation methods include gel size sieving, ion exchange chromatography, and thin layer chromatography. Includes matography. Fresh plaque is detached from normal arterial remnants and cooled Washed with normal saline. This plaque was then cut into 2x4mm fragments, Freeze-dried into small flakes (this is to remove as much free water as possible) ). The flakes were placed in O, C, T, medium (Mile+ Lab+, Elkaha rl, IN), block, and immediately frozen. frozen tissue mass, It was attached to a cryostat for tissue sectioning, and 5μ tissue sections were sliced. This tissue section , mixed with 10 parts acetonitrile in a glass beaker. This glass glass The maker was tightly covered and the contents were stirred vigorously at room temperature for 18-24 hours. Next Add the stirred contents to 20. Centrifugation was performed at 0 Hg and 4° C. for 1 hour, and the precipitate was discarded. Add the acetonitrile solution to 0. 22μ nylon filter (Millipore , Bedfo+d, MA), a pale yellowish supernatant was obtained. . Various chromatographs for antigen content using ELISA immunoassays The ee fraction was investigated. gel 7 filtration chromatography Evaporate the acetonitrile in the antigen solution and dissolve the residue again in 100% ethanol. did. This yellowish liquid was then mixed with 1 g of activated carbon per 100 ml of supernatant. The resulting slurry was stirred at room temperature for 1 hour. Next, add this slurry to 0 ．． A clear liquid was obtained by filtration through a 22μ filter. Next, add this solution to ethanol. Lipophilic Sephadex LH60fsiglla, St. C26/100 column (Pharmacia) packed with Loai3 MO). Pi+eaNvx7. The liquid was passed through Nl) and divided into sizes. Antigen positive fraction I pooled. Ion exchange chromatography was performed using a Mono Q HPLC column (Pharm acia), following the method of Mac++on (1. E, M ansion, B., Roseng+en, L., Svcnoerholm, I. Chromatograph7322. 465 (1985)) 6 However, the melt Ethanol was used as a medium instead of methanol. X2D3 antigen, unbound of the HPLC column at a void volume of . Thin layer chromatography (TLC) TLC was performed on Whatman LK2 linear cellulose plate (Cab $ 4825-620). Cut this plate in half and Two m plates were obtained. The fraction containing the z2D3 antigen was purified using a glass capillary tube. 1-10 uL per rune was applied to the plate. (Sample, per rune, 0. 5uL aliquot was applied multiple times and dried with a hair dryer after each application. . ) This coated plate is then washed with a mobile layer (chloroporum, methanol, ice vinegar). acid and water mixed in a volume ratio of 25:15:4+2). Ta. When the moving layer is about 3mm from the top of the plate, remove the plate. and air dried at room temperature. Plates obtained from various TLC operations were individually iodine stained. or immunoperoxidase staining using Z2D3 antibody. Ta. In the iodine dyeing method, iodine crystals are placed in a covered glass container, and then heated at 37°C. The ink was heated for 10-30 minutes to generate iodine vapor. dry TL The C plate was poured into this container. When the iodine reaction spots reach the desired density, remove the I took it out and inspected it. A single spot was observed at the top of the moving layer. z2D 3 antibodies and an immunoperoxidase staining method using a negative control antibody. Processing of the plate confirmed that it was the z2D3 antigen. Immunoperoxidase detection of Z2D3 antigen on TLC. Dry the plate at 0. 2% casein 150mM Tris-HCl/150mM NlCl buffer (TBS), pi (7,6) for 45 min. I checked. Next, one plate was added to 31 g of 22D in casein buffer. M　Add MAb to a solution of 5 μg/rnL and cool to room temperature while stirring gently. Then, it was incubated for 18 hours. The other plate is a negative control for the antibody. The cells were incubated with the solution. To remove unbound antibodies, wash three times for 15 minutes each time. I removed it. Next, wash the washed plate with goat anti-mouse IgM horseradish peroxidase conjugate (Tige, Bu

【ｌｉｎｇａｍｅ、　ＣＡ、　）の、１５００希釈液中で、静かに撹拌しな がら、３時間インキュベートした。次に、このプレートを、カゼイン・バッファ ーで洗浄し、さらにＴＢＳで３回洗浄した。次に、洗浄したプレートを、基質溶 液に浸した。この溶液は、３１ｇ／ｌ１ｌＬの４−クロロ・ナフトールのメタノ ・−ル溶液８ｍｌ、３２ｍ１のＴＢＳ、及び２ＱｕＬの３０％Ｈ２０２を含む。 プレートを１０−２０分現像し、脱イオン水ですすいで、反応を停止した。現像 したスポットは、ｚ２Ｄ３プレートの移動層ラインには見られたが、非特異的抗 体プレートには何も見られなかった。 ２２Ｄ３抗原は、小さな、脂質を含む分子のようである。これは、通常の酸加水 分解にたいして抵抗性を示すから、おそらくスフィンゴ脂質ではなく、中性脂質 か、または、蛋白脂質であろう。エタノールか、または、その他の有機溶媒に溶 かした、各種抗原分画を、１００ｕＬのサンプルとして、Ｉａ＋ｍｕｌｏｎ　４ 微小滴定プレート（Ｄ７ｎａｌ！ｅｈ、　Ｃｈｉｎｌｉｌ１７．　ｌｌａ、）の ウェルに加え、びん入り窒素ないし空気を静かに吹き付けて、有機溶媒を蒸発さ せた。次に、この乾燥プレートを、カゼイン／ＴＢＳ溶液（洗浄用バッファー） 　２００ｕＬで１時間処理して、ブロックした。次に、このプレートを４回洗浄 し、洗浄用バッファーで希釈した５　ｕｇ／ｍＬ　２２Ｄ３抗体の　１０ｆｌ　 ｕＬ分液を、各テスト・ウェルに加えた。プレートに蓋をして、３７℃で１時間 インキュベートした。プレートを４回洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＭ・パーオキシ ダーゼ結合体（抱合体）　１：１００希釈液の１００ｕＬを加えた。プレートを ３７℃で１時間インキュベートし、その後、洗浄した。 ＬＯＯｕＬのＴＭＢ基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　ａｎｄ　［’ｅｒ＋７．　Ｇ ａｉｊｈｅｒｓｂｕｒｇ。 ＭＤ、　）を各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。５０ａＬの　 ＩＭ　ＨＣｌを各ウェルに加え、基質の分解を停止し、プレートを、Ｍｏ１ｅｃ ｎｌｘｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓの　ＥＬｔＳＡ読み取り器（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅ ｔｉｃｅ３　Ｍｅａｌｏ　Ｐａｒｋ、　ＣＡ　）上で、４５０　ｎｍテ読みとツ タ。 この抗原を被覆しない利点の一つは、動脈病巣形成に直接的に関与する変化した 平滑筋細胞を標識することができるという科学的有用性である。本出願人の動物 実験から、平滑筋細胞が、正常から病的に移行する様が、アテローム硬化症のご く初期から、その終末段階にいたるまで、免疫組織学的手法によって観察できる ことは明白である。 アテローム硬化性プラークの、この分子マーカーを特定したことから得られるも う一つの利点は、これによって、新規の診断用及び治療用の試薬の開発が可能に なったことであり、これは、冠状、および／または、脳血管アテローム硬化症に 悩む患者の臨床治療を改善するのに役立つ。この種の薬剤は、核画像法で用いら れる核種、例えばテクネチウムのような核種で標識したＦａｂフラグメント、ま たは、ＭＲＩ画像法で用いられる常磁性分子で標識したものを含む画像化剤の形 態をとる。標的用の治療試薬は、例えば次のような新好子であるが、これは、構 築が可能である。すなわち、その分子とは、抗体様の、標的性酵素活性を持ち、 これが、アテローム硬化性プラークの結合組織内容物を、調節的に分解・減少さ せ、これによって、局所的動脈閉塞を除き、心筋梗塞および／または卒中を予防 する（Ｋｉｊｅ３　Ｍ、、　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｏｆ　Ｌｉｐｉｄｏｌｏｇ ７　（Ｅｌｉ！ｔｉｅｒ、　ＮｅｗＹｏｒｋ、ｅｄ、、　２．１９８６））。 方法２ 組織の処理と抗原の可溶化は、下記のように行なった。 １、死後２４時間に、ヒト遺体からアテローム硬化性動脈を入手。 ２、サンプルを摘出し、２０　ｍＭ　Ｐ　Ｂ　Ｓ　／　Ｇ、　１５Ｍ　ＮｔＣ１ ／ｐＨ７，３／０．０２％Ｎ５Ｎ３　（Ｐｕｓ）を何度も交換して洗浄し、血液 成分を除去する。３．病巣を、使用時まで、−８０℃で凍結する。 ４、病巣処理の準備が整ったならば、病巣を一８０℃のフリーザーから取り出し 、室温で解凍する。 ５、解凍した病巣を、冷却ＰＢＳですすぎ、正常動脈残留物から、アテローム硬 化性病巣を丁寧に剥離、保持する。動脈残留物は廃棄する。 ６、アテローム硬化性病巣を秤量し、記録する。 ７、鋭利な外科用鋏を用いて、病巣を、５ｘ５ｍｍの小片に刻む。１ｇの病巣当 り、８Ｍ尿素２ｍｌを加え、室温（ＲＴ）の８Ｍ尿素中で湿潤状態を保つ。３０ 秒間ｐｏｉ７ｔ＋ｏｎする。 ８、病巣フラグメントを、ＲＴの８Ｍ尿素中でホモジェネートする。この時、１ ｇの病巣にたいし　２ｍｌの８Ｍ尿素を加える。 ３０秒間ポリトロン処理する。 ９、ｔモジｚ＊−トを、１５．００ＯＲＰＭ、１０−１５℃テ、３０分間ｆｉ心 する。上清を保持し、脂質層は捨てる。 １０、ペレットを、８Ｍ尿素（２ｍｌ／ｇｍ）に再懸濁し、再び３０秒間ホモジ ヱネートする。 １１、必要に応じて手順９．１０を繰り返し、上清をプールする。 １２、その後さらに精製の残り手順を実行するのでないならば、プラーク上清を 分岐し、−８０℃で凍結する。 Ｃ＋ＣＩ勾配で分画したプラーク抽出物の調製１、サンプルを、８Ｍ尿素抽出物 １１当り　［１，５ｇのＣ＋ＣＩを加えて　３Ｍ　ＣｓＣｌとする。Ｃ＋ＣＩが 溶解するまで撹拌する。このためには、約３０分を要した。（混合は発熱反応で あり、３ＭのＣ＋Ｃ１／サンプルは最初半溶解状態となる。Ｃ＋ＣＩが溶液とな るまで撹拌を続ける。） ２、３Ｍの（＋ＣＩ／サンプル溶液を遠心管に入れ、フタをする。 管を液で完全に満たすことと、密封するように注意すること。 管をＴＭ０１　ｏ−ター（Ｂｓｃｋｍａｎ）中に入れる。 ３、ベックマン遠心器中で、８℃、５Ｇ、　ＧＯＯｒｐｍで６５時間回転させる 。 ４、操作の終りに、ローターから管を取り出し、ペリスタポンプを用いて管の底 から濃度勾配液を注意深くくみ出す。各々の管からの同じ分画を収集する。対応 する分画をプールする。分画１は最も底部の分画であり、分画ば最も上部の分画 である。 ５、各分画を必要となるまで一８０℃で保存する。 ［）ＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー１、Ｃ＋ＣＩ分画番号１　（Ｘ２［１ ３）か、分画番号２　（ＱＩＯＥ７　）　（ｆ）イずれかを、２０！ＩＭトリス ーＨＣｌ／７Ｍ尿素、ｐＨ７，５にたいし、３５００　Ｍ！チューブを用いて、 透析し、ｓｏ、　ｏｏｏ倍の透析結果を得た。 ２、サンプルのＯ，Ｄ、　を定量する。 ３、適当なり１ｏ−Ｇｅｌ　ＤＥＡＥ−５−ＰＷ　ｔｌＰＬｃカラム（Ｂｉｏ− Ｒｉｄ　）にサンプルを負荷する。 分析用カラム＝　１ｍＨの蛋白負荷範囲セミ分取用カラム＝　１０１５０ｍｇの 蛋白負荷範囲４、溶出バッファーは、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ／’７Ｍ尿素、ｌ ＩＨ７，５（Ａ）と、２０ｍＭ　ｈリス−）ＩＣ＋／７Ｍ尿素／ＬＭ　ＮａＣ１ ，ｐＨ７，５（Ｂ）である。 ５、　ＨＰＬＣにプログラムした溶出スペクトラムは下記の通り。 分析用カラム 時間　流量（ｍｌ／ｍ１ｎ）　％Ａ　％Ｂ　勾配特性０　１．０　１００　０　 直線 ５　１．０　１００　Ｇ　直線 ３５　１．０　５０　５０　直線 セミ分取用ＤＥＡＥカラム 時間　流量（ｍｌ／ｍ１ｎ）　％Ａ　％Ｂ　勾配特性０　４、Ｑ　ＩＧＯＱ　直 線 ｔｏ　４．０　１００　０　直線 ５５　４．０　５０　５０　直線 ６、分析用走行では、１ｍ１分画を収集し、セミ分取走行では、４ｍ１分画を収 集する。 ７、各々の管からの各サンプルの５０μＬを、２０ｍＭトリス−ＩＩＣＩ／３． ５Ｍ　尿素、ｐｉ（７，５で希釈し、収集した容管に対応する微小滴定用プレー ト上のウェルにコートするのに用いた。プレートをＲＴで一晩インキュベートす る口 ８、プレートを、上記のＥＬＩＳＡ　法を用いてテストし、ｚ２Ｄ３活性（Ｃ＋ ＣＩ分画番号１）またはＱＩＯＥＴ活性（ＣｓＣｌ分画番号４）を定量した。図 す、ｃを参照。 ９、その内容物が、問題の抗原にたいして陽性ＥＬＩＳＡ信号を与える試験管を まとめてプールした。 １０、この、Ｚ２Ｄ３あるいはＱ１０Ｅ７抗原含有混合物を２０１１１Ｍトリス −ＨＣｌ１０．１５Ｍ　ＮｌＣｌ、　ｐＨ７，４にたいして透析し、尿素を除去 した。３５００　ＭＮ孔を持つ透析チューブを用いた。 アフィニティー・クロマトグラフィー １、抗原含有混合物を、アガロース・ゲルに加え、ｚ２Ｄ３またはＱＩＱＥ７モ ノクローナル抗体に結合させる（どの抗原を精製するかによる）。 ２、このアガロース・ゲル／抗原混合物を、振とう器で、４℃で一晩静かに混合 する。 ３、次に、このゲルを、適当なサイズのガラス・カラムに負荷する。 ４、このゲルを、ゲルの２０倍容量の、２（１ｍＭトリス−１（＋、ｌ／１１． １５ＭＮＩＣ１，ｐＨ７，４（トリス）で洗浄する。 ５、抗原を、０．１Ｍ塩酸グリシンバッファー、ｐＨ２，５で溶出する。 ６、溶出抗原を、トリス・バッファーにたいして透析する。 ゲル・サイズ測定 １、アフィニティーで精製した抗原を、１０．０００１１Ｗフイルターを有する Ａｍ１ｅｏｎ濃縮器で濃縮する。 ２、濃縮抗原を、０．４５μフイルターを用いてろ過し、０．１Ｍ燐酸カリウム ・バッファー、ｐＨ７，０で平衡させた、Ｂｌｏ−３ｉｌ　ＴＳＫ−４００カラ ム（Ｚ２Ｄ３抗原）、または、Ｂｌｏ−３ｉｌ　ＴＳＫ−２５０カラム（ＱＩＯ Ｅ７抗原）に負荷した（Ｂｉｏ−３ｉｌカラムは、Ｂｉｏ−Ｒｉｄによって市販 されている）。 ３、２２Ｄ３抗原の主要分子は、Ｂｌｏ−３ｉｔ　ＴＳＫ−４００カラムにおい て、２０θ、００１１ＭＷを越えるところに溶出される。Ｑ１０Ｅ７抗原は、Ｂ ｌｏ−８℃１丁５Ｋ−２５０カラムにおいて、１５０．０００　ＭＷを越えると ころで溶出される。 ■、アテローム硬化性プラーク抗原の特性決定レクチン及び市販の抗体による結 合研究アフィニティー精製アテローム硬化性プラーク抗原を、ポリスチレン微小 滴定プレーｈ　（１ｍｉｕｎｌｏｎ　ＩＩ　）にコートした。サンプルを、ｌＧ ＯｍＭ　ＮａＰＯ４／４００ｍＭ　ＮａＣｌ／ｐＨ６，９の　１００１に希釈し 、１００μｍを各ウェルに入れ、４℃で、−晩インキユベートした。 プレートをブｏ、ｙりし、次に、１１％Ｔｒｉｊｏｎ　！−１００および００５ ％Ｔｖｅｅｎ−２０（レクチン研究用）、または、カゼイン・バッファー（市販 の抗体研究用）で洗浄した。ビオチン化レクチン（Ｖｅｃｔｏｒまたは、ＳＩｇ ｌｌｌｌから入手）を、最終濃度１−１０　μｇ／ｍｌになるように希釈し、ア テロ・抗原でコートしたウェルに入れ、３７℃で２時間放置した。結合レクチン は、アビヂン・パーオキシダーゼ結合体（ＶｅｃｔｏｒＬｘｂ＋のＡＢＣである ）を用いて検出した。市販のポリクローナル及びモノクローナル抗体を、カゼイ ン・バッファーで希釈しく　１／１００〜１／２０００　）　、コートした抗原 （上記のように調製）と共に、３７℃で２時間インキュベートした。次に、適当 なパーオキシダーゼに結合した（ｃｏｏｉｕｇａｔｅｄ）第２の抗体（Ｔｘｇｏ ）を加えた。これは、市販の抗体が、コートしたアテロ・抗原に結合するのを検 出するためでＰＢＳバッファーに溶解した、部分精製アテローム硬化性プラーク 抗原を、トリクロロ酢酸（Ｔ　ＣＡ）に、最終濃度５％（重量／容量）となるよ うに溶解し、氷上で３０分間インキュベートし、次に遠心し、酸に可溶性の分画 と不溶性の分画とを分離した。不溶性物賀をＰＢＳに分散し、ＥＬＩＳＡによっ て、残余の抗原の有無をテストした。ＴＣＡ上清分画は、１Ｍトリス、ｐＨ９を 加えて中和し、ＰＢＳにたいして透析し、ＥＬＩＳＡでア部分精製したアテロー ム硬化性プラーク抗原の１容量を、９容量の水冷アセトンと混ぜて、混合し、氷 上に３０分放置し、次に、遠心した。このペレットを空気乾燥し、最初の容量の ＰＢＳに再び懸濁し、ＥＬＩＳＡで分析した。アセトン上清は、捨てた。 部分精製したアテローム硬化性プラーク抗原の１容量を、１容量のクロロホルム と激しく混合し、２．００ＯＲＰＭで、５分間遠心した。上層の水層を取り出し 、再びクロロフォルムで抽出した。もう一度遠心した後で、水層を、ＥＬＩＳＡ で分析した。 アテローム硬化性プラーク抗原の酵素消化プラークないし血清から得た、アフィ ニティー精製アテローム硬化性プラークを、広範な加水分解性酵素と混合した。 それぞれに特異的な反応バッファーは、メーカーの指示するものであった。反応 はすべて、全容量１．０−１．５ｍｌの中で行い、３７℃で一晩インキユベート し、次に、５分間煮沸し、反応を停止させた。サンプルをろ過しく　０．４５μ ）　、　ＨＰＬＣカラム（ＴＳＫ−４００６０Ｏｍｍ　ｔ　７．５ｍｍ　Ｂｉｏ −Ｒｘｄ　）に注入し、０．１Ｍ　ＫＰＯ４，ｐｌＩ７．（ｌで、分子ふるいで の分画を行なった。個々の分画（それぞれ２５滴）を、抗体捕捉法、コート抗原 法の両方において、ＥＬＩＳＡでテストした。これによって、コントロール（未 消化）サンプルにたいする、アテローム硬化性プラーク抗原の溶出スペクトルの 変化を調べた。分子量標準（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、チログロブリン、免疫グロブリン 、オボアルブミン、ミオグロビン、ビタミンＢ−１２）を用いて、ＴＳＫ−４０ Ｇカラムの溶出を較正した。 発色定量法 ａ）全ヘキソサミンを、ＢＩＩｅｎｋｒｚｎｔｘ法、Ａｓｂｏｅ−Ｈｚｎｓｅｎ 法によって測定した［Ｃｌ１ｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、９：２６４　（１９７６１ １゜簡単に言うと、抗原サンプルを、燐酸・テトラボロン酸バッファーに溶かし た３、５％アセチルアセトン、０．３ｍｌ　と混合し、３０分間１００℃に加熱 した。混合物を冷却し、エールリッヒの試薬、１ｍｌを加え、得られた吸光度（ 波長５３５ｎｍ）を測定した。Ｄ（＋）グルコサミンを標準として用いた。 ｂ）ウロン酸を、　Ｂｌｕｍｅｎｋｔａｎｌｚ法、＾５ｈｏｔ−Ｌｎｓｅｎ法に よッテ測定した　（ＡＩＩ！１．　Ｂｉｏｅｈｅｍ、、　５４：４８４　（１９ ７３）Ｉ　ｏ簡単に言うと、０．１ｍｌの抗原サンプルに、硫酸／テトラボロン 酸試薬、０．６ｍｌを加え、混合し、１００℃で、５分間インキュベートした。 冷却後、ｍ−ｈ７ｄｒｏＢｄｉｐｈｅｎ７１試薬、０，０１ｍ１を加え、試験管 を振とうし、５分後、５２０ｎｍにおける吸光度を記録した。硫酸コンドロイチ ンを標準として用いた。 分子荷電定量法 初め、アテローム硬化性プラーク抗原の等電ｐＨ（ｐＩ）を定量しようとして、 Ｐｈ１ｒ＋ｉｚｃ目から入手した１混合ベッド・イオン交換樹脂試薬クロマトフ オーカシング装置を用いた。用いた条件は、メーカーの指示通りであった。すな わち、抗原サンプルを、高ｐＨバッファー（１１，０）中に透析し、１１を、ポ リバッファー交換１１８樹脂に加えた（１０ｍｌベッド）。次に、溶出勾配液を 、ｐＨ８，０バツフアーで現像した。個々の分画のｐＨを測定し、これらを、Ｐ Ｂ３９１（７，２にたいして透析し、ＥＬＩＳＡで分析した。 その他のイオン交換結合法は、ＱＡＥ−セファローズ（陰イオン交換体）と、Ｓ −セファローズ（陽イオン交換体）を、　Ｌ！ＢとＬａｎｇｅｒの方法に倣って 、ｐ）Ｉ７〜１２の範囲で行なった［人ｎｘ１．Ｂｉｏｃｈ１．．　１４７：１ ４８　（１９８５）］。簡単に言うと、部分精製した抗原を、ｐＨ７，１１，９ ，１０，１１及び１２で、５１Ｍ　ＮｌＰＯ４中に透析した。同じ　ｐＨで平衡 させた、イオン交換樹脂０．５１をパックしたゲルの一部を、１ｍ１の抗原と、 ２５℃で、３０分間混合した。サンプルを２．００ＯＲＰＭで５分間遠心し、上 溝を取り出し、ろ過してゲル・フラグメントを除去したのち、ＥＬＩＳＡでアッ セイして未結合の抗原を定量した。チトクロームＣとミオグロビンを、それぞれ 、高いｐ　Ｉ　（１０，２）標準及び中等のｐｉ（７，４）標準として用い、こ の方法が適正であることを確かめた。 アテローム硬化性プラーク抗原を、以下に列挙した変性剤に暴露し、次に、透析 によってもとのバッファー（Ｐ　Ｂ　Ｓ）に復帰させた。 薬剤： ＰＢＳに溶解した８１１１尿素に、室温で２４時間。 ＰＢＳに溶解した６Ｍ塩酸グアニジンに、室温で２４時間。 ２Ｍトリフルオロ酢酸に、室温で３０分。 ＰＢＳに溶解した３、　５Ｍ　１ｌｉｓｃＨに、室温で８時間。 ０、１Ｍグリシン、ｐＨ２，５に、室温で２時間。 ＰＢＳに溶解した０、１９ＳＤＳに、室温で１時間（アセトンによる沈澱で抗原 を回収する） （アルキル化・還元法） 部分精製したアテローム硬化性プラーク抗原（０，ＬＭ　ＫＰＯ４溶液０．５１ ．　ｐＨ７，０）を、０．４４塩酸グアニジン（最終濃度７Ｍ　）と、２５０μ ｇのジチオトレイトールと混合した。ｐＨを８，６に調節し、サンプルを室温で １時間放置した。次に、ヨードアセトアミド　１６ｍｇをゆっくりと加え、必要 に応じて、Ｎ！０［ｌでｐＨを８．５に維持した。室温で１時間放置後、このサ ンプルを、ＴＳＫ−４００ＨＰＬＣゲルろ過カラム（上述のものと同じ）に通し 、個々の分画について、ＥＬＩＳＡによって、アテローム硬化性プラーク抗原の 有無をテストし、未反応抗原から集めた分画と比較した。 ヒト血漿抗原と、コントロールの炭水化物分析下記の概要は、Ｖａ＋ｏｃｏ＋を 用いて、各種ポリサッカライドの加水分解物の炭水化物分析に用いられる方法を 述べる。 抗原精製 抗原と、コントロールサンプルを、アフィニティー・クロマトグラフィーによっ て調製した。アフィニティー樹脂を、発表された方法に従い、Ｖｌ＋ｏｅｏ＋モ ノクローナル抗体１５Ｈ５を８ｉｏ−Ｒｘｄ　Ａｆｆｉｇｅｌ　１０に結合させ て調製した。 血漿サンプルを、バッチ法により、樹脂と共にインキュベートした。洗浄後、結 合抗原を、０．１Ｍグリシン・バッファーｐＨ２，５で溶出した。次に、抗原溶 液を中和し、ＰＢＳにたいして透析した。 サンプル調製 ４℃で、純水にたいして、徹底的な透析を行い、塩類を除去した。各サンプルを 凍結乾燥することによって濃縮し、残渣を最小容量の純水に再度溶解した。 標準の調製 超高純度モノサッカライド標準を、Ｐｆａｎ＋ｔｅｉｅｈｌＬｚｂｏ＋ａｌｏ＋ ｉｅ＋　Ｉｎｃ、、　Ｗａｕｋ＋ｇｘｎ、ＩＬ、から入手した。標準液と、その 希釈液はすべて、純水で調製した。各標準の分岐（アリコート）は、使用するま で、−８０℃に保存した。 加水分解 濃縮トリフルオロ酢酸（Ｐｉｅｒｃｅ、　Ｒｏｃｋｆｏ＋ｄ、ＩＬ）を、サンプ ル水溶液に加え、最終濃度２Ｍとした。ビンをろ過した窒素で徹底的にフラッシ ュし、熱に安定なテフロン張りのキャップで封じた。このビンを、１０４土４℃ の砂浴に４時装置いた。加水分解後、ビンを冷却しく１０分）、ろ過した窒素を 流通して、溶媒を蒸発させた。 炭水化物分析 Ｄｉｏｎ＋ｘ　装置は、モノサッカライド分析用に構成されていると公表されて いる。これは、試薬搬送ユニット、微量注入バルブ、金電極装着パルス式電流検 出計、ＣａｒｂｏＰａＣＰ＾−１分析用カラムから成る。データは、Ｄｉｏｎｅ ｘ　４２７０積分計で収集した。 各ランごとに、カラムは、純水に溶解した１５ｍ１Ｊ　ＮｌＯＨで十分に平衡さ せた。加水分解物残査を、注入前に、純水に再溶解した。結合モノサッカライド は、ＣａｒｂｏＰａＣカラムから、純水に再溶解したＮａＯＨの直線勾配に伴っ て溶出した。 結果 第２０図は、純水のみによるクロマトグラフィーのブランクランを示す。 第２１図は、７種の標準モノサッカライドによるクロマトグラフィーランを示す 。 第２２図は、１５Ｈ５モノクロナ一ル抗体による、自己抗原アフィニティー精製 物のクロマトグラフィー・ブランクランを示す。 ■、抗体の単離及び調製法 セファローズへの抗体共役結合 凍結乾燥ＣＮＢｔ−セファローズ４Ｂ粉末（Ｐｈａｒｍａｅｉｘ　）を、１ｍＭ 　ＨＣＩ中で、１５分放置し膨潤させる。このゲルを、焼結ガラス・フィルター （空孔度Ｇ−３）上で、ゲル１．ｇ（乾燥重量）当り　１ｍＭ　ＨＣＩを合計２ ＱＯｍｌ用いて洗浄する。これをいくつかのアリコートについて行い、各連続的 な添加の合間に、上清を吸い取る。 １ｍｌのゲル当りに結合させる　５ｍｇの蛋白を、結合用バッファー　（０，Ｉ Ｍ　ＮａＨＣＯ３，ｐＨ８ｊ、０．５Ｍ　ＮａＣｌ含有）に溶解する。このゲル を結合用バッファーで洗浄し、余分を、吸引で除去し、蛋白溶液をゲルと混合す る。混合物を、撹拌しながら、４℃で、−晩装置する。次に、このゲルを、１Ｍ エタノールアミン、ｐｔｌ８．０を含むブロック用バッファーに入れ、室温で２ 時間放置する。次に、ゲルを、１Ｍエタノールアミン、ｐＨ８，０を含む結合用 バッファーで洗浄する。ゲルを、結合用バッファー、０．５ＭＮａＣ１含有の　 Ｇ、１Ｍアセテート・バッファー、ｐＨ４，０で１０回洗浄し、結合用バッファ ーで２回洗浄する。これで、この蛋白−セファロース結合体は使用可能となり１ ．４〜８℃で保存できる。臭化シアノーゲンを加えて、バッファー溶液を、静菌 性のものとし、でもよい。 プラーク上清からのＩｇＧ抗体の吸収 カラムを、抗−１ｇＧ抗体に結合したセファロース会ゲル２５ｍ１で充填する。 この抗体は、上記の方法に従って調製されたもので、全部で約１２９ｍｇ　の抗 −１ｇＧ抗体を含む。このカラムを、２から３倍容量のバッファー（０，１５Ｍ 　ＰＢＳ、ｐｔｌ　７．２　）で平衡させ、次に、サンプルをこのカラムに加え る。 溶出用バッフｙ−（０，１５Ｍ　ＰＢＳ、ｐＨ７，２）の流速は、１２５　ｍｌ ／ｈ＋である。抗体を含む溶出分画を、ピーク活性がなくなるまで、収集する。 次に、このカラムを、酢酸ナトリウム・バッファー液、ｐＨ４０（溶出用バッフ ァー）で洗浄し、免疫アフィニティー結合ＩｇＧ　抗体を脱着する。このカラム を、１５−２０　ｍｌ／ｈ＋の流速で溶出し、溶出サンプルを収集し、ピーク分 画を保持する。このピーク分画を、バッファーを何度も交換しながら、０．１５ Ｍ　ＰＢＳ。 ９Ｈ７，２にたいして、４℃で２４〜３６時間透析する。 プラーク上清からのＩｇＥ抗体の吸収 上記の操作を、上述のように調製した、抗−１ｇＥ抗体に結合したセファロース ・ゲル７、５ｍｌで充填したカラムで繰り返す。溶出用バッファーの流速は、１ ５１５−２Ｏ／ｈｒである。 プラーク上清からのＩｇＡ抗体の吸収 上記の操作を、上述の方法に従って調製した、抗−１ｇＥ抗体に結合したセファ ロース・ゲル７５ｍ１で充填したカラムで繰り返す。溶出用バッファーの流速は 、１５１５−２Ｏ／ｈ＋である。 プラーク上清からの■ｇＭ抗体の吸収 上記の操作を、上述の操作の通りに調製した、抗−１ｇＥ抗体に共役したセファ ローズ・ゲル７．５ｍｌでパックしたカラムで繰り返す。溶出用バッファーの流 速は、１５１５−２Ｏ／ｈ＋ｔ’ある。 ポリクローナル抗プラーク抗体 アテローム硬化性プラーク抗原にたいするポリクローナル抗血清は、免疫法を用 いてウサギで誘発させる、また、そのスケジュールは、文献に記載されている。 例えば、［Ｓ＋ｏｌｌａｔ。 ｉｊ＋ｔｈｏｄｉ　ｏｆＥｎＢｍｏｌｏｇｒ、７０ニア０　（１９８０）］　で ある。次に、この抗血清を、モノクローナル抗体の場合に用いるのと同じ固相ア ッセーでスクリーニングする［Ｌ　ｌ　ｎ　ｇ　ｅら、Ｃｌ１ｎ、ＥＩＩｌ、Ｉ ｍｍｕｎｏｌ、。 ２５：１９１　（１９７６）および、Ｐｉ＋ｅｔ＋に７ら、１．　Ｉｃｍｏｎ、 　Ｍｅｔｈｏｄ＋、４１１８７　（１９ｇ＋１１゜最初のスクリーニング基準は 、アテローム硬化性プラーク抗原にたいする結合がよいであろう。 ポリクローナル抗プラーク抗体は、下記のように調製しなければならない。すな わち、０．１５Ｍ塩化ナトリウム溶ｇｊＬ０．２ｚｌに溶解した、前述した方法 によって調製したプラーク抗原０．５ｍｇと、フロイントの完全アジュバント　 ０．８ａ＋ｌの混合液を、ウサギに筋注する。この免疫処置を１４日間繰り返し 、次に毎週１回、３週間繰り返す。さらに１０日間経過した後に、血液をウサギ から抽出し、その血液を凝固させ、凝固物を除去して、抗血清を回収する。 抗体試薬を、プラーク抗原と取り替えて、上記の操作を繰り返すと、ホースラデ ィツシュ・パーオキシダーゼまたはアルカリ・フォスファターゼ標識プラーク抗 原が得られる。 抗血清の　ＩｇＧ分画をさらにアフィニティー・カラムクロマトグラフィーによ って精製する。カラムは、抗プラーク抗原が固定された樹脂を含むんでいる。 モノクローナル抗プラーク抗体 精製アテローム硬化性プラーク抗原を用いて、プラーク抗原にたいするマウス・ モノクローナル抗体を、Ｇ＊ｌ［ｒｅとＭｉｌｓｌｅｉｎ標準法にしたがって入 手する［Ｍｅｊｈｏｄｘ　ｉｎ　Ｅｎｚ７ｍ、。 ７３１１　（１９８１）］。文献に記載されている方法の変法を用いて、モノク ローナル抗体をスクリーニングする。この文献は、例えば、血清プラーク抗原（ または、その免疫複合体）のアッセーに有効であるためには、モノクロナール抗 体は、高い親和性（できれば、Ｋ　１０”　Ｍ’）で、プラーク抗原に結合しな ければな入 らない。 マウス・モノクローナル抗体を、２段階法で精製する。取り出したままの腹水液 を、ｌ０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ、Ｇ、１５Ｍ　ＮａＣ１，ｐＨｇ、。 で平衡させたＡｆｌｉ−Ｇｅｔ　Ｂｌｕｅ　樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌｚｂｏ＋ ａｔｏｒｉｅ＋。 Ｒｉｃｂｍｏｎｄ、　Ｃ人）のカラムに加え、このバッファーで溶出する。 この段階でアルブミンが除去される。すなわち、アルブミンはカラムに保持され る。精製の最終段階は、ＤＥＡＥ−セファロース（Ｐｈａ＋ｍｘｃｉｘ　Ｆｉｎ ｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ＋、Ｐｉ＋ｃａｆａｖａ７．　Ｎｊ）へ加え、ｉＱｍＭト リス−１１ｃＩ、ｐＨ８，０から　１０ｍＭ　ｌ−リス−ＨＣ１，１００ｍＭ　 ＮａＣｌへの直線勾配液を用いて溶出することである。これによって、アルブミ ン、トランスフェリンのような汚染性の血清蛋白を持たない、精製マウス・モノ クローナル抗体が得られる。 ハイブリドーマ細胞系２２Ｄ３内の系変換変種の単離系変換は、アテローム硬化 性プラーク抗原特異性を持つ　１ｇＭイソタイプ細胞系２２Ｄ３　（ＡＴＣＣ受 託番号９８４０）から、同じ特異性を持つ　ＩｇＧイソタイプ細胞系（、２２Ｄ ３１５Ｃ５）へ行なわれた。 Ｘ２Ｄ３１５Ｃ５は、ｚ２Ｄ３の、い（つかの子孫細胞系の内の一例である。こ の子孫細胞系の中には、２２Ｄ３／３Ｅ５　（ＡＴＣＣ受託番号１１８１０４８ ５）も含まれる。 ＩｇＭイソタイプＺ２Ｄ３ハイブリドーマ細胞系は、Ｂａ１ｂ／ｃ牌臓細胞を、 ｓｐ２　ミエローマ細胞系と融合して調製した（Ｉｏａ＋ｘｎｘｌｏｆ　Ｉ＋＋ ＋ｍｏｎｏｌｏｇ７．１３１巻、２号、１９８３年８月、ｌ５ｏｌａｔｉｏｎｏ ｆ　Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　Ｃ１１ｌｌ　ｗｉｔｈ　Ｙａｒｉｘｌｘ　 ｆｒｏｍ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍｉ１ｉｎｅ＋　ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ　Ａｎｔｉ−１ ｄｉＯｔｏｐｅ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｂ７　ｓｅｑｕｅｎｔｉｘｌｇａｂｌ ｉｎｉｎｇ、Ｃｈｒｉ＋ｔａ　Ｅ、　Ｍｕｌｌｅｒ　ａｎｄ　Ｋ１１ｌｌｌ　Ｒ ＊ｉｅｖ＋に７；　Ｊｏｕｒｎｘｌｏｆ　１ｍｍｕｎｏｌｏｇ７１１ｅｊｈｏｄ ＋、　Ｙｏｌ、７４．　１９８４．９ｇ、３０７−３１５．　Ｔｈｅｉｄｅｎｌ 百１ｅａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎｉｌ　Ｃ１ｚｓｓ　Ｓｖ口ｃｈ　Ｙ ａｒｉｘｎｔｓ　ｂｙＳｉｂ　５ｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｇｏｄ　ｓｎ　ＥＬＩＳＡ 　Ａ＋ｓｘ７．　Ｇｏｄ　５ｐｉｒ＊　、　Ａｃ１ｏｎｉ。 Ｂｘｒｇｅｌｌｅｓｉ、Ｉｅｘｎ−Ｌａｃ　Ｔｅ１ｌｌｘｎｄ、　Ｍ！目ｈｅｗ 　Ｄ、５ｅｈａｒ＋１．）最初、ＩｇＧ産生細胞をめて、ｚ２Ｄ３をスクリーニ ングした。 １００個の細胞を、９６ウエルＦａｌｃｏｎプレートのウェルにプレートした。 全部で１０プレートを用いた。８日目、上溝を集め、ＩｇＧの有無を調べた。９ ６個のウェルを、ヤギ抗−マウス［ｇＧ（γ鎖特異的試薬、Ｂｍｅｄ　６２−６ ６０Ｇ　）で、１ウェル当り５０ｎｇでコートし、４℃で、−処置いた。ウェル を０．０５％Ｔｖｅｅｎ添加ＰＢＳ　（洗浄用バッファー）で４回洗浄し、プレ ートした細胞から得た上清５０μｍを加えた。室温で、２から３時間インキュベ ートした後、プレートを、洗浄用バッファーで４回洗浄し、アルカリ・フォスフ ァターゼ結合ヤギ抗マウス　ＩｇＧ（γ鎖特異的）試薬の　１／１０００希釈液 ５０μｌを加えた。室温で２時間インキュベートした後、プレートを洗浄用バッ ファーで４回洗浄し、四−メチルウンベリフェリルホスフェート（ｆｏｕ＋−ｍ ＋ｌｈ７１ｏｍｂｅｌｌｉｆｅｒＹｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）基質液（Ｓｉｇｍ ａ　Ｎｏ、　Ｍ８８８３　）の１００μｌを各ウェルに加えた。室温で６０分後 、Ｆｌｏｕ＋ｏ［ａｉ１９６ウエル蛍光測定器（３Ｍ　Ｄｉａｇｎｏ＋ｔｉ＋ｔ 、　５ｚｎｊａ　Ｃ１ａ＋ａ、ＣＡ　）でプレートを読みとった。 このアッセーの感度は、１００個の中に１個陽性細胞があっても、簡単に検出で きるほどのものであった。最初、３個の陽性ウェルが検出された。最高信号を発 するウェル（８Ｇ２　）の濃度を高めるために、下記のようにサブクローニング した。 次に、この陽性ウェルを、９％牛脂児血清を含む培養液１００ｍ１に再び懸濁し 、１ウェル当り　２００μｌで、９６ウ工ルプレート５枚にプレートした。これ らのウェルから得た上溝を、上記のように、８日後調べた。ウェルの７０％がＩ ｇＧにたいして陽性であった。ＩｇＧにたいして最高信号を発するウェル（ｌＡ １２）を選び、さらにサブクローニングを行なった。ウェル中の細胞を、ピペッ ト法によって懸濁し、懸濁液の２０μｌを１．９％牛脂児血清を含む培養液１０ ０ｍｌ中に希釈した。この懸濁液を、５枚のプレートに、１ウェル当り　２００ μｍでプレートした。１ウェル当りの細胞は約３個であった。 ８日後、上清について、１ｇ１ｉ、ＩｇＧの有無を調べた。プロトコルは上記の ものを用いたが、ただし、ウェルをコートするのに、ヤギ抗１ｇＭ　（ｔｌ鎖特 異的）試薬（Ｔａｇｏ　４１４２　）を５０％ｇ／ウェルで一晩、また、アルカ リ・フォスファターゼ結合体として、ヤギ抗−１１Ｍ　（ｕ鎖特異的）試薬（Ｔ ａｇｏ　４８５２　）を用い、１ｇＭ検出用のアッセー法とした。ＩｇＧ最高信 号を持つ３ウエルを、希釈カーブを用いて再テストした。これはμ鎖及びγ鎖の 量をさらに正確に定量するためである。７Ｄ１０で、γが最高で、μが最低であ った。次に、このウェルを、０．５細胞／ウエルで、６プレートを用いてサブク ローニングした。これによって、最終クローン系を得た。 個々のクローンを肉眼的に特定し、ＩｇＭ、ＩｇＧ試薬によってテストした。γ 産生クローンをいくつか選んだ。この内、５Ｃ５をさらに育成し、調べた。この クローンをＸ２Ｄ３１５Ｃ５と名付けた。 μ産生２２Ｄ３クローン系およびγ産生２２Ｄ３１５Ｃ５クローン系から得た上 清は、下記のようにテストしてみると、同一の特異性を示す。 １、２２１１３１ｇＭおよびＺ２Ｄ３１５Ｃ５ＩｇＧを、ヒトおよびウサギのア テ。−ム硬化性プラーク凍結切片の免疫組織学的染色に用いると、組織学的に同 じ分布を示し、正常組織では同じ陰性結果を呈す。 ２　抗原（ヒトアテローム硬化性プラークのアルコール抽出物）にたいする結合 を調べる（ＥＬＩＳＡ　）と、両抗体とも特異的Ｉこ結合するのに、同、一系統 に属する他の抗体は、陰性の結果を示す。 ＩｇＧ系統を確認し、サブイソタイプ決定キ・ソト（Ｓｕｂｌｓｏ！７ｐｉｎｇ 　Ｋ１１ｌ　（Ｈｙｃｌｏｎｅ　ＥＯ５Ｑ５１−Ｋ）を用いて、サブクラスを決 定した。２２Ｄ３１５Ｃ５は、ＩｇＧ１　である。 ■、免免疫ブツセ− 法体アッセー法 １、サンプルまたはコントロール（陽性、陰性）１０μｌを、ガラス管中のサン プル希釈液２ｍｌに加える。 ２．４℃で、−晩インキュベート。 ３、翌朝、抗原でコートしたプレートを取り出し、各ウェルから抗原コート液を 吸引する。次に、０２％カゼイン・ノ＜、ツファー２００μｍを各ウェルに加え 、室温で３０分間放置し、ウェルをブロックする。その後、吸引し、０２％カゼ イン・バッファーで一度洗浄する。 ４゜サンプルまたはコントロール１００μｍを、用意したプレート・マツプにし たがって各ウェルに与える（サンプルまたはコントロールのアッセイは二重とす る）。 ５、プレートをパラフィルムでカバーし、室温で２時間インキュベートする。 ６８吸引し、プレートを、０．２％カゼイン・バッファーで３回洗浄する。 ７、抗−ヒト　ＩｇＧ結合体、または、抗−ヒト　ＩｇＡ結合結合体上トＩｇＡ 結合体の実行用希釈液１００μｍを、各ウェルに加える。 室温で２時間インキュベート。 ８、プレートを０．２％カゼイン・バッファーで４回洗浄する。 ９．７ＭＢ基質を調製する（ＴＭＢ基質とベロイダーゼ液Ｂとの等容量混合物を 用いて）。 １０、各ウェルに基質１００μｌを加え、室温で６０分反応させる。 １１、先ず、プレートを、ＥＬＩＳＡ読み取り器により、６５ｈｍで読み、次に 、各ウェルに　ＩＭ　［ｌＣ１５０μｍを加え、反応を停止する。その後、４５ ０　ｎｍで再び読む。 １２、光学密度（０，Ｄ、）数は、試験サンプル中の抗体の濃度に直接比例する 。 抗原捕捉アッセー法 １、サンプルまたはコントロール（陽性または陰性）２５０μｍを、ガラス管中 のサンプル希釈液２５０μｍに加える。 ２、上記混合物を、３７℃で、４時間インキュベートする。 ３、　１５Ｈ５Ａｂでコートしたプレート（２００μｌ／ウエル）からバッファ ーを吸引し、プレートをｌＱＯｍｊ　ＰＢＳ／Ｔｖｅｅｎ／Ｔｔ口ｏｎバッファ ーで一度洗浄する。 ４、サンプルまたはコントロール２００μｍを、用意したプレート・マツプにし たがって各ウェルに加える（サンプルまたはコントロールアッセイは二重とする ）。 ５、プレートをパラフィルムでカバーし、室温で一晩インキュベート。 ６、翌朝、ウェルからサンプルを吸引する。プレートを０２％カゼイン・バッフ ァーで３回洗浄する。 ７、１７Ｈ３＾ｂ−パーオキシダーゼ結合体の実行用希釈液２００μｌを、各ウ ェルに加える。 ８、プレートをパラフィルムでカバーし、３７℃で４時間インキュベートする。 ９、プレートを、０３２％カゼイン・バッファーで４回洗浄する。 １０、ＴＭＢ基質を調製する（ＴＭＢ基質とパーオキシダーゼ液Ｂとの等容量混 合物を用いて）。 １１６各ウエルに基質２００μｍを加え、室温で６０分反応させる。 １２、先ず、プレートをＥＬＩＳＡ読み取り器により６５０ｎｍで読み、次に、 各ウェルに１１１　ｌｌＣｌ　５０μｌを加え反応を停止する。その後、４５０ 　ａｍで再び読む。 １３、光学密度（０，Ｄ、）数は、試験サンプル中の抗体の濃度に直接比例する 。 阻害アッセー処方 １　、１（ＣＡ［ｌマタ＋！、所内モ／りｏ−−Ｆ／ｌ／抗体（１７Ｈ３Ａｂ、 、　２２Ｄ３Ａｈ、、１５１’１５　Ａｂ、および正常マウスＩｇＭをｍｏｎｏ 　Ａｂ、コントロールとして、抗原をコートしたウェルに加え、あらかじめウェ ルをブロックする。同時に、１０ｍＭ　ＰＢＳバッファーを、抗原でコートした ウェルに加え、非阻害コントロールとする）の各種濃度のもの１００μｌを加え る。プレートをパラフィルムでカバーする。 ２、プレートを室温で２時間インキュベートし、次に、４℃で一晩インキュベー ト。 ３、翌朝、各ウェルを吸引し、０．２％カゼイン・バッファーで３回洗浄する。 ４、各モノクロナール抗体の至適濃度液１００μｌを、ＨＣＡＤであらかじめブ ロックした各ウェルに加える。または、ＩＩｃＡＤの至適希釈液ＬＯＧμｍを、 あらかじめブロックした各モノクローナル−ウェルに加える。プレートをパラフ ィルムでカバーする。 ５、室温で２時間インキュベートする。 ６、吸引し、０２％カゼイン・バッファーで４回洗浄する。 ７、結合体１ｆｌｏμｌ　（ＨＣＡＤブロック完了ウェルには、１２にヤギ抗− マウス　Ｉｇｍパーオキシダーゼ結合体を、モノクローナル・ブロック完了ウェ ルには、１４００マウス抗−Ｈｕ　ｌ　ｇＧ−パーオキシダーゼ結合体）を、Ｐ ＢＳコントロール・ウェルを含む各ウェルに加える。プレートをパラフィルムで カバーする。 ８、室温で２時間インキュベートする。 ９、吸引し、０．２％カゼイン・バッファーで４回洗浄する。 １０．７ＭＢ基貫１００μｌを各ウェルに加える。室温で１時間反応させる。 １１、プレートを６５０ｎｍで読み、次に、各ウエルニ１．［１Ｍ　ＨＣＬＯ停 止液５０μｌを加え、４５ｈｍで再びプレートを読む。 １２、計算 阻害％＝１００％−（アッセー・ウェル平均０．０．／コントロール平均０．Ｄ 、）ｘｌｏｏ％ＰＢＳ アテローム硬化性プラーク抗原にたいするイムノアッセー法抗−ブラーク抗体で コートした各微小滴定プレートに、試験する患者の血清サンプルで、正常マウス 血清１０μＩ／ウエルと混合したものを、９０μＩ／ウエルで与える。プレート を、乾燥を防ぐためにカバーし、−晩インキュベートする。血清混合物を取り出 し、プレートを、カゼイン洗浄用バッファーで３回洗浄する。 上記の方法にしたがって調製したホースラディツシュ・パーオキシダーゼ結合抗 体、または、アルカリ・フオスファダーゼ結合抗−プラーク抗体の１００μｍ／ ウェルを各ウェルに与え、乾燥を防ぐためにプレートをカバーし、２時間インキ ュベートする。酵素標識抗体溶液を取り出し、プレートをカゼイン洗浄用バッフ ァーで４回洗浄する。 次に、ホースラディツシュ・パーオキシダーゼの場合ならば、テトラメチルベン ジジン、アルカリ・フォスファターゼの場合ならば、４−メチルウンベリフェリ ル・ホスフェート（３ＭＤｉａｇｎｏｓｔｉｅ＋　ＳＨｌｅｍｔ）　のどちらか の　１００μｌ／ウヱルを、ウェルに加える。次に、この微小滴定プレートを、 呈色読み取り器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｗｉｅｓ＋　）　、または、蛍光測 定器（３１１Ｄ目ｇｎｏ＋ｌｉｃ＋　）のどちらかで、１０分毎に読みとる。こ れを、最大読み取り値が得られるまで、または、１時間経過するまでアテローム 硬化性プラーク抗原でコートした各微小滴定プレートに、ヒト血清の１００μｌ ／ウエルを入れる（サンプルは希釈してもよい）。乾燥を防ぐためにプレートを カバーして、２時間インキュベートし、残余の溶液を除去し、さらにプレートを カゼイン洗浄用バッファーで洗浄する。 ホースラディツシュ・パーオキシダーゼか、または、アルカリ・フォスファター ゼ（適当に希釈したもの）のどちらかに結合したアフィニティー精製ヤギ抗−１ ｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＨの溶液１００μｌ／ウエルを、各ウェルに加える。乾燥を 防ぐために、プレートをカバーし、２時間インキュベートする。抗−１ｇＧ、Ｉ ｇＭ。 Ｉｇ＾またはＩｇＥ溶液を除去し、プレートを、カゼイン洗浄用バッファーで３ 回洗浄する。 ホースラディツシュ・パーオキシダーゼ結合抗体の場合ならばテトラメチルベン ジジン、アルカリ・フォスファターゼ結合抗体の場合ならば４−メチルウンベリ フェリル・フォスフェート（３Ｍ　ＤｉＢｏｏ＋ｔｉｃｓ　ＳＳ７５ｔｅ＋）の どちらかの　１０１１μ＋／ウエルを、ウェルに加える。次に、この微小滴定プ レートを、呈色読み取り器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅ＋　）　、また は蛍光測定器（３￥Ｄｉａｇｎｏ＋ｌ１ｃｓ　）のどちらかで、１０分毎に読み とる。これを、最初の最大読み取り値が得られるまで、または、１時間経過する まで行なう。 プラーク抗原コート微小滴定プレートの調製プラーク抗原の調製希釈液の　１０ ０μＩを、ＩＭＭＵＬＯＮ　＋！微小滴定プレート　（Ｊｎａｔｅｃｈ）の表面 に塗布する。コート液の希釈率は、１：１０．　１１１００．　１：１０ＧＯ， ｌ：ｌＧ、０００である。プレートを軽くたたき、コート液が、各ウェルの底部 を完全にカバーするようにする。ウェルを、蓋をした、湿潤な箱の中で、４℃で 一晩インキュベートする。 コート液を捨て、１ウェル当り、２００μｌのＰＢＳを加える。 次に、ウェルを、湿潤箱中で、室温で１時間インキュベートし、洗浄用バッファ ー（ＰＢＳ、０．５％７ｖｅｅｎ及び０．０２％アジ化ナトリウム）の　２００ μｍで洗浄し、ａｌｌＩ箱中、４℃で保存し、使用に備える。 抗体コート微小滴定プレート 抗プラーク抗体の調製希釈液ＬＯＧμｍを、ＩＭＭＵＬＯＮ　１１微小滴定プレ ート（Ｄ７ｎａ＋ｅｃｈ）の表面に塗布する。コート溶液の濃度は、１〜５μｇ ／ウェルに選ぶが、選ばれた他の試薬や、その後のイムノアアセ−法によって、 それよりも上になったり、下になったりする。プレートを軽くたたき、コート液 が、各ウェルの底部を完全にカバーするようにする。