JPH0544475B2

JPH0544475B2 -

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Publication number: JPH0544475B2
Application number: JP4389584A
Authority: JP
Inventors: Ryoji Noyori; Yoshihiro Hayakawa; Yoshio Aso; Mamoru Uchama
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 1984-03-09
Filing date: 1984-03-09
Publication date: 1993-07-06
Also published as: JPS60190789A

Description

【発明の詳細な説明】〔発明の技術分野〕本発明は糖残基を有する化合物のリン酸化方法
に関し、更に詳しくは、ヌクレオチド等の糖残基
の水酸基がリン酸化された化合物の合成におい
て、ヌクレオシドのような糖残基を有する化合物
の水酸基を容易にかつ選択的にリン酸化し得る方
法に関する。〔発明の技術的背景とその問題点〕遺伝子工学の分野において、オリゴヌクレオチ
ドは近年ますます重要な研究対象となつてきた。
その化学合成の基礎反応はヌクレオシドのリン酸
化である。この反応を容易に進行させるには、下
記反応式でそれぞれ示されるように求電子剤であ
るホスホリル化剤の活性化、あるいは求核剤のヌ
クレオシドの活性化の二つの方法が原理的に考え
られる。（R²＝アルキル基、R³＝ヌクレオキシド残基）従来、この核酸関連分野においては、長期間に
亘つて、強力なリン酸化能を有するホスホリル化
剤（リン酸化剤）の開発に目が向けられていた。
その結果、スルホン酸とリン酸との混合酸無水物
が見い出され、この試剤は、現在、ヌクレオチド
合成のために多用されている。しかしながら、このホスホリル化剤を用いた場
合、作用が強力すぎるために、リン酸化はヌクレ
オシドの糖残基部分の酸素原子（水酸基の酸素原
子）上よりも、核酸塩基の窒素原子（アミノ基の
窒素原子）上でより速く進行するため、反応に際
しては、予め核酸塩基のアミノ基を保護する必要
があつた。また、反応に際しては、ホスホリル化
剤又はヌクレオシドのいずれかを過剰に用いなけ
ればならず、しかも活性化に要するスルホン酸誘
導体（sulfonyl chlorides，sulfonolides）が極め
て高価であるという欠点があつた。ミズノら、ヌ
クレオシドとヌクレオチドの合成、69−239頁、
1977年〔Mizuno et al、The Synthesis of
Nucleosides and Nucleotides、69−239（1977）〕
及びテナー・ジー・エム、ジヤーナル・オブ・
ジ・アメリカン・ケミカル・ソサエテイ、83巻、
159頁、1961年〔Tener、G.M.、Journal of the
American Chemical Society、83、159（1961）〕
参照。これに対し、ホスホロクロリデート又はｐ−ニ
トロフエニルホスフエート等の温和なホスホリル
化剤が見い出された。これらの試剤は安価である
という点で好ましい。しかしながら、反応時間が長く、また強い反応
条件が必要とされ、しかも目的化合物の生成は低
収率であつた。一方、次式：【式】PNP＝−C₆H₄−ｐ− NO₂）等で示されるように、ｐ−ニトロフエノールを脱
離基として有するヌクレオチドと他のヌクレオシ
ドのナトリウムアルコキシドとを反応させて、イ
ンターヌクレオチドを合成する方法が知られてい
る。スカリツク・ブイ．、クロアチカ・ケミカ・
アクタ、49巻、851頁、1977年〔Skaric V.et al、
Croatica Chemica Acta、49、851（1977）〕参
照。しかし、この方法は、極めて強い反応条件が必
要とされ、また、ウラシルヌクレオシド又はチミ
ジルヌクオシドを用いた報告例があるのみで、こ
れら以外の核酸塩基を含むヌクレオシドについて
は全く報告がない。〔発明の目的〕本発明の目的は、上述した欠点がなく、ヌクレ
オシドの水酸基を容易かつ選択的にリン酸化し得
る方法を提供することである。〔発明の概要〕本発明者らは、次式： PX＝ホスホリル化剤、Ｍ＝メタルで示されるように、窒素原子よりも酸素原子と大
きな親和性を示す金属を用いれば、メタルアルコ
キシドとメタルアミドの平衡がアルコキシド側に
ずれてＯ−選択的活性化が達成され、Ｏ−ホスホ
リル化体が選択的に得られるものと考えた。一般
に、結合解離エネルギーは原子間の親和性のひと
つの目安を与える。窒素に関するデータは現在の
ところ不明であるが、マグネシウムは窒素よりも
酸素に対してより大きな親和性をもつと考えられ
ている。結合解離エネルギー（KJmol^-1） Mg−Ｏ：393.7±35 ピー・ジエイ・ダグジギアンら、ザ・ジヤーナ
ル・オブ・ケミカル・フイジクス、第62巻、1824
頁、1975年〔P.J.Dagdigian et al、The
Journal of Chmical Physics、62、1824
（1975）〕；エー・ジー・ガイドン、二原子分子の
解離エネルギーとスペクトル、1968年〔A.G.
Gaydon，Dissociation Energies and Spectra
of Diatomic Molecules、（1968）〕等参照。本発明者らは、以上の推察に基づき、ヌクレオ
シドのような糖残基を有する化合物をまずマグネ
シウムアルコキシドとし、ついでこれをリン酸化
することにより、本発明を完成するに至つた。本発明の製造方法は糖残基を有する化合物をグ
リニヤール試薬で処理した後、ホスホリル化剤を
作用させて、該化合物の水酸基をリン酸化するこ
とを特徴とする。以下、本発明を更に詳細に説明する。本発明のリン酸化反応は、糖残基を有する化合
物（例、ヌクレオシド又はその誘導体等の配糖
体）の糖残基部分の水酸基を、リン酸化する際に
有用な方法である。以下、糖残基を有する化合物として、ヌクレオ
シド又はその誘導体を用いた場合につき、本反応
を説明することとするが、その他の糖残基を有す
る化合物であつても本発明の方法により水酸基を
リン酸化することが可能である。本反応においてヌクレオシドの水酸基をリン酸
化するには、まずグリニヤール試薬を用いてマグ
ネシウムアルコキシドとして水酸基を活性化し、
つぎにホスホリル化剤を用いてリン酸化する。本
反応の代表例として、次式：が挙げられる。上記反応はデオキシリボヌクレオ
シド１〜の3′−リン酸化に限らず、次式：【式】【式】 TBDMS＝Si（CH₃）₂−ｔ−C₄H₉ R⁴＝アルキル基、アリール基で示されるデオキシリボヌクレオキシド３〜又はリ
ボヌクレオキシド４〜の5′−リン酸化にも適用され
る。式１〜〜４〜中、Ｂはアデニン（Ade）、グアニン
（Gua）又はこれらの誘導体のプリン塩基；シト
シン（Cyt）、ラウシル（Ura）、チミン（Thy）
又はこれらの誘導体のピリミジン塩基を表わす。
本発明では、核酸塩基のアミノ基及びイミド基を
保護しなくても、Ｏ−選択的にホスホリル化する
ことができるため、Ｎ−未保護核酸塩基のヌクレ
オシドであつても糖残基部分の水酸基のみを選択
的にリン酸化することができる。グリニヤール試薬としては、例えば次式： R¹MgX （式中、R¹は炭素数１〜９のアルキル基を表
し；Ｘはハロゲン原子を表す）で示される化合物が挙げられる。R¹のアルキル
基としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イ
ソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、sec−ブ
チル、tert−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチ
ル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチ
ル、ｎ−ノニルが例示されるが、最も好ましくは
tert−ブチルである。またＸのハロゲン原子とて
は、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が例示され
るが、最も好ましくは塩素原子である。なお、本発明においては、R¹がアリール基で
あるグリニヤール試薬を用いてもよい。ここでア
リール基としては、例えばC₆H₅−、ｏ−
CH₃C₅H₄−、ｐ−CH₃C₆H₄、２，６−
〔（CH₃）₃C〕₂C₆H₃−、ｐ−CH₃OC₆H₄−、２−ナ
フチル等が挙げられる。以上に掲げたグリニヤール試薬の具体例として
は、例えば、CH₃MgBr、CH₃MgI、
C₂H₅MgBr、ｉ−C₃H₇MgCl、ｉ−C₃H₇MgBr、
ｎ−C₄H₉MgCl、ｔ−C₄H₉MgCl、C₆H₅MgBr、
２，４，６−（CH₃）₃C₆H₂MgClが挙げられるが、
この中では、ｔ−C₄H₉MgCl、C₆H₅MgBr、２，
４，６−（CH₃）₃C₆H₂MgBrが好ましい。ホスホリル化剤としては、例えば次式：（R⁵O）₂POY （式中、R⁵炭素数１〜10のアルキル基又は置換
もしくは非置換アリール基を表わし；Ｙはハロゲ
ン原子又は置換もしくは非置換アリールオキシ基
を表わす。）で示される化合物が挙げられる。R⁵の炭素数１
〜10のアルキル基としては、例えばメチル基、エ
チル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−
ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−
ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、
ｎ−ノニル基、ｎ−デシル基等が挙げられるが、
メチル基、エチル基が最も好ましい。R⁵の置換
もしくは非置換アリール基としては、例えばｏ−
ClC₆H₄−、C₆H₅−、ｐ−NO₂C₆H₄−、２−Cl−
４−NO₂C₆H₆−等が挙げられるが、C₆H₅−、及
びｏ−ClC₆H₄−が好ましい。Ｙのハロゲン原子
としては、例えば塩素原子、フツ素原子等が挙げ
られるが、塩素原子が最も好ましい。Ｙの置換も
しくは非置換アリールオキシ基としては、例えば
ｏ−ClC₆H₄O−、ｐ−NO₂C₆H₄O−、２，４−
（NO₂）₂C₆H₃O−、２−Cl−４−NO₂C₆H₃O−等
が挙げられるが、２−Cl−４−NO₂C₆H₃O−、
Ｐ−NO₂C₆H₄O−、２，４−（NO₂）₂C₆H₃O−等
が好ましい。ホスホリル化剤の具体例としては、
例えば（C₂H₅O）₂POCl、（C₂H₅O）₂PO（OC₆H₃−
２，４−（NO₂）₂）、（ｏ−ClC₆H₄O）₂POCl、（ｏ
−ClC₆H₄O）₂PO（OC₆H₃−２−Cl−４−NO₂）、
（C₂H₅O）₂PO（OC₆H₄−ｐ−NO₂）、（C₂H₅O）₂PO
（OC₆H₃−２−Cl−４−NO₂）、（C₆H₅O）₂POCl、
（C₆H₅O）₂PO（OC₆H₄−ｐ−NO₂）、（C₆H₅O）₂PO（OC₆H₃−２，４−（NO₂）₂）、（C₆H₅O）₂PO（OC₆H₃−２−Cl−４−NO₂）等が
挙げられるが、（C₂H₅O）₂POCl、
（C₆H₅O）₂POCl、（ｏ−ClC₆H₄O）₂POCl、
（C₂H₅O）₂PO（OC₆H₃−２−Cl−４−NO₂）、
（C₆H₅O）₂PO（OC₆H₃−２−Cl−４−NO₂）、
（C₂H₅O）₂PO（OC₆H₃−２，４−（NO₂）₂）、
（C₆H₅O）₂PO（OC₆H₃−２，４−（NO₂）₂）が好ま
しい。本反応は通常、溶媒中で行われる。使用可能な
溶媒としては、例えばテトラヒドロフラン
（THF）、エーテル（ジエチルエーテル）、ジメト
キシエタン等のエーテル系溶媒；ジメチルホルム
アミド（DMF）等のアミド系溶媒；ジクロロメ
タン等のハロゲン化炭化水素系溶媒が挙げられる
が、好ましくはTHF等のエーテル系溶媒及び
DMFである。なお、これらの混合溶媒も使用可
能である。本反応では、まず反応系にグリニヤール試薬を
加え、数分〜数十分間反応せしめた後、生成した
マグネシウムアルコキシドを単離することなく更
にホスホリル化剤を加えて目的化合物を得ること
ができる。グリニヤール試薬の使用量はヌクレオ
シドの水酸基１当量に対して、通常１〜２当量で
ある。また、ホスホリル化剤の使用量はヌクレオ
キシドの水酸基１当量に対して、通常１〜1.4当
量、好ましくは1.1〜1.2当量である。反応温度は
通常０〜60℃、好ましくは15〜25℃であり、反応
時間（上記二反応の合計時間）は通常0.5〜24時
間、好ましくは１〜６時間である。以上の反応が終了した後は、例えば、反応混合
液から目的値を抽出し、これを乾燥後、濃縮し
て、得られた残渣をカラムクロマトグラフイーに
付することにより目的物が得られる。本反応は次式で示されるインターヌクレオチド
結合形成にも有効である。（式中、B¹及びB²は前記の核酸塩基を表し、R¹、
R⁵、Ｘ及びＹは前記と同義であり、R⁶は
TBDMS等の水酸基の保護基を表す）上記反応のステツプＡは前記と同じ反応であ
る。ステツプＢでは、ステツプＡで得られるトリ
エステル体を単離精製することなく第二のヌクレ
オシド成分と反応させることができる。この第二
のヌクレオシド成分とは、前記本発明反応と同様
にヌクレオシドをグリニヤール試薬と反応せしめ
ることにより得たマグネシウムアルコキシドであ
り、該アルコキシドはステツプＡの最終産物であ
るトリエステル体のリン酸基１当量に対して通常
0.7〜1.4当量、好ましくは0.9〜1.2当量加えられ
る。ステツプＢの反応は、前記と同様の溶媒中で
行われ、反応温度は通常15〜60℃、好ましくは25
〜30℃であり、反応時間は通常１〜30時間、好ま
しくは1.5〜24時間である。この反応によりイン
ターヌクレオチドが得られるが、該物質は前記の
如き常法に従い単離することができる。この方法
によれば、ステツプＡだけではなくステツプＢに
おいても核酸塩基を保護する必要がなく、また第
一及び第二のヌクレオシド成分とホスホリル化剤
を上記式の順序で反応系に順次加えるだけで三成
分を連結することができるため、迅速かつ簡便な
インターヌクレオチド結合形成法が提供される。〔発明の効果〕本発明のリン酸化合物の製造方法は次の利点を
有する。 (1) すべての核酸塩基についてアミノ基の保護を
必要としない。 (2) 二官能性ホスホリル化剤を用いることにより
第一のヌクレオシドとの反応（ステツプＡ）で
第二のヌクレオキドアルコキシドとの縮合に活
性な中間体を生成し得る。したがつて、インタ
ーヌクレオチド結合形成のために従来法で汎用
される塩化スルホニル、スルホニルアミドなど
の高価な縮合剤を必要としない。 (3) その結果、従来法によるチミジンあるいはグ
アノシンのホスホリル化で繁々見られる副反応
（核酸塩基部へのスルホニル化）の懸念が無い。 (4) (2)に述べた活性合成中間体は精製する必要が
ない。すなわちインターヌクレオチド結合形成
反応はすべて同一フラスコ内で行うことができ
る。従来のトリエステル法が合成中間体である
ヌクレオシド−リン酸ジエステル体の精製を不
可欠としたのに対し、実験操作が簡便である。
以上総じて従来法に比較し、経済性、操作性に
優れるものである。以上のような利点を有する本発明のリン酸化方
法は、例えば、核酸化学、とくに遺伝子工学、
有機合成化学、農薬化学の分野において、
遺伝子操作を目的としたオリゴあるいはポリヌク
レオチドの合成、有機金属錯体を用いる有機合
成反応、とくに触媒反応の触媒の配位子としての
リン酸化合物の合成、リンを含む有効な農薬の
合成手段として有用である。〔発明の実施例〕融点（mp）補正は行つていない。赤外（IR）
スペクトルはJASCO IRA−１スペクトロメータ
ーで測定した。紫外（UV）スペクトルは日立
228UV−可視光スペクトロメーターで得た。格
磁気共鳴（NMR）スペクトルはJEOL FX−
90Q（90MHz）機器で記録した。テトラメチルシ
ラン（δ_Me4Si＝０）に対するδppm値として化学シ
フトを記録した。生成物の収率は¹H NMR分析
により求めた。内部標準としての１，１，２，２
−テトラクロロエタン（δ＝5.94）又はブロモホ
ルム（δ＝6.80）のシグナルの相対強度を、リン
酸化生成物のシグナル（アデニン5′−ヌクレオチ
ドについてはH₂、ウラシル5′−ヌクレオチドに
ついてはH₆、ウラシル3′−ヌクレオチドについ
てはH₃のシグナル）の相対強度と比較した。元
素分析は名古屋大学農学部で行つた。高圧液体ク
ロマトグラフイー（HPLC）を行うために、
JASCO UVIDEC−100UV吸収検出器を備えた
JASCO Trirotor又はJASCO BIPを用いた。
使用したカラムはコスモシル（ナカライ、ODS
−5μｍ）又はデベロシル（ノムラ、ODS−5μｍ）
であつた。イー・メルク・キーゼルゲル（E.
