JPH0525190A - Novel pharmacologically active substance chrysosporin and production thereof - Google Patents
Novel pharmacologically active substance chrysosporin and production thereofInfo
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- JPH0525190A JPH0525190A JP3203607A JP20360791A JPH0525190A JP H0525190 A JPH0525190 A JP H0525190A JP 3203607 A JP3203607 A JP 3203607A JP 20360791 A JP20360791 A JP 20360791A JP H0525190 A JPH0525190 A JP H0525190A
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Abstract
Description
【0001】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、クリソスポリン、当該
物質の製造法及び当該物質を生成する菌株に関する。ク
リソスポリンはコレステロールの生合成における律速酵
素である3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリル−Co
A(HMG−CoA)レダクターゼ(EC1,1,1,
34)を阻害し、血中コレステロール低下作用及び生体
内における活性酸素種を除去し、過酸化脂質の生成防止
ないし低下作用を有し、動脈硬化防止ないしは治療薬又
は活性酸素種に起因すると思われる各種疾患の治療薬と
して期待される。TECHNICAL FIELD The present invention relates to chrysosporin, a method for producing the substance, and a strain producing the substance. Chrysosporin is a rate-limiting enzyme in cholesterol biosynthesis, 3-hydroxy-3-methylglutaryl-Co.
A (HMG-CoA) reductase (EC1,1,1,
34), lowers blood cholesterol and removes active oxygen species in the body, has the effect of preventing or reducing lipid peroxides, and is thought to be due to arteriosclerosis preventing or therapeutic agents or active oxygen species Expected as a therapeutic drug for various diseases.
【0002】[0002]
【従来の技術】従来、動脈硬化治療薬としては、メバロ
チン、プログコール等が使用されている。2. Description of the Related Art Conventionally, mevallotin, progcol and the like have been used as therapeutic agents for arteriosclerosis.
【0003】[0003]
【発明が解決しようとする課題】上記治療薬は効力、毒
性の点ですぐれたものではあるが、コレステロール合成
阻害能と抗酸化作用を併わせ持ちより有用な動脈硬化治
療薬に適する新規化合物の発見が待望されている。Although the above-mentioned therapeutic agents are excellent in potency and toxicity, they are novel compounds suitable for a more useful therapeutic drug for arteriosclerosis that have both cholesterol synthesis inhibitory ability and antioxidant activity. The long-awaited discovery.
【0004】[0004]
【課題を解決する為の手段】そこで本発明者らは微生物
の代謝産物について種々検索した結果、不完全菌に属す
る一菌株がコレステロール合成阻害作用、過酸化脂質の
生成抑制作用及びスーパーオキサイドアニオンラジカル
スカベンジ作用を有する生理活性物質クリソスポリンを
産出することを見出した。本発明は上記知見に基づいて
完成されたものである。As a result of various searches for microbial metabolites, the present inventors have found that one strain belonging to an incomplete bacterium inhibits cholesterol synthesis, inhibits lipid peroxide production, and superoxide anion radicals. It was found that it produces a physiologically active substance, chrysosporin, which has a scavenging action. The present invention has been completed based on the above findings.
【0005】すなわち、本発明は下記の理化学的性質を
有することを特徴とする新規薬理活性物質クリソスポリ
ンに関する。
(a) 外 観 : 暗褐色粉末
(b) 分子量 ; 502 FAB−MS(m/z)
501、08323(M−H) -
(c) 示性式 ; C27H18O10
(d) 溶解性 ; 低級アルコール、クロロホルム、
酢酸エステルに可溶
(e) 紫外部吸収スペクトル ; 図1に示す。
(f) 赤外部吸収スペクトル ; 臭化カリウム錠剤
で測定したスペクトルを図2に示す。
(g) 水素核磁気共鳴スペクトル ; 重ジメチルス
ルホキシド中で測定したスペクトルを図3に示す。
(h) 炭素核磁気共鳴スペクトル ; 重ジメチルス
ルホキシド中で測定したスペクトルを図4に示す。That is, the present invention relates to a novel pharmacologically active substance, chrysosporin, which has the following physicochemical properties. (A) Exterior: Dark brown powder (b) Molecular weight: 502 FAB-MS (m / z)
501,08323 (M-H) - ( c) rational formula; C 27 H 18 O 10 ( d) solubility; lower alcohol, chloroform,
Soluble in acetic ester (e) Ultraviolet absorption spectrum; shown in FIG. (F) Red external absorption spectrum: The spectrum measured with a potassium bromide tablet is shown in FIG. (G) Hydrogen nuclear magnetic resonance spectrum: The spectrum measured in deuterated dimethyl sulfoxide is shown in FIG. (H) Carbon nuclear magnetic resonance spectrum: The spectrum measured in deuterated dimethyl sulfoxide is shown in FIG.