ウェルを、蓋をした、湿潤 な箱の中で、４℃で一晩インキユベートする。 コート液を捨て、ＰＢＳに溶かした１％ＢＳＡを、１ウェル当り２００μｌ加え る。次にウェルを、湿潤箱に入れて室温で１時間インキュベートし、ＢＳＡ溶液 を除去する。次いで、ウェルを、２００　ｕ　ｌ　（Ｄ洗浄用ハッ７７−　（Ｐ ＢＳ、　９．５％ＴＶεＥＮ及び０．０２％　アジ化ナトリウム）で、４回洗浄 し、湿潤箱中、４℃で保存し、使用に備える。 ■、抗体標識の手順 １５Ｈ５抗体、１７Ｈ３抗体ペルオキシダーゼ共役体下記の方法は、ペルオキシ ダーゼを、モノクローナル抗体（例えば、ハイブリドーマ　＋５Ｈ５，１７８３ によって産生されるモノクローナル抗体）に結合する１段階法である。 １、精製１５Ｈ５＾ｂ又は　１７）ｉ３　Ａｂの　ｆ　ｍｇを、１０ｍＭ　ＰＢ Ｓにたいして、４℃で一晩透析する。 ２．２ｘｍＨのベルオキシダーゼ酵素を、上記Ａｂ溶液に溶解する。 ３、ゲルタールアルデヒド（１％溶液）を、上記混合物に滴下する。ゲルタール アルデヒド溶液の（抗体ペルオキシダーゼ混合液）にたいする割合は、１２０゜ 次に、振とう器で、室温で２時間静かに撹拌する。 ４、共役体を、ｌＧｍＭ　ＰＢＳ　ｐ）ｌ　７．２　（バッファーを３回変える ）にたいし、４℃で一晩透析する。 ５、共役体を、０．２μでろ過する。 １−１３１標識抗体剤 抗体を、Ｒｏｓｅｂｒｏｕｇｈ、Ｓ、　（上記、９５７５）の記載する　Ｐｉｅ ｒｃｅ１ｏｄｏｂｅ１ｄ法によって、ｌ−１３１で標識することができる。０， ２ＭＰＢＳ、ｐｌＴ　７．０の　ＩＮμｌ　（マイクロリットル）を、抗体の　 １５０Ｉｇに加え、その添加の後、１０分間インキュベートする。溶液をピペッ トで取り出し、保存する。ビーズは、０．２Ｍ　ＰＢＳ。 ｐＨ７，０の　ＩＱＯμｌで洗浄する。溶液とビーズから得た溶液と洗浄バッフ ァーを合わせる。遊離沃素を分離するために、溶液を、ＣＥＮＴＲＩＣＯＮ　ｃ −３０フイルターで徹底的に洗浄する。もとの　ｌ−１３１の約６０％が抗体に 結合する。 ＤＴＰＡ標識抗体 ＤＴＰＡは、　Ｈｎａｔｏｖｉｅｈ、Ｄ、ｅｔ　ａｌ、　［Ｉｏｕｒｎｘｌ　ｏ ｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃｉ１Ｍｅｔｈｏｄ＋、　６５：　１４７　（１９８ ３）］の方法によって抗体に結合させる。 ＤＴＰＡ　の二重環無水体を、Ｈｎａｔｏｖｉｃｈ、　Ｄ、ｅｔｌｌ、、［ｌｎ ）、　］Ａｐｐ１．　Ｒａｄｉａｌ、１ｏｏｔ、　３３：３２７　（１９８２） ］の記載する通りに調整し、室温でデシケータ−に固体として保存する。乾燥ク ロロフォルムまたはエーテルに溶解した無水体の懸濁液（０，０１ｌｌ１ｇ／ｍ ｌｌを調整し、分液を窒素の存在下、清潔な、乾燥した試験管に蒸発させる。生 理食塩水に溶かした　０．０５Ｍ重炭酸ツク、ラフ７−＋ｌ’Ｈ７，０−７，５ に溶解した抗体溶液の　１０−２０μｌを直ちに加え、内容物を、３０から６０ 秒撹拌する。もしも結合抗体を標識前に精製しなければならないならば、この調 整液を、上記のバッファーで約０．２ｍｌまで希釈し、５ｃｍのゲルろ過カラム （Ｇ−５０゜Ｒｏｅｈｅ　Ｄｉｉｇｎｏ＋１ｉｃｓ、　Ｎｕｔｌｅｙ、　ＮＪ　 ）で、生理食塩水を溶出液として、精製する。この精製は約５分を要するが、約 り５％純度の製品を提供する。 Ｉｎ−１１１標識抗体 ０、５１１　酢酸塩バッファー、ＰＨ６，０に溶解した、キレートグレードの　 Ｉ−１１ｌ−１１１（［’ｈ７ｓｉｃｉ、ＥｍｅｒＴｖｉｌｌｅ　ＣＡ）を、上 記の、ＤＴＰＡ−抗体共役体液に、化学量論的に一致するように加える。 これによって、Ｉｎ−１１１キレート・抗体共役体が得られる。この産物は、通 常のクロマトグラフィーによって精製することができる。 フルオレセン抗体剤 抗体を、ｐＨ９，５の炭酸・重炭酸バッファー溶液にたいして一晩透析する。そ の濃度を定量する（例えば、２８０Ｉｍにおける光学的濃度で）。フルオレセン ・イソシアネートのＤＩＩＳＯ溶液（１，［ｌ／ｃｇ／ｍｌ　）を調整し、所期 の容量（全蛋白質溶液容量の１−１０％）を、撹拌しながら、抗体溶液に滴下す る。反応を、遮光して、２時間進行させる。０．１％ＮｘＮ３を含むＰＢＳを用 い、５ＥＰＨＡＤＥＸ　Ｇ−２５ゲルで、産物をゲルろ過・精製し、未反応の、 または、加水分解した弗化クロムを分離する。共役体の吸光度は、２８０Ｉｍと 、４９５Ｉｍで測定し、フルオレセン標識抗体溶液を得る。ローダミン標識抗体 抗体を、実施例７で記載したように、ｐＨ９，５の炭酸・重炭酸バッファー溶液 にたいして一晩透析する。ＤＭＳＯに溶解したローダミン・イソシアネート液（ １０，０ｍｇ／ｍｌ）を調整し、所期の容量（全蛋白質溶液容量の１−１０％） を、撹拌しながら、蛋白質溶液に滴下する。反応を、遮光して、２時間進行させ る。 ０．１％ＮＪ３を含むＰＢＳを用い、５ＥＰＨＡＤＥＸ　Ｇ−２５’ｆルテ、産 物をゲルろ過・精製し、未反応の、または、加水分解した弗化クロムを分離する 。共役体の吸光度は、２８０Ｉと、５５０ｎｉで測定し、ローダミン標識抗体溶 液を得る。 クマリン標識抗体 アテローム動脈硬化性プラーク（１ｒ＋モル）に特異的に結合する抗体を、０． ＧＩＭ　ＰＢＳ、ｐＨ６，８のバッファーにたいして、４℃で、−晩透析する。 この溶液に、５０ｎＭの３−カルボキシ−７−ヒドロキシクマリンを加える。こ の溶液を、５０ｎＭの３−カルボキシ−７−ヒドロキシクマリン（ご加える。こ の液を、水浴で冷却し、ここに、５０μｌＭの１−エチル−３−（３−ジメチル アミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロライドを加える。添加後、混合物を 、４℃で、１時間撹拌し、５ＥＰＩ（ＡＤＥＸ　Ｇ−５０の２．５Ｃ５（１ｃｍ カラムでクロマトグラフィーにかける。共役体の吸光度を、３４５Ｉｍで測定し 、クマリン標識抗体溶液を得る。 ナイル・ブルーＡ標識抗体 ナイル・ブルーＡ　（３５０Ｂ　）を、上記の方法により、ジアゾ化する。ナイ ル・ブルーＡのジアゾニウム塩を含む溶液を、０．１ＭＰＢＳ、ｐＨ８，０に溶 かした抗−プラーク抗体（０，０５ｍ１り液に、滴下する。滴下後、混合物を、 ２．５ｘ５Ｑｃｍ　５ＥＰＨＡ［ｌＥＸ　ｈ　ラムテ精製する。溶出物の吸光度 を６２８ｏｍで測定し、ナイル・ブルーＡ標識抗体を得る。 ヘマトポルフィリン共役 抗体１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（５０ｍ Ｍ）を、［１，０１Ｍ　ＰＢＳ、９Ｈ６，１１に溶解した、ヘマトポルフィリン （５０ｍＭ）と抗−プラーク抗体（１ｍＭ）の混合液に加える。 添加後、混合物を、４℃で２時間撹拌する。次に、この混合物を５ＥＰＨＡＤＥ Ｘ　Ｇ−５０カラムで精製し、ヘマトポルフィリン共役抗体を得る。 テトラサイクリン共役抗体 カルボキシメチルテトラサイクリンのＩＩＨｓエステルを、上記の通りに調整す る。この、Ｉｌ、ＩＭ　ＰＢＳ、ｐＨ８，０に溶解した抗−プラーク抗体溶液に 、テトラサイクリンのＮｉ１Ｓエステルを少しずつ加える。添加後、混合液を、 ４℃で２時間静置させる。混合物を５ＥＰＨＡ［ｌＥＸ　Ｇ−５０カラムで精製 すると、テトラサイクリンに共役した抗体が得られる。 酵素標識抗−プラーク抗体 抗−プラーク抗体は、Ｏ’５ｕｌｌｉｖａｎ、　Ｍ、ｅｌ　ａｔ、［Ａｎｘ１７ ｔｉｅａｌＢｉｏｃｈｅｍ、、１００：１００（１９７９）］の変法にしたがっ て、アルカリ・ホスファターゼに共役させることができる。 ホースラディツシュ・ペルオキシダーゼを、ｌｌｙｇｔｒ＋ｎ、　ｔ（、ｅｔａ ｌ、［Ｍ＋ｄｉ＋ａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、５７：１ｇ？−１９１（１９７９）） の方法にしたがって、下記の通りに、抗−プラーク抗体に共役させる。すなわち 、ホースラディツシュΦペルオキシダーゼ（ＩＩＲＰ、タイプＩＩまたはタイプ Ｉ　Ｖ、　Ｓｉｇｍａ　）を、０．２５％ゲルタールアルデヒド（ＧＡ、　Ｐｏ １ａ＋ｏｎ　）含有Ｑ、　［１５１４炭酸・重炭酸バッファー、ｐｌ＋９．５に 溶解する。室温で２時間放置後、過剰なＧＡを、０．１５Ｍ　ＮａＣｌで平衡さ せた５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５カラム（０，７１２ｃｍ、Ｐｈａｔｍａｃｉｉ 　）で、０人−１１ＲＰから分離する。このＧＡ−ＨＲＰ複合体を、第２段階と して、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ含有、０．０５Ｍ炭酸・重炭酸バｙ７ｙ−ｐＨ９５ 中の抗体と、様々なＩｇＧ：ＨＲＰ比のもと、４℃で１６−６４時間混合する。 反応を、最終濃度が０．０２Ｍとなるまでリジンを加えて停止させる。 トリプシン標識抗体 乾燥したジメチルフォルムアミド（１００μｌ、ｍモル／′ｌ）に溶解したｍ− アレイミドベンゾイルＮ−ヒドロキシスクシンイミドを、精製した抗プラーク抗 体に加える。得られた混合物を、室温で３０分撹拌する。この抗体溶液を、ＰＢ Ｓを溶出液として、５ＥＰＨＡＤＥＸ　Ｇ−５０カラムで分画する。プールした 抗体溶液に、室温で、トリプシンを加える。添加後、混合液を、さらに２時間撹 拌する。２−メルカプトエタノールを、最終濃度が２ｍＭ／ｌになるように加え 、溶液をさらに３０分撹拌する。この共役体を、ＰＢＳ　（３ｘ２リットル）に たいして−晩透析し、トリプシン標識抗体を得る。 パパイン標識抗体 等モル濃度の、パパインに溶解した精製抗プラーク抗体を、０、１Ｍナトリウム ・カリウム溶液中で混合する。この溶液に、燐酸バッファーに溶解した１容量％ ゲルタールアルデヒド溶液を加える。添加後、混合液を、室温で３時間撹拌し、 最後に、０．１Ｍ　ＰＢＳ、ｐＨ８，０にだいし、４℃で一晩透析する。この混 合液をさらに、５ＥＰＨＡＤＥＸ　Ｇ−５０カラムで精製し、パパイン標識抗体 ０．３Ｍ重炭酸バッファー、ｐＨ８，０の１．０１に溶解したヒアルロニダーゼ 溶液（５ｍｇ　）にたいして、フェニルイソチオシアネートを加える。これは、 ヒアルロニダーゼ分子上の遊離アミノ基を保護するためである。添加後、溶液を 、室温で１時間静かに撹拌する。過ヨウ素酸ナトリウム溶液（０，０６Ｍ蒸留水 溶液）を加え、その混合液を３０分静かに撹拌する。蒸留水に溶解した０１６Ｍ エチレングリコールの１ｍｌを加え、溶液を、さらに１時間室温で撹拌する。０ ．０１Ｍ炭酸ナトリウム・バッファー、ｐＨ９，５にたいして４℃で透析した後 （１１で３回）、混合液を、精製抗プラーク抗体と混合する。反応混合液を、２ −３１時間撹拌し、水素化ホウ素ナトリウムの５Ｂで処理する。混合液を、４℃ で一晩放置する。ＰＢＳにたいして透析した後、この混合液を、１．５　！　Ｎ ｉ５　ｃｍ　（ＢＮ）　５ＥＰＨ人ＤＥＸ　Ｇ−１００カラム（こより、り０７ トグラフイーで精製し、ヒアルロニダーゼ抗体を得る。 カリクライン標識抗体 精製抗−（正常血管上皮）抗体、尿中カリクラインの等モル量を、０．１Ｍ　燐 酸ナトリウム・カリウム・バッファー、９）１６．８中で混合する。実施例１２ の方法に倣って、その抗体とカリクラインを結合する。最後の反応混合物を、２ ．５　！　５０　ａｍＳＥＰＨＡＤＥＸ　Ｇ−２００カラムで精製し、カリクラ イン共役性抗−（正常血管上皮）抗体を得る。 コラーゲン分解酵素標識抗体 コラーゲン分解酵素■　（リジン６５個）、コラーゲン分解酵素ＩＩ（リジン５ ０個）を、０．０５Ｍ燐酸バッファー、ｐＨ１Ｏに溶解する。この溶液に、無水 ジメチルフォルムアミド（１００μＩ。 ８ｍＭ／Ｌ）に溶解したｍ−マレイミドペンゾロ、イ　Ｎ−ヒドロキシスクシン イミドを加える。添加後、混合液を、３０分撹拌する。 こ（Ｄｎｎ液液、まず、ＰＢＳを溶出液にして、５ＥＰＩＩＡＩ）ＥＸ　Ｇ−５ ０カラムで分画し、精製抗−プラーク抗体で処理する。この混合液を、室温で２ 時間撹拌し、２−メルカプトエタノールを、最終濃度が２ｍＭ／ｌとなるように 加える。この混合液を、さらに３０分撹拌し、５ＥＰＩＩＡＤＥＸ　Ｇ−５０カ ラムでクロマトグラフィー的に精製し、コラーゲン分解酵素共役抗−プラーク抗 原抗体を得る。 ベータ−１抗コラーゲン分解酵素標識抗体ベータ１抗−コラーゲン分解酵素、お よび、抗−（正常血管上皮）抗体を、上記の方法によって、ゲルタールアルデヒ ドと結合させる。最終反応混合物を、２．５ｘ５０ｃｍ　５ＥＰＨＡＤＥＸ　Ｇ −２００カラムで精製し、ベータ１抗コラーゲン分解酵素標識抗−（正常血管上 皮）抗体を得る。 ■、アテローム動動脈硬化性プラー７像像法ｚ２０３Ｄ　Ｄ［’ＴＡ　結合 １、　ＤＴＰＡ（７）混合無水物の調整［Ｋｒｅｉｃｘｒｅｋ　ｘｎｄ　Ｔｕｃ ｋｅｒ、　ＢＢＲＣ。 ７７：５８１（１９７７）１ ａ））リエチレンアンモニウム−ｆＩＴＰＡ、ｌｕｍｇ＋アセトニトリル２ｍ１ ｂ）４℃まで冷却する。 Ｃ）クロロギ酸イソブチルを加える。 ｄ）　ＤＴＰＡの混合無水物が４℃で形成される２、Ｚ２［１３の修飾 ａ）　０．１Ｍ　ＮｘＨＣＯ（２ｒｌｆｌ−９ｍｏｌ）、０．４５ｍ１に溶解し た１、６９２Ｄ３ ｂ）ＤＴＰＡ（２ｘｌＧ−１ｍａｔ）のカルボキシカルボン酸無水物１５μｌを 加える。 Ｃ）室温で１時間反応させる。 ｄ　）　０．１５１１　ＮａＣ１，６Ｌにおいて、４℃で、−晩透析。 ３、　ＤＴＰＡ−２２Ｄ３の　Ｉｎ−１１１標識ａ）ｆｉ１クエン酸＋１Ｈ５， ５の　１５１μｌに溶解したＤＴＰＡ−Ｚ２Ｄ３゜０、２５ｍｇと、同じクエン 酸の等容量に溶解した　”Ｉｎ−Ｃ１３゜ｂ）室温で３０分インキュベート Ｃ）抗体結合１１１．ｎから、５ｅｐｈ＊ｄｅｒ　Ｇ−２５カラム・クロマトグ ラフィーにより、遊離成分を分離する。この　”’Ｉｎ−ＤＴＰＡ−Ｘ２Ｄ３を 、０．１５Ｍ　ＮａＣ１を用いて溶出した。排除容積における活性分をプールし 、インビボ実験に用いた。 ４゜インビボ実験 約６週令の、下行大動脈上皮を剥離したウサギの耳静脈に、ＩＩＩＩｎ−ＤＴＰ Ａ−２２Ｄ３　の０．５−１．　（１ｍｃｉを静注した。ウサギを、ケタミンお よびロンパンで麻酔し、中位のエネルギー・コリメーターを装着したガンマφカ メラ（Ｏｈｉｏ　Ｎｕｃｌｅａｒ、Ｓｉｇｍａ　４１０または１００）で視像化 した。静注投与後間もなく、および、２４時間後に、前方像が得られた。次に、 その動物に、５％エバンス・ブルーの５ｉ１を静注し、次に、ベンドパルビター ル静注で安楽死させた。 胸郭領域からの下行大動脈部分を、上皮を剥離した腹腔部の下行大動脈にたいす る正常対照として用いた。大動脈部分から、血液を除去し、内面を削出した。 これらの部分を秤量し、次に、ガンマ・カウンタでカウントした。この部分を用 いて、マクロ・オートラジオグラフィーを得た。この部分を、アンモグラフィー フィルムに当てると、１から２週間で現像を可能とした。その後、フィルムを現 像し、この部分のカラー写真を撮り、オートラジオグラフと比較した。 モノクローナル抗体による実験的アテローム動脈硬化性病巣の位置特定 アテローマ結合組織抗原にたいして特異的なモノクローナル抗体２２０３−５Ｃ ５Ｆ　（ｚｂ’　）　２フラグメントを用いて、ウサギの実験モデルにおけるア テローム動脈硬化性病巣の非浸人的視像化を行なった。この病巣は、バルーン拳 カテーテルによる下行大動脈の内皮除去次いで高コレステロールと脂肪供与によ って作つたものである。７週間後、３匹の動物に、Ｉｎ−ｌ１ｌ　２２Ｄ３を静 注した。その動物の各々に、＋−１２５ｚ２Ｄ３．　ｌ−１２５非特異的モノク ローナル抗体Ｆ（ａｂ”）２も注射した。画像は、１５分、２４時、４８時後に 記録した。正常（Ｎ）、病的（Ｌ）部分を秤量し、ガンマ・シンチグラフィーで カウントし、ダラム当りの、平均注入量％で表わした。病巣は、１匹のウサギで は、Ｉｃ−１１１１２０３で見ることができ、また別のウサギでは、ｌ−１２５ １２Ｄ３で見ることができた。摘出大動脈のマクロ・オートラジオグラフィーに よって、２２Ｄ３の取り込みは、非特異的抗体の場合よりも優ることが分かった 。Ｉｎ−１１１１２Ｄ３の取り込みは、Ｎの０．０００８土Ｑ、　ｔ１００３に たいして、ＬではＱ、［１３５土Ｌ　０００１であった。それぞれについて、ｌ −１２５２２＋）３の取り込みは、００２５と０．００５　、＋−１２５非特異 的Ｆ（ａｂ’）２の取り込みは、０．１１０８と　０００３であった。この実験 によって、モノクローナル抗体によって、大動脈のアテローム動脈硬化性病巣を 浸入せずに視像化することの実行可能性が明らかにされた。 ■６組織学法 ヘマトキシリン・ラーナー−１による組織学的カウンター染色床 試薬と供給者 無水エタノール（Ｇｏｌｄ　５ｈｉｅｌｄ　Ｃｈｅｍｉｅｘｌ−Ｐ＋ｏｏｆ　２ Ｈ）　ｏ　ヘ？トキシリン、ラーナー−１（ｓｐ　１３７７３７−１またはそれ に相当するもの）。キシレン（ＳＰ　１８６６８−４．　Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏ ｄｔまたはそれに相当するもの）　。Ｃｏｖ＋ｒｂｏｎｄマウント剤（Ｓｌ’　 ＃１１７６３９０４またはそれに相当するもの）。脱イオン水。Ｃｏｐｌｉｎジ ャー（ＳＰ　＃５７６７５−１またはそれに相当するもの）。カバー・グラス（ ＳＰ１６０２［１またはそれに相当するもの）。 染色法 試薬　操作 】、ヘマトキシリン・ラーナー−１２回浸透（各回８カウント） ２、Ｄ、ｌ水（３回）　各々１回浸透 ３．７０％エタノール　１５回浸透 ４．９５％エタノール　１５回浸透 ５、無水エタノール（２回）　各々２０回浸透６、キシレン（２回）　各々１分 ７６カバー中グラスにＣｏｖｅ＋ｂｏｎｄマウント剤３滴を落とす。 非固定凍結組織切片（５−６μ厚）、できれば切りだしたばかりのものを、−晩 、−８０℃で保存する。 牛血清アルブミン　ＢＳＡ　（Ｓｉｇｌｎａ　＃Ａ−７０３０）正常馬血清（Ｖ ｅｃｔｏｒ−Ｐｅ＋０ｘｉｄａ＋＋　Ｍｏ＋＋＋ｅ　ＩｇＧ　ＰＫ　４００２　 ）−次抗体 ビオチン牝馬抗マウス　ＩｇＧ　（Ｖｅｃｔｏｒ−Ｐｅ＋０ｘｉｄａ＋＋　Ｍｏ ｕｓｅ　ＩｇＧ　ＰＫ４００２　’） ３０％過酸化水素（Ｓｉｇ■ａ　＃ｔｌ−１００９またはそれに相当するもの） メチルアルコール皆無ノアセトニ／　（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ　１３０＋６ −４またはそれに相当するもの） ３．３′−ジアミノベンジジン−ＤＡＢ　（Ｓｉｇ＋ｎＡ＃Ｄ−９０１５）Ｔｒ 　ｉ　ｘｍａベース（Ｓｉｇｍａ　＃Ｔ−１５０３またはそれに相当するもの） 塩化ナトリウム（Ｍａｌｌｉｎｅｋ＋ｏｄ）　８７５８１　またはそれに相当す るもの） ＩＮ　ＨＣＩ　（Ｒｉｃｃａ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｏｍｐｉｎ７１３７４０　 から調整した、またはそれに相当するもの） 燐酸ナトリウム、二塩基無水物（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ　１７９１７または それに相当するもの）。 燐酸カリウム、−塩基、無水（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ　８７１００またはそ れに相当するもの） 装置 しａｂ−１ｉｎｅ周回振とう器 煙フード 蓋付き、暗色、湿潤容器 試薬調剤 燐酸バッファー整理食塩水　（ＰＢＳ）　ｐＨ７，２１Ｌ塩化ｆ　ト’Ｊ　ラム ＮａＣ１７，２ｇ燐酸ナトリウム　Ｎａ２ＨＰＯ４１，山二塩基、無水 燐酸カリウム　ＫＨ２ＰＯ４０，由 −塩基、無水 り、１．水　０．５から１ＧＯＯｆＩＩＰＢｓ　＋　０．１％Ｏ３＾、９１１７ ．２　ＬＬＢＳＡ　Ｉｇ ＰＢＳ、　ｐＨ７，２，１０１００Ｏに溶解その都度新鮮なものを作る Ｔ＋ｉ＋−ＨＣｌ／生理食塩水バッファ　−（０，０５Ｍ　Ｔ＋ｉ＋−ＨＣｌ　 ＋　０．１５ＭＮａＣ１）、ｐＨ７，６ ０，５７＋ｉｉ　ＭＣＩ　ｐＨ７，６（保存液）　Ｔ＋ｉ＋ｉｍａベースＤ、ｌ 　水、ＨＣＩに溶解する、ｐＨ７，６に調節するＤｌ、水、０５から　１０００ ｍ１ ０９％ＮｘＣｌ　（正常生理食塩水） ａＣ１ ０，１水、ｊＯｆｌｏｍｌに溶解する Ｔ＋ｉ＋　ｔｌｃｌ／生理食塩水バッファー（実行液）４、３．１の１容量を、 ４．３２の９容量と混合するその都度新鮮なものを作る ３、３′−ジアミノベンジデンテトラヒドロクロライド（ＤＡＢ）０．５％ＤＡ Ｂ　（保存液） （１ビンは、Ｑ、Ｉｇの解凍ＤＡＢを含む）Ｔｔｉ＋７生理食塩水バッファー、 ｐＨ７，６゜溶解し、１１をビンに分液し、−２０℃で保存する。 ０．０５％ＤＡＢと０．０１％Ｈ２Ｏ２実行液［ＩＡＢ保存液　１１ 丁ｒｉｐ／１（ＣＩ　生理食塩水バッファー　９１３０％Ｈ２０２４μＩ ＶｅｃＤ＋１ｉｉｎ　ＡＢＣ試薬　１滴＝５０μｍ試薬Ａ　２滴 試薬８　２滴 ＱＳを　ＰＢＳ／ＢＳＡと、１０ｍ１まで。 直ちに混合し、使用前に３０分放置する。 １芸 免疫ペルオキシダーゼ染色法 １、フリーザーからスライドを取り出し、１０分間乾燥する。 ２、振とう器上で（非常に静かに）、２０分間、ＰＢＳ／ＢＳＡで洗浄する。 注意−ｍ−この手順の後、残りの操作のいずれにおいても、切片を乾燥させては ならない。干個びは、間違った結果を生ずることがある。 ３．３％正常ウマ血清と、２０分間インキュベート。 ４、余分の血清を、切片から、吸収。 ５、切片を、適当な希釈度の１次抗体と、３０分間インキュベート。あるいは必 要なら、湿潤容器でさらに長くインキュベート。 ６、振とう器上で、ＰＢＳＩＢＳＡ中で１Ｃ分間スライドを洗浄する。 ７、切片を、抗マウス　１．ｇＧ被ビオチン化抗体（Ｐｕｓ／ＢＳＡで１５０希 釈）と、３０分間インキュベート。 ８、振とう器上で、ＰＢＳ／ＢＳＡ中で１０分間スライドを洗浄する。 ９、メタノールに溶解した０３％　Ｈ２ｏ２で、内因性ペルオキシダーゼを、振 とう器上で、１０分間ブロックする。 １０、振とう器上で、ＰＢＳ／ＢＳＡ中で１０分間スライドを洗浄する。 １１、　Ｖｅｃｌｘ＋ｔａｉｎ　ＡＢＣと２０分間インキュベート。 １２、振とう器上で、ＰＢＳ／ＢＳＡ中で１０分間スライドを洗浄する。 １３、ＤＡＢと７分間インキュベート。 １４、Ｄ、ｌ水中で、切片を５分間洗浄する。 １５、ヘマトキシリンでカウンター染色を実行。 ■、アテローム動脈硬化性プラークの治療法１、下記の特性を持っＦＡＢ２フラ グメントを、静注する（第３ＯＡ図７照）。 ａ）Ｚ２Ｄ３抗原を結合する、１個の超可変領域と、もう−っ、線維芽細胞性コ ラーゲン分解酵素前駆体のプロペプチドに結合する超可変領域を持つ、二重機能 抗体。 ｂ）２２Ｄ３抗原に結合する、１個の超可変領域と、もう一つ、好中球性コラー ゲン分解酵素前駆体のプロペプチドに結合する変動領域を持つ、二重機能抗体。 ｃ）ｚ２Ｄ３抗原に結合する、１個の超可変領域と、もう一つ、タイプＩ　Ｖ／ Ｖコラーゲン分解酵素前駆体のプロペプチドに結合する超可変領域を持つ、二重 機能抗体。 ｄ）Ｚ２Ｄ３抗原に結合する、１個の超可変領域と、もう一つ、ストロメリシン 酵素前駆体のプロペプチドに結合する超可変領域を持つ、二重機能抗体。 ｅ）上記（ａ−ｄ）４種のＦＡＢ２の混合物で、核種Ｘで標識され、ド＾Ｂ２フ ラグメント全体プールの中の微小成分を表わすもの。 ２、ＦＡｂ２フラグメント投与２４から４８時間後に、核種Ｘに合わせた、ガン マ・カメラで患者をスキャンし、標的病巣に位置する　ＦＡｂ２フラグメントの 量を推定する。これは、検出されたＦＡｂ２フラグメントの量に基づいて行なう （第３０ＢｌｉＵ１１照）。 ３、線維芽細胞コラーゲン分解酵素、好中球コラーゲン分解酵素、タイプｌ　Ｖ ／Ｖコラーゲン分解酵素、ストロメリシン酵素前駆体の適当な混合物を、静注す る。これは、標的病巣に所在すると推定゛された、受容性ＦＡｂ　フラグメント の数に比例して行なう。各酵素前駆体の小部分を、核種で標識する（第３０Ｃ図 参照）。 ４、核種ｙに合わせたガンマ・カメラを用いて、酵素前駆体混合物の投与量を次 第に増やしていき、所期の量が病巣に所在するまで行なう。所期の量とは、動脈 閉塞を除去するのに十分なほどプラークを溶解はするが、動脈瘤形成や、病状の ひどい血管に藩札を生じたりしない量である（第３０Ｄ図参照）。 ５、組織プラスミノーゲン活性因子（Ｔ　Ｐ　Ａ）を、十分な量静注し、十分な 循環性プラスミンを生じさせ、それによって、機能的酵素を、その結合プロペプ チドから切断することはできるが、滲出性出血を生じさせるほどのものではない 、その程度の量である（第３０Ｅ図）。 ６、プラークに所在する　ＦＡｂ　フラグメントから放出されると、コラーゲン 分解酵素およびストロメリシン酵素は、たタチニ、その近傍の基質に結合し、こ れを分解する。 ａ）コラーゲン・タイプ■　（好中球コラーゲン分解酵素）ｂ）コラーゲン・タ イプＩＩＩ（線維芽細胞コラーゲン分解酵素） Ｃ）コラーゲン・タイプＩＶ／Ｖ（タイプＩ　Ｖ／Ｖコラーゲン分解酵素） ｄ）プロテオグリカン・フィブロネクチン（ストロメリンン）本発明は、さらに 、下記の、具体的ではあるが、限定的ではない、実施例に即して明らかにされる 。特に断わらない限り、温度は、℃であり、％は重量パーセントである。ここに おいて実行された実施例は、現在時制で表わし、以前に実行された実験室での実 験を表わす実施例は、過去時制で表わす。 プラーク治療 代表的な治療処方としては下記のようなものがある。 １、動脈にカテーテル挿入（冠状動脈口、頚動脈、大動脈、または、末梢血管） 。 ２、造影剤による血管腔の肉眼試験。 ３、生理的に受容可能な溶液に溶解した、抗体・酵素抑制剤共役体を注入する。 ４、十分なりリアランス時間を与える。 ５、生理的に受容可能な溶液に溶解した、プラーク抗体、酵素共役体を注入する 。ただし、この溶液中で、酵素は活性を持続するものとする。 ６、十分な時間循環させ、局所循環させる（例えば６０分）。 ７、Ｘ線透視下で、造影剤による、血管内膜および／または中膜の肉眼試験。 ８、血管腔の回復が満足いくまで、手順５−７を繰り返す。 ９、生理的に受容可能な溶液に溶解した酵素抑制剤を注入し、いずれの処置にお ける酵素といえど、すべてその反応を停止させる。 １０、数分後、または、試薬のクリアランス後、手順７を繰り返す。酵素による 血管のこれ以上の減退が見られなくなったならば、操作を停止する。さもなけれ ば、手順９．１ｏを繰り返すか、あるいは、ＩＶによって抑制剤を導入する。 討論 アテローム動脈硬化症は、本発明によって明らかにされた、アテローム動脈硬化 性プラーク特異的抗原が、１個以上存在するという特性を持つ。免疫反応は臨床 的な性質を持つものであるから、プラーク抗原、または、この抗原に特異的に結 合する抗体のどちらかが、いずれかの時点で検出できるようになろう。 したがって、該抗原またはそれに対する抗体の存在は、アテローム動脈硬化性プ ラークのあることを示している。第５図は、３５才未満の正常人と、冠状動脈疾 患（ＣＡＤ）と診断された人との間で、その血清に見られる、アテローム動脈硬 化性プラーク抗原にたいして特異的な　ＩｇＡレベルを比較したものである。 図に示されているように、３５才未満の２０７人の内の７０人、３５才以上の正 常人コ、２１人の内の２１人が、その血清中のＩｇＧレベルが上昇していた。正 常人とは、ＣＡＤと判定されない、見かけ上健康な人と定義される。第６図は、 ３５才を越える正常人と、ＣＡＤにかかつている人とで、その血清中のアテロー ム動脈硬化性プラーク特異的抗原のレベルの比較を示す。 Ｉ　ｇ　Ａ　レベルの場合と同様、アテローム動脈硬化性プラーク特異的抗原に 特異的に結合する　ＩｇＧレベルも、ＣＡＤ患者が高かった。ＣＡＤにかかって いる人については、１２５人調べた内、４５人が、抗原が上昇しているのに、３ ５才未満の正常人では、２５人の内たった４人が、３５才を越える４９人の正常 人では、８人が、抗原レベルの上昇を示したにすぎなかった。 発現した抗原の量を、年齢と、病気の重度との関数として調べた。′＄７図は、 見かけ上健康な人の、抗原レベルと患者年齢との関係をプロットしたものである 。一方、第８図は、その冠状動脈の５０％以上が閉塞している患者について同じ プロットを示しており、第９図は、低度のＣＡＤを持つ人について同じプロット を示したものである。グラフに示されているように、血清中の抗原の量は、ＣＡ Ｄの重度よりも、年齢にたいする依存度の方が低い。したがって、アテローム動 脈硬化症は、アテローム動脈硬化性プラーク特異的抗原の存在によって指示され る。 アテローム動脈硬化性プラーク抗原に特異的に結合する抗体の頻度は、正常人で は、年齢と共に増加するようである。しかしながら、この増加は、ＣＡＤ患者に 見られる抗体レベルと比べると小さい（東１０−１４図）。 第１５図は、年齢でグループ化した場合の、抗原にたいする陽性頻度を示す。調 べた人は、３１才から７５才までであった。 アテローム動脈硬化性プラーク抗原に関する初期の研究では、ヒト・アテローム 動脈硬化性プラークの燐酸バッファー生理食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ）による抽出物を 対象にしていた。次に、この抽出物を、ＨＰＬＣ−ＤＥＡＥ分画法にかけ、画分 について、それが、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）患者から得た血清と反応するかどう かをテストした（第２図膠原）。空白容積の直後に溶出した両分に大量の結合が 存在した。正常血清の存在下では（すなわち、ＣＡＤのない、３５才未満の患者 から得たものでは）、抗原・抗体結合は無かった。 カラムの排除容積の直後の画分は、ＣＡＤ血清にたいして最高度の結合を示した ので、これを、Ｂ１１ｂ　Ｃマウスにたいして用いた。抗体を産生じたマウスの 膵臓細胞を次に、永久分裂性細胞系株ＳＰ２と融合した。このような融合によっ て、バイブリド１５Ｈ５が得られた。 次に、１５８５モノクローナル抗体を、セファローズ・アガロースに共有結合さ せた。この同相支持体・抗体複合体は、各種標本中の抗原レベルを定量する多く のアッセイで用いた。さらに、ヒト・アテローム動脈硬化性プラークからＰＢＳ 抽出したものを、１５Ｈ５モノクローナル抗体・同相支持体複合体と接触させる ことによって、他の抽出材料からの自己抗原を除去することができた。次に、得 られた複合体を洗浄し、精製自己抗原を、この複合体から溶出した。 第１表 特性　抽出プラーク　抽出血清 １、冠状動脈患者血清と反応する　＋　＋２、１５１１５　Ａｈと反応する　＋ 　＋１７１１３　Ａｂと反応する　＋　＋ ２２Ｄ３　Ａｈと反応する ＱＩＯＥ７　Ａｈ　と反応する ３、１時間煮沸後の免疫反応性　＋　＋４、トリクロロ酢酸にたいする溶解性 ５、トリクロロ酢酸溶解後の免疫活性 ６、ＴＦＡ後の免疫活性　＋　＋ ７、ＴＦＡと加熱後の免疫活性 ８、ゲルふるいクロマトグラフィーによる推定分子量＞５００．０ＯＬ　＞５０ ０．０００ ９、イオン交換クロマトグラフィー、イオン交換ゲルによる分子荷電 −ＤＥＡＥセファロース −ＱＡＥセファロース 一３ｏｌ！ｏｐｒｏｐＹｌ　１ｅｐｈａｒｏ＋ｅｎｅｕｔ＋ａｌｎｅｕｔｒａ１ ０、グリコシダーゼ感受性　ごくわずか　ごくゎずか１１、蛋白質分解酵素への 抵抗性　十 １２、アセトンで沈澱　あり　あり １３、クロロフォルムで抽出可能　否　否１４、検出可能な１次アミノ基　否　 否１５、Ｂ４．　吸収　なし　なし １６、カオトロープ、ＳＤＳまたはアルキル化・還元にたいする感受性 否　否 １７、過ヨウ素酸処理にたいする感受性あり　あり １８、尿素にたいする感受性　否　否 抗原の特性をさらに明らかにするために、その抗原に特異的に結合する抗体およ び抗原を、アテローム動脈硬化性プラークに見出された色々な成分と反応させた 。 第２表、精製１５Ｈ５抗原との、抗−血清、モノクローナル抗体アポ脂質蛋白質 Ａ−１ アポ脂質蛋白質Ａ−１１ アポ脂質蛋白質Ｂ アポ脂質蛋白質Ｃ−１１１ アポ脂質蛋白質Ｅ ヒト・コラーゲンφタイプＩＩ＋ ヒト・コラーゲン・タイプ１ｖ ヒト・コラーゲン・タイプＶ ヒト・コラーゲン・タイプＹｌ ビトロネクチン 第２表に示したように、アテローム動脈硬化性プラークの各種成分に特異的に結 合する抗体は、１５Ｈ５には結合しない。これは、抗原が、第２表に挙げた成分 の一つではないことを示している。 この抗原の特性をさらに明らかにするために、この抗原を、各種酵素と反応させ 、抗原が分解されるかどうかを調べた。蛋白質分解酵素、デオキシリボヌクレア ーゼ、リパーゼ、リボヌクレアーゼは、１５）１５抗原を分解しないことが判明 した。しかしながら、１５Ｈ５抗原は、一部、ある種のグリコシダーゼ、特に、 α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グリコアミラーゼによって分解された。この ことから、１５Ｈ５抗原は、炭水化物的性質を持つ構造を含むことが明かである 。個々の酵素について得られた結果を第３表に示す。 第３表、酵素と、１５Ｈ５プラーク抗原との反応性酵素　反応性 蛋白質分解酵素 Ｂ＋ｏｍｅｌａｉｎ コラゲナーゼ（Ａｃｈ＋ｏｍｏｂａｅｔｅ＋　）コラゲナーゼ・ディスパー七 コラゲナーゼタイプＩ コラゲナーゼタイプ■ コラゲナーゼタイプ■ エンドプロテイナーゼＥ エンドプロテイナーゼＬ！ｌ−Ｃ 蛋白質分解酵素に ブドウ球菌蛋白質分解酵素￥−８ グリコシダーゼ類 コンドロイチナーゼＡＢＣ コンドロイチナーゼＡＣＩ コンドロイチナーゼＡＣｎ コンドロイチナーゼＢ α−ガラクトシダーゼ エンド−α−Ｎ−Ａｃｅｔｙ１ｇａｌａｃｔｏ＋ａＩｎｉｎｉｄａｓｅエンド− β−ガラクトンダーゼ β−Ｎ−Ａｃｅｔ７１ｈ＋ｒｏ＋ｅｘｍｉｎｉｄａ＋ｅドアセチル−Ｄ−ｇｌｕ ｃｏ＋ａｍｉｎｉｄａｉｅエンドグリコシダーゼＤ エンドグリコシダーゼＦ エンドグリコシダーゼＨ その他 デオキシリボヌクレアーゼ リパーゼ（細菌） リパーゼ（酵母） リボヌクレアーゼ 抗原の特性をさらに明らかにするために、自己抗原にたいして結合するレクチン の測定を行なった。例えば、Ｃｏｎａｖａ１口ｅｎｓｉｆ：、Ｔ＋ｉｉｉ＋ｕｍ 　ｖｕｌｇａｒｉｓは、１５Ｈ５抗原にたいして強い結合性を示したが、Ｌｉｎ ｔ　ｃｏ１ｎａｒｉ＋、Ｒｉｃｉｎｕ＋ｃｏｍｍｏｎｉｓ　。 Ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂａ＋　ｐａ＋ｐ！Ｉ＋ｅａｉ　は中等度の結合性を示 し、その他のレクチンは、結合性を示さなかった。この結果を、第４表にレクチ ン　プラーク抽出抗原 Ａｒ１ｅｈｉ＋　ｂｙｐｇｓｅｘ　（ビーナツツ）ＢｘｎｄｅｉｒＩｅｇ　ｔｉ ｍｐｌｉｃｉｔｏ１日Ｃｏｎａｖｘｌｉｘ　ｅｎｘｉｆｏｒｍｉ＋’（Ｃｏｎ＾ ）＋＋＋Ｄｏｌｉｅｈｏｘ　ｂｉｆｌｏｒｕｓ　（Ｈｏ＋ｉｅ　ｇｒａｍ）Ｇ１ ７ｃｉｎｅ　ｍａｘ　（大豆） Ｌｅｎｓ　ｅｕｌｉｎａｒｉ＋　（いんげん）＋＋Ｌｉｍｕｌｕｓ　ｐｏｌｙｐ ｈｅｎｕ＋　（Ｌｉｍｕｌｉｎ）Ｐｈ＊５ｅｏｌｕ＋　ｗｕｌｇｘｒｉｓ−Ｅ　 （植物ヘムアグルチニン）Ｐｈｓｓｅｏｌｎｓ　ｙｎ１ｇｘｒｉ＋−Ｌ　（植物 ヘムアグルチチン）Ｐｉｃａｓ　５ｘｊｉマｌＩｍ（なし）Ｒｉｃｉｎｕｓ　ｃ ｃｍｎｏｎｉ＋　（ＲＣ＾１）＋＋５ｏｐｈｏマ！１ｎｏｎｉｅ’ｓ　（えんじ ゅ）Ｔｅｌ＋ａｇｏｎｏｌｏｈｕｔ　Ｈ＋Ｈ＋ｅａｓ　（はす）＋＋Ｔ＋１ｊｉ ｅｕｉ　ｖｕｌｇｘｒｉｓ　（麦芽〕＋＋ＹＵｌｅｘ　ｅａ＋ｏｐａｅｕｓ　（ ＵＥＡ−りＵｌｅｘ　ｅｕｒｏＢｅａｓ　（ＵＥＡ−１１１Ｙｉｃｉａ　ｒｉｌ ｌｏｘａ　（１＋ｏｌｅｃｔｉｎ　Ｂ４１抗原は、また、２Ｍトリフルオロ酢酸 を用いて、１０４℃で、４時間加熱して加水分解を行い、次に、炭水化物分析を 行なって、その特性を調べた。（結果は、実験の詳細の節、ヒト血漿抗原の炭水 化物分析に示す。） 上記により、アテローム動脈硬化性プラーク抗原の、炭水化物特性は、第２０− ２２図に示される。 ハイブリドーマ　１５Ｈ５，２２Ｄ３．　ＱｉＧＥ７．　１７Ｈ３によって産生 されう抗体について、各種組織にたいする結合性をテストした。これは、抗原が プラーク特異的であるかどうかを調べるためである。このテストの結果は、実験 の詳細の節、組織学検査法に記載されている組織学法を用いて行なったものであ るが、それを、第５表に示す。第６表はさらに、交差反応性、および、ＣＡＤ血 清中の抗原の抑制を以て、抗体の特性を明らかにするものである。実際の抑制測 定結果を、第２５図に示す。東２６図は、ＣＡＤ血清の代わりに、モノクローナ ル抗体を用いた時の、結合抑制の作用を示す。 第５表、モノクローナル抗体の免疫組織学的スクリーニング組織　１５ｔ１５　 Ｚ２Ｄ３　Ｑ１ｔｌＥ７　１７１’１３小脳　２−３＋零 大脳皮質　−２−３＋本 延髄　−１−２＋事 末梢神経 横隔膜 膵臓　−３−４＋本１−　± 結腸 卵巣　−１−２＋本ｂ　− 冠状動脈病巣 一初期病巣　士−１＋　± −発達病巣　±　３−４十　−±−１＋正常動脈　４＋ ＊　細胞内染色のみ ａ　線維筋細胞のみ ｂ　黄体細胞のみ Ｃ皮脂腺のみ 第６表、モノクローナル抗体の特性 １５Ｈ５２２Ｄ３　Ｑ　１．　ＯＥ　７　１７Ｆ１３異性型　１ｇＭＩｇＭ　Ｉ ｇＧ　［ｇＭｐｉ　ｆ５．２−　（５，０−（５，１−（４，５−５，９）　５ ．７）　５．８）　５．１）自己抗原反応性　＋　＋　十 〇［１３抗原反応性　十 ＱＩＱＥ７抗原反応性 自己抗原特異的ヒト抗体の抑制 見かけの結合定数　１０９１０９？１０１０大脳皮質 硬膜 末梢神経 心臓 肺 気管 気管支 胸 胸筋 食道 横隔膜 膵臓　土木２ 結腸 卵巣　＋＊ａ 子宮 腎臓 膀胱 直腸 腹筋 リンパ節 皮膚　土木Ｃ 冠状動脈 一病巣　十 −正常動脈 大動脈 ＊　細胞内染色のみ ａ　線維筋細胞のみ ｂ　黄体細胞のみ Ｃ皮脂腺のみ 最後に、第３１−３５図は、１２Ｄ３．　ＱＩＯＥ７　抗原＜７）組ｍ学的特異 性を、組織学的に示したものである。第３１図は、ウサギ大動脈におけるアテロ ーム動脈硬化性プラークにたいする２２Ｄ３抗原の特異的結合を示す。非プラー ク領域には、染色部が無いことに注目されたい。第３２図、３３図は、死後に入 手した、ヒト冠状動脈の未固定切片における　２２Ｄ３抗体の特異的結合を示す 。非特異的染色のほとんどないこと、対照切片においては、すなわち、非特異的 モノクローナル抗体で処理したものであるが、そこには、染色部が無いことに注 目されたい。 第３４図の三つの写真は、動脈の連続切片からのものである。 第３４図は、ｚ２Ｄ３が後期のプラーク抗原を認識し、ＱＩＯＥ７・が初期段階 のプラーク抗原、または、動脈の正常断面を認識することを、明らかに示してい る。３４Ａ図は、Ｚ２Ｄ３の結合部が閉塞域にあることを示す。 第３４Ｂ図は、ＱＩＯＥ７の結合部が、ｚ２Ｄ３による染色部の反対領域にある こと、すなわち、アテローム動脈硬化症の初期段階ないしまだ正常な動脈に見ら れることを示す。第３４Ｃ図は、非特異的モノクローナル抗体を用いると、結合 が見られないことを示す。 第３５図は、ウサギ大動脈における、Ｉｎ−標識ｚ２Ｄ３のインビボ結合を示す 。この大動脈は、アテローム動脈硬化性プラークを生ずるように処置されたもの であった。この大動脈の非処置部分は、はんの痕跡的な結合しか示さなかった。 ウサギにおける　２２Ｄ３のインビボ結合から、本発明の抗体をインビボで使用 するのは、人の治療、画像化において有用であることが示された。これは、特に 、第３２−３４図に示した、ヒト冠状動脈の染色結果から支持される。 匿コ「ｉ １”ｉｇｕｒｃ　１　（４に、　９） 信号／雑音（ＣＡＤ／正常） Ｃ１ Ｆｉｇｕｒｅ　５　ＣＡｏ　３５　才未ｍ　ａ　ｓ　才ａｍα口／２０７）　（ ４／ａ５）　（２１／１２１）Ｆｉｇｕｒｅ　６　ＣＡＤ　３ｓ才未満　３５才 超越（４５ハツ）　（４／２５）　（！ｌ／４９）？１表千５−５００３０７　 （５０） 滅 滅 滅 滅 チャンネル８　注入　ｅ９θ８７９　ｉｉ富４］９］＜ｙｎｃ。 神 ＦｉｇｕｒＱｎ ”　ＳＷ　ｖ／ｂｏｄ７　ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ　ＩＩ−からのデータ。９８％目 。 Ｆｉｇｕｒｅ　２３ ”　ｓｖ豐／ｂｏｄｙ　ｄｉｍｅｎ＋ｉｏｎ＋　ＩＩ”からのデータ。１００％ 目。 Ｆｉｇｕｒ雷　２４ １：１０　１：２０　１：４０　１：８０　１：１６０．１ヨ＠２５　ＨＣに血 清希釈 ２０　１０　５　２．５　１．２５ ＭＡｂ　（μｇ／ｍｌ） Ｆｉｇｕｒｅ　２６ Ｚ２Ｄ３．０１０Ｅ７抗原の精製 〒８門−１．＆１ｍ１ｌｌｌル綽−ｐニーｈすＦｉｇｕｒｅ　２７ Ｆｉｇぽ＠３０Ａ れｇａｔｅ　３０Ｂ Ｆｉｇぽ・３０Ｃ ＦｉｇＬｆｅ　３Ｃ［） Ｆｌｑぽ・３０Ｅ ？１９ｇｏ　３２Ａ 〜゛ Ｆｉｇ車１３２Ｂ Ｆｉ穀１３シ Ｆｉｇｕｒｅ　３３Ｂ 、、　、　−’Ｊ ｒ鈎す（ル ｔ１兜（＠　３４Ｂ 特許庁長官　深　沢　亘　殿　平成４年１月３１日日１．特許出願の表示　ＰＣ Ｔ／ＵＳ　９０１０４２７２２、発明の名称　アテローム動脈硬化性プラーク特 異的抗原、それにたいする抗体、およびその使用　− ３、特許出願人 住　所　アメリカ合衆国、カリフォルニア、メン口・パーク、ハミルトン・コー ト・１０１４ 名　称　ベイシカ− ４、代　理　人　東京都新宿区新宿１丁目１番１４号　山田ビル５、補正書の提 出年月日　１９９１年８月１２日５３１ｊ紙１ この抗原はさらに、アポリポ蛋白質、ヒト・コラーゲン、フィブロネクチン、ケ ラチン、ラミニン、テナシンおよびビトロネクチンに結合する抗体にたいして非 反応性であるという特性を持つ。 本抗原のその他の特性には次のものがある。抗原を１時間沸騰させた後でも、ハ イブリドーマ１５Ｈ５（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ９８３９　）の産生ずるモノクロ ーナル抗体にたいして反応性を示し、また、抗原を、燐酸緩衝溶液に溶解した８ Ｍ尿素で室温で２４時間処理した後、燐酸緩衝溶液に溶解した６Ｍ塩酸グアニジ ンで室温で２４時間処理した後、２Ｍトリフルオロ酢酸で室温で３０分処理した 後、燐酸緩衝溶液に溶解した３、５Ｍチオシアン酸ナトリウムで室温で８時間処 理した後、または、燐酸緩衝溶液に溶解した０、１９Ｍドデシル硫酸ナトリウム で室温で１時間処理した後でも、ハイブリドーマ１５Ｈ５（ＡＴＣＣ受託番号Ｈ Ｂ９ｇ３９　）の産生ずるモノクローナル抗体にたいして反応性を示す。 本発明はまた、アテローム動脈硬化症およびある種の正常組織と関連する抗原、 ないし、エピトープを提供する。この抗原は、ハイブリドーマ１７１’１３　（ 入ＴＣＣ受託番号）！８１０１８９）産生のモノクローナル抗体に選択的に結合 すると０う特性を持つ。 もう一つ別の抗原をも、本発明は提供する。この抗原は、アテローム動脈硬化性 プラーク結合組織およびプラーク平滑筋細胞によって合成される、または、該組 織および細胞中に存在するもので、ハイブリドーマＺ２Ｄ３　（＾ＴＣＣ受託番 号ＨＢ９８４Ｇ＋、まタハ、バイブ’Ｊ　Ｆ　−７ｚ２Ｄ３／３Ｅ５　（ＡＴＣ Ｃ受託番号ｔｌＢ　１０４１１５）ノ産生するモノクローナル抗体に選択的に結 合する脂質含有性分子であるという特性を持つ。この抗原はさらに、アセトン処 理で破壊された組織学的染色法に使用できるという特性を持つ。 月１　紙　２ 不溶性支持体として利用できるその他の材料としては、上記ポリマーのラテック ス類、シリカ・ゲル、シリコン、ウェーファー類、ガラス、紙、不溶性蛋白質、 金属類、半金属類、金属酸化物、磁性材料、半導体材料、サーメット類、などを 挙げることができる。さらに、ゲルを形成する物賀、例えば、ゼラチン類のよう な蛋白質、リポポリサッカライド類、ケイ酸塩、アガロース、ポリアクリルアミ ド類、もしくは、デキストラン類のようないくつかの水相を形成するポリマー類 、ポリアルキレン・グリコール類（２−３個の炭素原子を含むアルキレン）、ま たは、表面活性剤、例えば、燐脂賀類、長鎖（１２−２４炭素原子）アルキル・ アンモニウム塩等のような、両性化合物がある。 ある診断用支持体は、ポリスチレン、スチレン・コポリマー類、または、ポリエ チレンないしポリプロピレンのようなポリオレフィン類、並びに、アクリレート およびメタクリレート・ポリマーおよびコポリマーから成る。抗プラーク試薬抗 体またはプラーク抗原は、吸着、イオン結合、ファンデルワールス吸着、静電結 合、または、その他の非共有結合によって、不溶性支持体に結合させることがで きる。あるいは、共有結合によって、不溶性の支持体に結合させることができる 。本性にとって特に有利な支持体は、多数のウェルを持つマイクロタイタープレ ートで構成される。ウェル表面、または、その中に挿入されるプラスチック・カ ップを、抗原ないし抗体の支持体としてもよい。 国際調査報告 にズ／ＩＢＸｌｌ’０６Ｚ７２ ＩＴ　ｒｌ、＋ｔｍＩ＋：′＋１−３４．　〕訃１９　Ａｎｄ　ＩＲＪ　Ａｒｅ 　ｄｒｌｌｂｎ　ｊ＋＋　４ｎ　Ａｎｔｉｂ＋ｓｌ）　Ｉｎｌ＋１ｌＳｑｐ＋＝ ＊　Ｊ３！＋　ａｎｄ　Ｊ３６ＴＴＴ　Ｃ１４１１＋１！！　１’ｌ’４７　ｄ ｌｌｄ　Ｊｎ−Ｊ２　ａｒｅ　＋１ｒＡｋＴ＋　ｊ＋’＋　Ａ　ｒｌ！ｅｌ）Ｉ Ｉｔｌｉｎ`ｎｔ ＧＸ＋１）’ｐｌＰＵ＋ｔｉ＋ＩＰ！　ｉｎ　ｔ゛１ａＩＩ１１９３５てＶ　（ ’１４ｔＪＩＩ愕　Ｊｌ−Ｊ’ｌ　Ａｒｅ　ｄｔＡＷｎ　ｒｒｔ　−Ｉｎ　Ａｎ ｔ、Ｌｂ＋Ｘｔ’ｌ’　ｌ］ｔ　Ａｎｊｉｑｌｌｎ@Ｋｌ）ｕｎｄ　ｔリ　Ａ ｇｕｉｌｄ　＊＋＋ｐｐｒ＋ｒｔ　Ｉｎ　ｃｌｓＦＩｓ　Ｊ３６１’ＴＴＴ　Ｃ １ｎ１ｍ５　＋１１１−１２’＋　＋ｎｄ　１１１１−１１フ　ｓｒｓ　ｄｒａ ＋ｗｎ　ｔｏ　４　ｔＪＡｇｑ＋＋ｒ、（ｎ■ ｄ１ａｃ３ｎ（１１１＋ｉｒ　１ｍ１１ｇ１ｎｇ　ｌｎ　ｃ３ｓ＋＋ｓ＋ｕｅｓ ＋　４３６　ｈｎｄ　８ＳＮＴ　ｍｌ、＜ｔｍ　１５２　ｂ＋　ｄｒ＋＋ｗｎ　 ｔ＋＋　Ａ　ｐｔ＋ｓｒｍａｅ＊ｕｒｔ＋＝ａｌ　ｌ：＋ａｍｐす５ｉｊｌｏｎ 　ｉｎ@＋４ｓｎｓ Ｘτてｔ　Ｃ１Ｃ１５ｔ　１６Ｑ−１７４、＜ｎｄ　１７Ｒａｒｐ　＋１ｒａｖ ｎ　ｒｏ　４　ｒｅａｇ＊＋＋ｔ　ｆ＋＋ｒ　ｄ＋＋１−＋窒kｎｇ ｐｌａｇｕ＠　ｉｎ　ｃｌａｓＩＩｅｓ　Ｊ２４１Ｊ１５ａｎｄ　４３Ｆ＋＜Ｔ Ｖ　（，１５４ｍ＊　ｔ７＋−１７７ｓｒｐ　ｄｒ＊＆、ｎ　ｔ−＞　Ａ　ｅ＋ ＊ｒｈＯｄ　ｆ＋＋ｒ　ａｈｌａｒ、ｉｎｇ　ｐｌａｇ浮■@ｔｎ ｃＩＡ＊Ｆ＋ｅｓ　Ｊ２Ｊ、Ｊｌ５５ｎｒｌ　Ｊ、ＩＡｗ　ｒｔＡｉｖ＋　１７ ９−ｔｌＲＩ　Ａｒｅ　＋ｌｒｓｗｎ　ｒｒｔ　Ａ　ｒ？Ａｑ＊ｎＦ　Ｃ１ｙｒ 　ｒ、ｒｓｓｔｉｎｇ、＋ｔｌ＋１＋ｒ＋＋＝＋ｒｌｐｒ＋、＋ｓｉｇ　’Ｉ　 ｃＪａ＋ｕ＋ｅｓ　４２４．　４３５ｓｎｃｌ　Ｊ：ＩＦ１ＰＣτβ！！！９０ １口４２］２ Ｉｎｌ＃１ＩＩｌｌ自ａＩＩａｌ＾ｏｏｌｌｅ自−”’”’ｗ”ｒｎ＞ｔｒｖ、 ｍIn the 1500 dilution solution of [lingame, CA,], stir gently. The mixture was incubated for 3 hours. This plate was then washed with casein buffer. - and then three times with TBS. Next, place the washed plate in the substrate solution. immersed in liquid. This solution contains 31 g/l of 4-chloro naphthol. - Contains 8 ml of solution, 32 ml of TBS, and 2 QuL of 30% H202. The plate was developed for 10-20 minutes and rinsed with deionized water to stop the reaction. developing Although the spots were seen in the moving phase line of the z2D3 plate, they were caused by non-specific anti-antibodies. Nothing was seen on the body plates. The 22D3 antigen appears to be a small, lipid-containing molecule. This is normal acid hydration Probably neutral lipids rather than sphingolipids because they are resistant to degradation. Or perhaps protein-lipid. Dissolved in ethanol or other organic solvents. The various antigen fractions obtained were prepared as a 100 uL sample, Ia+mulon 4 Microtitration plate (D7nal!eh, Chinlil17. lla,) of evaporate the organic solvent by gently blowing bottled nitrogen or air into the wells. I set it. Next, this dry plate was washed with casein/TBS solution (washing buffer). It was treated with 200 uL for 1 hour and blocked. Next, wash this plate 4 times. 10 fl of 5 ug/mL 22D3 antibody diluted with washing buffer A uL aliquot was added to each test well. Cover the plate and incubate at 37°C for 1 hour. Incubated. Wash the plate 4 times and add goat anti-mouse IgM peroxy 100 uL of a 1:100 dilution of Dase Conjugate (conjugate) was added. plate It was incubated for 1 hour at 37°C and then washed. TMB substrate of LOOuL (Kirkegaard and ['er+7. G aijhersburg. MD, ) was added to each well and incubated for 1 hour at room temperature. 