Merck Kieselgel）60F₂₅₄塗布プレート（0.25mm）
を薄層クロマトグラフイーに用いた。分析用プレ
ートをエタノール−ｐ−アニスアルデヒド−硫酸
−酢酸（90：５：５：１、ｖ／ｖ）の混合液に浸
漬し、次いで加熱して展開した。スポツト箇所は
Rf値で示した。水６％を加え不活化したイ・メ
ルク・キーゼルゲル60（70〜230メツシユ）をカラ
ムクロマトグラフイーに用いた。減圧（１〜３mm
Hg）下で十分加熱し、次いでアルゴンガスを充
満させた反応器を、ｔ−ブチルマグネシウムクロ
リドとの反応用に使用した。ヌクレオシドを、減
圧（１〜３mmHg）、50〜60℃で、P₂O₅により乾
燥させた。抽出によつて得た有機層を無水硫酸マ
グネシウムで乾燥した。ロータリーエバポレータ
ー（40〜50mmHg）又は真空ポンプ（１〜３mm
Hg）で濃縮した。溶媒及び物質ベンゾフエノンケチルカリウムを用いてテトラ
ヒドロフラン（THF）を蒸留した。水素化カル
シウムでピリジン及びジメチルホルムアミド
（DMF）を蒸留した。市販の2′−デオキシアデノ
シン（ヤマサ）、チミジン（コウジン）、2′−デオ
キシシチジン（ヤマサ）、2′−デオキシグアノシ
ン（ヤマサ）、2′，3′−Ｏ−イソプロピリデンア
デノシン（アルドリツチ）、2′，3′−Ｏ−イソプ
ロピリデンウリジン（シグマ）及び2′，3′−Ｏ−
イソプロピリデンシチジン塩酸塩（シグマ）は、
更に精製することなく市販のまま用いた。5′−Ｏ
−もしくは3′−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリルヌ
クレオシド及びＮ ³−メチルウリジンは公知の方
法で製造した。ｔ−ブチルマグネシウムクロリド
のTHF溶液は公知の方法で製造した。グリニヤ
ール試薬の活性マグネシウム量はギルマン法で定
量し、総マグネシウム量はエチレンジアミンテト
ラ酢酸二ナトリウム塩を用いたキレート滴定によ
つて定量した。ジ−ｏ−クロロフエニルホスホロ
クロリデート、ｐ−ニトロフエニルフエニルホス
ホロクロリデート及びジ−ｏ−クロロフエニルｐ
−ニトロフエニルホスフエートは、公知の方法で
製造した。ジエチルホスホロクロリデート及び抽
出操作用溶媒を含む他の全ての有機物質は、市販
物質を単に蒸留又は再結晶しただけで使用した。実施例１ 5′−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−2′−デオ
キシアデノシンジエチル3′−ホスフエート
（２、Ｂ＝Ade、R⁴＝エチル） 5′−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−2′−デオ
キシアデノシン（73.8mg、0.202ｍmol）のTHF
溶液（３ml）を、24℃でｔ−ブチルマグネシウム
クロリド（0.88ml、0.211ｍmol）の0.24M THF
溶液に滴下混合した。５分間撹拌した後、同温
で、ジエチルホスホロクロリデート（41.7mg、
0.242ｍmol）をその懸濁液に加えた。１時間後、
反応混合物をCH₂Cl₂（30ml）で希釈し、0.5N
NaOH水溶液で中和し、しかる後、CH₂Cl₂抽出
した（20ml、10ml×２）。合わせた有機層を10％
食塩水（10ml）で洗い、MgSO₄で乾燥し、蒸発
させると、ゴム状物が得られた。粗性成物の¹H
NMRスペクトルから、表題化合物の収率は96％
であることが判明した。分析試料のスペクトルデータは次のとおりであ
る。Ｒ _f（CHCl₃−CH₃OH、５：１、ｖ／ｖ）
0.51；IR（CHCl₃3540、3405（NH₂）、and1290cm
^-1（Ｐ＝Ｏ）；UV（CH₃OH）259.7nｍ（ε14500）；
¹H NMR（CDCl₃）δ0.04（6H、ｓ、Si（CH₃）₂）、
0.85（9H、ｓ、Si−ｔ−C₄H₉）、1.31（⁶H、dt、Ｊ
＝0.9、7.2Hz、Ｐ（OCH₂CＨ ₃）₂）、2.6−2.8（2H、
ｍ、2H₂）、3.90（2H、ｄ−like、Ｊ＝９Hz、
2H₅′）、3.92−4.34（5H、ｍ、H₄′、2POCH₂）、
4.96−5.16（1H、ｍ、H₃′）、6.21（2H、br ｓ、
NH₂）、6.45（1H、ｔ−like、_J＝6.8Hz、H₁′）、8.07
（1H、ｓ、H₂）、8.29（1H、ｓ、H₈）；¹³C NMR
（CDCl₃、ＣDCl₃＝76.9）δ−6.0、−5.9（Si
（CH₃）₂）、15.7（ｄ、Ｊ＝７Hz、POCH₂ ＣH₃）、
17.8（SiＣ（CH₃）₃）、25.4（SiＣ（CH₃）₃）、39.0
（ｄ、Ｊ＝４Hz、C₂′）、62.8（C₅′）、63.6（ｄ、Ｊ
＝
７Hz、POＣH₂CH₃）、77.6（ｄ、Ｊ＝６Hz、C₃′）、
83.8（C₁′）、85.6（ｄ、Ｊ＝６Hz、C₄′）、119.3
（C₅）、138.0（C₈）、149.1（C₄）、152.5（C₂）、155
.5
（C₆）．計算値（C₂₀H₃₆N₅O₆SiP）：Ｃ、47.89；Ｈ、
7.23；Ｎ、13.96％実測値：Ｃ、47.86；Ｈ、7.25；Ｎ、13.63％実施例２ 5′−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−2′−デオ
キシアデノシンジ−ｏ−クロロフエニル3′−
ホスフエート（２、Ｂ＝Ade、R⁴＝ｏ−クロ
ロフエニル） 5′−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−2′−デオ
キシアデノシン（72.4mg、0.20ｍmol）のTHF溶
液（2.5ml）に、17℃で、ｔ−ブチルマグネシウ
ムクロリドの0.22M THF溶液（0.9ml、0.20ｍ
mol）を加えた。５分間撹拌後、ジ−ｏ−クロロ
フエニルｐ−ニトロフエニルホスウエート（99.4
mg、0.226ｍmol）のTHF溶液（１ml）を17℃で
加えた。同温で15分間撹拌した後、反応混合物を
CH₂Cl₂（30ml）で希釈し、0.5N NaOH水溶液
（20ml）に注いだ。得られたエマルジヨンを遠心
除去した（2000cpm×５mm）。水層をCH₂Cl₂で抽
出した（20ml、10ml×２）。合わせた有機層を10
％食塩水（10ml）で洗い、MgSO₄で乾燥した。
濃縮すると黄色油状物が得られたが、¹H NMRに
よると、表題化合物の収率は98％であつた。分析試料のスペクトルデータは次のとおりであ
る。Ｒ _f（CH₃OH−AcOEt−CHCl₃、１：１：10、
ｖ／ｖ）0.36；mp114−115℃；IR（CHCl₃）
3490、3400（NH₂）、and1290cm^-1（Ｐ＝Ｏ）；UV
（CH₃OH）260nｍ（ε16700）；¹H NMR（CDCl₃）
δ0.08（6H、ｓ、Si（CH₃）₂）、0.89（9H、Si−ｔ−
C₄H₉）、2.87（2H、ｍ、2H₂′）、3.90（2H、２−
like、Ｊ＝3.1Hz、2H₅′、4.43（1H、ｍ、H₄′）、
5.55（1H、ｍ、H₃′）、5.87（2H、br ｓ、NH₂）、
6.52（1H、ｔ−like、Ｊ＝7.0Hz、H₁′）、7.05−
7.57（8H、ｍ、2C₆H₄Cl）、8.11（1H、ｓ、H₂）、
8.34（1H、ｓ、H₈；¹³C NMR（CDCl₃）δ−6.0、
−5.9（Si（CH₃）₂）、17.8（SiＣ（CH₃）₃）、25.4（S
iC
（ＣH₃）₃）、39.2（ｄ、Ｊ＝４Hz、C₂′）、62.7（C₅
′）、
80.6（ｄ、Ｊ＝４Hz、C₃′）、83.8（C₁′）、85.5（ｄ
、
Ｊ＝７Hz、C₄′）119.4（C₅）、121.9（ｄ、Ｊ＝２Hz、
C₆H₄Cl）、125.0（ｄ、Ｊ＝７Hz、C₆H₄Cl）、
126.2、127.6、130.3（C₆H₄Cl）、138.0（C₈）、145.8
（ｄ、Ｊ＝７Hz、C₆H₄Cl）、149.1（C₄）、152.6
（C₂）、155.6（C₆）．計算値（C₂₈H₃₄Cl₂N₅O₆PSi）：Ｃ、50.45；Ｈ、
5.14；Ｎ、10.51％実測値：Ｃ、50.22；Ｈ、5.14；Ｎ、10.54％実施例３ 5′−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−2′−デオ
キシシチジンジエチル3′−ホスフエート
（２、Ｂ＝Cyt、R⁴＝エチル） 5′−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−2′−デオ
キシシチジン（50mg、0.15ｍmol）のTHF懸濁液
（３ml）に、25℃で、ｔ−ブチルマグネシウムク
ロリドの034M THF溶液（0.43ml、0.15ｍmol）
を加えた。５分間撹拌した後、ジエチルホスホロ
クロリテート（30mg、0.18ｍmol）を、25℃で反
応混合物に加えた。15分間撹拌した後、混合物を
CH₂Cl₂（25ml）で希釈し、0.5N NaOH水溶液
（10ml）で洗つた。水層をCH₂Cl₂（10ml×２）で
抽出した。合わせた有機層をMgSO₄で乾燥し、
濃縮した。粗性成物の¹H NMRスペクトルから、
表題化合物の収率は95％であることが判明した。分析試料のスペクトルデータは次のとおりであ
る。：IR（CHCl₃）3540and3400（NH₂）、1260cm^-1
（Ｐ＝Ｏ）；UVλ_nax（CH₃OH）272nｍ（ε9900）；
¹H NMR（CCl₃）δ0.10（ｓ、Si（CH₃）₂）、0.90
（ｓ、Si−ｔ−C₄H₉）、1.34（dt、Ｊ＝1.1、7.1Hz、
2POCH₂CＨ ₃）、1.9−2.3（ｍ、H₂′）、2.6−2.8
（ｍ、H₂′）、3.89（ｍ、2H₅′）、4.11（dq、Ｊ＝7.3
、
7.1Hz、2POCＨ ₂CH₃）、4.27（ｍ、H₄′）、4.92（ｍ、
H₃′）、5.67（ｄ、Ｊ＝7.4Hz、H₅）、6.00（br ｓ、
NH₂）、6.38（dd、Ｊ＝1.8、11.7Hz、H₁′）、7.90
（ｄ、Ｊ＝7.4Hz、H₆）；¹³C NMR（CDCl₃）δ−
6.2、−6.1（Si（CH₃）₂）、15.4（ｄ、Ｊ＝７Hz、
POCH₂ ＣH₃）、17.6（SiＣ（CH₃）₃）、39.4（ｄ、Ｊ
＝４Hz、C₂′）、62.5（C₅′）、63.4（ｄ、Ｊ＝８Hz、
POＣH₂CH₃）、77.3（ｄ、Ｊ＝６Hz、C₄′）、85.0
（ｄ、Ｊ＝８Hz、C₃′）、85.2（C₁′）、94.7（C₅）、
139.4（C₆）、155.3（C₂）、165.5（C₄）．計算値（C₁₉H₃₆N₃O₇PSi）：Ｃ、47.79；Ｈ、
7.60、Ｎ、8.80％実測値：Ｃ、47.66；Ｈ、7.63；Ｎ、8.76％実施例４ 5′−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−2′−デオ
キシグアノシンジエチル3′−ホスフエート
（２、Ｂ＝Gua、R⁴＝エチル） (a) ｔ−ブチルマグネシウムクロリド２当量 5′−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−2′−デ
オキシグアノシン（77.1mg、0.202ｍmol）の
THF懸濁液（３ml）に、25℃でｔ−ブチルマ
グネシウムクロリドの0.24M THF溶液（1.70
ml、0.408ｍmol）を滴下混合した。５分間撹
拌した後、ジエチルホスホロクロリデート
（48.4mg、0.281ｍmol）を、25℃で反応混合物
に滴下混合した。同温で30分間撹拌した後、得
られた溶液をCHCl₃（30ml）で希釈し、混合物
を10％食塩水（20ml）に注いだ。抽出中に生じ
たエマルジヨンを遠心除去した（2000cpm×５
mm）。水層をCH₂Cl₂で抽出した（20ml×３）。
合わせた有機層をMgSO₄で乾燥した。濃縮す
ると固体物（0.13ｇ）が得られたが、その¹H
NMRスペクトルにより、表題化合物は94％得
られていることが判明した。粗性成物をシリカ
ゲルカラムクロマトグラフイーに付した。
CH₃OH−CHCl₃（１：９）で溶出すると、表
題化合物が得られた（93.0mg、89％）。Ｒ _f（CH₃OH−CHCl₃、１：５）0.53；IR
（CHCl₃）3500、3400（NH₂）、1690、1630、
1610（nucleobase）、1255（Ｐ＝Ｏ）cm^-1；UV
（CH₃OH）255nｍ（ε1.34×10⁴）；¹H NMR
（CDCl₃）δ0.60（6H、ｓ、Si（ＣＨ ₃）₂）、0.90
（9H、ｓ、SiC（CH₃）₃）、1.37（6H、ｔ−like、
Ｊ＝７Hz、2POＣ ₂CH₃）、2.5−2.77（2H、ｍ、
2H₂′）、3.72−3.9（2H、ｍ、2H₅′）、3.95−4.35
（5H、ｍ、2POCH₂、H₄′）、5.10（1H、ｍ、
H₃′）、6.25（1H、ｔ−like、Ｊ＝７Hz、H₁′）、
6.47（2H、brs、NH₂）、7.88（1H、ｓ、H₈）、
11.9（1H、brs、NHCO）．¹³C NMR（CD₃OD）
δ−7.2、−7.1（Si（CH₃）₂）、14.6（ｄ、Ｊ＝７
Hz、POCH₂ ＣH₃）、17.2（SiＣ（CH₃）₃）、24.5
（SiC（ＣH₃）₃）、37.7（ｄ、Ｊ＝５Hz、C₂′）、
62.2（C₅′）、63.7（ｄ、Ｊ＝６Hz、POCH₂）、77.4
（ｄ、Ｊ＝６Hz、C₃′）、83.0（C₁′）、85.1（ｄ、Ｊ
＝６Hz、C₄′）、115.9（C₅）、135.2（C₈）、150.5
（C₄）、153.2（C₂）、157.4（C₆）．計算値（C₂₀H₃₆N₅O₇SiP）：Ｃ、46.41；Ｈ、
7.01；Ｎ、13.53％実測値：Ｃ、45.49；Ｈ、6.79；Ｎ、13.27％ (b) ｔ−ブチルマグネシウムクロリド１当量ｔ−ブチルマグネシウムクロリド１当量を用