【0006】上記新規生理活性物質クリソスポリンは、
不完全菌に属するクリソスポリン生産菌を栄養培地で培
養し、クリソスポリンを生成蓄積せしめ、この培養物か
らクリソスポリンを採取することにより得られる。クリ
ソスポリンの生産菌の代表的なものとして、東京都近郊
(秋川市、五日市町)の土壌より分離したM10539
株(微工研菌寄第12279号「FERMP−1227
9)」があげられる。The above novel physiologically active substance chrysosporin is
It is obtained by culturing a chrysosporin-producing bacterium belonging to an incomplete bacterium in a nutrient medium to produce and accumulate chrysosporin, and collecting chrysosporin from this culture. M10539 isolated from the soil in the suburbs of Tokyo (Akigawa City, Itsukaichi Town) is a typical chrysosporin-producing bacterium.
Strain (Microtech Lab, No. 12279 "FERMP-1227"
9) ”.
【0007】以下にM10539株の菌学的性状を示
す。バレイショ・ブドウ糖寒天平板培養によるジャイア
ントコロニー、スライドカルチャーの肉眼、顕微鏡によ
る形態観察を行なった。コロニーは25℃、14日間の
培養で直径1.5〜2cmに達し、広がらず密な菌糸で盛
り上がり、表面が粉末状、綿毛状など変化に富んでい
る。色は表面・裏面ともに褐色で寒天の中も褐色に着色
した。顕微鏡観察から菌糸は1〜1.5μmで細く隔壁
があり、分生子柄と菌糸との区別ができず、分生子柄が
輪生状に急角度に分岐していること、分生子がアレウロ
型ようなし形であり、2〜4×2〜3μmであることが
示された。また、4、20、25及び30℃による発育
の観察の結果、4、20、25℃ではやや抑制的に発育
し、30℃では発育しなかった。これらの結果とカーマ
イケルの記述(Carmichel, J.W Can. J.Bot4
0,1137(1962)とを比較し、M10539株
をクリソスポリウムパノラム(リンク)ヒューズを同定
した。The bacteriological characteristics of the M10539 strain are shown below. Giant colonies by potato-glucose agar plate culture, macroscopic observation of slide culture, and morphological observation by microscope were performed. The colonies reach a diameter of 1.5 to 2 cm after culturing at 25 ° C. for 14 days, swell with dense mycelium without spreading, and have various powdery and fluffy surfaces. The color was brown on both the front and back sides, and the agar was colored brown. Microscopic observation shows that hyphae are thin with 1 to 1.5 μm and have septa, and conidia stalks and hyphae cannot be distinguished, and conidia stalks branch in a steep angle in a ring-like manner. It was shown to have a shape of 2-4 × 2-3 μm. As a result of observation of growth at 4, 20, 25, and 30 ° C, growth was slightly suppressed at 4, 20, 25 ° C, and no growth was observed at 30 ° C. These results and Carmichael's description (Carmichel, JW Can. J. Bot 4
0 , 1137 (1962) to identify the M10539 strain as a chrysosporium panoram (link) fuse.