50aL IM HCl was added to each well to stop substrate degradation and the plate was placed in a Molec nlxr Devices ELtSA reader (MolecularDe tice3 Mealo Park, CA), 450 nm reading and Ta. One of the advantages of not covering this antigen is that the altered antigens directly involved in arterial lesion formation Its scientific utility is that smooth muscle cells can be labeled. Applicant's animals Experiments have shown that smooth muscle cells undergo a transition from normal to pathological, similar to that seen in atherosclerosis. From the initial stage to the terminal stage, it can be observed using immunohistological techniques. That is clear. Benefits of identifying this molecular marker of atherosclerotic plaque Another advantage is that this allows the development of new diagnostic and therapeutic reagents. This is associated with coronary and/or cerebrovascular atherosclerosis. Helps improve clinical treatment for distressed patients. This type of drug is not used in nuclear imaging. Fab fragments labeled with nuclides such as technetium, or or forms of imaging agents, including those labeled with paramagnetic molecules used in MRI imaging. take a stance. Targeted therapeutic reagents are, for example, neonates, which are construction is possible. That is, the molecule has antibody-like, targeted enzymatic activity, This regulates the breakdown and reduction of the connective tissue content of atherosclerotic plaques. This removes local arterial occlusion and prevents myocardial infarction and/or stroke. (Kije3 M,, Techniques of Lipidolog 7 (Eli! tier, New York, ed., 2. 1986)). Method 2 Tissue processing and antigen solubilization were performed as described below. 1. Atherosclerotic arteries were obtained from human cadavers 24 hours after death. 2. Extract the sample and add 20mM PBS/G, 15M NtC1 /pH7,3/0. 02%N5N3 (Pus) was replaced and washed many times, and the blood Remove ingredients. 3. Lesions are frozen at -80°C until use. 4. When you are ready to treat the lesions, remove them from the freezer at -80°C. , thaw at room temperature. 5. Rinse the thawed lesion with cold PBS to separate atherosclerosis from normal arterial remnants. Carefully exfoliate and maintain the inflammatory lesions. Discard arterial residue. 6. Weigh and record atherosclerotic lesions. 7. Using sharp surgical scissors, chop the lesion into 5 x 5 mm pieces. 1g of lesions Add 2 ml of 8M urea and keep moist in 8M urea at room temperature (RT). 30 Poi7t+on for seconds. 8. Homogenize the focal fragment in 8M urea at RT. At this time, 1 Add 2 ml of 8M urea to the lesion in g. Polytron treatment for 30 seconds. 9. t mod z*-to, 15. 00ORPM, 10-15℃, heat for 30 minutes do. Retain the supernatant and discard the lipid layer. 10. Resuspend the pellet in 8M urea (2ml/gm) and homogenize again for 30 seconds. Enate. 11. Step 9 as necessary. Repeat 10 times and pool the supernatants. 12. If you do not then perform the remaining purification steps, remove the plaque supernatant. Branch and freeze at -80°C. Preparation of plaque extracts fractionated on C+CI gradient 1. Samples were added to 8M urea extract. Add 1.5 g of C+CI per 11 to make 3M CsCl. C+CI Stir until dissolved. This took approximately 30 minutes. (Mixing is an exothermic reaction. 3M C+C1/sample is initially in a semi-dissolved state. C+CI becomes a solution Continue stirring until the mixture is mixed. ) Place 2-3M (+CI/sample solution) in a centrifuge tube and cap. Take care to completely fill the tube with liquid and seal it tightly. Place the tube in a TM01 o-tor (Bsckman). 3. Spin in a Beckman centrifuge at 8°C, 5G, and GOOrpm for 65 hours. . 4. At the end of the operation, remove the tube from the rotor and pump the bottom of the tube using a peristaltic pump. Carefully pump out the concentration gradient solution. Collect the same fractions from each tube. correspondence Pool the fractions. Fraction 1 is the bottommost fraction; It is. 5. Store each fraction at -80°C until needed. [)EAE ion exchange chromatography 1, C+CI fraction number 1 (X2 [1 3) or fraction number 2 (QIOE7) (f) A, 20! IM Tris -HCl/7M urea, 3500M for pH 7.5! using a tube, Dialysis was performed and the dialysis results were so, ooo times as large. 2. Quantify O and D of the sample. 3. Appropriate 1o-Gel DEAE-5-PW tlPLc column (Bio- Load the sample into the Rid). Analytical column = 1mH protein loading range Semi-preparative column = 10150mg Protein loading range 4, elution buffer was 20mM Tris-HCl/'7M urea, l IH7,5 (A) and 20mM hlis-)IC+/7M urea/LM NaCl , pH 7.5 (B). 5. The elution spectrum programmed into the HPLC is as follows. analytical column Time Flow rate (ml/mln) %A %B Gradient characteristics 0 1. 0 100 0 straight line 5 1. 0 100 G straight line 35 1. 0 50 50 straight line DEAE column for semi-preparative use Time Flow rate (ml/mln) %A %B Gradient characteristics 0 4, Q IGOQ Direct line to 4. 0 100 0 straight line 55 4. 0 50 50 straight line 6. In the analysis run, collect 1 ml fraction, and in the semi-preparative run, collect 4 ml fraction. collect. 7. Transfer 50 μL of each sample from each tube to 20 mM Tris-IICI/3. 5M urea, pi (diluted with 7.5, microtiter plate corresponding to the collected container) was used to coat the wells on the plate. Incubate the plate overnight at RT. mouth 8. Plates were tested using the ELISA method described above for z2D3 activity (C+ CI fraction number 1) or QIOET activity (CsCl fraction number 4) was quantified. figure See c. 9. Select a test tube whose contents give a positive ELISA signal for the antigen in question. Pooled together. 10. This mixture containing Z2D3 or Q10E7 antigen was injected into 20111M Tris. -HCl10. Dialyzed against 15M NlCl, pH 7.4 to remove urea did. Dialysis tubing with 3500 MN pores was used. affinity chromatography 1. Add antigen-containing mixture to agarose gel and incubate with z2D3 or QIQE7 model. Bind to a noclonal antibody (depending on which antigen is being purified). 2. Gently mix this agarose gel/antigen mixture on a shaker overnight at 4°C. do. 3. The gel is then loaded onto an appropriately sized glass column. 4. Add 20 times the volume of the gel to 2 (1 mM Tris-1 (+, l/11. Wash with 15M NIC1, pH 7.4 (Tris). 5. Antigen, 0. Elute with 1M hydrochloric acid glycine buffer, pH 2.5. 6. Dialyze the eluted antigen against Tris buffer. Gel size measurement 1. The affinity-purified antigen is 10. Has 00011W filter Concentrate with Amleon concentrator. 2. Add concentrated antigen to 0. Filter using a 45μ filter to remove 0. 1M potassium phosphate ・Blo-3il TSK-400 color equilibrated with buffer, pH 7.0 column (Z2D3 antigen), or Blo-3il TSK-250 column (QIO E7 antigen) (Bio-3il columns are commercially available from Bio-Rid). ). 3. The main molecules of the 22D3 antigen were analyzed on a Blo-3it TSK-400 column. It is eluted above 20θ, 0011 MW. Q10E7 antigen is B lo-8°C in one 5K-250 column, 150. When exceeding 000 MW It is eluted with a roller. ■Characterization of atherosclerotic plaque antigens with lectins and commercially available antibodies. Joint research affinity-purified atherosclerotic plaque antigens into polystyrene microspheres It was coated on titration plate h (1 minlon II). sample, lG OmM NaPO4/400mM NaCl/pH 6,9 diluted to 1001 , 100 μm were placed in each well and incubated overnight at 4°C. Rinse the plate, then add 11% Trijon! -100 and 005 % Tveen-20 (for lectin research) or casein buffer (commercially available) (for antibody research). Biotinylated lectin (Vector or SIg (obtained from lllll) to a final concentration of 1-10 μg/ml, and It was placed in a well coated with terror antigen and left at 37°C for 2 hours. binding lectin is the ABC of avidin peroxidase conjugate (VectorLxb+) ) was used for detection. Commercially available polyclonal and monoclonal antibodies Dilute the coated antigen with buffer (1/100 to 1/2000). (prepared as above) for 2 hours at 37°C. Next, appropriate A second antibody cooiugated with peroxidase (Txgo ) was added. This test detects the binding of commercially available antibodies to the coated antigen. Partially purified atherosclerotic plaque dissolved in PBS buffer for extraction The antigen was added to trichloroacetic acid (TCA) to a final concentration of 5% (wt/vol). Dissolve the acid-soluble fraction by incubating on ice for 30 minutes, then centrifuging. and an insoluble fraction were separated. Insoluble Monoga was dispersed in PBS and determined by ELISA. The presence of residual antigen was then tested. The TCA supernatant fraction was diluted with 1M Tris, pH 9. In addition, atherosclerosis was neutralized, dialyzed against PBS, and partially purified by ELISA. Mix 1 volume of Sclerotic Plaque Antigen with 9 volumes of water-cooled acetone, mix and keep on ice. The mixture was left on top for 30 minutes and then centrifuged. Air-dry this pellet to its initial volume. Resuspended in PBS and analyzed by ELISA. The acetone supernatant was discarded. One volume of partially purified atherosclerotic plaque antigen was added to one volume of chloroform. Mix vigorously with 2. Centrifugation was performed at 00 ORPM for 5 minutes. Remove the upper water layer , and extracted again with chloroform. After centrifuging again, the aqueous layer was analyzed by ELISA It was analyzed in Enzymatic digestion of atherosclerotic plaque antigens from plaque or serum Nity-purified atherosclerotic plaque was mixed with a wide range of hydrolytic enzymes. Each specific reaction buffer was as specified by the manufacturer. reaction are all at full capacity 1. 0-1. Perform in 5 ml and incubate overnight at 37°C. Then, the reaction was stopped by boiling for 5 minutes. Filter the sample 0. 45μ ), HPLC column (TSK-40060Omm t7. 5mm Bio -Rxd) and 0. 1M KPO4, plI7. (In l, molecular sieve fractionation was performed. Individual fractions (25 drops each) were collected by antibody capture method, coated with antigen. Both methods were tested by ELISA. This allows the control (not The elution spectra of atherosclerotic plaque antigens for the samples (digested) We investigated the changes. Molecular weight standards (Bio-Rad, thyroglobulin, immunoglobulin , ovalbumin, myoglobin, vitamin B-12), TSK-40 The elution of the G column was calibrated. Colorimetric assay a) Total hexosamine by BIIenkrzntx method, Asboe-Hznsen [Cl1n, Biochem, 9:264 (19761 1゜Simply put, an antigen sample is dissolved in a phosphoric acid/tetraboronic acid buffer. 3.5% acetylacetone, 0. Mix with 3ml and heat to 100℃ for 30 minutes. did. The mixture was cooled, 1 ml of Ehrlich's reagent was added, and the resulting absorbance ( The wavelength was 535 nm). D(+)glucosamine was used as a standard. b) Applying uronic acid to Blumenktanlz method, ^5hot-Lnsen method I measured it (AII!1. Biohem, 54:484 (19 73) I　Simply put, 0. Add sulfuric acid/tetrabolone to 1 ml of antigen sample. Acid reagent, 0. 6ml was added, mixed and incubated at 100°C for 5 minutes. After cooling, add 0.01 ml of m-h7droBdiphen71 reagent and place in a test tube. was shaken and after 5 minutes the absorbance at 520 nm was recorded. chondroitic sulfate was used as a standard. Molecular charge determination method Initially, in an attempt to quantify the isoelectric pH (pI) of atherosclerotic plaque antigens, 1 mixed bed ion exchange resin reagent chromatograph obtained from Ph1r+izc order An orcasing device was used. The conditions used were as per the manufacturer's instructions. sand That is, the antigen sample is dialyzed into high pH buffer (11,0) and 11 is Added to rebuffer exchanged 118 resin (10ml bed). Next, add the elution gradient to , pH 8.0 buffer. Measure the pH of the individual fractions and combine these with P Dialyzed against B391 (7,2) and analyzed by ELISA. Other ion exchange coupling methods include QAE-Sepharose (anion exchanger) and S - Sepharose (cation exchanger), L! Following the method of B. and Langer , p) carried out in the range of I7 to 12 [person nx1. Bioch1. ．． 147:1 48 (1985)]. Briefly, partially purified antigen was purified at pH 7, 11, 9. , 10, 11 and 12 into 51M NlPO4. Equilibrium at the same pH Ion exchange resin 0. A part of the gel packed with 51 was mixed with 1ml of antigen, Mixed for 30 minutes at 25°C. Sample 2. Centrifuge for 5 minutes at 00ORPM, and The channel was removed, filtered to remove gel fragments, and then assayed by ELISA. The unbound antigen was quantified. cytochrome C and myoglobin, respectively. , used as a high p I (10,2) standard and a moderate pi (7,4) standard; The method was confirmed to be appropriate. Atherosclerotic plaque antigens are exposed to denaturing agents listed below and then dialyzed. It was returned to the original buffer (PBS) by Drug: 8111 urea dissolved in PBS for 24 hours at room temperature. 6M guanidine hydrochloride in PBS for 24 hours at room temperature. 2M trifluoroacetic acid for 30 minutes at room temperature. 3,5M 1liscH dissolved in PBS for 8 hours at room temperature. 0, 1M glycine, pH 2,5 for 2 hours at room temperature. Antigen was added to 0.19SDS dissolved in PBS for 1 hour at room temperature (precipitated with acetone). ) (Alkylation/reduction method) Partially purified atherosclerotic plaque antigen (0, LM KPO4 solution 0. 51 ．． pH 7.0), 0. 44 guanidine hydrochloride (final concentration 7M) and 250μ g of dithiothreitol. Adjust the pH to 8.6 and store the sample at room temperature. It was left for 1 hour. Next, slowly add 16 mg of iodoacetamide and Depending on the N! Adjust the pH to 8.0 [l]. It was kept at 5. After leaving for 1 hour at room temperature, this solution Pass the sample through a TSK-400 HPLC gel filtration column (same as above). , of atherosclerotic plaque antigens by ELISA for individual fractions. The presence was tested and compared with fractions collected from unreacted antigen. Carbohydrate analysis of human plasma antigens and controls The following outline shows Va+oco+ The method used for carbohydrate analysis of hydrolysates of various polysaccharides was state antigen purification Antigen and control samples were analyzed by affinity chromatography. It was prepared using Affinity resins were added to Vl + oeo + mole according to published methods. Binding noclonal antibody 15H5 to 8io-Rxd Affigel 10 It was prepared using Plasma samples were incubated with the resin in a batch manner. After cleaning, The combined antigen was 0. Elution was performed with 1M glycine buffer pH 2.5. Next, antigen lysis The solution was neutralized and dialyzed against PBS. sample preparation Salts were removed by extensive dialysis against pure water at 4°C. each sample It was concentrated by lyophilization and the residue was redissolved in a minimum volume of pure water. Preparation of standards Ultra-high purity monosaccharide standard, Pfan+teiehlLzbo+alo+ Obtained from ie+ Inc., Wauk+gxn, IL. standard solution and its All dilutions were prepared with pure water. A branch (aliquot) of each standard is and stored at -80°C. Hydrolysis Concentrated trifluoroacetic acid (Pierce, Rockfo+d, IL) was added to the sample. The final concentration was 2M. Thoroughly flush the bottle with filtered nitrogen and sealed with a heat-stable Teflon-lined cap. This bottle, 104 soil, 4℃ There was a 4 o'clock device in the sand bath. After hydrolysis, cool the bottle for 10 minutes) and add filtered nitrogen. The solvent was evaporated. carbohydrate analysis The Dion+x device is advertised as being configured for monosaccharide analysis. There is. It consists of a reagent transport unit, a microinjection valve, and a pulsed current detector equipped with a gold electrode. It consists of a CarboPaCP^-1 analytical column. The data is Dione Collected with x4270 integrator. For each run, the column was fully equilibrated with 15 ml of NlOH dissolved in pure water. I set it. The hydrolyzate residue was redissolved in pure water before injection. conjugated monosaccharide from a CarboPaC column with a linear gradient of NaOH redissolved in pure water. It eluted. result FIG. 20 shows a blank run of chromatography using only pure water. Figure 21 shows a chromatography run with seven standard monosaccharides. . Figure 22 shows autoantigen affinity purification using 15H5 monoclonal antibody. A chromatographic blank run of the product is shown. ■ Antibody isolation and preparation method Antibody conjugate binding to sepharose Freeze-dried CNBt-Sepharose 4B powder (Pharmaeix) was added to 1mM Leave to swell in HCI for 15 minutes. This gel is applied to a sintered glass filter. (porosity G-3), gel 1. 1mM HCI per g (dry weight) total 2 Wash using QOml. Do this for several aliquots, each successive Aspirate the supernatant between additions. 5 mg of protein to be bound per 1 ml of gel was added using binding buffer (0, I M NaHCO3, pH 8j, 0. (containing 5M NaCl). this gel Wash the gel with binding buffer, remove the excess by aspiration, and mix the protein solution with the gel. Ru. The mixture is kept under stirring at 4° C. overnight. Next, this gel was mixed with 1M Ethanolamine, ptl8. 2 in blocking buffer containing 0 at room temperature. Leave it for a while. The gel was then washed with a binding solution containing 1M ethanolamine, pH 8.0. Wash with buffer. The gel was washed with binding buffer, 0.0% binding buffer. Contains 5M NaCl G, 10 washes with 1M acetate buffer, pH 4.0, binding buffer; - Wash twice. This protein-Sepharose conjugate is now ready for use. ．． Can be stored at 4-8°C. Bacteriostatic the buffer solution by adding cyanogen bromide It's okay if it's a sexual thing. Absorption of IgG antibodies from plaque supernatants The column is packed with 25 ml of Sepharose gel coupled to anti-1gG antibody. This antibody was prepared according to the method described above, and the total amount of antibody was about 129 mg. - Contains 1gG antibody. This column was washed with 2 to 3 volumes of buffer (0.15 M PBS, ptl 7. 2), then add the sample to this column. Ru. The flow rate of the elution buffer y-(0.15M PBS, pH 7.2) was 125 ml. /h+. Elution fractions containing the antibody are collected until the peak activity is gone. The column was then washed with sodium acetate buffer solution, pH 40 (elution buffer). The immunoaffinity-bound IgG antibody is removed. this column was eluted at a flow rate of 15-20 ml/h+, the eluted sample was collected, and the peak fraction was hold the image. This peak fraction was divided into 0. 15 M PBS. Dialyze against 9H7,2 for 24-36 hours at 4°C. Absorption of IgE antibodies from plaque supernatants The above procedure was performed using Sepharose bound to anti-1gE antibody prepared as described above. - Repeat with column packed with 5 ml of Gel 7. The flow rate of the elution buffer was 1 It is 515-2O/hr. Absorption of IgA antibodies from plaque supernatants The above procedure was performed on Sephas bound to anti-1gE antibody prepared according to the method described above. Repeat with column packed with 75 ml of loose gel. The flow rate of the elution buffer is , 1515-2O/h+. Absorption of gM antibody from plaque supernatant The above procedure was performed using Sephas conjugated to anti-1gE antibody prepared as described above. Rose gel7. Repeat with column packed in 5 ml. Elution buffer flow The speed is 1515-2O/h+t'. Polyclonal anti-plaque antibody Polyclonal antisera against atherosclerotic plaque antigens are The schedule for induction in rabbits has been described in the literature. For example, [S+ollat. ij+thodi of EnBmologr, 70 Near 0 (1980)] be. This antiserum was then applied to the same solid phase solution used for monoclonal antibodies. [Llnge et al., Cl1n, EIIIl, I mmunol. 25:191 (1976) and Pi+et+ 7 et al., 1. Icmon, Method+, 41187 (19g+11゜The first screening criteria is , binding to atherosclerotic plaque antigens would be better. Polyclonal anti-plaque antibodies must be prepared as follows. sand Well, 0. 15M sodium chloride solution gjL0. The method described above, dissolved in 2zl Plaque antigen prepared by 0. 5mg and Freund's complete adjuvant 0. The mixture of 8a+l is injected intramuscularly into the rabbit. Repeat this immunization for 14 days , then repeat once a week for 3 weeks. After a further 10 days, the blood was collected from the rabbit. The antiserum is collected by extracting the blood from the patient, coagulating the blood, and removing the clot. If you replace the antibody reagent with the plaque antigen and repeat the above procedure, the horseradish peroxidase or alkaline phosphatase-labeled plaque anti- Hara is obtained. The IgG fraction of the antiserum was further subjected to affinity column chromatography. and refine it. The column contains a resin on which anti-plaque antigens are immobilized. Monoclonal anti-plaque antibody Purified atherosclerotic plaque antigens were used to test mice against plaque antigens. Monoclonal antibodies were added according to the standard Milslein method with G*l[re]. [Mejhodx in Enz7m,. 7311 (1981)]. Using a modification of the method described in the literature, monochrome Screen for local antibodies. This document contains, for example, serum plaque antigens ( or its immune complexes), monoclonal anti- The body binds to plaque antigens with high affinity (preferably K10”M’). If you don't enter No. Mouse monoclonal antibodies are purified in a two-step process. Ascites fluid that has been removed , 10mM Tris-HCl, G, 15M NaCl, pHg. Afli-Get Blue resin (Bio-Rad Lzbo+ atorie+. Ricbmond, C) and elute with this buffer. Albumin is removed at this stage. In other words, albumin is retained in the column. Ru. The final step of purification is DEAE-Sepharose (Pha+mxcix Fin e　Chemical+, Pi+cafava7. In addition to Nj), iQmM Lis-11cI, pH 8.0 to 10mM l-Lis-HC1, 100mM Elute using a linear gradient to NaCl. This allows the album purified mouse monomer, free of contaminating serum proteins such as transferrin. Clonal antibodies are obtained. Isolated lineage conversion of lineage conversion variants within hybridoma cell line 22D3 is associated with atherosclerosis. 1 gM isotype cell line 22D3 with sexual plaque antigen specificity (ATCC accepted) Accession number 9840) and an IgG isotype cell line with the same specificity (22D). 