いたことを除き、上記と同様の操作で反応を行
つた。15℃で６時間撹拌した後、反応混合物を
上記と同様にして処理した。¹H NMRスペクト
ル分析から、表題化合物は88％生成していたこ
とが判明した。実施例５ 5′−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリルチミジンジ
エチル3′−ホスフエート（２、Ｂ＝Thy、R⁴＝
エチル） (a) ｔ−ブチルマグネシウムクロリド２当量 5′−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリルチミジン
（72.0mg、0.20ｍmol）のTHF溶液（３ml）に、
25℃でｔ−ブチルマグネシウムクロリドの
0.24M THF溶液（1.70ml、0.408ｍmol）を加
えた。５分間撹拌した後、ジエチルホスホロク
ロリデート（48.4mg、0.281ｍmol）を25℃で反
応混合物に加えた。30分間撹拌した後、得られ
た均一な溶液をCH₂Cl₂（30ml）で希釈し、10％
食塩水（20ml）で中和した。抽出中に生じたエ
マルジヨンを遠心除去した（2000cpm×５mm）。
水層をCH₂Cl₂で抽出した（20ml、10ml×２）。
合わせた有機層をMgSO₄乾燥し、濃縮した。
残渣（0.14ｇ）の¹H NMRスペクトル分析よ
り、目的生成物の収率は98％であることが判明
した。シリカゲルカラムのクロマトグラフイー
（５ｇ、アセトン−CH₂Cl₂、１：９−１：６）
に付すと、表題化合物が得られた（91.0mg、92
％）。Ｒ _f（acetone−CH₂Cl₂、１：５、ｖ／ｖ）
0.38；mp70−74℃；IR（CHCl₃）3380
（CONH）、1710、1695（nucleebase）、and1260
（Ｐ＝Ｏ）cm^-1；UV（CH₈OH）266nｍ（ε1.12
×10⁴）；¹H NMR（CDCl₃）δ0.03（6H、ｓ、Si
（CH₃）₂）、0.77（9H、ｓ、SiC（CH₃）₃）、1.20
（6H、ｔ、Ｊ＝7.0Hz、Ｐ（OCH₂CＨ ₃）₂）、1.76
（3H、ｓ、Ｃ＝CCH₃）、2.05−2.7（2H、ｍ、
2H₂′）、3.47（2H、brs、2₅′）、3.84−4.15（5H、
ｍ、H₄′、2POCH₂）4.84（1H、ｍ、H₃′）、6.25
（2H、dd、Ｊ＝６、９Hz）、7.34（1H、ｓ、H₆）
10.15（1H、brs、NH）．¹³C NMR（CDCl₃δ−
6.0、5.9（Si（CH₃）₂）、12.0（ＣH₃C＝）、15.7
（POCH₂ ＣH₃）、17.9（SiＣ（CH₃）₃）、25.5
（SiC（ＣH₃）₃）、38.9（ｄ、Ｊ＝６Hz、C₂′）、
62.8（C₅′）、63.7（ｄ、Ｊ＝７Hz、POＣH₂）、
77.7（ｄ、Ｊ＝６Hz、C₃′）、84.1（C₁′）、85.3（ｄ
、
Ｊ＝４Hz、C₄′）、110.6（C₅）、134.4（C₆）、150.2
（C₂）、163.7（C₄）、計算値（C₂₀H₃₇N₂O₈SiP）：Ｃ、48.76；Ｈ、
7.59；Ｎ、5.69％実測値：Ｃ、48.78；Ｈ、7.45；Ｎ、5.64％ (b) ｔ−ブチルマグネシウムクロリド１当量ｔ−ブチルマグネシウムクロリド1.0当量を
用いたこと以外は、上記のとおりに反応を行つ
た。15℃で６時間撹拌した後、同様の方法で反
応混合物を処理した。¹H NMRスペクトル分析
より、表題化合物の収率は92％であることが判
明した。以上の実施例１〜５における実験条件及び収率
を第１表に示した。【表】次に、前記式４〜のリボヌクレオシドについての
リン酸化に関する実施例を掲げる。実施例６ジエチル 2′，3′−Ｏ−イソプロピリデンアデ
ノシン5′−ホスフエート 2′，3′−Ｏ−イソプロピリデンアデノシン（50
mg、0.15ｍmol）のTHF懸濁液（３ml）に、25℃
でｔ−ブチルマグネシウムクロリドの0.34M
THF溶液（0.48ml、0.16ｍmol）、次いでジエチ
ルホスホロクロリデート（36mg、0.21ｍmol）を
加えた。15分後、得られた均一な混合物を
CH₂Cl₂（25ml）で希釈し、0.5N NaOH水溶液
（10ml）で洗つた。水層をCH₂Cl₂で抽出した（10
ml×２）。合わせた有機抽出物を10％食塩水で洗
い、MgSO₄で乾燥した。濃縮すると、無色結晶
が得られた。¹H NMRスペクトル分析より、ホス
フエートの収率は91％であることが判明した。分析試料のスペクトルデータは次のとおりであ
る。Ｒ _f（MeOH−AcOEt、１：33）0.19；mp139
−141℃；IR（CHCl₃）3490、3400（NH₂）
and1290cm^-1（Ｐ＝Ｏ）；UV（CH₃OH）259.2nｍ
（ε17300）；¹H NMR（CDCl₃）δ1.28（6H、ｍ、
2POCH₂ ＣH₃）、1.40、1.63（6H、each、ｓ、Ｃ
（CH₃）₂）、3.7−4.6（7H、ｍ、2POＣH₂CH₃、
H₂′、H₃′、H₄′）、5.10（1H、dd、Ｊ＝3.6、7.5Hz、
H₅′）、5.40（1H、dd、Ｊ＝3.0、7.5Hz、H₅′）、
5.68 2H、br ｓ、NH₂）、6.14（1H、ｄ、Ｊ＝2.5
Hz、H₁′）、7.94（1H、ｓ、H₂）、8.34（1H、ｓ、
H₈）．¹³C NMR（CDCl₃）15.6（ｄ、Ｊ＝７Hz、
POC₂ ＣH₃）、25.0、26.7（Ｃ（CH₃）₂）、63.7（ｄ、
Ｊ＝６Hz、POC₂CH₃）、66.4（ｄ、Ｊ＝５Hz、
C₅′）、81.1（C₃′）、83.8（C₂′）、85.0（ｄ、Ｊ＝
８Hz、
C₄′）、90.5（C₁′）、114.1（Ｃ（CH₃）₂）、119.6（
C₅）、
139.1（C₈）、148.8（C₄）、152.8（C₂）、155.7（C₆）
．計算値（C₁₇H₂₆N₅O₇P）：Ｃ、46.05；Ｈ、5.91；
Ｎ、15.80％実測値：Ｃ、45.90；Ｈ、5.82；Ｎ、15.76％実施例７ジエチル2′，3′−Ｏ−イソプロピリデンシチジ
ン5′−ホスフエート使用前にピリジン（１ml×２）と共沸した2′，
3′−Ｏ−イソプロピリデンシチジン塩酸塩（64.6
mg、0.202ｍmol）のTHF懸濁液（３ml）に、26
℃でｔ−ブチルマグネシウムクロリドの0.24M
THF溶液（1.72ml、0.412ｍmol）を加えた。同
温で５分間撹拌した後、混合物にジエチルホスホ
ロクロリデート（41.7mg、0.242ｍmol）を加え
た。２時間撹拌した後、反応混合物をCH₂Cl₂（20
ml）で希釈し、10％食塩水（20ml）で中和した。
水層をCH₂Cl₂で抽出した（20ml、10ml×２）。合
わせた有機層をMgSO₄で乾燥し、留去するとゴ
ム状物（0.11ｇ）が得られ、これをシリカゲルカ
ラムクロマトグラフイーに付した。CH₃OH−
CHCl₃（１：40−１：30）で溶出すると、表題化
合物が得られた（64.3mg、76％）。Ｒ _f（CH₃OH−CHCl₃、１：10、ｖ／ｖ、
double developments）0.21； IR（CHCl₃）3500、3400（NH₂）、1670、1650
（nuclobase）、1260（Ｐ＝Ｏ）cm^-1.UV（CH₃OH）
269（ε7.19×10³）、240（ε7.74×10³）ｎｍ．¹H
NMR（CDCl₃）δ1.10−1.14（9H、ｍ、CCH₃、
2POCH₂CH₃）、1.52（3H、ｓ、CCH₃）、3.90−
4.44（7H、ｍ、2POＣH₂CH₃、H₂′、H₃′、H₄′、
5.02（2H、dd、Ｊ＝7.2、19.2Hz、2H₅′）、5.46
（1H、br ｓ、H₁′）、6.00（1H、ｄ、Ｊ＝7.2Hz、
H₅′）、7.29（1H、ｄ、Ｊ＝7.2Hz）、8.30（2H、br
ｓ、NH₂）；¹³C NMR（CDCl₃）δ16.1（ｄ、Ｊ＝
７Hz、POC₂ ＣH₃）、25.6、27.1（Ｃ（ＣH₃）₂）、
64.1（ｄ、Ｊ＝７Hz、POＣ ₂CH₃）、67.3（ｄ、Ｊ＝
5.5Hz、C₅′）、82.2（C₃′）、84.9（C₂′）、86.7（
ｄ、Ｊ
＝８Hz、C₄′）、95.7（C₁′）、97.6（C₅）、113.7（
Ｃ
（CH₃）₂）、146.9（C₆）、155.6（C₂）、166.7（C₄）
．計算値（C₁₆H₂₆N₃O₈P）：Ｃ、45.82；Ｈ、6.25；
Ｎ、10.02％実測値：Ｃ、45.88；Ｈ、6.17；Ｎ、9.87％実施例８ジエチル2′，3′−Ｏ−イソプロピリデンウリジ
ン5′−ホスフエート (a) ｔ−ブチルマグネシウムクロリド２当量 2′，3′−Ｏ−イソプロピリデンウリジン
（57.4mg、0.202ｍmol）の溶液に26℃でｔ−ブ
チルマグネシウムクロリドの0.24M THF溶液
（1.72ml、0.412ｍmol）を加えた。５分間撹拌
した後、不均一な混合物に26℃でジエチルホス
ホロクロリデート（48.7mg、0.283ｍmol）を加
えた。同温で１時間撹拌した後、均一な反応混
合物を10％食塩水（20ml）で中和し、CH₂Cl₂
で抽出した（30ml、10ml×２）。合わせた有機
層をMgSO₄で乾燥し、濃縮すると、黄色ゴム
状物（0.13ｇ）が得られたが、これをシリカゲ
ルカラムクロマトグラフイーに付した。アセト
ン−CH₂Cl（１：９−４：６）で溶出すると、
表題化合物が得られた（77.6mg、91％）。Ｒ _f（CH₃OH−CHCl₃、１：10、ｖ／ｖ）
0.33； IR（CHCl₃）3390（CONH）、1730、1695
（nucleobase）、1270（Ｐ＝Ｏ）cm^-1.UV
（CH₃OH）259nｍ（ε9.17×10³）．¹H NMR
（CDCl₃）δ1.35（9H、ｍ、2POCH₂CＨ ₃）、1.58
（3H、ｓ、CCH₃）、3.95−4.22（7H、ｍ、2PO
ＣH₂CH₃、H₂′、H₃′、H₄′）、4.88（2H、ｍ、
2H₅′）、5.70（1H、ｄ、Ｊ＝7.5Hz、H₅′）、5.78
（1H、ｄ、Ｊ＝1.2Hz、H₁′）、7.38（1H、ｄ、Ｊ
＝7.5Hz、H₆）、9.52（1H、br ｓ、NH）．；¹³C
NMR（CDCl₃）δ15.8（ｄ、Ｊ＝７Hz、
POC₂CH₃）、25.0、26.8（Ｃ（ＣH₃）₂）、63.8（ｄ、
Ｊ＝６Hz、POC₂CH₃）、66.5（ｄ、Ｊ＝６Hz、
C₅′）、80.4（C₃′）、84.1（C₂′）、84.6（ｄ、Ｊ＝
８
Hz、C₄′）、93.4（C₁′）、102.3（C₅）、114.3（Ｃ
（CH₃）₂）、141.5（C₆）、149.9（C₂）、163.3（C₄）
．計算値（C₁₆H₂₅N₂O₉P）：Ｃ、45.72；Ｈ、
5.99；Ｎ、6.66％実測値：Ｃ、45.81；Ｈ、6.20；Ｎ、6.28％ (b) ｔ−ブチルマグネシウムクロリド１当量ｔ−ブチルマグネシウムクロリド１当量を用
いたこと以外は、上記操作に従い反応を行つ
た。15℃で６時間撹拌した後、上記実験と同様
の方法で反応混合物を処理した。¹H NMRスペ
クトル分析より、目的生成物の収率は60％であ
つた。次に、本発明の製造方法を用いたインターヌ
クレオチド結合形成法に関する応用例を掲げ
る。応用例１フエニル5′−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−
2′−デオキシアデニリル（3′→5′）−3′−Ｏ−ｔ
−ブチルジメチルシリル−2′−デオキシアデノ
シン 3′−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−2′−デオ
キシアデノシン（73.8mg、0.202ｍmol；３、Ｂ
（B¹）＝Ade）のTHF溶液（３ml）に15℃でｔ−
ブチルマグネシウムクロリド（0.92ml、0.202ｍ
mol）の0.22M溶液を加え、５分間撹拌した。反
応混合物をアルゴンガス下、15℃で15分間かけて
フエニルｐ−ニトロフエニルホスホロクロリデー
ト（72.4mg、0.231ｍmol）のTHF溶液（１ml）
中に加え、15℃で３時間撹拌した。5′−Ｏ−ｔ−
ブチルジメチルシリル−2′−デオキシアデノシン
（81.7mg、0.223ｍmol；１、Ｂ（B²）＝Ade）の
THF溶液（２ml）に15℃でｔ−ブチルマグネシ
ウムクロリドの0.22M THF溶液（1.01mg、0.223
ｍmol）を加えた。得られた溶液にアルゴンガス
下、15℃で上記で得た5′−ヌクレオチドを含む反
応混合物を加えた。1.5時間撹拌した後、得られ
た黄色溶液をCH₂Cl₂（30ml）で希釈し、0.5N
NaOH水溶液で中和し、CH₂Cl₂で抽出した（20
ml×２、10ml）。合わせた有機抽出液を10％食塩
水（10ml）で洗い、MgSO₄で乾燥した。留去す
ると淡黄色ゴム状物が得られた（0.24ｇ）。アセ
トン−ベンゼン（１：10−２：５）、次いで
CH₃OH−CHCl₃（１：10−１：５）でシリカゲ
ルカラムクロマトグラフイーに付すと、無色非晶
体のジアステレオマーの１：１混合物として表題
化合物が得られた（133.2ｇ、85％）。これらのジアステレオマーはHPLCによると二
つに分裂したピークを示す（コスモシルODS−
5μｍ、λ＝260nｍ、流速＝１mlmm^-1、圧力＝1.27
×107Pa、溶媒＝H₂O−CH₃OH、１：４：７、
ｖ／ｖ）。一つの異性体：Ｔ _R＝19mm：Ｒ _f
（CH₃OH−AcOEt−CHCl₃、１：１：10、ｖ／
ｖ）0.21；IR（CHCl₃）3500、3410（NH₂）
and1280cm^-1（Ｐ＝Ｏ）；UV（CH₃OH）260nｍ
（ε26000）；¹H NMR（CDCl₃）δ0.06、0.09（12H.