【0008】この発明で使用するクリソスポリウムパノ
ラム株は、例えば紫外線、60Co等の照射処理、ナイト
ロジェンマスタード、亜硝酸、N−メチル−N´−ニト
ローニトロソグアニジン、2アミノプリン等の変異誘起
剤による変異処理、形質導入、形質転換、細胞融合等の
通常用いられる育種手段によってクリソスポリンの生産
能力を高める事ができる。The chrysosporium panoram strain used in the present invention includes, for example, irradiation treatment with ultraviolet rays and 60 Co, nitrogen mustard, nitrous acid, N-methyl-N'-nitro-nitrosoguanidine, 2 aminopurine and the like. The production capacity of chrysosporin can be enhanced by commonly used breeding means such as mutation treatment with a mutagen, transduction, transformation, and cell fusion.
【0009】本発明のクリソスポリンを製造するにはク
リソスポリンを産生する能力を有する微生物を栄養培地
中で培養し、培養物中にクリソスポリンを生成蓄積せし
め、次いでこれを採取すれば良い。培養法は、液体培養
による深部培養法が有利である。培養に用いられる培地
としては、クリソスポリン・パノラム・ヒューズ株が利
用する栄養源を含有する培地であれば良い。栄養源とし
ては、従来からカビの培養に利用されている公知のもの
が使用出来、例えば炭素源としては、グリコース、D−
キシロース、D−フラクトース、ショ糖、乳糖、グリセ
ロール、デキストリン、澱粉、水飴、大豆油など単独ま
たは組合せて用いることが出来る。無機及び有機窒素源
としては塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸ア
ンモニウム、尿素、硝酸ソーダ、ペプトン、肉エキス、
酵母エキス、乾燥酵母、コーン・スティープ・リカー、
大豆粉、ファーマメディア、オートミール、カザミノ
酸、バクトソイトン、ソリブル・ベジタブル・プロティ
ンなど単独または組合せて用いることができる。In order to produce the chrysosporin of the present invention, a microorganism having the ability to produce chrysosporin is cultured in a nutrient medium so that chrysosporin is produced and accumulated in the culture and then collected. As the culture method, a deep culture method by liquid culture is advantageous. The medium used for the culture may be any medium containing a nutrient source used by the Chrysosporin panoram hughes strain. As the nutrient source, known ones conventionally used for culturing mold can be used. For example, the carbon source can be glucose or D-.
Xylose, D-fructose, sucrose, lactose, glycerol, dextrin, starch, starch syrup, soybean oil and the like can be used alone or in combination. As inorganic and organic nitrogen sources, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium nitrate, urea, sodium nitrate, peptone, meat extract,
Yeast extract, dry yeast, corn steep liquor,
Soybean flour, pharma media, oatmeal, casamino acid, bacto soyton, sorible vegetable protein, etc. can be used alone or in combination.
【0010】その他必要に応じて食塩、硫酸マグネシウ
ム、硫酸銅、硫酸亜鉛、塩化マンガン、炭酸カルシウ
ム、リン酸塩などの無機塩を加えることが出来るほか、
該菌株の生育やクリソスポリンの生産を促進する有機
物、例えば核酸類、アミノ酸、ビタミン類や無機物を適
当に添加することが出来る。培養中発泡が著しい時に
は、例えば大豆油、亜麻仁油等の植物油やプロナール1
(東邦化学社製)、シリコンKM−70(信越化学工業
社製)等の石油系消泡剤を適宜に添加すれば良い。培養
温度は18〜28℃の範囲が望ましく、好ましくは25
℃附近が用いられ、培地のpHは5〜10、好ましくは
6〜8で培養を行うことが望ましい。培養期間は培地の
組成・温度により変動するが一般的に3〜12日間培養
を行なうとクリソスポリンが培養物中に生成蓄積され
る。In addition, inorganic salts such as sodium chloride, magnesium sulfate, copper sulfate, zinc sulfate, manganese chloride, calcium carbonate and phosphate can be added, if necessary.
Organic substances such as nucleic acids, amino acids, vitamins and inorganic substances that promote the growth of the strain and the production of chrysosporin can be appropriately added. When foaming is remarkable during culture, vegetable oils such as soybean oil and flaxseed oil and pronal 1
(Toho Chemical Co., Ltd.), silicon KM-70 (Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.) and other petroleum antifoaming agents may be added appropriately. The culture temperature is preferably in the range of 18 to 28 ° C, and preferably 25.