315C5). X2D315C5 is an example of one of the progeny cell lines of z2D3. Among the progeny cell lines are 22D3/3E5 (ATCC accession number 1181048 5) is also included. The IgM isotype Z2D3 hybridoma cell line contains Ba1b/c splenic cells, prepared by fusion with sp2 myeloma cell line (Ioa+xnxlof I++ +monolog7. Volume 131, No. 2, August 1983, l5olationo f Immunoglobulin C11ll with Yarixlx from Hybridomi1ine+ secreting Anti-1 diOtope Antibodies b7 sequence gabl ining, Chri+ta E, Muller and K11lll R *7 to iev+; Journxlof 1mmunolog711ejhod +, Yol, 74. 1984. 9g, 307-315. 　Theidenl 101 ation of Monoclonil C1zss Sv mouth ch Y arixnts bySib 5election god sn ELISA A+sx7. God 5pir*, Ac1oni. Bxrgellesi, Iexn-Lac Te1llxnd, M! Eye hew D, 5ehar+1. ) First, collect IgG-producing cells and screen for z2D3. I nged. 100 cells were plated into wells of a 96-well Falcon plate. A total of 10 plates were used. On the 8th day, the superior sulcus was collected and examined for the presence of IgG. 9 Six wells were filled with goat anti-mouse [gG (γ chain specific reagent, Bmed 62-6 -treated at 4°C. well 0. Wash 4 times with PBS (washing buffer) containing 05% Tveen, and 50 μm of the supernatant obtained from the cultured cells was added. Incubate for 2 to 3 hours at room temperature. After washing, the plates were washed four times with wash buffer and washed with alkaline phosphorus. 1/1000 dilution of goat anti-mouse IgG (gamma chain specific) reagent conjugated with Added 50 μl. After incubating for 2 hours at room temperature, transfer the plate to a washing bag. Wash 4 times with 4-methylumbelliferyl phosphate (fou+-m +lh71obelliferYl phosphate) substrate solution (Sigma 100 μl of a No. M8883) was added to each well. After 60 minutes at room temperature , Flou+o [ai 196-well fluorescence meter (3M Diagno+ti+t , 5znja C1a+a, CA). The sensitivity of this assay is such that even one positive cell in 100 can be easily detected. It was more than possible. Initially, 3 positive wells were detected. emit the highest signal To increase the concentration of well (8G2), perform subcloning as described below. did. Next, this positive well was resuspended in 100 ml of culture medium containing 9% tallow serum. , plated in five 96-well plates at 200 μl per well. this The superior grooves from these wells were examined after 8 days as described above. 70% of wells are I It was positive for gG. The well that gives the highest signal for IgG (lA 12) was selected and further subcloned. Pipette the cells in the wells. 20 μl of the suspension was added to 1. Culture solution 10 containing 9% beef tallow serum Diluted in 0ml. This suspension was added to 5 plates at 200 μl per well. Plated in μm. There were approximately 3 cells per well. After 8 days, the supernatant was examined for the presence of 1g1i and IgG. The protocol is as above However, goat anti-1 gM (tl chain specific) was used to coat the wells. Reagent (Tago 4142) was added at 50% g/well overnight, and alkaline Goat anti-11M (U chain specific) reagent (T Ago 4852) was used as an assay method for detecting 1 gM. IgG Best Shin Three wells with numbers were retested using the dilution curve. This is due to the μ and γ chains. This is to quantify the amount more accurately. 7D10, γ is the highest and μ is the lowest. It was. Next, this well was 0. Subculture using 6 plates at 5 cells/well. I rowed. This resulted in the final clonal line. Individual clones were identified visually and tested with IgM, IgG reagents. γ Several producing clones were selected. Among these, 5C5 was further grown and investigated. this The clone was named X2D315C5. obtained from the μ-producing 22D3 clonal line and the γ-producing 22D315C5 clonal line. The assays show the same specificity when tested as described below. 1, 221131gM and Z2D315C5IgG in human and rabbit mice. Te. - When used for immunohistological staining of frozen sections of sclerotic plaques, the results are histologically similar. They show the same distribution and give the same negative results in normal tissues. 2. Binding to antigen (alcoholic extract of human atherosclerotic plaque) When examining (ELISA), it was found that both antibodies specifically bound to the same strain. Other antibodies belonging to the group show negative results. Confirm the IgG lineage and determine the subisotype using Sublso!7ping. Determine the subclass using K11l (Hyclone EO5Q51-K) Established. 22D315C5 is IgG1. ■Immunology legal body assay method 1. Add 10 μl of sample or control (positive, negative) to the sample in a glass tube. Add to 2 ml of pull dilution. 2. Incubate overnight at 4°C. 3. The next morning, remove the antigen-coated plate and pour the antigen-coating solution from each well. Suction. Next, add 200 μm of 02% casein powder to each well. Block the wells for 30 minutes at room temperature. After that, aspirate and 02% cold. Wash once with in-buffer. Place 100 μm of 4° sample or control onto the prepared plate map. Therefore, give each well (sample or control assays should be done in duplicate). ). 5. Cover the plate with parafilm and incubate for 2 hours at room temperature. 68 aspirate and remove the plate. Wash three times with 2% casein buffer. 7. Anti-human IgG conjugate or anti-human IgA conjugate on IgA Add 100 μm of working dilution of conjugate to each well. Incubate for 2 hours at room temperature. 8. Place the plate at 0. Wash 4 times with 2% casein buffer. 9. Prepare 7MB substrate (mix equal volumes of TMB substrate and beloidase solution B) make use of). 10. Add 100 μl of substrate to each well and incubate for 60 minutes at room temperature. 11. First read the plate with an ELISA reader at 65hm, then , add 150 μm of IM [IC] to each well to stop the reaction. After that, 45 Read again at 0 nm. 12. The optical density (0,D,) number is directly proportional to the concentration of antibody in the test sample. . Antigen capture assay 1. Sample or control (positive or negative) 250μm in a glass tube Add to 250 μm of sample dilution solution. 2. Incubate the above mixture at 37°C for 4 hours. 3. Buffer from plate coated with 15H5Ab (200 μl/well) Aspirate the liquid and transfer the plate to PBS/Tveen/Tt buffer. - Wash once. 4. Place 200 μm of sample or control onto the prepared plate map. Therefore, add to each well (sample or control assays should be duplicated). ). 5. Cover the plate with parafilm and incubate overnight at room temperature. 6. The next morning, aspirate the sample from the well. Plate with 02% casein buff Wash 3 times in the air. 7. Add 200 μl of working dilution of 17H3^b-peroxidase conjugate to each group. Add to well. 8. Cover the plate with parafilm and incubate for 4 hours at 37°C. 9. Wash the plate 4 times with 032% casein buffer. 10. Prepare TMB substrate (mix equal volumes of TMB substrate and peroxidase solution B). (using a compound). 116 Add 200 μm of substrate to each well and incubate for 60 minutes at room temperature. 12. First read the plate at 650 nm with an ELISA reader, then Add 50 μl of 111 Cl to each well to stop the reaction. After that, 450 Read it again on am. 13. The optical density (0,D,) number is directly proportional to the concentration of antibody in the test sample. . Inhibition assay formulation 1, 1 (CA[lmata+!, in-house mo/rio--F/l/antibody (17H3Ab, , 22D3Ah, , 151'15 Ab, and normal mouse IgM were mono Ab, as a control, add it to the antigen-coated well and block the file. At the same time, 10mM PBS buffer was coated with antigen. Add 100 μl of various concentrations of 100 μl to the wells and serve as a non-inhibitory control. Ru. Cover the plate with parafilm. 2. Incubate the plate for 2 hours at room temperature, then overnight at 4°C. to. 3. The next morning, aspirate each well and add 0. Wash three times with 2% casein buffer. 4. Pre-block 100 μl of each monoclonal antibody at optimal concentration with HCAD. Add to each locked well. Or, the optimal dilution solution LOGμm of IIcAD, Add to each pre-blocked monoclonal well. paraff the plate Cover with film. 5. Incubate for 2 hours at room temperature. 6. Aspirate and wash 4 times with 02% casein buffer. 7. 1 floμl of conjugate (for HCAD block completed wells, add goat anti- Mouse Igm peroxidase conjugate was added to the monoclonal block complete wafer. 1400 mouse anti-Hul gG-peroxidase conjugate) Add to each well, including BS control wells. Cover the plate with parafilm Cover. 8. Incubate for 2 hours at room temperature. 9. Aspirate, 0. Wash 4 times with 2% casein buffer. 10. Add 100 μl of 7MB base to each well. Let react for 1 hour at room temperature. 11. Read the plate at 650 nm, then read each well 1. [1M HCLO stop Add 50 μl of stop solution and read plate again at 45 hm. 12. Calculation % inhibition = 100% - (assay well average 0. 0. /control average 0. D ,)xloo%PBS Immunoassay method anti-Braak antibody against atherosclerotic plaque antigen Inject each coated microtitration plate with the serum sample of the patient to be tested from a normal mouse. Give 90 μl/well mixed with serum 10 μl/well. plate Cover to prevent drying and incubate overnight. Remove serum mixture and wash the plate three times with casein wash buffer. Horseradish peroxidase-conjugated antibody prepared according to the method described above. body or alkaline phosphadase-conjugated anti-plaque antibody. Ink wells for 2 hours, covering the plate to prevent drying. cuveate. Remove the enzyme-labeled antibody solution and place the plate in casein washing buffer. Wash 4 times in the air. Next, in the case of horseradish peroxidase, tetramethylbenzene In the case of didine, alkaline phosphatase, 4-methylumbellifer Either Le Phosphate (3MDiagnostie + SHlemt) Add 100 μl/well of Next, this microtitration plate is Color reader (Molecular Dewies+) or fluorometer Read every 10 minutes using either the meter (311D gno+lic+). child the atherosclerosis until the maximum reading is obtained or until 1 hour has elapsed. Add 100 μl of human serum to each microtiter plate coated with sclerosing plaque antigen. /well (sample may be diluted). plate to prevent drying Cover and incubate for 2 hours, remove any remaining solution, and remove the plate. Wash with casein wash buffer. Horseradish peroxidase or alkaline phosphater Affinity-purified goat anti-1 conjugated to either enzyme (appropriately diluted) Add 100 μl/well of gG, IgM, IgH solution to each well. dry To prevent this, cover the plate and incubate for 2 hours. anti-1gG,I gM. Remove the Ig^ or IgE solution and wash the plate 3 times with casein wash buffer. Wash twice. For horseradish peroxidase-conjugated antibodies, tetramethylben Didine, 4-methylumbeli for alkaline phosphatase-conjugated antibodies Feryl phosphate (3M DiBoo+tics SS75te+) Add either 1011μ+/well to the wells. Next, this microtitration The rate is measured using a color reader (Molecular Device+) or is read every 10 minutes using either a fluorescence meter (3 yen Diagno+l1cs). Take. Do this until the first maximum reading is obtained or after 1 hour. I will do it up to Preparation of Plaque Antigen Coated Microtiter Plate Preparation of Plaque Antigen Dilution of 10 0 μI, IMMULON +! Surface of microtitration plate (Jnatech) Apply to. The dilution ratio of the coating liquid was 1:10. 　11100. 1:10 GO, l:lG, 000. Tap the plate to ensure that the coating solution is at the bottom of each well. be completely covered. Place the wells in a covered, moist box at 4°C. Incubate overnight. Discard the coating solution and add 200 μl of PBS per well. The wells were then incubated in a humid box for 1 hour at room temperature and washed with washing buffer. - (PBS, 0. 5% 7veen and 0. 02% sodium azide) 200 Wash with μm and store in an all I box at 4°C and ready for use. Antibody coated microtiter plate The prepared dilution of anti-plaque antibody LOG μm was added to the IMMULON 11 microtitration plate. Apply to the surface of the sheet (D7na+ech). The concentration of the coating solution is 1 to 5 μg / well, but with other reagents selected and the subsequent immunoassay method. It can be higher or lower than that. Tap the plate lightly to remove the coating solution. Make sure to completely cover the bottom of each well. well, capped, moist Incubate overnight at 4°C in a clean box. Discard the coating solution and add 200 μl of 1% BSA dissolved in PBS per well. Ru. The wells were then incubated for 1 hour at room temperature in a humidified box and the BSA solution remove. Next, the wells were washed with 200 ul (D washing cap 77-(P BS, 9. 5% TVεEN and 0. Washed 4 times with 02% sodium azide) Store in a humidified box at 4°C and prepare for use. ■, Antibody labeling procedure 15H5 antibody, 17H3 antibody peroxidase conjugate The following method uses peroxidase dase with a monoclonal antibody (e.g., hybridoma +5H5,1783 It is a one-step method that binds to monoclonal antibodies produced by 1. f mg of purified 15H5^b or 17) i3 Ab was added to 10 mM PB Dialyze against S overnight at 4°C. 2. 2×mH of peroxidase enzyme is dissolved in the above Ab solution. 3. Add geltaraldehyde (1% solution) dropwise to the above mixture. geltal The ratio of aldehyde solution to (antibody peroxidase mixture) is 120° Then, gently stir on a shaker for 2 hours at room temperature. 4. Transfer the conjugate to 1GmM PBS p) 7. 2 (Change the buffer 3 times ) overnight at 4°C. 5. conjugate, 0. Filter through 2μ. 1-131 labeled antibody agent The antibodies are described by Rosebrough, S. (supra, 9575). It can be labeled with l-131 by the rce1odobeld method. 0, 2MPBS, plT 7. 0 INμl (microliter) of the antibody Add 150 Ig and incubate for 10 minutes after its addition. Pipette the solution. Remove and save. Beads are 0. 2M PBS. Wash with IQO μl pH 7.0. Solution and wash buffer obtained from solution and beads Adjust the a. To separate free iodine, the solution was passed through CENTRICON c - Thoroughly wash with 30 filter. Approximately 60% of the original l-131 is converted into antibodies Join. DTPA labeled antibody DTPA Hnatovieh, D. et al. f Immunology1Method+, 65: 147 (198 3)] to the antibody. The double ring anhydride of DTPA was prepared by Hnatovich, D. etll, [ln ),] App1. Radial, 1oot, 33:327 (1982) ] and stored as a solid in a desiccator at room temperature. Dry Loloform or a suspension of the anhydride dissolved in ether (0.01 1 g/m Adjust the volume and evaporate the aliquots in the presence of nitrogen into a clean, dry test tube. Living 0. Dissolved in saline. 05M bicarbonate, rough 7-+l'H7,0-7,5 Immediately add 10-20 μl of antibody solution dissolved in Stir for seconds. If the bound antibody must be purified before labeling, this preparation Adjust the solution to about 0.0% with the above buffer. Dilute to 2 ml and apply to a 5 cm gel filtration column. (G-50゜Roehe Diigno+1ics, Nutley, NJ ), using physiological saline as the eluent. This purification takes about 5 minutes, but about We provide products with 5% purity. In-111 labeled antibody 0,511 Chelate grade dissolved in acetate buffer, pH 6,0 I-11l-111 (['h7sici, EmerTville CA), above Add the DTPA-antibody conjugate described above to the body fluid to match the stoichiometry. This yields an In-111 chelate/antibody conjugate. This product is commonly It can be purified by conventional chromatography. Fluorescene antibody agent The antibody is dialyzed overnight against a pH 9.5 carbonate/bicarbonate buffer solution. So (e.g., with optical density at 280 Im). fluorescein ・Adjust the DIISO solution of isocyanate (1, [l/cg/ml]) and (1-10% of the total protein solution volume) dropwise into the antibody solution while stirring. Ru. The reaction is allowed to proceed for 2 hours, protected from light. 0. Use PBS containing 1% NxN3. Then, the product was gel-filtered and purified using 5EPHADEX G-25 gel, and the unreacted Alternatively, hydrolyzed chromium fluoride can be separated. The absorbance of the conjugate is 280 Im. , 495Im to obtain a fluorescein-labeled antibody solution. Rhodamine labeled antibody Antibodies were prepared in a carbonate-bicarbonate buffer solution at pH 9.5 as described in Example 7. Dialyze overnight. Rhodamine isocyanate solution dissolved in DMSO ( 10,0 mg/ml) and adjust to the desired volume (1-10% of the total protein solution volume). is added dropwise to the protein solution while stirring. The reaction was allowed to proceed for 2 hours, protected from light. Ru. 0. Using PBS containing 1% NJ3, 5EPHADEX G-25'f lute, Gel filtration and purification of substances to separate unreacted or hydrolyzed chromium fluoride . The absorbance of the conjugate was measured at 280I and 550ni, and the absorbance of the conjugate was measured at 280I and 550ni. Get the liquid. Coumarin labeled antibody Antibodies that specifically bind to atherosclerotic plaques (1r+ moles) were incubated at 0. Dialyze overnight at 4° C. against GIM PBS, pH 6,8 buffer. Add 50 nM 3-carboxy-7-hydroxycoumarin to this solution. child Add 50 nM 3-carboxy-7-hydroxycoumarin (add this solution). The solution was cooled in a water bath, and 50 μlM of 1-ethyl-3-(3-dimethyl Add (aminopropyl) carbodiimide hydrochloride. After addition, the mixture , stirred at 4°C for 1 hour, and 5EPI (ADEX G-50 2. 5C5 (1cm Chromatography on a column. The absorbance of the conjugate was measured at 345 Im. , obtain a coumarin-labeled antibody solution. Nile blue A-labeled antibody Nile Blue A (350B) is diazotized by the method described above. No A solution containing the diazonium salt of Le Bleu A was added at 0. Dissolved in 1MPBS, pH 8.0 Add the diluted anti-plaque antibody (0.05 ml) dropwise to the solution. After dropping, add the mixture to 2. 5x5Qcm 5EPHA [1EXh Ramte purification. Absorbance of eluate is measured at 628 om to obtain a Nile Blue A-labeled antibody. hematoporphyrin conjugate Antibody 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (50m M) was dissolved in [1,01M PBS, 9H6,11, hematoporphyrin] (50mM) and anti-plaque antibody (1mM). After the addition, the mixture is stirred for 2 hours at 4°C. Next, add this mixture to 5EPHADE Purify with an XG-50 column to obtain a hematoporphyrin-conjugated antibody. Tetracycline conjugated antibody The IIHs ester of carboxymethyltetracycline was prepared as described above. Ru. In this anti-plaque antibody solution dissolved in Il, IM PBS, pH 8.0, , Ni1S ester of tetracycline is added in portions. After addition, the mixture is Let stand at 4°C for 2 hours. Purify the mixture with 5EPHA [1EX G-50 column] Then, an antibody conjugated to tetracycline is obtained. Enzyme-labeled anti-plaque antibody Anti-plaque antibodies were obtained from O'5ullivan, M, elat, [Anx17 tiealBiochem, 100:100 (1979)]. can be conjugated to alkaline phosphatase. Horseradish peroxidase, llygtr+n, t(, eta l, [M+di+al Biology, 57:1g? -191 (1979)) conjugated to anti-plaque antibodies, as described below. i.e. , horseradish Φ peroxidase (IIRP, type II or type IV, Sigma) to 0. 25% geltaraldehyde (GA, Po 1a+on) Contains Q, [1514 carbonate/bicarbonate buffer, pl+9. to 5 dissolve. After standing for 2 hours at room temperature, excess GA was removed by 0. Equilibrated with 15M NaCl 5 ephadex G-25 column (0,712 cm, Phatmacii ), separate from 0 person-11 RP. This GA-HRP complex is called the second stage. Then, 0. Contains 15M NaCl, 0. 05M Carbonic/Bicarbonate Bay7y-pH95 16-64 hours at 4°C under various IgG:HRP ratios. The reaction was carried out at a final concentration of 0. Stop by adding lysine until 0.02M. trypsin labeled antibody m- dissolved in dry dimethylformamide (100 μl, mmol/′l) Aleimidobenzoyl N-hydroxysuccinimide is purified as an anti-plaque anti- Add to body. The resulting mixture is stirred at room temperature for 30 minutes. This antibody solution was added to PB Fractionation is performed using a 5EPHADEX G-50 column using S as an eluent. pooled Add trypsin to the antibody solution at room temperature. After addition, stir the mixture for an additional 2 hours. Stir. Add 2-mercaptoethanol to a final concentration of 2mM/l. , the solution is stirred for an additional 30 minutes. Add this conjugate to PBS (3 x 2 liters) Trypsin-labeled antibodies are obtained by dialysis overnight. papain-labeled antibody Equimolar concentrations of purified anti-plaque antibodies dissolved in papain were added to 0, 1 M sodium - Mix in potassium solution. To this solution, add 1% by volume dissolved in phosphate buffer. Add gel taraldehyde solution. After the addition, the mixture was stirred at room temperature for 3 hours, Finally, 0. Dialyze against 1M PBS, pH 8.0, overnight at 4°C. This mixture The combined solution was further purified using a 5EPHADEX G-50 column, and papain-labeled antibody 0. 1. of 3M bicarbonate buffer, pH 8.0. Hyaluronidase dissolved in 01 Add phenyl isothiocyanate to the solution (5 mg). this is, This is to protect free amino groups on the hyaluronidase molecule. After addition, the solution , stir gently for 1 hour at room temperature. Sodium periodate solution (0.06M distilled water solution) and stir the mixture gently for 30 minutes. 016M dissolved in distilled water 1 ml of ethylene glycol is added and the solution is stirred for a further hour at room temperature. 0 ．． After dialysis at 4°C against 01M sodium carbonate buffer, pH 9.5. (3 times at 11), mix the mixture with purified anti-plaque antibody. The reaction mixture, 2 - Stir for 31 hours and treat with sodium borohydride 5B. The mixture was heated to 4℃. Leave it overnight. After dialysis against PBS, this mixture was divided into 1. 5! N i5 cm (BN) 5EPH Human DEX G-100 Column (Koyorori 07 Purify with tography to obtain hyaluronidase antibody. Kallikrine labeled antibody Equimolar amounts of purified anti-(normal vascular epithelial) antibody and urinary kallikrine were mixed at 0. 1M phosphorus acid sodium potassium buffer, 9)16. Mix in 8. Example 12 The antibody and kallikrine are combined according to the method of . The final reaction mixture was ．． 5! Purify with a 50 am SEPHADEX G-200 column and Obtain an in-conjugated anti-(normal vascular epithelial) antibody. Collagen degrading enzyme labeled antibody Collagen degrading enzyme ■ (65 lysines), Collagen degrading enzyme II (lysine 5 0), 0. Dissolve in 05M phosphate buffer, pH 1O. Add anhydrous to this solution. Dimethylformamide (100μI. m-maleimidopenzolo, iN-hydroxysuccine dissolved in 8mM/L) Add imide. After addition, the mixture is stirred for 30 minutes. (Dnn liquid, first use PBS as eluent, 5EPIIAI) EX G-5 0 column and treated with purified anti-plaque antibody. Mix this mixture at room temperature for 2 Stir for an hour and add 2-mercaptoethanol to a final concentration of 2mM/l. Add. This mixture was further stirred for 30 minutes, and then the 5EPIIADEX G-50 Chromatographically purified collagen-degrading enzyme-conjugated anti-plaque anti- Obtain the original antibody. beta-1 anti-collagenase labeled antibody beta-1 anti-collagenase, and anti-(normal vascular epithelial) antibody by the method described above. Combine with de. The final reaction mixture was prepared by 2. 