two s′s、2Si（CH₃）₂）、0.87、0.90（18H.two s′s
、
2Si−ｔ−C₄H₉）、2.26−2.98（4H、ｍ、4H₂′）、
3.82（2H、ｍ、2H₅′−OSi）4.02−4.48（4H、ｍ、
2H₄′、2H₅′OP）、4.65（1H、ｍ、H₃′OSi）、5.22
（1H、ｍ、H₃′OP）．6.20−6.56（6H、ｍ、2H₁′、
2NH₂）、7.12−7.38（5H、ｍ、C₆H₅）、7.97、8.08
（2H、two s′s、2H₂）、8.27（2H、ｓ、2H₈）；
FDMS（ｍ／ｚ）868（M⁺）．他の異性体：Ｔ _R＝23
mm：Ｒ _f（CH₃OH−AcOEt−CHCl₃、１：１：
10、ｖ／ｖ）0.22；IR（CHCl₃）3500、3410
（NH₂）and1290cm^-1（Ｐ＝Ｏ）；UV（CH₃OH）
260nｍ（ε27000）；¹H NMR（CDCl₃）δ0.04、
0.11（12H.two s′s、2Si（CH₃）₂）、0.84、0.91
（18H、two s′s、2Si−ｔ−C₄H₉）、2.28−3.02
（4H、ｍ、4H₂′）、3.74（2H、ｍ、2H₅′−OSi）、
4.18（2H、ｍ、2H₅′OP）、4.39（2H、ｍ、2H₄′）、
4.68（1H、ｍ、H₃′OSi）、5.22（1H、ｍ、H₃′OP）、
6.18（4H、br ｓ、2NH₂）、6.41（2H、ｍ、2H₁′）、
7.12−7.44（5H、ｍ、C₆H₅）、7.98、8.04（2H、
two s′s、2H₂）、8.26（2H、ｓ、2H₈）；FDMS
（ｍ／ｚ）868（M⁺）．応用例２フエニル5′−Ｏ−ｔ−ブチルジメチル−2′−デ
オキシシチジリル（3′→5′）−3′−Ｏ−ｔ−ブチ
ルジメチルシリル−2′−デオキシアデノシン 3′−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−2′−デオ
キシアデノシン（81.4mg、0.223ｍmol；３、Ｂ
（B¹）＝Ade）のTHF溶液（2.5ml）に、15℃で15
分間かけてｔ−ブチルマグネシウムクロリドの
0.22M THF溶液（1.01ml、0.223ｍmol）を加え
た。５分間撹拌した後、混合物を15℃でフエニル
ｐ−ニトロフエニルホスホロクロリデート（79.7
mg、0.254ｍmol）のTHF溶液（１ml）に加え、
2.5時間撹拌した。5′−Ｏ−ｔ−ブチルジメチル
シリル−2′−デオキシシチジン（83.8mg、0.245ｍ
mol；１Ｂ（B²）＝Cyt）のTHF懸濁液（２ml）に
15℃でｔ−ブチルマグネシウムクロリドの0.22M
THF溶液（1.11ml、0.245ｍmol）を加えた。得
られた懸濁液に、アルゴンガス下、15℃で上記得
た5′−ヌクレオチドを含む反応混合物を加えた。
60℃で２時間撹拌した後、得られた黄色溶液を
CH₂Cl₂（30ml）で希釈し、0.5N NaOH（20ml）
で洗つた。得られたエマルジヨンを遠心除去した
（2000cpm×５mm）。水層をCH₂Cl₂で抽出した
（20ml×２、10ml）。合わせた有機抽出液を10％食
塩水（10ml）で洗い、乾燥した。濃縮すると淡黄
色ゴム状物（0.28ｇ）が得られ、これをシリカゲ
ルカラムクロマトグラフイーに付した。CH₃OH
−CHCl₃（１：50−１：５）で溶出させると、無
色非晶体として表題化合物が得られた（151.4mg、
81％、ジアステレオマーの１：１混合物）。Ｒ _f（CH₃OH−CHCl₃、２：15、ｖ／ｖ）
0.33； IR（CHCl₃）3500、3400（NH₂）、1630、1595
（nucleobase）、1250（Ｐ＝Ｏ）cm^-1. UV（CH₃OH）260nｍ． ¹H NMR（CDCl₃）0.05、0.70、0.10（12H、
three s′s、2Si（CH₃）₂）、0.86、0.90（18H、two
s′s、2SiC（CH₃）₃）、2.2−2.96（4H、ｍ、4H₂′）
、
3.82（2H、ｍ、2H₅′OSi）、4.05−4.46（4H、ｍ、
2H₄′、2H₅′OP）、4.66（1H、ｍ、H₃′OSi）、5.05
（1H、ｍ、H₃′OP）、5.69（1H、ｄ、Ｊ＝7.5Hz、
H₅）、6.25−6.55（2H、ｍ、2H₁′）、6.95（2H.brs、
NH₂）、7.10−7.37（5H、ｍ、C₆H₅）、7.77（1H、
ｄ、Ｊ＝7.5Hz、H₆）、7.85（2H、brs、NH₂）、
8.08、8.27（1H.two s′s、H₂）、8.29、8.51（1H、
two s′s、H₈）．応用例３Ｏ−クロロフエニル5′−Ｏ−ｔ−ブチルジメチ
ルシリル−2′−デオキシグアニリル（3′→5′）−
3′−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−2′−デオ
キシアデノシン 3′−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−2′−デオ
キシアデノシン（74.9mg、0.205ｍmol；３Ｂ（B¹）
＝Ade）のTHF溶液（2.5ml）に15℃でｔ−ブチ
ルマグネシウムクロリドの0.79M THF溶液
（0.26ml、0.205ｍmol）を加えた。５分間撹拌し
た後、アルゴンガス下で10分間かけて反応混合を
ｏ−クロロフエニルｐ−ニトロフエニルホスホロ
クロリデート（78.7mg、0.226ｍmol）のTHF溶
液（１ml）に加えた。混合物を15℃で２時間撹拌
した。5′−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−2′−
デオキシグアノシン（86.2mg、0.226ｍmol；１、
Ｂ（B²）＝GuaのDMF溶液（２ml）に15℃でｔ−
ブチルマグネシウムクロリドの0.97M THF溶液
（0.57ml、0.451ｍmol）を加えた。得られた懸濁
液にアルゴンガス下、15℃で上記で得た5′−ヌク
レオチドを含む反応混合を加えた。15℃で24時間
撹拌した後、反応混合物にメタノール（１ml）を
加え、15℃で10分間撹拌した。ほぼ乾燥するまで
蒸発すると残渣が得られ、これをCH₂Cl₂（30ml）
に溶かし、10％食塩水（25ml）に注いだ。得られ
たエマルジヨンを遠心除去し（2000cpm×５mm）、
水層をCH₂Cl₂で抽出した（25ml×２、10ml×
２）。合わせた有機層をMgSO₄で乾燥した。蒸発
させて得られた黄色油状物（0.26ｇ）をシリカゲ
ルカラムクロマトグラフイーに付した。CH₃OH
−CHCl₃（１：40−１：５）で溶出させると無色
非晶体として表題化合物が得られた（106.1mg、
56％、ジアステレオマーの１：１混合物）。Ｒ _f（CH₃OH−CHCl₃、１：５、）0.54； IR（CHCl₃）3500、3320（NH₂）、1700、1645、
1610（nucleobase）、1260（Ｐ＝Ｏ）cm^-1. UV（CH₃OH）258nｍ． ¹H NMR（CDCl₃）−0.19、0.0、0.07、0.10
（12H、four s′s、2Si（CH₃）₂）、0.80、0.81、
0.89、0.90（18H、four s′s、2Si（CH₃）₃）、2.1−
3.1（4H、ｍ、4H₂′）、3.70（2H、ｍ、2H₅′OSi）、
4.1−4.8（5H、ｍ、2H₄′、2H₅′OP、H₃′OSi）、
5.13（1H、ｍ、H₃′OP）、6.03−6.5（2H、ｍ、
2H₁′）、6.63−7.5（8H、ｍ、2NH₂、C₆H₄Cl）
7.7、7.77（1H、two s′s、H₈ of Gu）、8.0、8.03
（1H、two s′s、H₂ of Ad）、8.33、8.35（1H、
two s′s、H₈ of Ad）、12.86（1H、brs、NH）．本実施例で用いたｏ−クロロフエニルｐ−ニト
ロフエニルホスホロクロリデートは次のようにし
て得た。ｏ−クロロフエニルホスホロクロリデート
（9.39ｇ、38.32ｍmol）．ｐ−ニトロフエノール
（4.84ｇ、34.8ｍmol）及びマグネシウムクロリド
（20mg、0.21ｍmol）の混合物を、45℃で１時間、
70℃で１時間、80℃で１時間、100℃で１時間及
び120℃で６時間撹拌した。反応温度を上げてい
る間は、HClガスが発生し、KOH水溶液で捕捉
した。反応経過は¹H NMRで監視した。得られ
た黄色油状物からアスピレーターでCaCl₂管を通
して脱気した。バルブ間の蒸留（240℃／６mm
Hg）により、淡黄色固体物としての表題化合物
（6.03ｇ、50％）を得た。 mp60−65℃；IR（KBr）1620、1590、and1520
（ｏ−置換Ar）、1520and1345（NO₂）、1200（Ｐ＝
０）、860（ｐ−置換Ar）、760（ｏ−置換Ar）cm
^-1；¹H NMR（CDCl₃）7.2−7.7（6H、ｍ、
C₆H₄Cl、OCCＨ＝CHCNO₂）、8.25−8.5（2H、
ｍ、OCCH＝ＣＨCNO₂）．応用例４ｏ−クロロフエニル5′−Ｏ−ｔ−ブチルジメチ
ルシリルチミジリル（3′→5′）−3′−Ｏ−ｔ−ブ
チルジメチルシリル−2′−デオキシアデノシン 3′−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−2′−デオ
キシアデノシン（74.9mg、0.205ｍmol；３、Ｂ
（B¹）＝Ade）のTHF溶液（2.5ml）に15℃でｔ−
ブチルマグネシウムクロリドの0.79M THF溶液
（0.26ml、0.205ｍmol）を加えた。５分間撹拌し
た後、アルゴンガス下、15℃で10分間かけて、混
合物をｏ−クロロフエニルｐ−ニトロフエニル
ホスホロクロリデート（78.7mg、0.226ｍmol）の
THF溶液（１ml）に加え、２時間撹拌した。
5′−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリルチミジン
（80.6mg、0.226ｍmol；１、Ｂ（B²）＝Thy）の
DMF溶液（２ml）に15℃でｔ−ブチルマグネシ
ウムクロリドの0.79M THF溶液（0.57ml、0.451
ｍmol）を加えた。得られた懸濁液に、アルゴン
ガス下、15℃で上記で得た5′−ヌクレオチドを含
む反応混合物を加えた。12時間撹拌した後、
AcOEt及びヘキサン（２：１、40ml）の混合液
を得られた黄色混合に加え、10％食塩水（30ml）
に注いだ。生成したエマルジヨンを遠心除去した
（2000cpm×５mm）。水層をAcOEt−ヘキサン
（２：１、20ml×２、10ml）で抽出した。合わせ
た有機層を10％食塩水（８ml）で洗い、MgSO₄
で乾燥した。蒸発させて得られたゴム状物（0.16
ｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフイーに付
し、アセトン−ベンゼン（１：30）次いで
CH₃OH−CHCl₃（１：120−１：20）で溶出させ
ると、無色非晶体として表題化合物が得られた
（146.7mg、80％、ジアステレオマーの１：１混合
物）。Ｒ _f（CH₃OH−AcOEt−CHCl₃、１：１：10）
0.24and0.30； IR（CHCl₃）3450、3390（NH₂）、3320
（CONH）、1690、1610、1600（nucleobase）、
1280（Ｐ＝Ｏ）cm^-1. UV（CH₃OH）263nｍ． ¹H NMR（CDCl₃）0.06、0.12（12H、two s′s、
2Si（CH₃）₂）、0.88、0.91（18H、two s′s、2Si
（CH₃）₃）、1.89（3H、ｓ、Ｃ＝CCH₃）、2.00−
3.10（4H、ｍ、4H₂′）、3.70、3.87（2H、ｍ、
2H₅′OSi）、4.03−4.55（4H、ｍ、2H₄′、2H₅′OP、
4.7（1H、ｍ、H₃′OSi）、5.08（1H、ｍ、H₃′OP）、
6.16−6.5（2H、ｍ、2H₁′）、6.85（2H、brs、
NH₂）、7.06−7.43（4H、ｍ、C₆H₄Cl）、7.49（1H、
brs、H₆）8.10、8.13（1H、two s′s、H₂）、8.37
（1H、ｓ、H₈）．以上の応用例１〜４における実験条件及び収率
を第２表に示した。なお、表中のB¹、B²、R⁵及
びR⁶は前記と同義である。【表】 _ｂ
_ｃ
Thy Ade TBDMS o−ClC_６H_４ 2
DMF−THF 15 12
80
Detailed Description of the Invention [Technical Field of the Invention] The present invention relates to a method for phosphorylating a compound having a sugar residue, and more specifically, in the synthesis of a compound in which the hydroxyl group of a sugar residue such as a nucleotide is phosphorylated, The present invention relates to a method for easily and selectively phosphorylating the hydroxyl group of a compound having a sugar residue such as a nucleoside. [Technical background of the invention and its problems] In the field of genetic engineering, oligonucleotides have become an increasingly important research subject in recent years.