It is desirable to carry out the culture at a temperature of around 0 ° C. and a pH of the medium of 5 to 10, preferably 6 to 8. The culturing period varies depending on the composition and temperature of the medium, but generally, when culturing is performed for 3 to 12 days, chrysosporin is produced and accumulated in the culture.
【0011】培養物中の生成量が最大に達した時培養を
停止し、遠心分離または濾過により菌体を除去した後、
濾過液から有効物質の抽出を行なう。該物質の精製・単
離には一般に微生物代謝生産物をその培養物から単離す
る為に用いられる分離、精製の方法が利用される。即
ち、各種溶剤による抽出、ゲル濾過法、高速液体クロマ
ト法(HPLC)などを適宜組合せて用いることが出来
る。例えば、培養物を濾過し濾液を酸性下に酢酸エチル
で3回抽出する。酢酸エチル溶液を無機硫酸ナトリウム
で脱水後、減圧濃縮する。これを5%炭酸水素ナトリウ
ム溶液(pH8.5)で3回抽出する。5%炭酸水素ナ
トリウム層を塩酸でpH2.5に調整し、生じた沈殿を
遠心分離で集め、水洗後、凍乾乾燥する。When the production amount in the culture reaches the maximum, the culture is stopped, and the cells are removed by centrifugation or filtration.
The active substance is extracted from the filtrate. For the purification / isolation of the substance, a separation / purification method generally used for isolating a microbial metabolism product from the culture is used. That is, extraction with various solvents, gel filtration, high performance liquid chromatography (HPLC) and the like can be appropriately combined and used. For example, the culture is filtered and the filtrate is extracted with ethyl acetate three times under acidity. The ethyl acetate solution is dehydrated with inorganic sodium sulfate and then concentrated under reduced pressure. It is extracted 3 times with a 5% sodium hydrogen carbonate solution (pH 8.5). The pH of the 5% sodium hydrogen carbonate layer is adjusted to 2.5 with hydrochloric acid, the generated precipitates are collected by centrifugation, washed with water, and then freeze-dried.
【0012】得られた沈殿乾燥物を弱アルカリ溶液に、
溶解度塩酸酸性下(pH3)に酢酸ブチルで3回抽出す
る。酢酸ブチル層を無水硫酸ナトリウムで脱水後、減圧
濃縮乾固する。得られた粗粉末を20mMリン酸カリウ
ム溶液(pH7.4)に溶解し、同様の緩衝液で平衡化
したバイオ・ゲルP6カラムクロマトグラフィーにより
精製する。展開溶液は同様の緩衝液を用いて溶出し、活
性区分を得る。これを塩酸でpH3に調整後、酢酸エチ
ルで3回抽出する。分離した酢酸エチル層を無水硫酸ナ
トリウムで脱水後、減圧濃縮乾固する。この粉末アセト
ニトル/0.1%リン酸溶液(40:60)に溶解し、
シリカODSカラムを用いたHPLCにかけ、同様の展
開溶媒で溶出し、活性画分を分取する。これを酢酸エチ
ルで抽出し、無水硫酸ナトリウムで脱水後、減圧濃縮乾
固し、精製標品を得る。The obtained dried precipitate is dissolved in a weak alkaline solution,
Solubility Extract 3 times with butyl acetate under hydrochloric acid acidity (pH 3). The butyl acetate layer is dehydrated with anhydrous sodium sulfate and then concentrated under reduced pressure to dryness. The obtained crude powder is dissolved in a 20 mM potassium phosphate solution (pH 7.4) and purified by Bio-gel P6 column chromatography equilibrated with the same buffer solution. The developing solution is eluted with the same buffer to obtain the active compartment. This is adjusted to pH 3 with hydrochloric acid and then extracted 3 times with ethyl acetate. The separated ethyl acetate layer is dried over anhydrous sodium sulfate and then concentrated under reduced pressure to dryness. Dissolve this powder acetonitr / 0.1% phosphoric acid solution (40:60),
Apply to HPLC using a silica ODS column, elute with the same developing solvent, and collect the active fraction. This is extracted with ethyl acetate, dehydrated with anhydrous sodium sulfate, and then concentrated under reduced pressure to dryness to obtain a purified sample.