5x50cm 5EPHADEX G -200 column, beta1 anti-collagenase-labeled anti-(on normal blood vessels) skin) to obtain antibodies. ■, Atherosclerotic plaque 7 imaging method z203D D ['TA combination 1. Preparation of DTPA (7) mixed anhydride [Kreicxrek xnd Tuc ker, BBRC. 77:581 (1977) 1 a)) Liethylene ammonium-fITPA, lumg + acetonitrile 2ml b) Cool to 4°C. C) Add isobutyl chloroformate. d) Mixed anhydride of DTPA is formed at 4 °C. Modification of 2, Z2 [13 a) 0. 1M NxHCO (2rlfl-9mol), 0. Dissolve in 45ml Ta1,692D3 b) Add 15 μl of carboxycarboxylic acid anhydride of DTPA (2xlG-1mat) Add. C) React for 1 hour at room temperature. d) 0. Dialysis in 1.6 L of 1511 NaCl at 4°C - overnight. 3. In-111 labeling of DTPA-22D3 a) fi1 citric acid + 1H5, DTPA-Z2D3°0, 25 mg dissolved in 151 μl of No. 5 and the same quench In-C13°b) dissolved in an equal volume of acid and incubated for 30 minutes at room temperature. C) Antibody binding 111. From n, 5eph*der G-25 column chromatog The free components are separated by roughy. This “’In-DTPA-X2D3 ,0. Elution was performed using 15M NaCl. Pool the active content in the excluded volume , used for in vivo experiments. 4゜In vivo experiment IIIn-DTP was injected into the ear vein of an approximately 6-week-old rabbit from which the descending aortic epithelium had been removed. 0. of A-22D3. 5-1. (1mci was administered intravenously.The rabbit was treated with ketamine and The gamma φ camera was anesthetized with an anesthetizer and Ronpan and fitted with a medium energy collimator. Visualization with Mera (Ohio Nuclear, Sigma 410 or 100) did. Anterior views were obtained shortly after intravenous administration and 24 hours later. next, The animal was given 5% Evans Blue 5i1 intravenously followed by bendoparviter. The animal was euthanized by intravenous injection. The descending aorta from the thoracic region is attached to the descending aorta in the abdominal cavity from which the epithelium has been removed. This was used as a normal control. Blood was removed from the aorta, and the inner surface was scraped out. These portions were weighed and then counted in a gamma counter. Use this part Macro autoradiography was obtained. Ammograph this part When exposed to film, it was possible to develop it in 1 to 2 weeks. Then expose the film. A color photograph of this area was taken and compared with the autoradiograph. Localization of experimental atherosclerotic lesions using monoclonal antibodies Monoclonal antibody 2203-5C specific for atheroma connective tissue antigen Using the 5F (zb’)2 fragment, Non-immersive visualization of teloma atherosclerotic lesions was performed. This lesion is a balloon fist Endothelialization of the descending aorta by catheter followed by high cholesterol and fat donation. This is what I made. After 7 weeks, 3 animals were given In-l1l 22D3. I noted it. To each of the animals +-125z2D3. l-125 non-specific monoch Local antibody F(ab”)2 was also injected. Images are shown after 15 minutes, 24 hours, and 48 hours. Recorded. Weigh the normal (N) and pathological (L) parts and perform gamma scintigraphy. It was counted and expressed as % average injection volume per duram. The lesion was in one rabbit. can be seen in Ic-1111203, and in another rabbit, l-125 I was able to see it on 12D3. For macro autoradiography of isolated aorta Therefore, the uptake of 22D3 was found to be superior to that of nonspecific antibodies. . The uptake of In-11112D3 was 0.0% of N. 0008 Sat Q, t1003 For L, it was Q, [135 Sat L 0001. For each, l -12522+)3 uptake is 0025 and 0. 005, +-125 non-specific The uptake of target F(ab')2 was 0. They were 1108 and 0003. this experiment , a monoclonal antibody was used to treat atherosclerotic lesions in the aorta. The feasibility of visualization without immersion was demonstrated. ■6 Histology method Histological counter staining bed with hematoxylin Lerner-1 Reagents and suppliers Anhydrous ethanol (Gold 5hield Chemiexl-P+oof 2 H)　o　he? Toxilin, Lerner-1 (sp 137737-1 or ). Xylene (SP 18668-4. Mallinckro dt or equivalent). Cov+rbond mounting agent (Sl’ #11763904 or equivalent). Deionized water. Coplin (SP #57675-1 or equivalent). Cover glass ( SP1602 [1 or equivalent). staining method Reagent operation ], Hematoxylin Lerner - 12 penetrations (8 counts each time) 2, D, l water (3 times) Penetration once each 3. 70% ethanol 15 times penetration 4. 95% ethanol 15 times penetration 5. Absolute ethanol (2 times) 20 times each 6. Xylene (2 times) 1 minute each 76 Drop 3 drops of Cove+bond mounting agent onto the glass inside the cover. Freeze unfixed frozen tissue sections (5-6μ thick), preferably freshly cut, overnight. , store at -80°C. Bovine serum albumin BSA (Siglna #A-7030) Normal horse serum (V ector-Pe+0xida++ Mo+++e IgG PK 4002 ) - Next antibody Biotin mare anti-mouse IgG (Vector-Pe+Oxida++ Mo use IgG PK4002') 30% hydrogen peroxide (Sig■a #tl-1009 or equivalent) Methyl alcohol free noacetoni/(Mallinckrodt 130+6 -4 or equivalent) 3. 3'-Diaminobenzidine-DAB (Sig+nA#D-9015) Tr i xma base (Sigma #T-1503 or equivalent) Sodium chloride (Mallinek+od) 87581 or equivalent ) IN HCI (Ricca chemical compin713740 or its equivalent) Sodium phosphate, dibasic anhydride (Mallinckrodt 17917 or equivalent). Potassium phosphate, base, anhydrous (Mallinckrodt 87100 or similar) equivalent) Device Shiab-1ine orbital shaker smoke hood Dark-colored, wet container with lid Reagent preparation Phosphate buffered saline (PBS) pH 7, 21L chloride f-J rum NaC17.2g Sodium phosphate Na2HPO41, Yamadibasic, anhydrous Potassium phosphate KH2PO40, Yu - base, anhydrous ri, 1. Water 0. 5 to 1 GOOofIIPBs + 0. 1% O3^, 9117 ．． 2 LLBSA Ig Dissolve in PBS, pH 7, 2, 10, 100O, make fresh each time T+i+-HCl/Physiological saline buffer-(0,05M T+i+-HCl +0. 15M NaCl), pH 7.6 0,57+ii MCI pH 7,6 (preservation solution) T+i+ima base D, l Water, dissolved in HCI, adjusted to pH 7.6 Dl, water, 05 to 1000 m1 09% NxCl (normal saline) aC1 Dissolve in 0,1 water, jOfloml T+i+ tlcl/saline buffer (running solution) 4, 3. 1 capacity of 1, 4. Make fresh each time mixed with 9 volumes of 32 3,3'-diaminobenzidene tetrahydrochloride (DAB) 0. 5%DA B (preservation solution) (1 bottle contains thawed DAB of Q, Ig) Tti+7 saline buffer; Dissolve at pH 7.6°, divide 11 into bottles, and store at -20°C. 0. 05% DAB and 0.05% DAB. 01% H2O2 working solution [IAB storage solution 11 Dingrip/1 (CI saline buffer 9130% H2024μI VecD+1iin ABC reagent 1 drop = 50μm reagent A 2 drops Reagent 8 2 drops QS with PBS/BSA up to 10m1. Mix immediately and let stand 30 minutes before use. 1 trick Immunoperoxidase staining method 1. Remove slides from the freezer and dry for 10 minutes. 2. Wash with PBS/BSA for 20 minutes on a shaker (very gently). CAUTION - After this step, do not allow the sections to dry during any of the remaining operations. No. Dried pieces may produce erroneous results. 3. Incubate with 3% normal horse serum for 20 minutes. 4. Absorb excess serum from the section. 5. Incubate sections with appropriate dilution of primary antibody for 30 minutes. Or if necessary If necessary, incubate longer in a moist container. 6. Wash slides in PBSIBSA for 1 C on a shaker. 7. Treat the sections with anti-mouse 1. gG biotinylated antibody (150 diluted with Pus/BSA) incubate for 30 minutes. 8. Wash slides in PBS/BSA for 10 minutes on a shaker. 9. Shake endogenous peroxidase with 3% H2O2 dissolved in methanol. Block for 10 minutes on a bowl. 10. Wash slides in PBS/BSA for 10 minutes on a shaker. 11. Incubate with Veclx+tain ABC for 20 minutes. 12. Wash slides in PBS/BSA for 10 minutes on a shaker. 13. Incubate with DAB for 7 minutes. 14. D. Wash sections for 5 minutes in l water. 15. Perform counter staining with hematoxylin. ■, Atherosclerotic plaque treatment method 1, FAB2 flora with the following characteristics Inject the drug intravenously (see Figure 3OA, Figure 7). a) One hypervariable region that binds the Z2D3 antigen and another, a fibroblastic region. Dual function with a hypervariable region that binds to the propeptide of lagenase precursor antibody. b) one hypervariable region and another neutrophilic collar that binds to the 22D3 antigen A dual-functional antibody with a variable region that binds to the propeptide of the genase precursor. c) one hypervariable region and another type IV/ A double protein with a hypervariable region that binds to the propeptide of V collagen degrading enzyme precursor. Functional antibodies. d) One hypervariable region and another stromelysin that binds to the Z2D3 antigen. A dual-functional antibody with a hypervariable region that binds to the propeptide of the zymogen. e) A mixture of the four types of FAB2 in (a-d) above, labeled with nuclide Represents a small component within the entire fragment pool. 2. 24 to 48 hours after administration of FAb2 fragment, cancer according to nuclide Scan the patient with a camera and identify the FAb2 fragment located in the target lesion. Estimate the amount. This is done based on the amount of FAb2 fragments detected. (No. 30BliU11). 3. Fibroblast collagen degrading enzyme, neutrophil collagen degrading enzyme, type l V Inject an appropriate mixture of /V collagen degrading enzyme and stromelysin enzyme precursor intravenously. Ru. This is the receptive FAb fragment presumed to be located in the target lesion. Do this in proportion to the number of A small portion of each zymogen is labeled with a nuclide (Figure 30C). reference). 4. Using a gamma camera tailored to nuclide y, determine the dose of the enzyme precursor mixture as follows: Increase the amount until the desired amount is located in the lesion. The desired amount is the arterial Although it dissolves enough plaque to remove the blockage, it can cause aneurysm formation and disease. It is an amount that does not cause hansatsu in severe blood vessels (see Figure 30D). 5. Inject a sufficient amount of tissue plasminogen activator (TPA) intravenously to ensure sufficient generates circulating plasmin, thereby freeing functional enzymes from their bound propeplements. It can be cut from the tide, but not enough to cause exudative bleeding. , the amount is about that amount (Fig. 30E). 6. When released from FAb fragments located in plaque, collagen Degradative enzymes and stromelysin enzymes bind to the substrate in the tatina and its vicinity; Disassemble it. a) Collagen type ■ (neutrophil collagen degrading enzyme) b) Collagen type Type III (fibroblast collagen degrading enzyme) C) Collagen type IV/V (type I V/V collagen degrading enzyme) d) Proteoglycan fibronectin (stromelin) The present invention further provides , as elucidated in the context of specific, but non-limiting, examples below. . Unless otherwise specified, temperatures are in °C and percentages are weight percentages. Here Examples performed in a laboratory are expressed in the present tense and are Examples expressing experiences are expressed in the past tense. plaque treatment Typical treatment prescriptions include the following: 1. Inserting a catheter into an artery (coronary ostium, carotid artery, aorta, or peripheral blood vessel) . 2. Macroscopic examination of the vascular lumen using a contrast agent. 3. Inject the antibody-enzyme inhibitor conjugate dissolved in a physiologically acceptable solution. 4. Give yourself enough time to react. 5. Inject the plaque antibody and enzyme conjugate dissolved in a physiologically acceptable solution. . However, the enzyme should maintain its activity in this solution. 6. Circulate for a sufficient period of time to allow local circulation (e.g. 60 minutes). 7. Macroscopic examination of the vascular intima and/or media with a contrast agent under fluoroscopy. 8. Repeat steps 5-7 until satisfactory recovery of the vascular lumen. 9. Inject an enzyme inhibitor dissolved in a physiologically acceptable solution for any treatment. Even the enzymes that cause reactions are stopped. 10. After a few minutes or after clearance of the reagents, repeat step 7. by enzymes The operation is stopped when no further attenuation of the vessel is observed. Otherwise Step 9. Repeat 1o or introduce inhibitor by IV. discussion Atherosclerosis is the atherosclerosis revealed by the present invention. It is characterized by the presence of one or more sexual plaque-specific antigens. Immune response is clinical Plaque antigens or those that bind specifically to this antigen are Either matching antibody will become detectable at some point. Therefore, the presence of the antigen or antibodies against it may be associated with atherosclerotic plaque. It shows that there is a lark. Figure 5 shows normal people under 35 years old and those with coronary artery disease. Atherosclerosis found in the serum of people diagnosed with CAD This is a comparison of IgA levels specific to infectious plaque antigens. As shown in the figure, 70 out of 207 people under 35 years old, 70 people over 35 years old Twenty-one out of 21 people had elevated IgG levels in their serum. Positive A normal person is defined as an apparently healthy person who is not diagnosed with CAD. Figure 6 shows Atherosclerosis in the serum of normal people over 35 years old and people with CAD Figure 3 shows a comparison of levels of atherosclerotic plaque-specific antigen. As with IgA levels, atherosclerotic plaque-specific antigen Levels of specifically binding IgG were also higher in CAD patients. It depends on CAD Of the 125 people tested, 45 had elevated antigen levels but 3 Among normal people under 5 years of age, only 4 out of 25 are normal compared to 49 normal people over 35 years of age. In humans, only eight people showed elevated antigen levels. The amount of antigen expressed was examined as a function of age and disease severity. '$7 figure is This is a plot of the relationship between antigen levels and patient age in apparently healthy people. . On the other hand, Figure 8 shows the same results for patients whose coronary arteries are occluded by 50% or more. Figure 9 shows the same plot for people with low CAD. This is what is shown. As shown in the graph, the amount of antigen in serum is The degree of dependence on age is lower than on the severity of D. Therefore, atherosclerosis Atherosclerosis is directed by the presence of atherosclerotic plaque-specific antigens Ru. The frequency of antibodies that specifically bind to atherosclerotic plaque antigens is appears to increase with age. However, this increase This is small compared to the antibody levels seen (East Figures 10-14). Figure 15 shows the frequency of positivity for the antigen when grouped by age. tone The participants were between the ages of 31 and 75. Early studies on atherosclerotic plaque antigens showed that human atherosclerotic plaque antigens Extract of atherosclerotic plaque with phosphate buffered saline (PBS) It was targeted. This extract was then subjected to HPLC-DEAE fractionation to fractionate and whether it reacts with serum obtained from patients with coronary artery disease (CAD). (Fig. 2 collagen). There was a large amount of binding in both volumes that eluted immediately after the blank volume. Were present. In the presence of normal serum (i.e., patients younger than 35 years without CAD) There was no antigen-antibody binding. The fraction immediately after the excluded volume of the column showed the highest degree of binding for CAD serum. Therefore, this was used for B11bC mice. of mice that produced antibodies. The pancreatic cells were then fused with the permanently dividing cell line SP2. Through this kind of fusion, Thus, hybrid 15H5 was obtained. Next, the 1585 monoclonal antibody was covalently linked to Sepharose agarose. I set it. This in-phase support/antibody complex is used to quantify antigen levels in various specimens. used in the assay. Furthermore, PBS from human atherosclerotic plaques Contact the extracted material with 15H5 monoclonal antibody/in-phase support complex This allowed the removal of autoantigens from other extracted materials. Next, get The assembled complex was washed and the purified autoantigen was eluted from the complex. Table 1 Characteristics Extracted plaque Extracted serum 1, Reacts with coronary artery patient serum + +2, Reacts with 15115 Ah + +17113 Reacts with Ab + + 22D3 Reacts with Ah Reacts with QIOE7 Ah 3. Immunoreactivity after boiling for 1 hour + 4. Solubility in trichloroacetic acid 5. Immune activity after dissolving trichloroacetic acid 6. Immune activity after TFA + + 7. Immune activity after TFA and heating 8. Molecular weight estimated by gel sieve chromatography >500. 0OL >50 0. 000 9. Ion exchange chromatography, molecular charging using ion exchange gel -DEAE Sepharose -QAE Sepharose 13ol! opropYl 1epharo+eneut+alneutra1 0, Glycosidase sensitivity Very slight 11, Sensitivity to proteolytic enzymes Resistance 10 12. Precipitation with acetone Yes 13. Can be extracted with chloroform? 14. Detectable primary amino group? No 15, B4. Absorption None None 16. Sensitivity to chaotropes, SDS or alkylation/reduction No no 17. Sensitivity to periodic acid treatment Yes 18. Sensitivity to urea To further characterize the antigen, we have developed antibodies and antibodies that specifically bind to the antigen. and antigens were reacted with various components found in atherosclerotic plaques. . Table 2. Anti-serum, monoclonal antibody apolipid protein with purified 15H5 antigen. A-1 Apolipid protein A-11 Apolipid protein B Apolipid protein C-111 apolipid protein E Human collagen φ type II+ human collagen type 1v human collagen type V Human collagen type Yl vitronectin As shown in Table 2, it specifically binds to various components of atherosclerotic plaque. Antibodies that match do not bind to 15H5. This means that the antigen is a component listed in Table 2. It shows that it is not one of them. In order to further clarify the characteristics of this antigen, this antigen was reacted with various enzymes. , we investigated whether the antigen was degraded. Proteolytic enzymes, deoxyribonucleas It was found that enzymes such as enzymes, lipases, and ribonucleases do not degrade 15) antigens. did. However, the 15H5 antigen is partially linked to certain glycosidases, especially Decomposed by α-amylase, β-amylase, and glycoamylase. this Therefore, it is clear that the 15H5 antigen contains a structure with carbohydrate-like properties. . The results obtained for the individual enzymes are shown in Table 3. Table 3: Reactivity between enzymes and 15H5 plaque antigen Enzyme reactivity proteolytic enzyme B+omelain Collagenase (Ach+omobate+) Collagenase Disper 7 Collagenase type I Collagenase type■ Collagenase type■ Endoproteinase E Endoproteinase L! l-C for proteolytic enzymes Staphylococcal protease ￥-8 Glycosidases Chondroitinase ABC chondroitinase ACI chondroitinase ACn Chondroitinase B α-galactosidase End-α-N-Acety1galacto+alinidase End- β-galactadase β-N-Acet71h+ro+exminida+e-doacetyl-D-glu co+aminidaie endoglycosidase D endoglycosidase F Endoglycosidase H others deoxyribonuclease lipase (bacteria) Lipase (yeast) ribonuclease lectins that bind to self-antigens to further characterize antigens. Measurements were made. For example, Conava 1 mouth ensif:, T+iii+um vulgaris showed strong binding to 15H5 antigen, but Lin t co1nari+, Ricinu+commonis. Tetragonoloba+ pa+p! I+eai shows moderate connectivity. However, other lectins showed no binding properties. This result is shown in Table 4. Plaque extracted antigen Ar1ehi+bypgsex (Beanatsu) BxndeirIegti mplicito1 dayConavxlix enxiformi+’(Con^ ) +++ Doliehox biflorus (Ho+ie gram) G1 7cine max (soybeans) Lens eulinari+ (green beans)++Limulus polyp henu+ (Limulin) Ph*5eolu+ wulgxris-E (Plant hemagglutinin) Phsseolns yn1gxri+-L (plant Hemagglutitin) Picas 5xji marim (none) Ricinus c cmnoni+ (RC^1)++5ophoma! 1nonie’s (enji )Tel+agonolohut H+H+eas (hasu)++T+1ji eui vulgxris (malt) ++YUlex ea+opaeus ( UEA-ri Ulex euroBeas (UEA-111Yicia ril loxa (1+olectin) B41 antigen is also 2M trifluoroacetic acid Hydrolysis was carried out by heating at 104°C for 4 hours, followed by carbohydrate analysis. and investigated its characteristics. (Results are shown in the Experimental Details section, Carbohydrate of Human Plasma Antigens Shown in chemical analysis. ) According to the above, the carbohydrate properties of atherosclerotic plaque antigens are This is shown in Figure 22. Hybridoma 15H5, 22D3. QiGE7. Produced by 17H3 The antibodies were tested for binding to various tissues. This means that the antigen This is to examine whether it is plaque-specific. The results of this test are It was performed using the histology method described in the details section, Histology Test Methods. However, it is shown in Table 5. Table 6 further shows cross-reactivity and CAD blood The characteristics of the antibody are clarified by suppressing the antigen in the serum. Actual suppression measurement The results are shown in Figure 25. Figure 26 shows monoclonal serum instead of CAD serum. This figure shows the effect of binding inhibition when using a polyantibody. Table 5, Monoclonal antibody immunohistological screening tissue 15t15 Z2D3 Q1tlE7 171’13 Cerebellum 2-3+0 Cerebral cortex -2-3+ books Medulla oblongata -1-2+ thing peripheral nerve diaphragm Pancreas -3-4 + book 1-± colon Ovary -1-2 + book b - coronary artery lesions Initial lesion -1+± -Developmental lesions ±3-40 -±-1+Normal arteries 4+ *Intracellular staining only a Fibromyocytes only b. Luteal cells only C sebaceous glands only Table 6, Characteristics of monoclonal antibodies 15H522D3 Q 1. OE 7 17F13 isomer 1g MIgM I gG [gMpi f5. 2-(5,0-(5,1-(4,5-5,9)5 ．． 7) 5. 8) 5. 