The basic reaction for its chemical synthesis is phosphorylation of nucleosides. In order to facilitate this reaction, two methods can be considered in principle: activation of the phosphorylating agent, which is an electrophile, or activation of a nucleoside, which is a nucleophile, as shown in the reaction formulas below. . (R ² = alkyl group, R ³ = nucleoxide residue) Traditionally, in this nucleic acid-related field, the focus has been on the development of phosphorylating agents (phosphorylating agents) with strong phosphorylation ability. It was getting worse.
As a result, a mixed acid anhydride of sulfonic acid and phosphoric acid was discovered, and this reagent is currently widely used for nucleotide synthesis. However, when this phosphorylating agent is used, its action is too strong, and phosphorylation occurs on the nitrogen atom of the nucleobase (oxygen atom of the amino group) rather than on the oxygen atom of the sugar residue of the nucleoside (the oxygen atom of the hydroxyl group). Because the reaction proceeds more quickly on atoms), it was necessary to protect the amino group of the nucleobase in advance during the reaction. Further, in the reaction, either the phosphorylating agent or the nucleoside must be used in excess, and the sulfonic acid derivatives (sulfonyl chlorides, sulfonolides) required for activation are extremely expensive. Mizuno et al., Synthesis of Nucleosides and Nucleotides, pp. 69-239.
1977 [Mizuno et al, The Synthesis of
Nucleosides and Nucleotides, 69-239 (1977)]
and Tenor G.M., Journal of
The American Chemical Society, Volume 83,
159 pages, 1961 [Tener, GM, Journal of the
American Chemical Society, 83 , 159 (1961)]
reference. In contrast, milder phosphorylating agents have been found, such as phosphorochloridate or p-nitrophenyl phosphate. These reagents are preferred because they are inexpensive. However, the reaction time was long and strong reaction conditions were required, and the yield of the target compound was low. On the other hand, the following formula: [Formula] PNP=-C ₆ H ₄ -p- NO ₂ There are known methods of synthesis. Skalitsk buoy. ,Croatica Chemica
Acta, vol. 49, p. 851, 1977 [Skaric V. et al,
Croatica Chemica Acta, 49 , 851 (1977)]. However, this method requires extremely strong reaction conditions, and there are only reports using uracil nucleosides or thymidyl nucleosides, and there are no reports on nucleosides containing other nucleobases. [Object of the Invention] An object of the present invention is to provide a method that does not have the above-mentioned drawbacks and can easily and selectively phosphorylate the hydroxyl groups of nucleosides. [Summary of the Invention] The present inventors have developed the following formula: As shown by PX = phosphorylating agent and M = metal, if a metal that has a greater affinity for oxygen atoms than nitrogen atoms is used, the equilibrium between metal alkoxide and metal amide shifts to the alkoxide side, resulting in O-selective activity. It was thought that the O-phosphorylated product could be selectively obtained. Generally, bond dissociation energy provides one measure of the affinity between atoms. Data regarding nitrogen are currently unknown, but magnesium is believed to have a greater affinity for oxygen than nitrogen. Bond dissociation energy (KJmol ^-1 ) Mg-O: 393.7±35 P.G. Dagzigian et al., The Journal of Chemical Physics, Vol. 62, 1824
Page, 1975 [PJ Dagdigian et al, The
Journal of Chemical Physics, 62 , 1824
(1975)]; A.G. Guiden, Dissociation energies and spectra of diatomic molecules, 1968 [AG
Gaydon, Dissociation Energies and Spectra
of Diatomic Molecules, (1968)] etc. Based on the above speculation, the present inventors completed the present invention by first converting a compound having a sugar residue such as a nucleoside into magnesium alkoxide, and then phosphorylating this. The production method of the present invention is characterized in that after a compound having a sugar residue is treated with a Grignard reagent, a phosphorylating agent is applied to phosphorylate the hydroxyl group of the compound. The present invention will be explained in more detail below. The phosphorylation reaction of the present invention is a useful method for phosphorylating the hydroxyl group of a sugar residue of a compound having a sugar residue (eg, a glycoside such as a nucleoside or a derivative thereof). Hereinafter, this reaction will be explained using a nucleoside or a derivative thereof as a compound having a sugar residue, but even compounds having other sugar residues can be phosphorylated by the method of the present invention. It is possible to oxidize. To phosphorylate the hydroxyl group of a nucleoside in this reaction, first activate the hydroxyl group as magnesium alkoxide using a Grignard reagent,
Next, it is phosphorylated using a phosphorylating agent. As a representative example of this reaction, the following formula: can be mentioned. The above _reaction is not limited to 3' _- phosphorylation _of deoxyribonucleosides 1 ^to ₁ . It also applies to the 5'-phosphorylation of deoxyribonucleoxide 3 or ribonucleoxide 4 as shown. In formulas 1 to 4, B is a purine base of adenine (Ade), guanine (Gua) or a derivative thereof; cytosine (Cyt), lausyl (Ura), thymine (Thy)
or represents the pyrimidine base of these derivatives.
In the present invention, O-selective phosphorylation can be performed without protecting the amino group and imide group of the nucleobase, so even if the nucleoside is an N-unprotected nucleobase, the hydroxyl group of the sugar residue moiety can be can be selectively phosphorylated. Examples of Grignard reagents include compounds represented by the following formula: R ¹ MgX (wherein R ¹ represents an alkyl group having 1 to 9 carbon atoms; X represents a halogen atom). Examples of the alkyl group for ^R1 include methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, n-hexyl, n-heptyl, n-octyl, Examples include n-nonyl, most preferably
It is tert-butyl. Further, examples of the halogen atom of X include a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom, and the most preferred is a chlorine atom. In addition, in the present invention, a Grignard reagent in which R ¹ is an aryl group may be used. Here, as the aryl group, for example, C ₆ H ₅ -, o-
_CH3C5H4- , _p _- _CH3C6H4 _, _2,6-
_Examples include [( _CH3 ) _3C ] _2C6H3- , p- _CH3OC6H4- , 2 _- _naphthyl _, and the like. Specific examples of the Grignard reagents listed above include, for example, CH ₃ MgBr, CH ₃ MgI,
C ₂ H ₅ MgBr, i-C ₃ H ₇ MgCl, i-C ₃ H ₇ MgBr,
n- _C4H9MgCl , _t _- _C4H9MgCl , _C6H5MgBr _,
_Examples include _2,4,6- ( _CH3 ) _3C6H2MgCl ,
Among these, t-C ₄ H ₉ MgCl, C ₆ H ₅ MgBr, 2,
_4,6- ( _CH3 ) _3C6H2MgBr _is preferred. As a phosphorylating agent, for example, the following formula: (R ⁵ O) ₂ POY (wherein R ⁵ represents an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms or a substituted or unsubstituted aryl group; Y is a halogen atom or a substituted or unsubstituted aryl group) represents an aryloxy group). Number of carbons in R ⁵ is 1
-10 alkyl groups include, for example, methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, n-
Butyl group, t-butyl group, n-pentyl group, n-
hexyl group, n-heptyl group, n-octyl group,
Examples include n-nonyl group, n-decyl group, etc.
Most preferred are methyl group and ethyl group. The substituted or unsubstituted aryl group for R ⁵ is, for example, o-
_ClC6H4- , _C6H5- _, p _- _NO2C6H4- _, 2 _- Cl-
_Examples include 4 _- _NO2C6H6- , _and _C6H5- and o- _ClC6H4- are _preferred . Examples of the halogen atom of Y include a chlorine atom and a fluorine atom, but a chlorine atom is most preferred. Examples of the substituted or unsubstituted aryloxy group of Y include o-ClC ₆ H ₄ O-, p-NO ₂ C ₆ H ₄ O-, 2,4-
( _NO2 ) _2C6H3O- , ₂ -Cl-4 _- NO2C6H3O- _, etc., _but 2 _- Cl- ₄ _-NO2C6H3O- _,
P _-NO2C6H4O- _, _2,4- ( _NO2 ) _2C6H3O- _, etc. are _preferred . Specific examples of phosphorylating agents include:
For example, (C ₂ H ₅ O) ₂ POCl, (C ₂ H ₅ O) ₂ PO (OC ₆ H ₃ −
2,4-(NO ₂ ) ₂ ), (o-ClC ₆ H ₄ O) ₂ POCl, (o
_-ClC6H4O ) _2PO ( _OC6H3-2 _- Cl-4- _NO2 ) _,
(C ₂ H ₅ O) ₂ PO (OC ₆ H ₄ −p-NO ₂ ), (C ₂ H ₅ O) ₂ PO
( _OC6H3-2 -Cl _- 4- _NO2 ₎ , ( _C6H5O ) _2POCl ,
(C ₆ H ₅ O) ₂ PO (OC ₆ H ₄ -p-NO ₂ ), (C ₆ H ₅ O) ₂ PO (OC ₆ H ₃ -2,4-(NO ₂ ) ₂ ), (C ₆ Examples include ₍ _{C 2} _H ₅ _O ₎ ₂ _POCl ,
(C ₆ H ₅ O) ₂ POCl, (o-ClC ₆ H ₄ O) ₂ POCl,
( _C2H5O ) _2PO ( _OC6H3-2 _- Cl-4- _NO2 ₎ ,
( _C6H5O ) _2PO ( _OC6H3-2 _- Cl-4- _NO2 ₎ ,
( _C2H5O ) _2PO ₍ _OC6H3-2,4- ( _NO2 ₎ ₂ ),
( _C6H5O ) _2PO ( _OC6H3-2,4- ₍ _NO2 ₎ ₂ ) is preferred. This reaction is usually carried out in a solvent. Examples of usable solvents include ether solvents such as tetrahydrofuran (THF), ether (diethyl ether), and dimethoxyethane; amide solvents such as dimethylformamide (DMF); and halogenated hydrocarbon solvents such as dichloromethane. However, preferably an ether solvent such as THF and
It is DMF. Note that a mixed solvent of these can also be used. In this reaction, a Grignard reagent is first added to the reaction system, the reaction is allowed to proceed for several minutes to several tens of minutes, and then a phosphorylating agent is added without isolating the produced magnesium alkoxide to obtain the target compound. The amount of Grignard reagent used is usually 1 to 2 equivalents per 1 equivalent of the hydroxyl group of the nucleoside. The amount of the phosphorylating agent used is usually 1 to 1.4 equivalents, preferably 1.1 to 1.2 equivalents, per 1 equivalent of the hydroxyl group of the nucleoxide. The reaction temperature is usually 0 to 60°C, preferably 15 to 25°C, and the reaction time (total time of the above two reactions) is usually 0.5 to 24 hours, preferably 1 to 6 hours. After the above reaction is completed, the target value can be obtained by, for example, extracting the target value from the reaction mixture, drying and concentrating it, and subjecting the obtained residue to column chromatography. This reaction is also effective for forming internucleotide bonds represented by the following formula. (In the formula, B ¹ and B ² represent the above-mentioned nucleobases, R ¹ ,
R ⁵ , X and Y are as defined above, and R ⁶ is
represents a hydroxyl-protecting group such as TBDMS) Step A of the above reaction is the same reaction as above. In Step B, the triester obtained in Step A can be reacted with the second nucleoside component without being isolated and purified. This second nucleoside component is a magnesium alkoxide obtained by reacting a nucleoside with a Grignard reagent in the same manner as in the reaction of the present invention, and the alkoxide is a phosphoric acid group of the triester which is the final product of Step A. Normally for equivalent weight
0.7 to 1.4 equivalents, preferably 0.9 to 1.2 equivalents are added. The reaction in step B is carried out in the same solvent as above, and the reaction temperature is usually 15 to 60°C, preferably 25°C.
~30°C, and the reaction time is usually 1 to 30 hours, preferably 1.5 to 24 hours. This reaction yields internucleotides, which can be isolated according to conventional methods as described above. According to this method, there is no need to protect the nucleobase not only in step A but also in step B, and the first and second nucleoside components and the phosphorylating agent are simply added to the reaction system in the order of the above formula. The ability to link three components provides a rapid and convenient method for forming internucleotide bonds. [Effects of the Invention] The method for producing a phosphoric acid compound of the present invention has the following advantages. (1) No protection of amino groups is required for all nucleobases. (2) By using a difunctional phosphorylating agent, the reaction with the first nucleoside (Step A) can produce an intermediate that is active for condensation with the second nucleoside alkoxide. Therefore, expensive condensing agents such as sulfonyl chloride and sulfonylamide, which are commonly used in conventional methods, are not required for internucleotide bond formation. (3) As a result, there is no concern about side reactions (sulfonylation to the nucleobase moiety) that are often observed in the phosphorylation of thymidine or guanosine by conventional methods. (4) The active synthetic intermediates mentioned in (2) do not need to be purified. That is, all internucleotide bond forming reactions can be performed within the same flask. Unlike the conventional triester method, which required purification of the nucleoside phosphoric acid diester as a synthetic intermediate, the experimental procedure is simple.