【0013】尚、培養及び粗分画中でクリソスポリンの
活性はHMG−CoA還元酵素活性の阻害率にて測定し
た。本発明化合物クリソスポリンは、動脈硬化治療薬及
び抗炎症剤、自己免疫疾患治療剤、抗心筋梗塞剤、抗不
整脈剤、脳浮腫改善剤などの医薬品として期待される。The activity of chrysosporin in the culture and the crude fraction was measured by the inhibition rate of HMG-CoA reductase activity. The compound of the present invention, chrysosporin, is expected as a drug such as an arteriosclerosis therapeutic agent, an anti-inflammatory agent, an autoimmune disease therapeutic agent, an anti-myocardial infarction agent, an antiarrhythmic agent, and a cerebral edema improving agent.
【0014】本発明化合物を医薬品として使用する場合
には、単独または賦形剤として注射剤、経口剤、坐剤等
として投与する。賦形剤は薬理学的な許容されるもので
あればいずれでも良く、その種類及び組成は投与経路や
投与方法によって決まる。例えば、液状賦形剤としては
水、アルコールもしくは大豆油、ピーナツ油、ミネラル
油等の動植物油または合成油を用いることが出来る。固
体賦形剤としてはマルトース、シュクロースなどの糖
類、各種アミノ酸類、ヒドロキシプロピルセルロース等
のセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウムなどの
有機酸塩類などを使用することが出来る。When the compound of the present invention is used as a medicine, it is administered as an injection, an oral preparation, a suppository, etc. alone or as an excipient. Any excipient may be used as long as it is pharmacologically acceptable, and its type and composition depend on the administration route and administration method. For example, as the liquid excipient, water, alcohol, or animal or vegetable oil such as soybean oil, peanut oil, mineral oil, or synthetic oil can be used. As the solid excipient, sugars such as maltose and sucrose, various amino acids, cellulose derivatives such as hydroxypropyl cellulose, organic acid salts such as magnesium stearate and the like can be used.
【0015】注射剤の場合には、賦形剤としては、生理
食塩水、各種緩衝液、グルコース、イノシトール、マン
ニトール等の糖類溶液、エチレングリコール、ポリエチ
レングリコール等のグリコール類溶液が望ましい。ま
た、イノシトール、マンニトール、グルコース、マンノ
ース、マルトース、シュクロース等の糖類やフェニルア
ラニン等のアミノ酸類の賦形剤と共に凍結乾燥剤とな
し、投与時に注射用の適当な溶剤、例えば、滅菌水、ブ
ドウ糖溶液、電解質溶液、アミノ酸溶液等に溶解して静
脈および筋肉内に投与することもできる。In the case of injections, physiological saline, various buffer solutions, sugar solutions such as glucose, inositol and mannitol, and glycol solutions such as ethylene glycol and polyethylene glycol are desirable as excipients. Also, a lyophilizer together with sugars such as inositol, mannitol, glucose, mannose, maltose, sucrose and excipients of amino acids such as phenylalanine, and a suitable solvent for injection at the time of administration, for example, sterile water, glucose solution Alternatively, it can be dissolved in an electrolyte solution, an amino acid solution or the like and administered intravenously or intramuscularly.
【0016】経口剤の場合には、前記液状賦形剤もしく
は固体賦形剤とともに錠剤、カプセル剤、粉剤、顆粒
剤、液剤、ドライシロップ剤等の形態にするのがよい。
また、ペレット剤として経皮、粘膜剤などの局所投与剤
としてもよい。In the case of oral preparations, it is preferable to form tablets, capsules, powders, granules, liquids, dry syrups, etc. together with the liquid or solid excipients.