1) Autoantigen reactivity + + 10 〇 [13 Antigen reactivity 10 QIQE7 antigen reactivity Suppression of autoantigen-specific human antibodies Apparent coupling constant 109109?1010 Cerebral cortex dura mater peripheral nerve heart lung trachea bronchus chest Pectoral muscle esophagus diaphragm Pancreas Civil engineering 2 colon Ovary +*a uterus kidney bladder rectum abs lymph nodes Skin civil engineering C coronary artery One lesion 10 -normal artery aorta *Intracellular staining only a Fibromyocytes only b. Luteal cells only C sebaceous glands only Finally, Figures 31-35 show 12D3. QIOE7 Antigen <7) Classification specificity This is a histological representation of the nature of the disease. Figure 31 shows atherosclerosis in the rabbit aorta. Figure 2 shows specific binding of 22D3 antigen to atherosclerotic plaques. non puller Note that there is no staining in the dark area. Figures 32 and 33 show what happens after death. Showing specific binding of 22D3 antibody in unfixed sections of human coronary artery prepared by hand. . Almost no non-specific staining in control sections, i.e. It was treated with a monoclonal antibody, but note that there is no stained area. I want to be noticed. The three photographs in Figure 34 are from serial sections of an artery. Figure 34 shows that z2D3 recognizes late stage plaque antigen and QIOE7 recognizes early stage plaque antigen. clearly demonstrate recognition of plaque antigens or normal cross-sections of arteries. Ru. Figure 34A shows that the junction of Z2D3 is in the occlusion zone. Figure 34B shows that the binding site of QIOE7 is in the opposite area to the area stained by z2D3. that is, in the early stages of atherosclerosis or in still normal arteries. Indicates that Figure 34C shows that using a non-specific monoclonal antibody, binding indicates that it cannot be seen. Figure 35 shows in vivo binding of In-labeled z2D3 in rabbit aorta. . This aorta has been treated to develop an atherosclerotic plaque. Met. This untreated portion of the aorta showed only trace attachment of cancer. In vivo binding of 22D3 in rabbits suggests that antibodies of the invention can be used in vivo It has been shown to be useful in human treatment and imaging. This is especially This is supported by the staining results of human coronary arteries shown in Figures 32-34. Anonymous “i” 1”igurc 1 (to 4, 9) Signal/Noise (CAD/Normal) C1 Figure 5 CAo 35 years old m a s old am α mouth/207) ( 4/a5) (21/121) Figure 6 CAD Under 3s 35 years old Transcendence (45x) (4/25) (!l/49)? 1 table 1,500-500,307 (50) Extinction Extinction Extinction Extinction Channel 8 injection e9θ879 ii wealth 4] 9] < ync. God FigurQn "Data from SW v/bod7 dimension II-. 98% . Figure 23 Data from "sv 豐/body dimen+ion+ II". 100% eye. Figur lightning 24 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160. 1yo@25 Blood on HC clear dilution 20 10 5 2. 5 1. 25 MAb (μg/ml) Figure 26 Z2D3. Purification of 010E7 antigen 〒8mon-1. &1m1lllru-p knee hsu Figure 27 Figpo@30A Regate 30B Fig Po・30C FigLfe 3C[) Flqpo・30E ? 19go 32A ~゛ Fig car 132B Fi grain 13shi Figure 33B ,, , −’J r hook t1 helmet (@34B Wataru Fukasawa, Commissioner of the Japan Patent Office, January 31, 1992, 1. Display of patent application PC T/US 901042722, title of the invention: Atherosclerotic plaque characteristics Foreign antigens, antibodies against them, and their uses - 3. Patent applicant Address: Hamilton Co., Menkou Park, California, United States 1014 Name: Basika 4. Representative Yamada Building 5, Shinjuku 1-1-14, Shinjuku-ku, Tokyo, submission of amendment. Date of publication: August 12, 1991, 531j paper 1 This antigen also includes apolipoprotein, human collagen, fibronectin, and collagen. Antibodies that bind latin, laminin, tenascin and vitronectin It has the characteristic of being reactive. Other properties of the antigen include: Even after boiling the antigen for 1 hour, ha Monochrome produced by hybridoma 15H5 (ATCC accession number HB9839) 8 which showed reactivity with the null antibody and the antigen was dissolved in a phosphate buffered solution. After treatment with M urea for 24 hours at room temperature, 6M guanidihydrochloride dissolved in phosphate buffer solution was added. The mixture was treated with 2M trifluoroacetic acid for 30 minutes at room temperature. Afterwards, it was treated with 3.5M sodium thiocyanate dissolved in phosphate buffer solution for 8 hours at room temperature. or 0.19M sodium dodecyl sulfate dissolved in phosphate buffer solution. Hybridoma 15H5 (ATCC Accession No. H It shows reactivity with the monoclonal antibody produced by B9g39). The invention also provides antigens associated with atherosclerosis and certain normal tissues, or provide an epitope. This antigen is derived from hybridoma 171'13 ( Incoming TCC accession number)! 810189) selectively binds to produced monoclonal antibodies Then, it has zero characteristic. Another antigen is also provided by the invention. This antigen is associated with atherosclerotic Synthesized by or associated with plaque connective tissue and plaque smooth muscle cells It exists in tissues and cells, and hybridoma Z2D3 (^TCC accession number No. HB984G+, Mataha, Vibe'JF-7z2D3/3E5 (ATC selectively binds to monoclonal antibodies produced by C accession number tlB 104115). It has the property of being a lipid-containing molecule. This antigen was further treated with acetone. It has the characteristic that it can be used in histological staining methods that have been destroyed by physical processing. Monthly 1 paper 2 Other materials that can be used as insoluble supports include latex of the above polymers. silica gel, silicon, wafers, glass, paper, insoluble proteins, Metals, metalloids, metal oxides, magnetic materials, semiconductor materials, cermets, etc. can be mentioned. In addition, materials that form gels, such as gelatins, proteins, lipopolysaccharides, silicates, agarose, polyacrylamide polymers that form some aqueous phase, such as compounds or dextrans. , polyalkylene glycols (alkylene containing 2-3 carbon atoms), or or surfactants, such as phosphorus, long chain (12-24 carbon atoms) alkyl, There are amphoteric compounds, such as ammonium salts. Some diagnostic supports are polystyrene, styrene copolymers, or polyester. Polyolefins such as tyrene or polypropylene, and acrylates and methacrylate polymers and copolymers. anti plaque reagent anti Body or plaque antigens can be absorbed by adsorption, ionic bonding, van der Waals adsorption, and electrostatic binding. or other non-covalent bonds to an insoluble support. Wear. Alternatively, it can be attached to an insoluble support by covalent bonding. . A particularly advantageous support for this purpose is a microtiter plate with a large number of wells. Consists of plastic cover inserted into the well surface or into it. The support may also be used as a support for antigens or antibodies. international search report Nizu/IBXll’06Z72 IT rl, +tmI+:'+1-34. 　　　　19　And　IRJ　Are drllbn j++ 4n Antib+sl) Inl+1lSqp+= *J3! + and J36TTT C1411+1! ! 1'l'47d lld Jn-J2 are +1rAkT+j+’+A rl! el)I Itlin`nt GX+1)’plPU+ti+IP! int゛1aII11935teV ( '14tJII Shocking Jl-J'l Are dtAWn rrt-In An t, Lb+Xt'l' l]t Anjiqlln@Kl) and tli A guild *++ppr+rt In clsFIs J361’TTT C 1n1m5 +111-12'+ +nd 1111-11fu srs dra +wn to 4 tJAgq++r, (n ■ d1ac3n(111+ir 1m11g1ng ln c3s++s+ues + 436 hnd 8SNT ml, <tm 152 b+ dr++wn t++ A pt+srmae*urt+=al l:+ampsu5ijlon 　in@＋4SNS Xτtet C1C15t 16Q-174, <nd 17Rarp +1rav nro 4 reag*++t f++r d++1-+nitrogen kng plagu@in clasIIes J241J15and 43F+<T V (,154m* t7+-177srp dr*&, nt->A e+ *rhOd f++r ahlar, ing plug floating■@tn cIA*F+es J2J, Jl55nrl J, IAw rtAiv+ 17 9-tlRI　Are　+lrswn　rrt　A　r? Aq*nF C1yr r, rssting, +tl+1+r++=+rlpr+, +sig 'I cJa+u+es　424. 435sncl J:IF1PCτβ! ! ! 90 1 mouthful 42] 2 Inl#1IIllself aIIal^oolle self-”’”’w”rn>trv, m

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．アテローム動脈硬化性プラークの存在を示す精製抗原であって、複合炭水化 物構造を有し、２００，０００ダルトンより大きい分子量を有し、アテローム動 脈硬化性プラークの細胞外成分として存在することを特徴とする、前記抗原。 ２．平滑筋細胞によって合成されるか、又はその中に存在することを更に特徴と する、請求項１の抗原。 ３．抗原がハイブリドーマ１５Ｈ５（ＡｔＣＣ受託番号ＨＢ９８３９）によって 産生されるモノクローナル抗体に対する選択的結合によって特徴づけられる、請 求項２の抗原。 ４．中性電荷を有することを更に特徴とする請求項３の抗原。 ５．第２２図に表わされる炭水化物プロフィールを有することを更に特徴とする 請求項３の抗原。 ６．抗原がハイブリドドーマ、１７Ｈ３ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０１８９）によ って産生されるモノクローナル抗体に対する選択的結合によって特徴づけられる 、請求項１の抗原。 ７．Ｃｏｎａｖａｌｉａ　ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ，Ｔｒｉｔｉｃｕｍｖｕｌｇａ ｒｉｓ，Ｌｅｎｓｃｎｌｉｎａｒｉｓ，Ｒｉｃｉｎｕｓｃｏｍｍｏｎｉｓ，及び Ｔｒｉｔｃｕｍｖｕｌｇａｒｉｓのレクチンには結合するが、Ａｒａｃｈｉｓｈ ｙｐｑａｅａ，８ａｎｄｅｉｒａｅａｓｉｍｐｌｉｃｉｔｏｌｉａ，Ｄｉｏｌｉ ｃｈｏｓｂｉｆｌｏｒｕｓ，ＧｌｙｃｉｎｅＭａｘ，Ｌｉｍｕｌｕｓｐｏ１ｙｐ ｈｅｎｕｓ，ｐｈａｓｅｏｌｕｓｖｕｌｇａｒｉｓ−Ｅ，Ｐｈａｓｅｏｌｕｓｖ ｕｌｇａｒｉｓ−Ｌ，Ｐｉｓｕｍｓａｔｉｖｕｍ，Ｓｏｐｈｏｙａｊａｐｏｎｉ ｃａ，Ｕｌｅｘｅｕｒｏｐａｅｓ，Ｕｌｅｓｅｕｒｏｐａｅｕｓ，及びＶｉｃｉ ａｖｉｌｌｏｓａのレクチンには結合しないことを更に特徴とする、請求項３の 抗原。 ８．さらに、蛋白質分解酵素、デオキシリボヌクレアーゼ、リパーゼ及びリボヌ クレアーゼによる分解にたいして抵抗性を示すことを特徴とする、請求項３の抗 原。 ９．さらに、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、及びグルコアミラーゼによる部 分的分解にたいして感受性を持つことを特徴とする、請求項３の抗原。 １０．さらに、アポリポ蛋白質、ヒト・コラーゲン、フィブロネクチン、ケラチ ン、ラミニン、テナシン、及びビトロネクチンに結合する抗体にたいして非反応 性であることを特徴とする、請求項３の抗原。 １１．さらに、抗原を１時間沸騰した後で、ハイブリドーマ１５Ｈ５（ＡＴＣＯ 受託番号ＨＢ９８４０）の産生するモノクローナル抗体にたいして反応性を示す ことを特徴とする、請求項３の抗原。 １２．さらに、抗原を、燐酸バッファー生食液に溶解した８Ｍ尿素で室温で２４ 時間処理した後、燐酸バッファー生食液に溶解した６Ｍ塩酸グアニジンで室温で ２４時間処理した後、２Ｍトリフルオロ酢酸と室温で３０分処理した後、燐酸バ ッファー生食液に溶解した３．５Ｍチオシアン酸ナトリウムで室温で８時間処理 した後、又は燐酸バッファー生食液に溶解した０．１９Ｍドデシル硫酸ナトリウ ムで室温で１時間処理した後でも、ハイブリドーマ１５Ｈ５（ＡＴＣＣ受託番号 ＨＢ９８４０）の産生するモノクローナル抗体にたいして反応性を示すことを特 徴とする、請求項３の抗原。 １３．アテローム動脈硬化性プラークの存在を示す精製抗原であって、ハイブリ ドーマＺ２Ｄ３（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ９８４０）または、ハイブリドーマＺ２ Ｄ３／３Ｅ５（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０４８５）の産生するモノクローナル抗 体に選択的に結合する、脂質含有性分子であることを特徴とする、前記抗原。 １４．抗原がさらに、アテローム動脈硬化性プラーク結合組織およびプラーク平 滑筋細胞によって合成される、または、それら組識及び細胞中に存在することを 特徴とする、請求項１３の抗原。 １５．抗原が、アセトン処理で破壊された駆組識学的染色法に用いることができ ることを特徴とする、請求項１３の抗原。 １６．ハイプリドーマＺ２Ｄ３／３Ｅ５（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０４８５）の 産生するモノクローナル抗体に選択的に結合することを特徴とする、請求項１３ の抗原。 １７．抗原が、ハイブリドーマＱ１０Ｅ８７（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０１８８ ）の産生するモノクローナル抗体に選択的に結合することを特徴とする、精製抗 原。 １８．さらに、正常平滑筋細胞および動脈周辺正常結合組織によって合成される 、または、その中に存在する、ことを特徴とする、請求項１７の精製抗原。 １９．検出可能なマーカーで標識されている、請求項１、３、１３、６、または １７の抗原。 ２０．マーカーが、酵素、常磁性イオン、ビオチン、蛍光団、発色団、重金属、 または、放射性同位元素である、請求項１９の抗原。 ２１．マーカーが酵素である請求項２０の抗原。 ２２．酵素が、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼか、または、アルカリ・ ホスファターゼである請求項２１の抗原。 ２３．請求項１、３、または、６の抗原に特異的に結合する精製抗体。 ２４．請求項１３の抗原に特異的に結合する精製抗体。 ２５．請求項１７の抗原に特異的に結合する精製抗体。 ２６．検出可能なマーカーで標識されている請求項２３、２４、または、２５の 抗体。 ２７．マーカーが、酵素、常磁性イオン、ビオチン、蛍光団、発色団、重金属、 または、放射性同位元素である請求項２６の抗体。 ２８．マーカーが酵素である請求項２７の抗体。 ２９．酵素が、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼか、または、アルカリ・ ホスファターゼである請求項２８の抗体。 ３０．請求項２３のモノクローナル抗体。 ３１．ハイブリドーマ１５Ｈ５（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ９８３９）の産生する、 請求項３０のモノクローナル抗体、もしくは、そのフラグメント。 ３２．ハイブリドーマ１７Ｈ３（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０１８９）の産生する 、請求項３０のモノクローナル抗体、もしくは、そのフラグメント。 ３３．請求項２４のモノクローナル抗体。 ３４．ハイブリドーマＺ２Ｄ３（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ９８４０）、または、ハ イブリドーマＺ２Ｄ３／３Ｅ５（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０４８５）の産生する 、請求項３３のモノクローナル抗体、もしくは、そのフラグメント。 ３５．請求項３４のモノクローナル抗体の超可変領域のアミノ酸配列と実質的に 同じアミノ酸配列から成る組換えポリペプチド。 ３６．請求項３５の組換えポリペプチド、または、部位特異的突然変異によって 修飾された同類ペプチドから成る、キメラ抗体、もしくは、そのフラグメント。 ３７．ヒトのフレームワーク領域、および、ヒト抗体の定常領域のアミノ酸配列 から成る請求項３６のキメラ抗体、もしくは、そのフラグメント。 ３８．請求項２５のモノクローナル抗体。 ３９．ハイブリドーマＱ１０Ｅ７（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０１８８）によって 産生される請求項３８のモノクローナル抗体、もしくは、そのフラグメント。 ４０．請求項３９のモノクローナル抗体の超可変領域のアミノ酸配列と実質的に 同じアミノ酸配列から成る組換えポリペプチド。 ４１．請求項４０の組換えポリペプチド、または、部位特異的突然変異によって 修飾された同類ペプチドから成る、キメラ抗体、もしくは、そのフラグメント。 ４２．ヒトのフレームワーク領域、および、ヒト抗体の定常領域のアミノ酸配列 から成る請求項４１のキメラ抗体、もしくは、そのフラグメント。 ４３．固相の支持体に結合した、請求項１、３、１３、６、または、１７の抗原 。 ４４．固相の支持体に結合した、請求項２３、２４、または、２５の抗体。 ４５．固相の支持体に結合した、請求項３１、３２、３４、３５、３９、または 、４０のモノクローナル抗体。 ４６．生物学的試料中に、アテローム動脈硬化性プラーク中にあり、かつ、その 存在を示す抗原を検出する方法であって、その生物学的試料を、請求項２３また は２４の抗体と、抗体が抗原に結合して、検出可能な複合体を形成するような条 件下に接触させ、こうして形成された複合体を検出し、これによって、その生物 学的試料中に存在する抗原を検出することから成る該方法。 ４７．生物学的試料が組織試料である請求項４６の方法。 ４８．生物学的試料が生物学的液体である請求項４６の方法。 ４９．生物学的液体が、血液、血漿、または、血清から成る請求項４８の方法。 ５０．生物学的液体が血清である請求項４９の方法。 ５１．抗体が検出可能なマーカーで標識されている請求項４６の方法。 ５２．抗体がモノクローナル抗体である請求項４６の方法。 ５３．モノクローナル抗体がハイブリドーマ１５Ｈ５（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ９ ８３９）によって産生される請求項５２の方法。 ５４．モノクローナル抗体がハイブリドーマ１７Ｈ３（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１ ０１８９）によって産生される請求項５２の方法。 ５５．モノクローナル抗体がハイブリドーマＺ２Ｄ３（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ９ ８４０）、もしくは、ハイブリドーマＺ２Ｄ３／３Ｅ５（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ １０４８５）によって産生される請求項５２の方法。 ５６．抗体が固相の支持体に結合した請求項４８の方法。 ５７．固相の支持体が、不活性ポリマーでできたビーズである請求項５６の方法 。 ５８．固相の支持体が、マイクロウェルである請求項５６の方法。 ５９．生物学的液体試料において、アテローム動脈硬化性プラーク中にあって、 その存在を指示する抗原の濃度を定量する方法であって、 ａ）固相支持体を、請求項２３または２４の過剰な抗体と、その抗体が固相支持 体の表面に付着することができるような条件下に、接触させ、 ｂ）未結合の抗体を除去し、 ｃ）得られた抗体の結合した固相支持体を、生物学的液体試料と、その試料中の 抗原が結合抗体に結合し、それと複合体を形成するような条件下で接触させ、 ｄ）複合体に結合していない抗原を除去し、ｅ）このようにして形成された複合 体を、複合体中の抗原に特異的に結合する、過剰な、検出可能な試薬と接触させ 、抗体、抗原、及び検出可能な試薬を含む第二の複合体を形成し、ｆ）第二の複 合体に結合しない検出可能な試薬を除去し、ｇ）第二の複合体に含まれる検出可 能な試薬の濃度を定量し、ｈ）これによって、生物学的液体中の抗原の濃度を定 量する、ことから成る前記方法。 ６０．生物学的液体が、血液、血漿、または、血清から成る請求項５９の方法。 ６１．生物学的液体が血清である請求項６０の方法。 ６２．試薬が検出可能なマーカーで標識されている請求項５９の方法。 ６３．マーカーが、酵素、常磁性イオン、ビオチン、蛍光団、発色団、重金属、 または、放射性同位元素である請求項６２の方法。 ６４．試薬が検出可能なマーカーで標識された抗体である請求項５９の方法。 ６５．マーカーが、酵素、常磁性イオン、ビオチン、蛍光団、発色団、重金属、 または、放射性同位元素である請求項６４の方法。 ６６．マーカーが酵素である請求項６５の方法。 ６７．酵素が、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼか、または、アルカリ・ ホスファターゼである請求項６６の方法。 ６８．請求項５９の方法であって、検出可能な試薬が酸素で標識されており、手 順（ｇ）は、第二の複合体を、酸素にたいする特異的な基質に、その酵素が基質 と反応して、検出可能な産物を形成するような条件下で、接触させることである 前記方法。 ６９．生物学的試料において、アテローム動脈硬化性プラーク中にあってその存 在を指示する抗原と特異的に複合体を形成する抗体を検出する方法であって、そ の生物学的試料を、請求項１、３、１３、または、６の抗原に、その生物学的試 料中で抗原が抗体に結合するような条件下に接触させ、抗体に結合した抗原を検 出し、これによって、その生物学的試料中の抗体を検出することから成る前記方 法。 ７０．生物学的試料が組識試料である請求項６９の方法。 ７１．生物学的試料が生物学的液体である請求項６９の方法。 ７２．生物学的液体が、血液、血漿、または、血清から成る請求項７１の方法。 ７３．生物学的液体が、血清である請求項７２の方法。 ７４．抗原が検出可能なマーカーで標識されている請求項６９の方法。 ７５．抗原が固相の支持体に結合した請求項７１の方法。 ７６．固相の支持体が、不活性ポリマーでできたビーズである請求項７５の方法 。 ７７．固相の支持体が、マイクロウェルである請求項７５の方法。 ７８．生物学的液体試料において、アテローム動脈硬化性プラーク中にあって、 その存在を指示する抗原と、特異的に複合体を形成する抗体の濃度を定量する方 法であって、ａ）固相支持体を、請求項１、３、１３、または６の過剰な抗原と 、その抗原が固相支持体の表面に付着することができるような条件下に、接触さ せ、 ｂ）未結合の抗原を除去し、 ｃ）得られた抗原の結合した固相支持体を、生物学的液体試料と、その試料中の 抗体が結合抗原に結合し、それと複合体を形成するような条件下で接触させ、 ｄ）複合体に結合していない抗体を除去し、ｅ）このようにして形成された複合 体を、複合体中の抗体に特異的に結合する、過剰な、検出可能な試薬と接触させ 、抗原、抗体、検出可能な試薬を含む第二の複合体を形成し、ｆ）第二の複合体 に結合しない検出可能な試薬を除去し、ｇ）第二の複合体に含まれる検出可能な 試薬の濃度を定量し、ｈ）これによって、生物学的液体の中の抗体の濃度を定量 する、ことから成る前記方法。 ７９．生物学的液体が血液、血漿、または、血清から成る請求項７８の方法。 ８０．生物学的液体が、血清である請求項７９の方法。 ８１．試薬が検出可能なマーカーで標識されている請求項７８の方法。 ８２．マーカーが、酵素、常磁性イオン、ビオチン、蛍光団、発色団、重金属、 または、放射性同位元素である請求項８１の方法。 ８３．試薬が、検出可能なマーカーで標識された抗体である請求項７８の方法。 ８４．マーカーが、酵素、常磁性イオン、ビオチン、蛍光団、発色団、重金属、 または、放射性同位元素である請求項８３の方法。 ８５．マーカーが酵素である請求項８４の方法。 ８６．酵素が、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼか、または、アルカリ・ ホスファターゼである請求項８５の方法。 ８７．請求項７８の方法であって、検出可能な試薬が、酵素で標識されており、 手順（ｇ）は、第二の複合体を、酵素にたいする特異的な基質に、その酵素が基 質と反応して、検出可能な産物を形成するような条件下で、接触させることであ る前記方法。 ８８．生物学的液体試料において、アテローム動脈硬化性プラーク中にあって、 その存在を指示する抗原の濃度を定量する方法であって、 ａ）固相支持体を、請求項２３または２４の所定量の抗体と、その抗体が固相支 持体の表面に付着することができるような条件下に、接触させ、 ｂ）未結合の抗体を除去し、 ｃ）得られた抗体の結合した固相支持体を、抗原が固相支持体に結合した抗体に 結合し、それと複合体を形成するような条件下で、検出可能なマーカーで標識し た所定量の抗原、および、生物学的液体試料と接触させ、 ｄ）複合体に結合していない抗原を除去し、ｅ）固相の支持体に結合した標識抗 原の濃度を定量し、ｆ）これによって、生物学的液体中の抗原の濃度を定量する 、ことから成る前記方法。 ８９．生物学的液体が、血液、血漿、または、血清から成る請求項８８の方法。 ９０．生物学的液体が血清である請求項８９の方法。 ９１．検出可能なマーカーが、酵素、常磁性イオン、ビオチン、蛍光団、発色団 、重金属、または、放射性同位元素である請求項８８の方法。 ９２．マーカーが酵素である請求項９１の方法。 ９３．酵素が、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼか、または、アルカリ・ ホスファターゼである請求項９２の方法。 ９４．請求項８８の方法であって、抗原が、酵素で標識されており、手順（ｅ） は、固相の支持体に待合した標識抗原を、その酵素にたいして特異的な基質と、 酵素が基質と反応して、検出可能な産物を形成するような条件下で、接触させる ことである、前記方法。 ９５．生物学的液体試料において、アテローム動脈硬化性プラーク中にあって、 その存在を指示する抗原の濃度を定量する方法であって、 ａ）固相支持体を、請求項２３または２４の、所定量の抗体と、その抗体が固相 支持体の表面に付着することができるような条件下に、接触させ、 ｂ）支持体に結合しない抗体は除去し、ｃ）抗体の結合した固相支持体を、生物 学的試料と、その試料中の抗原が結合した抗体に結合し、それと複合体を形成す るような条件下で接触させ、 ｄ）複合体に結合していない抗原を除去し、ｅ）このようにして形成された複合 体を、所定量の、検出可能なマーカーで標識したプラーク抗原と、その標識抗原 が、生物液由来抗原と、抗体への結合を競合するような条件下で接触させ、 ｆ）固相支持体に結合しない標識抗原の濃度を定量し、ｇ）これによって、生物 学的液体の中の抗原の濃度を定量する、ことから成る前記方法。 ９６．生物学的液体が血液、血漿、または、血清から成る請求項９５の方法。 ９７．生物学的液体が血清である請求項９６の方法。 ９８．マーカーが、酵素、常磁性イオン、ビオチン、蛍光団、発色団、重金属、 または、放射性同位元素である請求項９５の方法。 ９９．マーカーが酵素である請求項９８の方法。 １００．酵素が、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼか、または、アルカリ ・ホスファターゼである請求項９９の方法。 １０１．請求項９５の方法であって、抗原が酵素で標識されており、手順（ｆ） は、固相の支持体に今結合していない標識抗原を除去し、これをその酵素にたい する特異的な基質に、その酵素が基質と反応して検出可能な産物を形成するよう な条件下で、接触させることである前記方法。 １０２．生物学的液体試料において、アテローム動脈硬化性プラーク中にあって その存在を指示する抗原と、特異的に複合体を形成する抗体の濃度を定量する方 法であって、ａ）固相支持体を、請求項１、３、１３、または６の所定量の抗原 と、その抗原が支持体の表面に付着することができるような条件下に、接触させ 、 ｂ）未結合の抗原を除去し、 ｃ）得られた、抗原の結合した固相支持体を、検出可能なマーカーで標識した所 定量の抗体、および、生物学的液体と、抗体が固相支持体に結合した抗原に結合 しそれと複合体を形成するような条件下で接触させ、 ｄ）複合体に結合していない抗体を除去し、ｅ）固体支持体に結合した標識抗体 の濃度を定量し、ｆ）これによって、生物学的液体の中の抗体の濃度を定量する 、ことから成る前記方法。 １０３．生物学的液体が、血液、血漿、または、血清から成る請求項１０２の方 法。 １０４．生物学的液体が、血清である請求項１０３の方法。 １０５．マーカーが、酵素、常磁性イオン、ビオチン、蛍光団、発色団、重金属 、または、放射性同位元素である請求項１０２の方法。 １０６．マーカーは、酵素である請求項１０５の方法。 １０７．酵素が、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼか、または、アルカリ ・ホスファターゼである請求項１０６の方法。 １０８．請求項１０２の方法であって、抗体が、酵素で標識されており、手順（ ｅ）は、固相の支持体に結合した標識抗体を、酵素にたいする特異的な基質に、 その酵素が基質と反応して検出可能な産物を形成するような条件下で、接触させ ることである、前記方法。 １０９．生物学的液体試料において、アテローム動脈硬化性プラーク中にあって その存在を指示する抗原と、特異的に複合体を形成する抗体の濃度を定量する方 法であって、ａ）固相支持体を、請求項１、３、１３、または６の所定量の抗原 と、その抗原が支持体の表面に付着することができるような条件下に、接触させ る、 ｂ）支持体に結合していない抗原を除去し、ｃ）抗原の結合した固相支持体を、 生物学的液体試料と、試料中の抗体が結合抗原に結合して、それと複合体を形成 するような条件下で接触させ、 ｄ）複合体に結合していない抗体を除去し、ｅ）形成された複合体を、検出可能 なマーカーで標識した所定量のプラーク抗体と、標識抗体が生物学的液体中の抗 体と、抗原への結合を競合するような条件下に、接触させ、ｆ）固相支持体に結 合していない標識抗体の濃度を定量し、ｇ）これによって、生物学的液体の中の 抗体の濃度を定量する、ことから成る前記方法。 １１０．生物学的液体が血液、血漿、または、血清から成る請求項１０９の方法 。 １１１．生物学的液体が血清である請求項１１０の方法。 １１２．マーカーが、酸素、常磁性イオン、ビオチン、蛍光団、発色団、重金属 、または、放射性同位元素である請求項１０９の方法。 １１３．マーカーが、酵素である請求項１１２の方法。 １１４．酵素が、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼか、または、アルカリ ・ホスファターゼである請求項１１３の方法。 １１５．請求項１０９の方法であって、抗体は酵素で標識されており、手順（ｆ ）は、固相の支持体に結合していない標識抗体を除去し、酵素にたいする特異的 な基質に、その酵素が基質と反応して検出可能な産物を形成するような条件下で 、接触させることである、前記方法。 １１６．アテローム動脈硬化症の進行を監視する方法であって、患者の生物学的 液体試料中にある、請求項１、３、１３、または、６の測定を定量し、測定され た量を、それ以前の時点で測定した量と比較することから成り、ここに、抗原量 の変化は、アテローム動脈硬化性プラークの程度の変化を表わすものである、前 記方法。 １１７．アテローム動脈硬化症治療の効能を監視する方法であって、患者の生物 学的液体試料中にある請求項１、３、１３または６の抗原量を測定し、それ以前 の時点で測定した量と比較することから成り、ここに、抗原量の変化は、アテロ ーム動脈硬化性プラークの程度の変化を表わすものである、前記方法。 １１８．検出可能なマーカーで標識された、請求項２３または２４の抗体から成 る、アテローム動脈硬化性プラーク画像化に用いられる試薬。 １１９．画像化に有効な量の請求項１１８の議薬と、生理的に受容可能な搬送剤 から成る組成物。 １２０．マーカーは、放射性同位元素、Ｘ線にたいして不透明な元素、常磁性イ オン、または、常磁性イオンのキレート化合物である請求項１１８の試薬。 １２１．マーカーが、放射性同位元素である請求項１２０の試薬。 １２２．マーカーが、１−１２３，１−１２５．１−１２８，１−１３１，また は、コバルト−５７，ガリウム−６７，インディウム−１１１，インディウム− １１３ｍ，水銀−１９７，セレン−７５．タリウム−２０１，テクネチウム−９ ９ｍ，鉛−２０３，ストロニチウムー８５，ストロンチウム−８７，ガリウム− ６８，サマリウム−１５３，ユーロピウム−１７１，イッテルビウム−１６９， 亜鉛−６２，レニウム−１８８または、クロム−５１のキレート金属イオン、ま たはその混合物である請求項１２１の試薬。 １２３．マーカーが、ヨー素か、または、ヨー素の金属イオン・キレートである 請求項１２０の試薬。 １２４．マーカーが、常磁性イオンである請求項１２０の試薬。 １２５．常磁性イオンが、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ） 、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、プラセオジ ム（ＩＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（Ｉ ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、デイスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（Ｉ ＩＩ）、エルビウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、またはその混合物 である請求項１２４の試薬。 １２６．アテローム動脈硬化性プラークの画像法であって、画像化すべきアテロ ーム動脈硬化性プラークを請求項１１８の試薬と、試薬がアテローム動脈硬化性 プラークに結合し、そこに結合した試薬を検出し、それによって、アテローム動 脈硬化性プラークを画像化するように、接触させる、前記方法。 １２７．アテローム動脈硬化性プラークと、周辺の正常組織を画像化する方法で あって、 ａ）画像化すべき正常血管腔を、正常内膜および／または中膜に特異的に結合し 、かつ、検出可能なマーカーで標識される抗体と接触させ、 ｂ）アテローム動脈硬化性プラークを、請求項１１８の試薬と、試薬がアテロー ム動脈硬化性プラークに結合するような条件下で接触させ、 ｃ）アテローム動脈硬化性プラークおよび周辺正常組織に結合した試薬を検出し 、それによって、アテローム動脈硬化性プラークおよび周辺正常組織を画像化す ることから成る前記方法。 １２８．請求項１２７の方法であって、正常内膜および／または中膜に特異的に 結合する抗体が精製抗体であり、かつ、この抗体は、動脈周辺の正常平滑筋細胞 及び正常結合組識によって合成され、または、その中に存在することを特徴とす る抗原に特異的に結合する、前記方法。 １２９．抗体がハイブリドーマ Ｑ１０Ｅ７ （ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０１８８ ）によって産生されるモノクローナル抗体である請求項１２７の方法。 １３０．検出可能なマーカーで標識した請求項３９ないし４０の抗体から成る、 正常内膜および／または中膜を画像化するのに使用される試薬。 １３１．画像化に有効な量の請求項１３０の試薬と、生理的に受容可能な搬送剤 から成る、組成物。 １３２．マーカーが、放射性同位元素、Ｘ線にたいして不透明な元素、常磁性イ オン、または、常磁性イオンのキレート化合物である請求項１３０の試薬。 １３３．マーカーが、放射性同位元素である請求項１３２の試薬。 １３４．マーカーが、１−１２３，１−１２５，１−１２８，１−１３１，また は、コパルト−５７，ガリウム−６７，インディウム−１１１，インディウム− １１３ｍ，水銀−１９７，セレン−７５，タリウム−２０１，テクネチウム−９ ９ｍ，鉛−２０３，ストロンチウム−８５，ストロンチウム−８７，ガリウム− ６８．サマリウム−１５３，ユ−ロビウム−１７１，イッテルビウム−１６９， 亜鉛−６２，レニウム−１８８またはクロム−５１のキレート金属イオン、又は その混合物である請求項１３３の試薬。 １３５．マーカーが、ヨー素か、または、ヨー素の金層イオンキレートである請 求項１３４の試薬。 １３６．マーカーが、常磁性イオンである請求項１３２の試薬。 １３７．常磁性イオンが、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鋏（ＩＩＩ） 、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、プラセオジ ム（ＩＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（Ｉ ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ディスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（Ｉ ＩＩ）、エルビウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、またはその混合物 である請求項１３６の試薬。 １３８．アテローム動脈硬化症の進行を監視する方法であって、患者の血管中に ある、請求項１、３、１３、または、６の抗原量を測定し、測定された量を、そ れ以前の時点で測定した量と比較することから成り、ここに抗原量の変化は、ア テローム動脈硬化性プラークの程度の変化を表わすものである、前記方法。 １３９．アテローム動脈硬化症治療の効能を監視する方法であって、患者の血管 にある請求項１、３、１３または６の抗原量を測定し、測定された量を、それ以 前の時点で測定した量と比較することから成り、ここに、抗原量の変化は、アテ ローム動脈硬化性プラークの程度の変化を表わす。 １４０．被検者におけるアテローム動脈硬化性プラークの画像法であって、 ａ）アテローム動脈硬化性プラークを含む血管壁を請求項１１８の試薬と接触さ せ、 ｂ）アテローム動脈硬化性プラークに結合した試薬を検出し、ｃ）アテローム動 脈硬化性プラークを画像化する、ことから成る、前記方法。 １４１．被検者におけるアテローム動脈硬化性プラークおよび周辺正常組織の画 像法であって、 ａ）画像化するべき正常血管腔を、正常内膜および／または中膜に特異的に結合 し、かつ、検出可能なマーカーで標識された抗体と接触させ、 ｂ）画像化すべきアテローム動脈硬化性プラークと周辺領域を含む血管壁を、試 薬がアテローム動脈硬化性プラークに結合するような条件下で、請求項１１８の 試薬と接触させ、ｃ）アテローム動脈硬化性プラーク、および、周辺正常組識に 結合した試薬を検出し、それによって、アテローム動脈硬化性プラークおよび周 辺正常組織を画像化することから成る、前記方法。 １４２．正常内膜および／または、中腹に特異的に結合する抗体が、ハイブリド ーマＱｌ０Ｅ７（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０１８８）によって産生されるモノク ローナル抗体である請求項１４１の方法。 １４３．アテローム動脈硬化性プラークの成分を消化することのできる酵素、ま たは、切断されるとアテローム動脈硬化性プラークの成分を消化することのでき る酸素に変換される酵素前駆体に接合した請求項２３、２４、３４、３５、３６ 、または、３７の抗体。 １４４．ハイブリドーマＺ２Ｄ３（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ９８４０）、もしくは 、ハイブリドーマＺ２Ｄ３／３Ｅ５（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０４８５）によっ て産生されるモノクローナル抗体である請求項１４３の抗体。 １４５．アテローム動脈硬化性プラークの成分を消化することのできる酵素、ま たは、切断されるとアテローム動脈硬化性プラークのある成分を消化することの できる酵素に変換される酵素前駆体に接合した請求項３６、または、３７の抗体 。 １４６．キメラ抗体が、酵素または酵素前駆体に接合したハイブリッド新分子で ある請求項１４５の抗体。 １４７．キメラ抗体が、二官能抗体である請求項１４５の抗体。 １４８．二官能抗体がクアドローマによって産生される請求項１４７の抗体。 １４９．クアドローマが、ハイプリドーマ系統Ｚ２Ｄ３またはＺ２Ｄ３／３Ｅ５ と、酵素に結合するモノクローナル抗体を分泌するあるハイブリドーマとの融合 から得られた請求項１４８の抗体。 １５０．酵素が、蛋白質分解酵素、エラスターゼ、コラゲナーゼ、または、サッ カリダーゼである請求項１４３の抗体。 １５１．酵素が、線維芽細胞性コラゲナーゼ、ゲラチナーゼ、多形核細胞性コラ ゲナーゼ、顆粒細胞性コラゲナーゼ、ストロメリシンＩ、ストロメリシンＩＩ、 または、エラスターゼである請求項１４３の抗体。 １５２．アテローム動脈硬化性プラークの成分を消化するのに有効な量の請求項 １４３の抗体と、生理的に受容可能な搬送剤から成る医薬組成物。 １５３．血管におけるアテローム動脈硬化性プラークの量を減退させる方法であ って、アテローム動脈硬化性プラークを、請求項１４３の抗体から成る試薬と、 その試薬がプラークの成分に結合し、それを消化するような条件及び量で接触さ せる、前記方法。 １５４．アテローム動脈硬化性プラークを消化することのできる酵素の抑制因子 に結合させた請求項２５、３９、４０、４１、または、４２の抗体を含む正常な 動脈組識を、アテローム動脈硬化性プラークを消化することのできる酵素から保 護するのに用いられる試薬。 １５５．抗体が、ハイブリドーマＱ１０Ｅ７（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０１８８ ）によって産生されるモノクローナル抗体である請求項１５４の試薬。 １５６．血管におけるアテローム動脈硬化性プラークの量を減退させる方法であ って、 ａ）正常血管腔を、内膜および／または中膜に特異的に結合し、かつ、そこに、 アテローム動脈硬化性プラークの成分を消化できる酵素の抑制因子を結合する抗 体と、この抗体が正常内膜に結合するような条件下で、接触させ、 ｂ）アテローム動脈硬化性プラークを、請求項１４３の抗体と、その抗体がアテ ローム動脈硬化性プラークに結合するような条件下で接触させる、ことから成る 前記方法。 １５７．請求項１５６の方法であって、正常内膜および／または中膜に特異的に 結合する抗体が精製抗体であり、かつ、この抗体は、動脈周辺の、正常平滑筋細 胞及び正常結合組識によって合成され、または、その中に存在することを特徴と する抗原に特異的に結合する、前記方法。 １５８．抗体が、ハイブリドーマＱ１０Ｅ７（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０１８８ ）によって産生されるモノクローナル抗体である請求項１５７の試薬。 １５９．血管におけるアテローム動脈硬化性プラークの量を減退させる方法であ って、 ａ）アテローム動脈硬化性プラークを、試薬がプラークに結合し試薬・プラーク 複合体を形成するような条件下試薬と接触させるが、ここでプラークと、切断さ れると、酵素に変換され、その酵素の基質は、アテローム動脈硬化性プラークに 見られる結合組織であり、したがって、その酵素は、プラークの成分を溶解する ことができる酵素前駆体に特異的に結合することができ、 ｂ）試薬・プラーク複合体を、酵素前駆体が試薬に結合し、酵素前駆体・試薬・ プラーク複合体を形成するような条件下で、その試薬が特異的に結合する酵素前 駆体と接触させ、ｃ）酵素前駆体・試薬・プラーク複合体を、酵素前駆体を特異 的に切断し、酵素前駆体を酵素に変換することのできる薬剤とその酵素がプラー クを消化できる条件下で、接触させる、ことから成る、前記方法。 １６０．血管におけるアテローム動脈硬化性プラークの量を減退させる方法であ って、 ａ）アテローム動脈硬化性プラークを、試薬がプラークに結合し、試薬・プラー ク複合体を形成するような条件下で、請求項１４３、１４５、または、１４６の 抗体を含む試薬と接触させるが、ここで、試薬は、プラークと、切断されると、 酵素に変換され、その酵素の基質は、アテローム動脈硬化性プラークに見られる 結合組織であり、したがって、その酵素は、プラークの成分を溶解することがで きる酵素前駆体に特異的に結合し、ｂ）酵素前駆体・試薬・プラーク複合体を、 酵素前駆体を特異的に切断し、酵素前駆体を酵素に変換することのできる薬剤と 、その酸素がプラークを消化する条件下で、接触させる、ことから成る前記方法 。 １６１．血管におけるアテローム動脈硬化性プラークの量を減退させる方法であ って、 ａ）アテローム動脈硬化性プラークを、試薬がプラークに結合し、試薬・プラー グ複合体を形成するような条件下で試薬と接触させるが、ここで、試薬は、プラ ークと、切断されると、酵素に変換され、その酵素の基質は、アテローム動脈硬 化性プラークに見られる結合組織であり、したがって、その酵素は、プラークの 成分を溶解することができる酵素前駆体に結合し、ｂ）酵素前駆体・試薬・プラ ーク複合体を、酵素前駆体を特異的に切断し、酸素前駆体を酸素に変換すること のできる薬剤とその酸素が、プラークを消化する条件下で接触させる、ことから 成る前記方法。 １６２．試薬が二官能抗体である請求項１５９または１６１の方法。 １６３．二官能抗体がクアドローマによって産生される請求項１６２の方法。 １６４．二官能抗体が、ハイブリドーマ系統Ｚ２Ｄ３（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ９ ８４０）またはハイブリドーマＺ２Ｄ３／３Ｅ５（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０４ ８５）によって産生されるモノクローナル抗体を含むハイブリドーマ系統と、酵 素に結合するモノクローナル抗体を分泌するあるハイブリドーマとの融合から得 られた、クアドローマ由来のものである請求項１６２の方法。 １６５．酵素前駆体が、顆粒細胞性コラゲナーゼの酵素前駆体である請求項１５ ９または１６０の方法。 １６６．酵素前駆体が、線維芽細胞性コラゲナーゼの酵素前駆体である請求項１ ５９または１６０。 １６７．酵素前駆体が、ストロメリシンの酵素前駆体である請求項１５９または １６０の方法。 １６８．手順（ｃ）の薬剤がプラスミンである請求項１５９または１６０の方法 。 １６９．プラーク消散性波長を持つ放射線を吸収することのできる発色団に結合 した請求項２３または２４の抗体を含む、アテローム動脈硬化性プラーク消散に 用いられる試薬。 １７０．抗体がモノクローナル抗体である請求項１６９の試薬。 １７１．モノクローナル抗体が、ハイブリドーマＺ２Ｄ３（ＡＴＣＣ受託番号Ｈ Ｂ９８４０）によって産生されるモノクローナル抗体である請求項１７０の試薬 。 １７２．発色団が、約１９０ｎｍから１１００ｎｍまでの波長を持つ光を吸収す る請求項１６９の試薬。 １７３．発色団が、フルオレセン、ローダミン、テトラサイクリン、または、ヘ マトポルフィリンである請求項１７２の試薬。 １７４．アテローム動脈硬化性プラークを消散するのに有効な量の請求項１６９ の試薬と、生理的に受容可能な搬送剤を含む組成物。 １７５．アテローム動脈硬化性プラークの消散法であって、ａ）アテローム動脈 硬化性プラークと、請求項１６９の試薬の有効量と接触させ、試薬がアテローム 動脈硬化性プラークに結合し、アテローム動脈硬化性プラーク・試薬複合体を形 成し、ｂ）得られた複合体を、プラーク消散性波長を有する放射線に、するが、 その放射線の十分なエネルギーが発色団によってアテローム動脈硬化性プラーク の消散をもたらすような条件下で暴露することから成る、前記方法。 １７６．血管に存在するアテローム動脈硬化性プラークを消散するための方法で 、 ａ）正常血管腔を、正常内膜および／または中膜に特異的に結合し、プラーク消 散性波長を反射することのできる部分を結合する抗体に接触させ、 ｂ）アテローム動脈硬化性プラークを請求項１６９の試薬と、試薬がアテローム 動脈硬化性プラークに結合するような条件下で接触させ、 ｃ）アテローム動脈硬化性プラークを、プラーク消散性波長を有する放射線に暴 露し、これによってプラークを消散する、ことから成る前記方法。 １７７．正常内膜および／または中腹に特異的に結合する抗体が、ハイブリドー マＱ１０Ｅ７（ＡＴＣＣ受託番号、ＨＢ１０１８８）の産生するモノクローナル 抗体である請求項１７６の方法。 １７８．プラーク消散性波長の放射線を反射することのできる部分に結合する請 求項２５のモノクローナル抗体。 １７９．アテローム動脈硬化症に有効な薬剤に結合させた請求項２４の抗体を含 むアテローム動脈硬化症治療に有用な試薬。 １８０．抗体が、ハイブリドーマＺ２Ｄ３（ＡＴＣＣ受託番号、ＨＢ９８４０） の産生するモノクローナル抗体である請求項１７９の試薬。 １８１．ある被検者におけるアテローム動脈硬化症治療法であって、その被検者 に、請求項１７９の試薬を、アテローム動脈硬化症治療に有効な量投与すること から成る前記方法。 １８２．ある被検者におけるアテローム動脈硬化症治療であって、 ａ）その被検者に、正常内膜および／または中膜に特異的に結合し、かつ、アテ ローム動脈硬化症治療に有効な薬剤の抑制剤をそこに結合する抗体を投与し、 ｂ）その被検者に、アテローム動脈硬化症治療の有効量の請求項１７９の試薬を 投与する、 ことから成る、前記方法。 １８３．正常動脈組織をアテローム動脈硬化症治療に有効な薬剤から保護するの に使用される抗体が、ハイプリドーマＱ１０Ｅ７（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０１ ８８）によって産生されるモノクローナル抗体である請求項１８１の方法。 １８４．アテローム動脈硬化症の治療に有効な薬剤の抑制剤に結合させた請求項 ２５のモノクローナル抗体。 １８５．請求項１、３、１３、または、６の抗原の合成をプロックするアテロー ム動脈硬化症の治療法。 １８６．抗原の合成を、ある核酸にたいして特異的に結合するアンチセンス核酸 分子を用いてブロックするものであり、その核酸の発現が、その抗原の合成に関 連する、請求項１８５の方法。 １８７．抗原の合成を、その抗原の合成に関わる酵素を抑制することによって、 ブロックする請求項１８５の方法。 １８８．請求項１、３、１３、または、６の抗原にたいする抗体の結合をブロッ クするアテローム動脈硬化症の治療法。 １８９．診断法であって、 ａ）患者の体質量示数（ＢＭＩ）を入手し、ｂ）病状に関連する抗原、その他の 血清ないし血漿分析対象、もしくは、該抗原に結合する抗体の濃度についての値 を得、ｃ）患者の体質量示数を、同じ患者の抗原、または、抗体濃度にたいして プロットし、 ｄ）得られた数値を、一組の参考数値と比較し、得られた数値が、参考値を越え ているか、したがって、病的状態の存在を示しているかを調べる、ことから成る 前記方法。 １９０．請求項１８９の方法を用いる、アテローム動脈硬化症にたいする罹患性 の判定法であって、抗原が、請求項１、３、１３、または、６の抗原である、前 記方法。 １９１．請求項１８９の方法を用いる、アテローム動脈硬化症にたいする罹患性 の判定法であって、抗体は、請求項２３、または、２４の抗体である、前記方法 。 [Claims] 1. A purified antigen indicative of the presence of atherosclerotic plaque, comprising a complex carbohydrate structure, has a molecular weight greater than 200,000 Daltons, and has an atherosclerotic structure. The above-mentioned antigen is characterized in that it is present as an extracellular component of atherosclerotic plaques. 2. 2. The antigen of claim 1, further characterized in that it is synthesized by or present in smooth muscle cells. 3. The antigen is characterized by selective binding to the monoclonal antibody produced by hybridoma 15H5 (AtCC Accession No. HB9839). Antigen of claim 2. 4. 4. The antigen of claim 3 further characterized in that it has a neutral charge. 5. 4. The antigen of claim 3 further characterized in that it has a carbohydrate profile as depicted in FIG. 6. The antigen is a hybridoma, 17H3ATCC accession number HB10189). 2. The antigen of claim 1, characterized by selective binding to monoclonal antibodies produced by. 7. It binds to the lectins of Conavalia ensiformis, Triticum vulga ris, Lensclinaris, Ricinus commonis, and Tritcum vulgaris, but binds to the lectins of Arachish ypquaea, 8 and deirae. asimplicitolia, Dioli chosbiflorus, Glycine Max, Limuluspolyp henus, phaseolus vulgaris-E, Phaseolusv ulgaris-L, Pisumsativum, Sopho yajaponi ca,Ulexeuropaes,Uleseuropaeus 4. The antigen of claim 3, further characterized in that it does not bind to lectins of , and Vici avillosa. 8. In addition, proteolytic enzymes, deoxyribonucleases, lipases and ribonuclease The anti-inflammatory agent according to claim 3, characterized in that it exhibits resistance to degradation by creases. original. 9. In addition, α-amylase, β-amylase, and glucoamylase Antigen according to claim 3, characterized in that it is susceptible to partial degradation. 10. In addition, apolipoprotein, human collagen, fibronectin, keratin 4. The antigen according to claim 3, characterized in that it is non-reactive with antibodies that bind to tenacin, laminin, tenascin, and vitronectin. 11. The antigen according to claim 3, which further exhibits reactivity with a monoclonal antibody produced by hybridoma 15H5 (ATCO Accession No. HB9840) after boiling the antigen for 1 hour. 12. Additionally, the antigen was treated with 8M urea dissolved in phosphate-buffered saline for 24 hours at room temperature, followed by 6M guanidine hydrochloride dissolved in phosphate-buffered saline for 24 hours at room temperature, and then treated with 2M trifluoroacetic acid for 30 hours at room temperature. After treatment, phosphoric acid After treatment with 3.5 M sodium thiocyanate in buffered saline for 8 hours at room temperature or 0.19 M sodium dodecyl sulfate in phosphate buffered saline. It has been shown that it shows reactivity with the monoclonal antibody produced by hybridoma 15H5 (ATCC accession number HB9840) even after being treated for 1 hour at room temperature. 4. The antigen of claim 3, which has a characteristic. 13. A purified antigen indicative of the presence of an atherosclerotic plaque, the antigen being a hybrid Monoclonal antibody produced by doma Z2D3 (ATCC accession number HB9840) or hybridoma Z2 D3/3E5 (ATCC accession number HB10485) The antigen is characterized in that it is a lipid-containing molecule that selectively binds to the body. 14. Antigens also target atherosclerotic plaque connective tissue and plaque flattening tissue. Antigen according to claim 13, characterized in that it is synthesized by smooth muscle cells or is present in their tissues and cells. 15. The antigen is destroyed by acetone treatment and can be used for histochemical staining. 14. The antigen according to claim 13, characterized in that: 16. 14. The antigen of claim 13, which selectively binds to a monoclonal antibody produced by hybridoma Z2D3/3E5 (ATCC accession number HB10485). 17. A purified antibody characterized in that the antigen selectively binds to a monoclonal antibody produced by hybridoma Q10E87 (ATCC accession number HB10188). original. 18. 18. The purified antigen of claim 17, further characterized in that it is synthesized by or present in normal smooth muscle cells and normal connective tissue around arteries. 19. 18. The antigen of claim 1, 3, 13, 6, or 17, which is labeled with a detectable marker. 20. 20. The antigen of claim 19, wherein the marker is an enzyme, a paramagnetic ion, biotin, a fluorophore, a chromophore, a heavy metal, or a radioisotope. 21. 21. The antigen of claim 20, wherein the marker is an enzyme. 22. 22. The antigen of claim 21, wherein the enzyme is horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. 23. A purified antibody that specifically binds to the antigen of claim 1, 3, or 6. 24. A purified antibody that specifically binds to the antigen of claim 13. 25. A purified antibody that specifically binds to the antigen of claim 17. 26. 26. The antibody of claim 23, 24, or 25, which is labeled with a detectable marker. 27. 27. The antibody of claim 26, wherein the marker is an enzyme, a paramagnetic ion, biotin, a fluorophore, a chromophore, a heavy metal, or a radioisotope. 28. 28. The antibody of claim 27, wherein the marker is an enzyme. 29. 29. The antibody of claim 28, wherein the enzyme is horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. 30. The monoclonal antibody of claim 23. 31. 31. The monoclonal antibody of claim 30, or a fragment thereof, produced by hybridoma 15H5 (ATCC Accession No. HB9839). 32. 31. The monoclonal antibody of claim 30, produced by hybridoma 17H3 (ATCC Accession No. HB10189), or a fragment thereof. 33. The monoclonal antibody of claim 24. 34. Hybridoma Z2D3 (ATCC accession number HB9840) or 34. The monoclonal antibody of claim 33, produced by hybridoma Z2D3/3E5 (ATCC Accession No. HB10485), or a fragment thereof. 35. A recombinant polypeptide comprising substantially the same amino acid sequence as the hypervariable region amino acid sequence of the monoclonal antibody of claim 34. 36. 36. A chimeric antibody, or a fragment thereof, comprising the recombinant polypeptide of claim 35 or a homologous peptide modified by site-directed mutagenesis. 37. 37. The chimeric antibody or fragment thereof of claim 36, comprising the amino acid sequences of a human framework region and a constant region of a human antibody. 38. The monoclonal antibody of claim 25. 39. 39. The monoclonal antibody of claim 38, or a fragment thereof, produced by hybridoma Q10E7 (ATCC Accession No. HB10188). 40. A recombinant polypeptide comprising substantially the same amino acid sequence as the hypervariable region amino acid sequence of the monoclonal antibody of claim 39. 41. 41. A chimeric antibody, or a fragment thereof, comprising the recombinant polypeptide of claim 40 or a homologous peptide modified by site-directed mutagenesis. 42. 42. The chimeric antibody or fragment thereof of claim 41, comprising the amino acid sequences of a human framework region and a constant region of a human antibody. 43. 18. The antigen of claim 1, 3, 13, 6, or 17 bound to a solid support. 44. 26. The antibody of claim 23, 24, or 25, bound to a solid support. 45. 41. The monoclonal antibody of claim 31, 32, 34, 35, 39, or 40, bound to a solid support. 46. A method for detecting an antigen present in and indicative of an atherosclerotic plaque in a biological sample, the method comprising: detecting an antigen present in an atherosclerotic plaque; contains 24 antibodies and conditions that allow the antibodies to bind to the antigen and form a detectable complex. and detecting the complex thus formed, thereby detecting the antigen present in the biological sample. 47. 47. The method of claim 46, wherein the biological sample is a tissue sample. 48. 47. The method of claim 46, wherein the biological sample is a biological fluid. 49. 49. The method of claim 48, wherein the biological fluid comprises blood, plasma, or serum. 50. 50. The method of claim 49, wherein the biological fluid is serum. 51. 47. The method of claim 46, wherein the antibody is labeled with a detectable marker. 52. 47. The method of claim 46, wherein the antibody is a monoclonal antibody. 53. 53. The method of claim 52, wherein the monoclonal antibody is produced by hybridoma 15H5 (ATCC Accession No. HB9 839). 54. 53. The method of claim 52, wherein the monoclonal antibody is produced by hybridoma 17H3 (ATCC Accession No. HB1 0189). 55. 53. The method of claim 52, wherein the monoclonal antibody is produced by hybridoma Z2D3 (ATCC Accession No. HB9 840) or hybridoma Z2D3/3E5 (ATCC Accession No. HB 10485). 56. 49. The method of claim 48, wherein the antibody is attached to a solid support. 57. 57. The method of claim 56, wherein the solid phase support is a bead made of an inert polymer. 58. 57. The method of claim 56, wherein the solid phase support is a microwell. 59. 25. A method for quantifying the concentration of an antigen in a biological fluid sample indicative of the presence of an atherosclerotic plaque, the method comprising: a) converting the solid support to an excess of the antibody of claim 23 or 24. b) removing unbound antibody, and c) exposing the resulting solid support to which the antibody is bound. , contacting a biological fluid sample under conditions such that the antigen in the sample binds to and forms a complex with bound antibodies; d) removing unconjugated antigen; and e) The complex thus formed is contacted with an excess of a detectable reagent that specifically binds the antigen in the complex to form a second complex comprising the antibody, antigen, and detectable reagent. and f) a second complex. g) removing detectable reagents that do not bind to the second complex; h) thereby determining the concentration of antigen in the biological fluid; The method comprises: 60. 60. The method of claim 59, wherein the biological fluid comprises blood, plasma, or serum. 61. 61. The method of claim 60, wherein the biological fluid is serum. 62. 60. The method of claim 59, wherein the reagent is labeled with a detectable marker. 63. 63. The method of claim 62, wherein the marker is an enzyme, a paramagnetic ion, biotin, a fluorophore, a chromophore, a heavy metal, or a radioisotope. 64. 60. The method of claim 59, wherein the reagent is an antibody labeled with a detectable marker. 65. 65. The method of claim 64, wherein the marker is an enzyme, a paramagnetic ion, biotin, a fluorophore, a chromophore, a heavy metal, or a radioisotope. 66. 66. The method of claim 65, wherein the marker is an enzyme. 67. 67. The method of claim 66, wherein the enzyme is horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. 68. 60. The method of claim 59, wherein the detectable reagent is labeled with oxygen and the detectable reagent is labeled with oxygen. Step (g) is contacting the second complex with a substrate specific for oxygen under conditions such that the enzyme reacts with the substrate to form a detectable product. . 69. In biological samples, its presence in atherosclerotic plaques A method for detecting an antibody that specifically forms a complex with an antigen that instructs the presence of the antibody, the method comprising: the biological sample of claim 1, 3, 13, or 6. The antigen is brought into contact with the antibody under conditions that allow it to bind to the antibody, and the antigen bound to the antibody is detected. and thereby detecting the antibodies in the biological sample. Law. 70. 70. The method of claim 69, wherein the biological sample is a tissue sample. 71. 70. The method of claim 69, wherein the biological sample is a biological fluid. 72. 72. The method of claim 71, wherein the biological fluid comprises blood, plasma, or serum. 73. 73. The method of claim 72, wherein the biological fluid is serum. 74. 70. The method of claim 69, wherein the antigen is labeled with a detectable marker. 75. 72. The method of claim 71, wherein the antigen is attached to a solid support. 76. 76. The method of claim 75, wherein the solid phase support is a bead made of an inert polymer. 77. 76. The method of claim 75, wherein the solid phase support is a microwell. 78. A method for quantifying, in a biological fluid sample, the concentration of an antibody that specifically complexes with an antigen indicative of the presence of an atherosclerotic plaque. a) treating a solid support with an excess of the antigen of claim 1, 3, 13, or 6 under conditions such that the antigen is able to attach to the surface of the solid support; contact b) removing unbound antigen; and c) combining the resulting antigen-bound solid support with a biological fluid sample and antibodies in the sample that bind to the bound antigen and form complexes with it. d) removing any unbound antibody to the complex; and e) subjecting the complex thus formed to an excess of antibody that specifically binds to the antibody in the complex. f) contacting a detectable reagent with a detectable reagent to form a second complex comprising an antigen, an antibody, and a detectable reagent; h) thereby determining the concentration of the antibody in the biological fluid. 79. 79. The method of claim 78, wherein the biological fluid comprises blood, plasma, or serum. 80. 80. The method of claim 79, wherein the biological fluid is serum. 81. 79. The method of claim 78, wherein the reagent is labeled with a detectable marker. 82. 82. The method of claim 81, wherein the marker is an enzyme, a paramagnetic ion, biotin, a fluorophore, a chromophore, a heavy metal, or a radioisotope. 83. 79. The method of claim 78, wherein the reagent is an antibody labeled with a detectable marker. 84. 84. The method of claim 83, wherein the marker is an enzyme, a paramagnetic ion, biotin, a fluorophore, a chromophore, a heavy metal, or a radioisotope. 85. 85. The method of claim 84, wherein the marker is an enzyme. 86. 86. The method of claim 85, wherein the enzyme is horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. 87. 79. The method of claim 78, wherein the detectable reagent is labeled with an enzyme, and step (g) comprises attaching the second complex to a substrate specific for the enzyme. contact with the substance under conditions such that it reacts with the substance to form a detectable product. The method described above. 88. 25. A method for quantifying the concentration of an antigen in a biological fluid sample indicative of the presence of an atherosclerotic plaque, the method comprising: a) adding a solid phase support to the predetermined amount of claim 23 or 24; An antibody and its solid support b) removing unbound antibodies, and c) transferring the resulting antibody-bound solid phase support to the surface of the carrier in which the antigen is attached to the solid phase support. labeled with a detectable marker under conditions such that it binds to and forms a complex with antibodies bound to d) removing uncomplexed antigen and e) contacting a predetermined amount of antigen bound to a solid support with a biological fluid sample; f) thereby determining the concentration of the antigen in the biological fluid. 89. 89. The method of claim 88, wherein the biological fluid comprises blood, plasma, or serum. 90. 90. The method of claim 89, wherein the biological fluid is serum. 91. 89. The method of claim 88, wherein the detectable marker is an enzyme, a paramagnetic ion, biotin, a fluorophore, a chromophore, a heavy metal, or a radioisotope. 92. 92. The method of claim 91, wherein the marker is an enzyme. 93. 93. The method of claim 92, wherein the enzyme is horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. 94. 89. The method of claim 88, wherein the antigen is labeled with an enzyme, and step (e) comprises treating the labeled antigen on a solid support with a substrate specific for the enzyme, and the enzyme as a substrate. the contacting under conditions such that they react and form a detectable product. 95. 25. A method for quantifying the concentration of an antigen in a biological fluid sample indicative of the presence of an atherosclerotic plaque, the method comprising: a) comprising a solid support in a predetermined amount according to claim 23 or 24; b) removing the antibody that does not bind to the support, and c) removing the antibody bound to the solid support under conditions that allow the antibody to adhere to the surface of the solid support. binds to a biological sample and the antigen-bound antibody in the sample and forms a complex with it. d) removing antigen not bound to the complex; and e) contacting the complex thus formed with a predetermined amount of plaque antigen labeled with a detectable marker. , the labeled antigen is brought into contact with a biological fluid-derived antigen under conditions such that it competes for binding to the antibody, f) quantifying the concentration of the labeled antigen that does not bind to the solid support, and g) thereby quantitating the concentration of an antigen in a biological fluid. 96. 96. The method of claim 95, wherein the biological fluid comprises blood, plasma, or serum. 97. 97. The method of claim 96, wherein the biological fluid is serum. 98. 96. The method of claim 95, wherein the marker is an enzyme, a paramagnetic ion, biotin, a fluorophore, a chromophore, a heavy metal, or a radioisotope. 99. 99. The method of claim 98, wherein the marker is an enzyme. 100. 100. The method of claim 99, wherein the enzyme is horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. 101. 96. The method of claim 95, wherein the antigen is labeled with an enzyme, and step (f) includes removing labeled antigen not currently bound to the solid support and directing it to the enzyme. contacting a specific substrate for the enzyme under conditions such that the enzyme reacts with the substrate to form a detectable product. 