Overall, this method is superior in economy and operability compared to conventional methods. The phosphorylation method of the present invention having the above-mentioned advantages can be applied, for example, to nucleic acid chemistry, particularly genetic engineering,
In the fields of organic synthetic chemistry and agrochemical chemistry,
Useful for the synthesis of oligo or polynucleotides for the purpose of genetic manipulation, organic synthesis reactions using organometallic complexes, especially the synthesis of phosphoric acid compounds as ligands for catalysts in catalytic reactions, and as a means of synthesizing effective agricultural chemicals containing phosphorus. It is. [Embodiments of the Invention] No melting point (mp) correction was performed. Infrared (IR)
Spectra were measured with a JASCO IRA-1 spectrometer. Ultraviolet (UV) spectrum is provided by Hitachi
Obtained on a 228 UV-visible spectrometer. The magnetic resonance (NMR) spectrum is JEOL FX−
Recorded with 90Q (90MHz) equipment. Chemical shifts were reported as δ ppm values relative to tetramethylsilane (δ _Me4Si =0). Product yield was determined by ¹ H NMR analysis. 1, 1, 2, 2 as an internal standard
- The relative intensities of the signals of tetrachloroethane (δ = 5.94) or bromoform (δ = 6.80) are compared to the signals of the phosphorylated products ( _H2 for adenine 5'-nucleotides, _H6 for uracil 5'-nucleotides, uracil For 3'-nucleotides, the relative intensities of _H3 signals were compared. Elemental analysis was performed at the Faculty of Agriculture, Nagoya University. To perform high pressure liquid chromatography (HPLC),
JASCO UVIDEC-Equipped with 100UV absorption detector
JASCO Trirotor or JASCO BIP was used.
The column used was Cosmosil (Nacalai, ODS
-5μm) or Deverosil (Nomura, ODS-5μm)
It was hot. E. Merck Kiesergel (E.
Merck Kieselgel) 60F ₂₅₄ application plate (0.25mm)
was used for thin layer chromatography. The analytical plate was immersed in a mixture of ethanol-p-anisaldehyde-sulfuric acid-acetic acid (90:5:5:1, v/v) and then developed by heating. The spot location is
Shown as Rf value. Merck Kieselgel 60 (70-230 mesh) inactivated by adding 6% water was used for column chromatography. Decompression (1~3mm
A reactor heated well under Hg) and then filled with argon gas was used for the reaction with t-butylmagnesium chloride. Nucleosides were dried with _P2O5 at 50-60 _<0> C under reduced pressure (1-3 mmHg). The organic layer obtained by extraction was dried over anhydrous magnesium sulfate. Rotary evaporator (40~50mmHg) or vacuum pump (1~3mm
Hg). Solvents and Materials Tetrahydrofuran (THF) was distilled using potassium benzophenone ketyl. Pyridine and dimethylformamide (DMF) were distilled over calcium hydride. Commercially available 2'-deoxyadenosine (Yamasa), thymidine (Koujin), 2'-deoxycytidine (Yamasa), 2'-deoxyguanosine (Yamasa), 2',3'- O -isopropylidene adenosine (Aldrich), 2 ′,3′- O -isopropylidene uridine (Sigma) and 2′,3′- O −
Isopropylidenecytidine hydrochloride (Sigma)
It was used as received without further purification. 5'- O
- or 3' ^- O -t-Butyldimethylsilyl nucleoside and N3 -methyluridine were produced by known methods. A THF solution of t -butylmagnesium chloride was produced by a known method. The amount of active magnesium in the Grignard reagent was determined by the Gilman method, and the total amount of magnesium was determined by chelate titration using ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt. Di- o -chlorophenyl phosphorochloridate, p -nitrophenyl phenyl phosphorochloridate and di- o -chlorophenyl p
-Nitrophenyl phosphate was produced by a known method. All other organic materials, including diethyl phosphorochloridate and the solvent for the extraction procedure, were commercially available materials that were simply distilled or recrystallized. Example 1 5'-O-t-butyldimethylsilyl-2'-deoxyadenosine diethyl 3'-phosphate ( 2 , B=Ade, ^R4 =ethyl) 5'-O-t-butyldimethylsilyl-2'- Deoxyadenosine (73.8mg, 0.202mmol) in THF
A solution (3 ml) of t-butylmagnesium chloride (0.88 ml, 0.211 mmol) in 0.24 M THF was added at 24 °C.
The mixture was added dropwise to the solution. After stirring for 5 minutes, diethyl phosphorochloridate (41.7 mg,
0.242 mmol) was added to the suspension. 1 hour later
The reaction mixture was diluted with _CH2Cl2 ( _30ml ) and 0.5N
It was neutralized with NaOH aqueous solution and then extracted with CH ₂ Cl ₂ (20 ml, 10 ml×2). 10% of the combined organic layer
Washed with brine (10ml), dried over _MgSO4 and evaporated to give a gum. ¹ H of crude product
From the NMR spectrum, the yield of the title compound is 96%
It turned out to be. The spectral data of the analysis sample is as follows. Rf ( _CHCl3 - _CH3OH , 5:1, v _/ v)
0.51; IR (CHCl ₃ 3540, 3405 (NH ₂ ), and1290cm
^-1 (P=O); UV (CH ₃ OH) 259.7nm (ε14500);
¹ H NMR (CDCl ₃ ) δ0.04 (6H, s, Si(CH ₃ ) ₂ ),
0.85 (9H, s, Si- t _- _C4H9 ), 1.31 ( ^6H , dt, J
=0.9, 7.2Hz , P( _OCH2CH3 ) ₂ ) _, 2.6-2.8(2H,
m, 2H ₂ ), 3.90 (2H, d-like, J = 9Hz,
2H ₅ ′), 3.92−4.34 (5H, m, H ₄ ′, 2POCH ₂ ),
4.96−5.16 (1H, m, H ₃ ′), 6.21 (2H, br s,
NH ₂ ), 6.45 (1H, t-like, _J = 6.8Hz, H ₁ '), 8.07
(1H, s, H ₂ ), 8.29 (1H, s, H ₈ ); ¹³ C NMR
( _CDCl3 , C _DCl3 = 76.9) δ-6.0, -5.9 (Si
(CH ₃ ) ₂ ), 15.7 (d, J = 7Hz, POCH ₂ CH ₃ ),
17.8 (Si C (CH ₃ ) ₃ ), 25.4 (Si C (CH ₃ ) ₃ ), 39.0
(d, J = 4Hz, C ₂ ′), 62.8 (C ₅ ′), 63.6 (d, J
=
7Hz, PO CH ₂ CH ₃ ), 77.6 (d, J = 6Hz, C ₃ '),
83.8 (C ₁ ′), 85.6 (d, J = 6Hz, C ₄ ′), 119.3
( _C5 ), 138.0 ( _C8 ), 149.1 ( _C4 ), 152.5 ( _C2 ), 155
.Five
( _C6 ). Calculated value ( _{C20H36N5O6SiP} ) _: _C , _47.89 ; H,
7.23; N, 13.96% Actual value: C, 47.86; H, 7.25; N, 13.63% Example 2 5'-O-t-butyldimethylsilyl-2'-deoxyadenosine di-o-chlorophenyl 3'-
Phosphate ( 2 , B = Ade, ^R4 = o-chlorophenyl) was added to a THF solution (2.5 ml) of 5'-O-t-butyldimethylsilyl-2'-deoxyadenosine (72.4 mg, 0.20 mmol) at 17 °C. , 0.22M THF solution of t-butylmagnesium chloride (0.9ml, 0.20m
mol) was added. After stirring for 5 minutes, di-o-chlorophenyl p-nitrophenyl phosphate (99.4
mg, 0.226 mmol) in THF (1 ml) was added at 17°C. After stirring at the same temperature for 15 minutes, the reaction mixture was
Diluted _with _CH2Cl2 (30ml) and poured into 0.5N aqueous NaOH (20ml). The resulting emulsion was removed by centrifugation (2000 cpm x 5 mm). The aqueous layer was extracted with CH ₂ Cl ₂ (20 ml, 10 ml×2). 10% of the combined organic layer
% saline (10 ml) and dried over _MgSO4 .
Concentration gave a yellow oil, and the yield of the title compound was 98% according to ¹ H NMR. The spectral data of the analysis sample is as follows. R _f ( _CH3OH -AcOEt- _CHCl3 , 1:1:10,
v/v) 0.36; mp114-115℃; IR ( _CHCl3 )
3490, 3400 (NH ₂ ), and1290cm ^-1 (P=O); UV
(CH ₃ OH) 260 nm (ε16700); ¹ H NMR (CDCl ₃ )
δ0.08 (6H, s, Si( _CH3 ) ₂ ), 0.89 (9H, Si- t-
C ₄ H ₉ ), 2.87 (2H, m, 2H ₂ '), 3.90 (2H, 2-
like, J = 3.1Hz, 2H ₅ ′, 4.43 (1H, m, H ₄ ′),
5.55 (1H, m, H ₃ ′), 5.87 (2H, br s, NH ₂ ),
6.52 (1H, t-like, J = 7.0Hz, H ₁ '), 7.05-
7.57 (8H, m, 2C ₆ H ₄ Cl), 8.11 (1H, s, H ₂ ),
8.34 (1H, s, _H8 ; ^13C NMR ( _CDCl3 ) δ-6.0,
−5.9(Si( _CH3 ) ₂ ), 17.8( SiC ( _CH3 ) ₃ ), 25.4(S
I C
( C H ₃ ) ₃ ), 39.2 (d, J = 4Hz, C ₂ '), 62.7 (C ₅
′),
80.6 (d, J = 4Hz, C ₃ ′), 83.8 (C ₁ ′), 85.5 (d
,
J = 7 Hz, C ₄ ′) 119.4 (C ₅ ), 121.9 (d, J = 2 Hz,
C ₆ H ₄ Cl), 125.0 (d, J = 7Hz, C ₆ H ₄ Cl),
126.2, 127.6 _, 130.3 ( _C6H4Cl ), 138.0 ( _C8 ), 145.8
(d, J = 7Hz, C ₆ H ₄ Cl), 149.1 (C ₄ ), 152.6
(C ₂ ), 155.6 (C ₆ ). Calculated value (C ₂₈ H ₃₄ Cl ₂ N ₅ O ₆ PSi): C, 50.45; H,
5.14; N, 10.51% Actual value: C, 50.22; H, 5.14; N, 10.54% Example 3 5'-O-t-butyldimethylsilyl-2'-deoxycytidine diethyl 3'-phosphate ( 2 , B= Cyt, ^R4 = ethyl) 5'-O-t-butyldimethylsilyl-2'-deoxycytidine (50 mg, 0.15 mmol) in THF suspension (3 ml) at 25°C was added with 034 M of t-butylmagnesium chloride. THF solution (0.43ml, 0.15mmol)
added. After stirring for 5 minutes, diethyl phosphorochloritate (30 mg, 0.18 mmol) was added to the reaction mixture at 25°C. After stirring for 15 minutes, the mixture
Diluted with _CH2Cl2 ( _25ml ) and washed with 0.5N aqueous NaOH (10ml). The aqueous layer was extracted with _CH2Cl2 ( _10ml x 2). The combined organic layers were dried with _MgSO4 and
Concentrated. From the ^1H NMR spectrum of the crude product,
The yield of the title compound was found to be 95%. The spectral data of the analysis sample is as follows. :IR( _CHCl3 )3540and3400( _NH2 ),1260cm ^-1
(P=O); UVλ _nax (CH ₃ OH) 272 nm (ε9900);
¹ H NMR (CCl ₃ ) δ0.10 (s, Si(CH ₃ ) ₂ ), 0.90
(s, Si- t _- _C4H9 ), 1.34 (dt, J = 1.1, 7.1Hz,
2POCH ₂ C H ₃ ), 1.9−2.3 (m, H ₂ ′), 2.6−2.8
(m, H ₂ ′), 3.89 (m, 2H ₅ ′), 4.11 (dq, J = 7.3
,
7.1Hz, 2POC H ₂ CH ₃ ), 4.27 (m, H ₄ ′), 4.92 (m,
H ₃ ′), 5.67 (d, J = 7.4Hz, H ₅ ), 6.00 (br s,
NH ₂ ), 6.38 (dd, J = 1.8, 11.7Hz, H ₁ ′), 7.90
(d, J = 7.4Hz, _H6 ); ^13C NMR ( _CDCl3 ) δ-
6.2, -6.1 (Si( _CH3 ) ₂ ), 15.4 (d, J = 7Hz,
POCH ₂ CH ₃ ), 17.6 (Si C (CH ₃ ) ₃ ), 39.4 (d, J
= 4 Hz, C ₂ ′), 62.5 (C ₅ ′), 63.4 (d, J = 8 Hz,
PO CH ₂ CH ₃ ), 77.3 (d, J = 6Hz, C ₄ '), 85.0
(d, J = 8Hz, C ₃ ′), 85.2 (C ₁ ′), 94.7 (C ₅ ),
139.4 (C ₆ ), 155.3 (C ₂ ), 165.5 (C ₄ ). Calculated value (C ₁₉ H ₃₆ N ₃ O ₇ PSi): C, 47.79; H,
7.60, N, 8.80% Actual value: C, 47.66; H, 7.63; N, 8.76% Example 4 5'-O-t-butyldimethylsilyl-2'-deoxyguanosine diethyl 3'-phosphate ( 2 , B= Gua, R ⁴ = ethyl) (a) 2 equivalents of t-butylmagnesium chloride 5'-O-t-butyldimethylsilyl-2'-deoxyguanosine (77.1 mg, 0.202 mmol)
A 0.24 M solution of t-butylmagnesium chloride in THF (1.70
ml, 0.408 mmol) were added dropwise. After stirring for 5 minutes, diethyl phosphorochloridate (48.4 mg, 0.281 mmol) was added dropwise to the reaction mixture at 25°C. After stirring at the same temperature for 30 minutes, the resulting solution was diluted with CHCl ₃ (30 ml) and the mixture was poured into 10% brine (20 ml). The emulsion generated during the extraction was removed by centrifugation (2000 cpm x 5
mm). The aqueous layer was extracted with _CH2Cl2 ( _20ml x 3).
The combined organic layers were dried with _MgSO4 . When concentrated, a solid (0.13 g) was obtained, but the ¹ H
NMR spectrum showed 94% yield of the title compound. The crude product was subjected to silica gel column chromatography.