In addition, as a pellet, a transdermal agent, a topical agent such as a mucosal agent may be used.
【0017】製剤中における本化合物の含量は、通常
0.001〜1重量%であり、好ましくは0.01〜
0.1重量%である。例えば、注射剤の場合には、通常
0.01〜0.05重量%がよい。経口剤の場合には
0.005〜10重量%、好ましくは0.05〜5重量
%とし、残部を賦形剤とする。The content of the present compound in the preparation is usually 0.001-1% by weight, preferably 0.01-.
It is 0.1% by weight. For example, in the case of an injection, it is usually 0.01 to 0.05% by weight. In the case of an oral preparation, the amount is 0.005 to 10% by weight, preferably 0.05 to 5% by weight, and the balance is the excipient.
【0018】投与量は、患者の年令、体重、症状、治療
目的等により決定されるが、一般的には、非経口投与で
は、例えば坐剤としては0.1mg〜10mg/kg/日、注
射剤としては0.1mg〜10mg/kg/日、経口投与では
0.5mg〜100mg/kg/日である。The dose is determined according to the patient's age, body weight, symptom, purpose of treatment and the like. Generally, for parenteral administration, for example, as a suppository, 0.1 mg to 10 mg / kg / day, The injection is 0.1 mg to 10 mg / kg / day, and the oral administration is 0.5 mg to 100 mg / kg / day.
【0019】[0019]
1. HMG−CoA還元酵素の阻害活性測定
1) 粗酵素液の調製
本酵素系はKnauss らの方法(J.Biol. Chem. 2
34,2835(1959))を改変した遠藤らの方法
(Biochim. Biophys Acta 489,119(197
9))により、ラット肝から以下のように調製した。ラ
ットはウィスター系の雄、約200gを用い、比活性の
高い酵素を得るためにコレスチラミン(Dowex 1−X
2,C1型,ダウケミカル)を含む市販粉末飼料(オリ
エンタル酵母)を5日間自由摂取させた後、真夜中に断
頭屠殺して肝臓を取り出し、直ちに氷冷後2mM Mg
Cl2 、15mMニコチン酸アミドを含む0.1Mリン
酸緩衝液(pH7.4)で5秒間洗った。以下の操作は
すべて4℃あるいは氷冷下で行った。洗浄後濾紙で水分
を除いたのち、肝臓をメスでみじん切りにし、その5g
に同緩衝液10mlを加え、“loose fitting"のポッター
型ホモジイナイザーで軽く磨砕(4往復)した。この時
ミトコンドリアにはHMG−CoAの分解酵素が存在す
るので肝臓を強く磨砕し過ぎてミトコンドリアを破壊し
ないよう注意する。その後、700×g、5分間遠心し
て得られる上清をさらに12,000×g、30分間遠
心し、核・ミトコンドリアを除いた。脂肪は綿濾過より
除いた後その上清を105,000×g、60分間の超
遠心のミクロソーム画分を得た。ミクロソーム画分は
0.1Mリン酸カリ緩衝液(pH7.4)に懸濁後、さ
らに105,000×g、60分間超遠心し、同緩衝液
に3g/mlとなるように懸濁した。得られたミクロソー
ム画分は小分けして、−80℃に貯蔵し、使用直前に融
解した。なおタンパク質の定量はローリー法で行なっ
た。1. Measurement of inhibitory activity of HMG-CoA reductase 1) Preparation of crude enzyme solution This enzyme system was prepared by the method of Knauss et al. (J. Biol. Chem. 2) .
34 , 2835 (1959)) by modifying Endo et al.'S method (Biochim. Biophys Acta 489 , 119 (197).
According to 9)), it was prepared from rat liver as follows. About 200 g of Wistar male rats were used, and cholestyramine (Dowex 1-X) was used to obtain an enzyme with high specific activity.
After free ingestion of commercially available powdered feed (Oriental yeast) containing 2, C1 type, Dow Chemical) for 5 days, decapitated at midnight, the liver was taken out, and immediately after ice cooling, 2 mM Mg was added.