102. A method for quantifying the concentration of antibodies in biological fluid samples that specifically complex with antigens that indicate the presence of atherosclerotic plaques. A method comprising: a) contacting a solid support with a predetermined amount of the antigen of claim 1, 3, 13, or 6 under conditions such that the antigen can adhere to the surface of the support. b) removing unbound antigen, and c) combining the resulting antigen-bound solid phase support with a predetermined amount of antibody labeled with a detectable marker and with a biological fluid. contacting the antibody under conditions such that it binds to and forms a complex with the antigen bound to the solid support, d) removes the antibody that is not bound to the complex, and e) removes the labeled antibody bound to the solid support. f) thereby quantifying the concentration of the antibody in the biological fluid. 103. Claim 102, wherein the biological fluid comprises blood, plasma, or serum. Law. 104. 104. The method of claim 103, wherein the biological fluid is serum. 105. 103. The method of claim 102, wherein the marker is an enzyme, a paramagnetic ion, biotin, a fluorophore, a chromophore, a heavy metal, or a radioisotope. 106. 106. The method of claim 105, wherein the marker is an enzyme. 107. 107. The method of claim 106, wherein the enzyme is horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. 108. 103. The method of claim 102, wherein the antibody is labeled with an enzyme, and step (e) comprises exposing the labeled antibody bound to a solid support to a specific substrate for the enzyme, the enzyme being the substrate. contact under conditions such that they react to form a detectable product. The said method. 109. A method for quantifying the concentration of antibodies in biological fluid samples that specifically complex with antigens that indicate the presence of atherosclerotic plaques. A method comprising: a) contacting a solid support with a predetermined amount of the antigen of claim 1, 3, 13, or 6 under conditions such that the antigen can adhere to the surface of the support. let me b) removing antigen that is not bound to the support, and c) removing the antigen-bound solid phase support from a biological fluid sample and allowing antibodies in the sample to bind to and complex with the bound antigen. d) removing antibodies not bound to the complex, and e) removing the formed complex from a predetermined amount of plaque antibody labeled with a detectable marker and the labeled antibody. is anti-oxidant in biological fluids. f) binding to a solid support; g) thereby determining the concentration of antibody in a biological fluid. 110. 110. The method of claim 109, wherein the biological fluid comprises blood, plasma, or serum. 111. 111. The method of claim 110, wherein the biological fluid is serum. 112. 110. The method of claim 109, wherein the marker is oxygen, a paramagnetic ion, biotin, a fluorophore, a chromophore, a heavy metal, or a radioisotope. 113. 113. The method of claim 112, wherein the marker is an enzyme. 114. 114. The method of claim 113, wherein the enzyme is horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. 115. 110. The method of claim 109, wherein the antibody is labeled with an enzyme, and step (f) includes removing the labeled antibody that is not bound to the solid support and transferring the enzyme to a specific substrate for the enzyme. contacting the substrate under conditions such that the substrate reacts with the substrate to form a detectable product. 116. A method for monitoring the progression of atherosclerosis, comprising: quantifying the measurement of claim 1, 3, 13, or 6 in a biological fluid sample of a patient; The change in the amount of antigen represents a change in the extent of the atherosclerotic plaque. How to write. 117. A method for monitoring the efficacy of atherosclerosis treatment, the method comprising: measuring the amount of the antigen of claim 1, 3, 13 or 6 in a biological fluid sample of a patient; It consists of comparing the amount of antigen, and here, the change in antigen amount is The above-mentioned method represents a change in the degree of atherosclerotic plaque in a patient's body. 118. consisting of the antibody of claim 23 or 24, labeled with a detectable marker. A reagent used in atherosclerotic plaque imaging. 119. 120. A composition comprising an imaging effective amount of the drug of claim 118 and a physiologically acceptable carrier. 120. Markers include radioactive isotopes, elements that are opaque to X-rays, and paramagnetic 120. The reagent of claim 118, which is a chelate compound of an ion or a paramagnetic ion. 121. 121. The reagent of claim 120, wherein the marker is a radioisotope. 122. The markers are 1-123, 1-125.1-128, 1-131, and are cobalt-57, gallium-67, indium-111, indium-113m, mercury-197, selenium-75. Thallium-201, technetium-9 9m, lead-203, strontium-85, strontium-87, gallium-68, samarium-153, europium-171, ytterbium-169, zinc-62, rhenium-188 or chromium-51 chelate metal ions, or a mixture thereof. 123. 121. The reagent of claim 120, wherein the marker is iodine or a metal ion chelate of iodine. 124. 121. The reagent of claim 120, wherein the marker is a paramagnetic ion. 125. Paramagnetic ions include chromium(III), manganese(II), iron(III), iron(II), cobalt(II), nickel(II), copper(II), and praseodynia. aluminum (III), neodymium (III), samarium (III), gadolinium (III), terbium (III), disprosium (III), holmium (III), erbium (III), ytterbium (III), or 125. The reagent of claim 124, which is a mixture thereof. 126. An imaging method for atherosclerotic plaques, the atherosclerotic plaque being imaged. the atherosclerotic plaque, the reagent binds to the atherosclerotic plaque, and the reagent bound thereto is detected, thereby detecting atherosclerotic plaque. The method described above, comprising imaging and contacting a atherosclerotic plaque. 127. A method for imaging an atherosclerotic plaque and surrounding normal tissue, comprising: a) a normal vascular lumen to be imaged that specifically binds to normal intima and/or media and is detectable; b) contacting the atherosclerotic plaque with the reagent of claim 118, wherein the reagent is an atherosclerotic plaque; c) detecting the reagent bound to the atherosclerotic plaque and surrounding normal tissue, thereby imaging the atherosclerotic plaque and surrounding normal tissue; The method comprising: 128. 128. The method of claim 127, wherein the antibody that specifically binds to normal intima and/or media is a purified antibody, and the antibody is synthesized by normal smooth muscle cells and normal connective tissue surrounding the artery. characterized by being or existing in The method described above, wherein the method specifically binds to an antigen. 129. 128. The method of claim 127, wherein the antibody is a monoclonal antibody produced by hybridoma Q10E7 (ATCC Accession No. HB10188). 130. 41. A reagent for use in imaging normal intima and/or media, comprising the antibody of claims 39-40 labeled with a detectable marker. 131. 131. A composition comprising an imaging effective amount of the reagent of claim 130 and a physiologically acceptable carrier. 132. If the marker is a radioactive isotope, an element that is opaque to X-rays, or a paramagnetic 131. The reagent of claim 130, which is a chelate compound of ion or paramagnetic ion. 133. 133. The reagent of claim 132, wherein the marker is a radioisotope. 134. The markers are 1-123, 1-125, 1-128, 1-131, and Copalt-57, Gallium-67, Indium-111, Indium-113m, Mercury-197, Selenium-75, Thallium-201, Technetium-9 9m, Lead-203, Strontium-85, Strontium-87, Gallium -68. 134. The reagent of claim 133, which is a chelated metal ion of samarium-153, eurobium-171, ytterbium-169, zinc-62, rhenium-188 or chromium-51, or a mixture thereof. 135. The marker may be iodine or a gold ion chelate of iodine. Reagent of claim 134. 136. 133. The reagent of claim 132, wherein the marker is a paramagnetic ion. 137. Paramagnetic ions include chromium(III), manganese(II), scissors(III), iron(II), cobalt(II), nickel(II), copper(II), and praseodynia. aluminum (III), neodymium (III), samarium (III), gadolinium (III), terbium (III), dysprosium (III), holmium (III), erbium (III), ytterbium (III), or 137. The reagent of claim 136, which is a mixture thereof. 138. A method for monitoring the progress of atherosclerosis, comprising: measuring the amount of the antigen according to claim 1, 3, 13, or 6 in a patient's blood vessel; This consists of comparing the amount measured at a previous time point, where the change in antigen amount is determined by The method described above, which represents a change in the degree of telosclerotic plaque. 139. A method for monitoring the efficacy of atherosclerosis treatment, comprising: measuring the amount of the antigen according to claim 1, 3, 13, or 6 in a patient's blood vessels; It consists of comparing the amount measured at the previous time point, where the change in antigen amount is Represents changes in the degree of loamy atherosclerotic plaque. 140. 120. A method of imaging an atherosclerotic plaque in a subject, comprising: a) contacting a blood vessel wall containing an atherosclerotic plaque with the reagent of claim 118. b) detecting reagents bound to atherosclerotic plaques; and c) detecting atherosclerotic plaques. The method comprises: imaging a atherosclerotic plaque. 141. Image of atherosclerotic plaque and surrounding normal tissue in subject An imaging method comprising: a) contacting a normal vascular lumen to be imaged with an antibody that specifically binds to normal intima and/or media and labeled with a detectable marker; and b) imaging. The vessel wall, including the atherosclerotic plaque and surrounding areas to be treated, is sampled. contacting the reagent of claim 118 under conditions such that the drug binds to the atherosclerotic plaque, c) detecting the bound reagent to the atherosclerotic plaque and surrounding normal tissue, thereby Atherosclerotic plaque and surrounding area The method comprises imaging marginal normal tissue. 142. An antibody that specifically binds to the normal intima and/or mid-intima is a hybrid. The monoclonal protein produced by the marketer Ql0E7 (ATCC accession number HB10188) 142. The method of claim 141, which is a local antibody. 143. Enzymes that can digest components of atherosclerotic plaque, or or, when cut, are unable to digest components of atherosclerotic plaque. 38. The antibody of claim 23, 24, 34, 35, 36, or 37, which is conjugated to a zymogen that is converted into oxygen. 144. by hybridoma Z2D3 (ATCC accession number HB9840) or hybridoma Z2D3/3E5 (ATCC accession number HB10485). 144. The antibody of claim 143, which is a monoclonal antibody produced by. 145. Enzymes that can digest components of atherosclerotic plaque, or 38. The antibody of claim 36 or 37, wherein the antibody is conjugated to a proenzyme that, when cleaved, is converted into an enzyme capable of digesting certain components of atherosclerotic plaque. 146. 146. The antibody of claim 145, wherein the chimeric antibody is a hybrid new molecule conjugated to an enzyme or proenzyme. 147. 146. The antibody of claim 145, wherein the chimeric antibody is a bifunctional antibody. 148. 148. The antibody of claim 147, wherein the bifunctional antibody is produced by a quadroma. 149. 149. The antibody of claim 148, wherein the quadroma is obtained from the fusion of hybridoma line Z2D3 or Z2D3/3E5 with a hybridoma that secretes a monoclonal antibody that binds to the enzyme. 150. The enzyme is proteolytic enzyme, elastase, collagenase, or 144. The antibody of claim 143 which is a callidase. 151. Enzymes include fibroblastic collagenase, gelatinase, and polymorphonuclear collagenase. 144. The antibody of claim 143, which is genease, granulocytic collagenase, stromelysin I, stromelysin II, or elastase. 152. 144. A pharmaceutical composition comprising an amount of the antibody of claim 143 effective to digest components of atherosclerotic plaque and a physiologically acceptable carrier. 153. It is a method of reducing the amount of atherosclerotic plaque in blood vessels. Thus, an atherosclerotic plaque is contacted with a reagent comprising the antibody of claim 143 under conditions and in an amount such that the reagent binds to and digests components of the plaque. The method described above. 154. normal arterial tissue containing the antibody of claim 25, 39, 40, 41, or 42 conjugated to an inhibitor of an enzyme capable of digesting atherosclerotic plaque; Protected from enzymes that can reagent used to protect 155. 155. The reagent of claim 154, wherein the antibody is a monoclonal antibody produced by hybridoma Q10E7 (ATCC Accession No. HB10188). 156. It is a method of reducing the amount of atherosclerotic plaque in blood vessels. a) a normal vascular lumen with an antibody that specifically binds to the intima and/or media and binds thereto an inhibitor of an enzyme capable of digesting components of atherosclerotic plaque; b) contacting the atherosclerotic plaque with the antibody of claim 143 under conditions such that the antibody binds to normal intima; contacting the loamy atherosclerotic plaque under conditions such that it binds to the atherosclerotic plaque. 157. 157. The method of claim 156, wherein the antibody that specifically binds to normal intima and/or media is a purified antibody, and the antibody binds to normal smooth muscle cells surrounding an artery. The above method specifically binds to an antigen characterized in that it is synthesized by or present in cells and normal binding tissues. 158. 158. The reagent of claim 157, wherein the antibody is a monoclonal antibody produced by hybridoma Q10E7 (ATCC Accession No. HB10188). 159. It is a method of reducing the amount of atherosclerotic plaque in blood vessels. a) an atherosclerotic plaque is contacted with a reagent under conditions such that the reagent binds to the plaque and forms a reagent-plaque complex, where the plaque and the cleaved Once absorbed, it is converted into an enzyme whose substrate is the connective tissue found in atherosclerotic plaques, and the enzyme therefore specifically binds to the proenzyme that can dissolve components of the plaque. b) converting the reagent-plaque complex to an enzyme to which the reagent specifically binds under conditions such that the zymogen binds to the reagent to form a zymogen-pro-reagent-plaque complex; Before c) A drug capable of specifically cleaving the enzyme precursor and converting the enzyme precursor into an enzyme, and c) the enzyme precursor-reagent-plaque complex. said method, comprising contacting the food under conditions in which it can be digested. 160. It is a method of reducing the amount of atherosclerotic plaque in blood vessels. a) The reagent binds to the atherosclerotic plaque, and the reagent/plaque contacting the antibody of claim 143, 145, or 146 with a reagent comprising the antibody of claim 143, 145, or 146 under conditions such as to form a plaque complex, wherein the reagent is cleaved with the plaque and converted to an enzyme; The enzyme's substrate is the connective tissue found in atherosclerotic plaques, and therefore the enzyme is able to dissolve components of the plaque. b) a drug capable of specifically cleaving the zymogen/reagent/plaque complex and converting the zymogen into an enzyme; contacting under conditions that digest plaque. 161. It is a method of reducing the amount of atherosclerotic plaque in blood vessels. a) The reagent binds to the atherosclerotic plaque, and the reagent/plaque contact with the reagent under conditions such as to form a plastic complex, where the reagent is When cleaved, it is converted into an enzyme, and the substrate for that enzyme is atherosclerosis. connective tissue found in inflammatory plaque; therefore, its enzymes bind to proenzymes that can lyse components of the plaque; b) proenzymes, reagents, and The method comprises contacting the plaque complex with an agent capable of specifically cleaving the enzyme precursor and converting the oxygen precursor to oxygen under conditions in which the oxygen digests the plaque. 162. 162. The method of claim 159 or 161, wherein the reagent is a bifunctional antibody. 163. 163. The method of claim 162, wherein the bifunctional antibody is produced by a quadroma. 164. The bifunctional antibodies are hybridoma strains containing monoclonal antibodies produced by hybridoma line Z2D3 (ATCC Accession No. HB9 840) or hybridoma Z2D3/3E5 (ATCC Accession No. HB104 85) and 163. The method of claim 162, wherein the quadroma is derived from a fusion with a hybridoma that secretes a monoclonal antibody that binds to the quadroma. 165. 161. The method of claim 159 or 160, wherein the zymogen is a granular collagenase zymogen. 166. Claim 1 59 or 160. 167. The enzyme precursor is a fibroblastic collagenase enzyme precursor. 161. The method of claim 159 or 160, wherein the zymogen is a stromelysin zymogen. 168. 161. The method of claim 159 or 160, wherein the agent in step (c) is plasmin. 169. 25. A reagent for use in atherosclerotic plaque dissipation, comprising the antibody of claim 23 or 24 conjugated to a chromophore capable of absorbing radiation having a plaque dissipating wavelength. 170. 170. The reagent of claim 169, wherein the antibody is a monoclonal antibody. 171. 171. The reagent of claim 170, wherein the monoclonal antibody is a monoclonal antibody produced by hybridoma Z2D3 (ATCC Accession No. HB9840). 172. Chromophores absorb light with wavelengths from about 190 nm to 1100 nm. 170. The reagent of claim 169. 173. The chromophore is fluorescein, rhodamine, tetracycline, or 173. The reagent of claim 172, which is matoporphyrin. 174. 170. A composition comprising an amount of the reagent of claim 169 effective to dissolve atherosclerotic plaque and a physiologically acceptable carrier. 175. 170. A method for dissolving an atherosclerotic plaque comprising: a) contacting an atherosclerotic plaque with an effective amount of the reagent of claim 169, the reagent binding to the atherosclerotic plaque; Shape reagent complex b) exposing the resulting complex to radiation having a plaque-dissipating wavelength, but under conditions such that sufficient energy of the radiation results in dissipation of the atherosclerotic plaque by the chromophore; The method comprising: 176. A method for dissolving atherosclerotic plaque present in a blood vessel, comprising: a) binding a normal vascular lumen specifically to normal intima and/or media; b) contacting the atherosclerotic plaque with the reagent of claim 169 under conditions such that the reagent binds to the atherosclerotic plaque; c) exposing the atherosclerotic plaque to radiation having a plaque-dissipating wavelength; exposing and thereby dissipating the plaque. 177. Antibodies that specifically bind to normal intima and/or mid-intima are 177. The method of claim 176, wherein the antibody is a monoclonal antibody produced by MaQ10E7 (ATCC accession number, HB10188). 178. A component that binds radiation at plaque dissipative wavelengths to parts that can be reflected. Monoclonal antibody according to claim 25. 179. comprising the antibody of claim 24 conjugated to a drug effective against atherosclerosis. A useful reagent for the treatment of atherosclerosis. 180. 180. The reagent of claim 179, wherein the antibody is a monoclonal antibody produced by hybridoma Z2D3 (ATCC accession number, HB9840). 181. 180. A method for treating atherosclerosis in a subject, the method comprising administering to the subject the reagent of claim 179 in an amount effective for treating atherosclerosis. 182. The treatment of atherosclerosis in a subject comprises: a) binding specifically to normal intima and/or media; administering an antibody that binds thereto an inhibitor of a drug effective in treating atherosclerosis; and b) administering to the subject an amount of the reagent of claim 179 effective in treating atherosclerosis. The method comprising: 183. 182. The method of claim 181, wherein the antibody used to protect normal arterial tissue from agents effective in treating atherosclerosis is a monoclonal antibody produced by hybridoma Q10E7 (ATCC Accession No. HB10188). 184. 26. The monoclonal antibody of claim 25 conjugated to an inhibitor of a drug effective in the treatment of atherosclerosis. 185. Atherosclerosis that blocks the synthesis of the antigen according to claim 1, 3, 13, or 6. Treatment for arteriosclerosis. 186. Antigen synthesis is blocked using an antisense nucleic acid molecule that specifically binds to a certain nucleic acid, and the expression of that nucleic acid is linked to the synthesis of that antigen. 186. The method of claim 185. 187. 186. The method of claim 185, wherein synthesis of the antigen is blocked by inhibiting an enzyme involved in the synthesis of the antigen. 188. Blocking the binding of antibodies to the antigen of claim 1, 3, 13, or 6. treatment of atherosclerosis. 189. A diagnostic method comprising: a) obtaining a patient's body mass index (BMI); and b) obtaining values for the concentration of antigens associated with the disease state, other serum or plasma analytes, or antibodies that bind to the antigens. c) plot the patient's body mass readings against antigen or antibody concentrations for the same patient, and d) compare the resulting values to a set of reference values, and determine whether the resulting values are the same as the reference values. The method comprises determining whether a value is exceeded, thus indicating the presence of a pathological condition. 190. 190. A method for determining susceptibility to atherosclerosis using the method of claim 189, wherein the antigen is the antigen of claim 1, 3, 13, or 6. How to write. 191. 25. A method for determining susceptibility to atherosclerosis using the method of claim 189, wherein the antibody is the antibody of claim 23 or 24.
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