Elution with _CH3OH - _CHCl3 (1:9) gave the title compound (93.0 mg, 89%). R _f ( _CH3OH - _CHCl3 , 1:5)0.53; IR
(CHCl ₃ ) 3500, 3400 (NH ₂ ), 1690, 1630,
1610 (nucleobase), 1255 (P=O) cm ^-1 ; UV
(CH ₃ OH) 255 nm (ε1.34×10 ⁴ ); ¹ H NMR
(CDCl ₃ ) δ0.60 (6H, s, Si( CH ₃ ) ₂ ), 0.90
(9H, s, SiC(CH ₃ ) ₃ ), 1.37 (6H, t-like,
J=7Hz, 2PO C ₂ CH ₃ ), 2.5−2.77 (2H, m,
2H ₂ ′), 3.72−3.9 (2H, m, 2H ₅ ′), 3.95−4.35
(5H, m, 2POCH ₂ , H ₄ ′), 5.10 (1H, m,
H ₃ ′), 6.25 (1H, t-like, J = 7Hz, H ₁ ′),
6.47 (2H, brs, NH ₂ ), 7.88 (1H, s, H ₈ ),
11.9 (1H, brs, NHCO). ^13C NMR ( _CD3OD )
δ-7.2, -7.1 (Si( _CH3 ) ₂ ), 14.6 (d, J = 7
Hz, POCH ₂ CH ₃ ), 17.2 (Si C (CH ₃ ) ₃ ), 24.5
(SiC( CH3 ) ₃ ) _, 37.7(d, J = 5Hz, _C2 '),
62.2 (C ₅ ′), 63.7 (d, J = 6Hz, POCH ₂ ), 77.4
(d, J = 6Hz, C ₃ ′), 83.0 (C ₁ ′), 85.1 (d, J
= 6Hz, C ₄ ′), 115.9 (C ₅ ), 135.2 (C ₈ ), 150.5
(C ₄ ), 153.2 (C ₂ ), 157.4 (C ₆ ). Calculated value ( _{C20H36N5O7SiP} ) _: _C , _46.41 ; H,
7.01; N, 13.53% Actual value: C, 45.49; H, 6.79; N, 13.27% (b) 1 equivalent of t-butylmagnesium chloride Same operation as above except that 1 equivalent of t-butylmagnesium chloride was used. I did the reaction. After stirring for 6 hours at 15°C, the reaction mixture was worked up as above. ¹ H NMR spectroscopy showed 88% production of the title compound. Example 5 5'-O-t-butyldimethylsilylthymidine diethyl 3'-phosphate ( 2 , B=Thy, ^R4 =
(a) 2 equivalents of t-butylmagnesium chloride A solution of 5'-O-t-butyldimethylsilylthymidine (72.0 mg, 0.20 mmol) in THF (3 ml),
of t-butylmagnesium chloride at 25℃
A 0.24M THF solution (1.70ml, 0.408mmol) was added. After stirring for 5 minutes, diethyl phosphorochloridate (48.4 mg, 0.281 mmol) was added to the reaction mixture at 25°C. After stirring for 30 min, the resulting homogeneous solution was diluted with CH ₂ Cl ₂ (30 ml) and diluted with 10%
Neutralized with saline (20ml). The emulsion generated during the extraction was removed by centrifugation (2000 cpm x 5 mm).
The aqueous layer was extracted with CH ₂ Cl ₂ (20 ml, 10 ml×2).
The combined organic layers were dried with _MgSO4 and concentrated.
¹ H NMR spectrum analysis of the residue (0.14 g) revealed that the yield of the desired product was 98%. Chromatography on silica gel column (5 g, acetone-CH ₂ Cl ₂ , 1:9-1:6)
The title compound was obtained (91.0 mg, 92
%). R _f (acetone-CH ₂ Cl ₂ , 1:5, v/v)
0.38; mp70−74℃; IR (CHCl ₃ ) 3380
(CONH), 1710, 1695 (nucleebase), and1260
(P=O) cm ^-1 ; UV (CH ₈ OH) 266 nm (ε1.12
×10 ⁴ ); ¹ H NMR (CDCl ₃ ) δ0.03 (6H, s, Si
(CH ₃ ) ₂ ), 0.77 (9H, s, SiC (CH ₃ ) ₃ ), 1.20
(6H, t, J = 7.0Hz, P(OCH ₂ C H ₃ ) ₂ ), 1.76
(3H, s, C=CCH ₃ ), 2.05−2.7 (2H, m,
2H ₂ ′), 3.47 (2H, brs, 2 ₅ ′), 3.84−4.15 (5H,
m, H ₄ ′, 2POCH ₂ ) 4.84 (1H, m, H ₃ ′), 6.25
(2H, dd, J = 6, 9Hz), 7.34 (1H, s, H ₆ )
10.15 (1H, brs, NH). ^13C NMR ( _CDCl3δ−
6.0, 5.9 (Si( _CH3 ) ₂ ), 12.0 ( CH3C ₌ ), 15.7
(POCH ₂ CH ₃ ), 17.9 (Si C (CH ₃ ) ₃ ), 25.5
(SiC( CH3 ) ₃ ) _, 38.9(d, J = 6Hz, _C2 '),
62.8 (C ₅ ′), 63.7 (d, J = 7Hz, PO CH ₂ ),
77.7 (d, J = 6Hz, C ₃ ′), 84.1 (C ₁ ′), 85.3 (d
,
J=4Hz, C ₄ ′), 110.6 (C ₅ ), 134.4 (C ₆ ), 150.2
(C ₂ ), 163.7 (C ₄ ), Calculated value (C ₂₀ H ₃₇ N ₂ O ₈ SiP): C, 48.76; H,
7.59; N, 5.69% Actual value: C, 48.78; H, 7.45; N, 5.64% (b) 1 equivalent of t-butylmagnesium chloride React as above except that 1.0 equivalent of t-butylmagnesium chloride was used. I went there. After stirring for 6 hours at 15°C, the reaction mixture was worked up in a similar manner. ¹ H NMR spectroscopy showed that the yield of the title compound was 92%. The experimental conditions and yields in Examples 1 to 5 above are shown in Table 1. [Table] Next, examples regarding phosphorylation of ribonucleosides represented by formulas 4 to 4 are listed below. Example 6 Diethyl 2',3'-O-isopropylideneadenosine 5'-phosphate 2',3'-O-isopropylideneadenosine (50
mg, 0.15 mmol) in THF suspension (3 ml) at 25°C.
0.34M of t-butylmagnesium chloride in
A THF solution (0.48 ml, 0.16 mmol) was added followed by diethyl phosphorochloridate (36 mg, 0.21 mmol). After 15 minutes, the resulting homogeneous mixture
Diluted with _CH2Cl2 ( _25ml ) and washed with 0.5N aqueous NaOH (10ml). The aqueous layer was extracted _with _CH2Cl2 (10
ml x 2). The combined organic extracts were washed with 10% brine and dried over _MgSO4 . Concentration gave colorless crystals. ¹ H NMR spectroscopy showed that the yield of phosphate was 91%. The spectral data of the analysis sample is as follows. R _f (MeOH-AcOEt, 1:33) 0.19; mp139
−141℃; IR (CHCl ₃ ) 3490, 3400 (NH ₂ )
and1290cm ^-1 (P=O); UV (CH ₃ OH) 259.2nm
(ε17300); ¹ H NMR (CDCl ₃ ) δ1.28 (6H, m,
2POCH ₂ C H ₃ ), 1.40, 1.63 (6H, each, s, C
(CH ₃ ) ₂ ), 3.7−4.6 (7H, m, 2PO CH ₂ CH ₃ ,
H ₂ ′, H ₃ ′, H ₄ ′), 5.10 (1H, dd, J = 3.6, 7.5Hz,
H ₅ ′), 5.40 (1H, dd, J = 3.0, 7.5Hz, H ₅ ′),
5.68 2H, br s, NH ₂ ), 6.14 (1H, d, J = 2.5
Hz, H ₁ ′), 7.94 (1H, s, H ₂ ), 8.34 (1H, s,
_H8 ). ^13C NMR ( _CDCl3 ) 15.6 (d, J = 7Hz,
POC ₂ CH ₃ ), 25.0, 26.7 (C(CH ₃ ) ₂ ), 63.7 (d,
J = 6Hz, POC ₂ CH ₃ ), 66.4 (d, J = 5Hz,
C ₅ ′), 81.1 (C ₃ ′), 83.8 (C ₂ ′), 85.0 (d, J =
8Hz,
C ₄ ′), 90.5 (C ₁ ′), 114.1 ( C (CH ₃ ) ₂ ), 119.6 (
_C5 ),
139.1 ( _C8 ), 148.8 ( _C4 ), 152.8 ( _C2 ), 155.7 ( _C6 )
．． Calculated value (C ₁₇ H ₂₆ N ₅ O ₇ P): C, 46.05; H, 5.91;
N, 15.80% Actual values: C, 45.90; H, 5.82; N, 15.76% Example 7 Diethyl 2',3'-O-isopropylidene cytidine 5'-phosphate Azeotroped with pyridine (1 ml x 2) before use 2′,
3'-O-isopropylidene cytidine hydrochloride (64.6
mg, 0.202 mmol) in THF suspension (3 ml), 26
0.24M of t-butylmagnesium chloride at °C
A THF solution (1.72ml, 0.412mmol) was added. After stirring at the same temperature for 5 minutes, diethyl phosphorochloridate (41.7 mg, 0.242 mmol) was added to the mixture. After stirring for 2 hours, the reaction mixture was dissolved in CH ₂ Cl ₂ (20
ml) and neutralized with 10% saline (20 ml).
The aqueous layer was extracted with CH ₂ Cl ₂ (20 ml, 10 ml×2). The combined organic layers were dried with MgSO ₄ and evaporated to give a gum (0.11 g), which was subjected to silica gel column chromatography. _CH3OH−
Elution with _CHCl3 (1:40-1:30) gave the title compound (64.3 mg, 76%). R _f ( _CH3OH - _CHCl3 , 1:10, v/v,
double developments) 0.21; IR (CHCl ₃ ) 3500, 3400 (NH ₂ ), 1670, 1650
(nuclobase), 1260 (P=O) cm ^-1 .UV (CH ₃ OH)
269 (ε7.19×10 ³ ), 240 (ε7.74×10 ³ ) nm. ^1H
NMR (CDCl ₃ ) δ1.10−1.14 (9H, m, CCH ₃ ,
2POCH ₂ CH ₃ ), 1.52 (3H, s, CCH ₃ ), 3.90−
4.44 (7H, m, 2PO CH ₂ CH ₃ , H ₂ ′, H ₃ ′, H ₄ ′,
5.02 (2H, dd, J = 7.2, 19.2Hz, 2H ₅ ′), 5.46
(1H, br s, H ₁ ′), 6.00 (1H, d, J = 7.2Hz,
H ₅ ′), 7.29 (1H, d, J = 7.2Hz), 8.30 (2H, br
s, NH ₂ ); ¹³ C NMR (CDCl ₃ ) δ16.1 (d, J =
7Hz, _POC2CH3 ) _, _25.6 , 27.1(C( CH3 ) ₂ ) ,
64.1 (d, J = 7Hz, PO C ₂ CH ₃ ), 67.3 (d, J =
5.5Hz, C ₅ ′), 82.2 (C ₃ ′), 84.9 (C ₂ ′), 86.7 (
d, J
=8Hz, C ₄ ′), 95.7 (C ₁ ′), 97.6 (C ₅ ), 113.7 (
C
( _CH3 ) ₂ ), 146.9( _C6 ), 155.6( _C2 ), 166.7( _C4 )
．． Calculated value (C ₁₆ H ₂₆ N ₃ O ₈ P): C, 45.82; H, 6.25;
N, 10.02% Actual value: C, 45.88; H, 6.17; N, 9.87% Example 8 Diethyl 2',3'-O-isopropylidene uridine 5'-phosphate (a) t-butylmagnesium chloride 2 equivalents 2' , 3'-O-isopropylidene uridine (57.4 mg, 0.202 mmol) at 26°C was added a 0.24M THF solution of t-butylmagnesium chloride (1.72 ml, 0.412 mmol). After stirring for 5 minutes, diethyl phosphorochloridate (48.7 mg, 0.283 mmol) was added to the heterogeneous mixture at 26°C. After stirring at the same temperature for 1 hour, the homogeneous reaction mixture was neutralized with 10% brine (20 ml) and diluted with CH ₂ Cl ₂
(30ml, 10ml x 2). The combined organic layers were dried with MgSO ₄ and concentrated to give a yellow gum (0.13 g), which was subjected to silica gel column chromatography. Elution with acetone- _CH2Cl (1:9-4:6) gives
The title compound was obtained (77.6 mg, 91%). R _f ( _CH3OH - _CHCl3 , 1:10, v/v)
0.33; IR (CHCl ₃ ) 3390 (CONH), 1730, 1695
(nucleobase), 1270 (P=O) cm ^-1 .UV
(CH ₃ OH) 259 nm (ε9.17×10 ³ ). ^1H NMR
(CDCl ₃ ) δ1.35 (9H, m, 2POCH ₂ C H ₃ ), 1.58
(3H, s, CCH ₃ ), 3.95−4.22 (7H, m, 2PO
CH ₂ CH ₃ , H ₂ ′, H ₃ ′, H ₄ ′), 4.88 (2H, m,
2H ₅ ′), 5.70 (1H, d, J = 7.5Hz, H ₅ ′), 5.78
(1H, d, J = 1.2Hz, H ₁ ′), 7.38 (1H, d, J
=7.5Hz, H ₆ ), 9.52 (1H, br s, NH). ; ^13C
NMR (CDCl ₃ ) δ15.8 (d, J = 7Hz,
POC ₂ CH ₃ ), 25.0, 26.8 (C( CH ₃ ) ₂ ), 63.8 (d,
J = 6Hz, POC ₂ CH ₃ ), 66.5 (d, J = 6Hz,
C ₅ ′), 80.4 (C ₃ ′), 84.1 (C ₂ ′), 84.6 (d, J =
8
Hz, C ₄ ′), 93.4 (C ₁ ′), 102.3 (C ₅ ), 114.3 ( C
( _CH3 ) ₂ ), 141.5( _C6 ), 149.9( _C2 ), 163.3( _C4 )
．． Calculated value (C ₁₆ H ₂₅ N ₂ O ₉ P): C, 45.72; H,
5.99; N, 6.66% Actual value: C, 45.81; H, 6.20; N, 6.28% (b) 1 equivalent of t-butylmagnesium chloride The reaction was carried out according to the above procedure except that 1 equivalent of t-butylmagnesium chloride was used. I went. After stirring for 6 hours at 15°C, the reaction mixture was worked up in a manner similar to the experiment described above. According to ¹ H NMR spectrum analysis, the yield of the desired product was 60%. Next, application examples regarding the internucleotide bond formation method using the production method of the present invention will be listed. Application example 1 Phenyl 5'-O-t-butyldimethylsilyl-
2'-deoxyadenylyl (3'→5')-3'-O-t
-Butyldimethylsilyl-2'-deoxyadenosine 3'-O-t-butyldimethylsilyl-2'-deoxyadenosine (73.8 mg, 0.202 mmol; 3 , B
(B ¹ )=Ade) in THF solution (3 ml) at 15℃.
Butylmagnesium chloride (0.92ml, 0.202m
mol) was added and stirred for 5 minutes. The reaction mixture was diluted with phenyl p-nitrophenyl phosphorochloridate (72.4 mg, 0.231 mmol) in THF (1 ml) at 15°C for 15 min under argon gas.
and stirred at 15°C for 3 hours. 5'-O-t-
Butyldimethylsilyl-2'-deoxyadenosine (81.7 mg, 0.223 mmol; 1 , B (B ² ) = Ade)
A 0.22M solution of t-butylmagnesium chloride in THF (1.01 mg, 0.223
mmol) was added. The reaction mixture containing the 5'-nucleotide obtained above was added to the resulting solution at 15° C. under argon gas. After stirring for 1.5 hours, the resulting yellow solution was diluted with _CH2Cl2 ( _30ml ) and diluted with 0.5N
Neutralized with _aqueous NaOH and extracted with _CH2Cl2 (20
ml×2, 10ml). The combined organic extracts were washed with 10% brine (10ml) and dried over _MgSO4 . After evaporation, a pale yellow gum was obtained (0.24 g). acetone-benzene (1:10-2:5), then
Silica gel column chromatography with CH ₃ OH-CHCl ₃ (1:10-1:5) afforded the title compound as a colorless amorphous 1:1 mixture of diastereomers (133.2 g, 85% ). These diastereomers show two split peaks by HPLC (Cosmosil ODS-
5μm, λ=260nm, flow rate=1mlmm ^-1 , pressure=1.27
×107Pa, solvent = _H2O - _CH3OH , 1:4:7,
v/v). One isomer: T _R =19mm: R _f
( _CH3OH -AcOEt- _CHCl3 , 1:1:10, v/
v) 0.21; IR (CHCl ₃ ) 3500, 3410 (NH ₂ )
and1280cm ^-1 (P=O); UV (CH ₃ OH) 260nm
(ε26000); ¹ H NMR (CDCl ₃ ) δ0.06, 0.09 (12H.
two s′s, 2Si(CH ₃ ) ₂ ), 0.87, 0.90(18H.two s′s
,
2Si- t _- _C4H9 ), 2.26-2.98 (4H, m, _4H2 '),
3.82 (2H, m, 2H _5′ −OSi) 4.02−4.48 (4H, m,
2H ₄ ′, 2H _5′OP ), 4.65 (1H, m, H _3′OSi ), 5.22
(1H, m, H ₃ ′OP). 6.20−6.56 (6H, m, 2H ₁ ′,
2NH ₂ ), 7.12−7.38 (5H, m, C ₆ H ₅ ), 7.97, 8.08
(2H, two s′s, 2H ₂ ), 8.27 (2H, s, 2H ₈ );
FDMS (m/z) 868 (M ⁺ ). Other isomers: T _R =23
mm: R _f ( _CH3OH -AcOEt- _CHCl3 , 1:1:
10, v/v) 0.22; IR (CHCl ₃ ) 3500, 3410
(NH ₂ ) and1290cm ^-1 (P=O); UV (CH ₃ OH)
260nm (ε27000); ^1H NMR ( _CDCl3 ) δ0.04,
0.11 (12H.two s′s, 2Si(CH ₃ ) ₂ ), 0.84, 0.91
(18H, two s′s, 2Si− t −C ₄ H ₉ ), 2.28−3.02
(4H, m, 4H ₂ ′), 3.74 (2H, m, 2H ₅ ′−OSi),
4.18 (2H, m, 2H _5'OP ), 4.39 (2H, m, 2H ₄ '),
4.68 (1H, m, H ₃ ′OSi), 5.22 (1H, m, H ₃ ′OP),
6.18 (4H, br s, 2NH ₂ ), 6.41 (2H, m, 2H ₁ ′),
7.12−7.44 (5H, m, C ₆ H ₅ ), 7.98, 8.04 (2H,
two s′s, 2H ₂ ), 8.26 (2H, s, 2H ₈ ); FDMS
( m / z )868(M ⁺ ). Application example 2 Phenyl 5'-O-t-butyldimethyl-2'-deoxycytidylyl (3'→5')-3'-O-t-butyldimethylsilyl-2'-deoxyadenosine 3'-O- t-Butyldimethylsilyl-2'-deoxyadenosine (81.4 mg, 0.223 mmol; 3 , B
(B ¹ ) = Ade) in THF solution (2.5 ml) at 15°C for 15 min.
of t-butylmagnesium chloride over a period of minutes.
A 0.22M THF solution (1.01 ml, 0.223 mmol) was added. After stirring for 5 minutes, the mixture was stirred at 15°C with phenyl p-nitrophenyl phosphorochloridate (79.7
mg, 0.254 mmol) in THF solution (1 ml),
Stirred for 2.5 hours. 5'-O-t-butyldimethylsilyl-2'-deoxycytidine (83.8mg, 0.245m
mol; 1 B (B ² ) = Cyt) in THF suspension (2 ml)
0.22M of t-butylmagnesium chloride at 15℃
A THF solution (1.11 ml, 0.245 mmol) was added. The reaction mixture containing the 5'-nucleotide obtained above was added to the resulting suspension at 15° C. under argon gas.
After stirring at 60°C for 2 hours, the resulting yellow solution was
Diluted with _CH2Cl2 ( _30ml ) and 0.5N NaOH (20ml)
I washed it with The resulting emulsion was removed by centrifugation (2000 cpm x 5 mm). The aqueous layer was extracted with CH ₂ Cl ₂ (2×20 ml, 10 ml). The combined organic extracts were washed with 10% brine (10 ml) and dried. Concentration gave a pale yellow gum (0.28 g), which was subjected to silica gel column chromatography. _CH3OH
Elution with _-CHCl3 (1:50-1:5) gave the title compound as a colorless amorphous (151.4 mg,
81%, 1:1 mixture of diastereomers). R _f ( _CH3OH - _CHCl3 , 2:15, v/v)
0.33; IR (CHCl ₃ ) 3500, 3400 (NH ₂ ), 1630, 1595
(nucleobase), 1250 (P=O) cm ^-1 . UV (CH ₃ OH) 260 nm. ^1H NMR ( _CDCl3 ) 0.05, 0.70, 0.10 (12H,
three s′s, 2Si( _CH3 ) ₂ ), 0.86, 0.90(18H, two
s′s, 2SiC(CH3) ₃ ), 2.2−2.96(4H, m _, _4H2 ′)
,
3.82 (2H, m, 2H _5′OSi ), 4.05−4.46 (4H, m,
2H ₄ ′, 2H _5′OP ), 4.66 (1H, m, H _3′OSi ), 5.05
(1H, m, H ₃ ′OP), 5.69 (1H, d, J = 7.5Hz,
H ₅ ), 6.25−6.55 (2H, m, 2H ₁ ′), 6.95 (2H.brs,
NH ₂ ), 7.10−7.37 (5H, m, C ₆ H ₅ ), 7.77 (1H,
d, J = 7.5Hz, H ₆ ), 7.85 (2H, brs, NH ₂ ),
8.08, 8.27 (1H.two s′s, H ₂ ), 8.29, 8.51 (1H,
two s′s, H ₈ ). Application example 3 O-chlorophenyl 5'-O-t-butyldimethylsilyl-2'-deoxyguanylyl (3'→5')-
3'-O-t-butyldimethylsilyl-2'-deoxyadenosine 3'-O-t-butyldimethylsilyl-2'-deoxyadenosine (74.9 mg, 0.205 mmol; 3 B (B ¹ )
To a THF solution (2.5 ml) of t-butylmagnesium chloride (0.26 ml, 0.205 mmol) was added at 15°C. After stirring for 5 minutes, the reaction mixture was added to a solution of o-chlorophenyl p-nitrophenyl phosphorochloridate (78.7 mg, 0.226 mmol) in THF (1 ml) over 10 minutes under argon gas. The mixture was stirred at 15°C for 2 hours. 5'-O-t-butyldimethylsilyl-2'-
Deoxyguanosine (86.2 mg, 0.226 mmol; 1 ,
B (B ² ) = Gua in a DMF solution (2 ml) at 15°C.
A 0.97M solution of butylmagnesium chloride in THF (0.57ml, 0.451mmol) was added. The reaction mixture containing the 5'-nucleotide obtained above was added to the resulting suspension at 15° C. under argon gas. After stirring at 15°C for 24 hours, methanol (1 ml) was added to the reaction mixture, and the mixture was stirred at 15°C for 10 minutes. Evaporation to near dryness gave a residue, which was dissolved in CH ₂ Cl ₂ (30 ml)
and poured into 10% saline (25 ml). The obtained emulsion was removed by centrifugation (2000 cpm x 5 mm),
The aqueous layer was extracted with CH ₂ Cl ₂ (25 ml x 2, 10 ml x
2). The combined organic layers were dried with _MgSO4 . The yellow oil (0.26 g) obtained by evaporation was subjected to silica gel column chromatography. _CH3OH
Elution with -CHCl ₃ (1:40-1:5) gave the title compound as a colorless amorphous substance (106.1 mg,
56%, 1:1 mixture of diastereomers). R _f ( _CH3OH - _CHCl3 , 1:5,) 0.54; IR ( _CHCl3 ) 3500, 3320 ( _NH2 ), 1700, 1645,
1610 (nucleobase), 1260 (P=O) cm ^-1 . UV (CH ₃ OH) 258 nm. ^1H NMR ( _CDCl3 ) −0.19, 0.0, 0.07, 0.10
(12H, four s′s, 2Si(CH ₃ ) ₂ ), 0.80, 0.81,
0.89, 0.90 (18H, four s′s, 2Si(CH ₃ ) ₃ ), 2.1−
3.1 (4H, m, 4H ₂ ′), 3.70 (2H, m, _2H 5′OSi),
4.1−4.8 (5H, m, 2H ₄ ′, 2H _5′OP , H _3′OSi ),
5.13 (1H, m, H ₃ ′OP), 6.03−6.5 (2H, m,
2H ₁ ′), 6.63−7.5 (8H, m, 2NH ₂ , C ₆ H ₄ Cl)
7.7, 7.77 (1H, two s′s, H ₈ of Gu), 8.0, 8.03
(1H, two s′s, H ₂ of Ad), 8.33, 8.35 (1H,
two s′s, H ₈ of Ad), 12.86 (1H, brs, NH). O-chlorophenyl p-nitrophenyl phosphorochloridate used in this example was obtained as follows. o-chlorophenylphosphorochloridate (9.39 g, 38.32 mmol). A mixture of p-nitrophenol (4.84 g, 34.8 mmol) and magnesium chloride (20 mg, 0.21 mmol) was heated at 45° C. for 1 hour.
The mixture was stirred at 70°C for 1 hour, at 80°C for 1 hour, at 100°C for 1 hour, and at 120°C for 6 hours. While increasing the reaction temperature, HCl gas was evolved and was captured with aqueous KOH. The reaction progress was monitored by ¹ H NMR. The resulting yellow oil was degassed with an aspirator through a CaCl ₂ tube. Distillation between valves (240℃/6mm
Hg) to give the title compound (6.03 g, 50%) as a pale yellow solid. mp60−65℃; IR (KBr) 1620, 1590, and1520
( o -substituted Ar), 1520and1345( _NO2 ), 1200(P=
0), 860 ( p -substituted Ar), 760 ( o -substituted Ar) cm
^-1 ; ^1H NMR ( _CDCl3 ) 7.2−7.7 (6H, m,
_C6H4Cl , OCCH ₌ _CHCNO2 ), 8.25−8.5(2H,
m, OCCH=C H CNO ₂ ). Application example 4 o-chlorophenyl 5'-O-t-butyldimethylsilylthymidyl (3'→5')-3'-O-t-butyldimethylsilyl-2'-deoxyadenosine 3'-O-t- Butyldimethylsilyl-2'-deoxyadenosine (74.9 mg, 0.205 mmol; 3 , B
(B ¹ )=Ade) in THF solution (2.5 ml) at 15℃.
A 0.79M THF solution of butylmagnesium chloride (0.26ml, 0.205mmol) was added. After stirring for 5 minutes, the mixture was diluted with o-chlorophenyl p-nitrophenyl phosphorochloridate (78.7 mg, 0.226 mmol) over 10 minutes at 15°C under argon gas.
It was added to a THF solution (1 ml) and stirred for 2 hours.
5′-O-t-butyldimethylsilylthymidine (80.6 mg, 0.226 mmol; 1 , B (B ² ) = Thy)
A 0.79M solution of t-butylmagnesium chloride in THF (0.57ml, 0.451
mmol) was added. To the resulting suspension was added the reaction mixture containing the 5'-nucleotide obtained above at 15°C under argon gas. After stirring for 12 hours,
A mixture of AcOEt and hexane (2:1, 40 ml) was added to the resulting yellow mixture, plus 10% saline (30 ml).
poured into. The generated emulsion was removed by centrifugation (2000 cpm x 5 mm). The aqueous layer was extracted with AcOEt-hexane (2:1, 2×20 ml, 10 ml). The combined organic layers were washed with 10% brine (8 ml) and diluted with MgSO ₄
It was dried. Gum obtained by evaporation (0.16
g) was subjected to silica gel column chromatography, acetone-benzene (1:30) and then
Elution with _CH3OH - _CHCl3 (1:120-1:20) gave the title compound as a colorless amorphous (146.7 mg, 80%, 1:1 mixture of diastereomers). R _f ( _CH3OH -AcOEt- _CHCl3 , 1:1:10)
0.24and0.30; IR (CHCl ₃ ) 3450, 3390 (NH ₂ ), 3320
(CONH), 1690, 1610, 1600 (nucleobase),
1280 (P=O) cm ^-1 . UV (CH ₃ OH) 263 nm. ^1H NMR ( _CDCl3 ) 0.06, 0.12 (12H, two s′s,
2Si( _CH3 ) ₂ ), 0.88, 0.91(18H, two s′s, 2Si
(CH ₃ ) ₃ ), 1.89 (3H, s, C=CCH ₃ ), 2.00−
3.10 (4H, m, 4H ₂ ′), 3.70, 3.87 (2H, m,
2H _5′OSi ), 4.03−4.55(4H, m, 2H ₄ ′, 2H _5′OP ,
4.7 (1H, m, H ₃ ′OSi), 5.08 (1H, m, H ₃ ′OP),
6.16−6.5 (2H, m, 2H ₁ ′), 6.85 (2H, brs,
NH ₂ ), 7.06−7.43 (4H, m, C ₆ H ₄ Cl), 7.49 (1H,
brs, H ₆ ) 8.10, 8.13 (1H, two s′s, H ₂ ), 8.37
(1H, s, H ₈ ). The experimental conditions and yields in Application Examples 1 to 4 above are shown in Table 2. In addition, B ¹ , B ² , R ⁵ and R ⁶ in the table have the same meanings as above. [Table] _b
_c.
Thy Ade TBDMS o−ClC ₆ H ₄ 2
DMF−THF 15 12
80

Claims

[Scope of Claims] 1. A method for producing a phosphoric acid compound, which comprises treating a compound having a sugar residue with a Grignard reagent and then treating the compound with a phosphorylating agent to phosphorylate the hydroxyl group of the compound. 2. The Grignard reagent is a compound represented by the following formula: R ¹ MgX (wherein R ¹ represents an alkyl group having 1 to 9 carbon atoms; X represents a halogen atom) A method for producing a phosphoric acid compound. 3. The method for producing a phosphoric acid compound according to claim 1, wherein the compound having a sugar residue is a nucleoside or a derivative thereof, and the reaction is carried out in a solvent.