The plate was washed with 0.1 M phosphate buffer (pH 7.4) containing Cl 2 and 15 mM nicotinamide for 5 seconds. The following operations were all performed at 4 ° C. or under ice cooling. After washing, remove water with filter paper, and chop the liver with a scalpel.
The same buffer solution (10 ml) was added to, and the mixture was lightly ground (4 strokes) with a potter-type homogenizer of "loose fitting". At this time, since HMG-CoA degrading enzyme exists in mitochondria, be careful not to overly grind the liver and destroy the mitochondria. Then, the supernatant obtained by centrifugation at 700 xg for 5 minutes was further centrifuged at 12,000 xg for 30 minutes to remove the nucleus and mitochondria. The fat was removed by cotton filtration, and the supernatant was subjected to ultracentrifugation at 105,000 xg for 60 minutes to obtain a microsome fraction. The microsome fraction was suspended in 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.4) and then ultracentrifuged at 105,000 × g for 60 minutes, and suspended in the same buffer at 3 g / ml. The resulting microsomal fraction was aliquoted, stored at -80 ° C and thawed immediately before use. The protein was quantified by the Lowry method.
【0020】2) HMG−CoA還元酵素阻害活性の
測定法
10mMジチオスレイトール(DTT)、10mM E
DTA、100mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.
4)、ミクロソーム画分0.6mg/ml、基質として10
0mM DL−[3−14C]HMG−CoA(6.66
MBg/mmol) を含む全量25μlの反応液をマイクロ
チューブ(スナップ・シール・チューブ1.5ml容) に
加え、以下の手順で行う。好気的条件下で37℃、30
分間インキュベートした後、5μlの2N HClで反
応を停止し、さらに10μlのDL−[5− 3H]meva
lonolactone (100,000 dpm)を内部標準として
加え、15分間インキュベートした。反応液30μlを
シリカゲルTLCプレート(Kieselgel 60
F254 ,Merck)上に数回にわけてスポットした。これ
にはあらかじめキャリアーとして20mM mevalonola
ctone 5μlをスポットして置いた。ベンゼン/アセト
ン(1:1)で展開したのち、溶媒を気発させ、プレー
トをヨウ素で発色させた。mevalonolactonのRf値0.
4〜0.6の部分をミクロスパチュラでバイアルにかき
取り、トルエン系シンチレーター4mlを加え、 3Hと14
Cの放射能を測定(Packard Tri−Carb Liquid S
cintillation Spectrometer 3255型)し、生成し
た[14C]mevalonolactone の量を定量し、酵素活性を
求めた。阻害活性の結果を第1表に示す。2) Method for measuring HMG-CoA reductase inhibitory activity 10 mM dithiothreitol (DTT), 10 mM E
DTA, 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.
4), microsome fraction 0.6 mg / ml, 10 as substrate
0mM DL- [3- 14 C] HMG -CoA (6.66
A total of 25 μl of the reaction solution containing MBg / mmol) is added to a microtube (snap seal tube 1.5 ml volume) and the following procedure is performed. 37 ° C under aerobic conditions, 30
After incubation for 5 minutes, the reaction was stopped by adding 5 μl of 2N HCl, and further adding 10 μl of DL- [5- 3 H] meva.
lonolactone (100,000 dpm) was added as an internal standard and incubated for 15 minutes. 30 μl of the reaction solution was added to a silica gel TLC plate (Kieselgel 60
(F 254 , Merck) spotted several times. For this, 20 mM mevalonola as a carrier was prepared beforehand.
5 μl of ctone was spotted and placed. After development with benzene / acetone (1: 1), the solvent was evolved and the plate was developed with iodine. Rf value of mevalonolacton 0.
Scrap the 4 to 0.6 part into a vial with a micro spatula, add 4 ml of a toluene scintillator, and add 3 H and 14
Measure the radioactivity of C (Packard Tri-Carb Liquid S
cintillation Spectrometer 3255 type), and the amount of [ 14 C] mevalonolactone produced was quantified to determine the enzyme activity. The results of the inhibitory activity are shown in Table 1.
【0021】 [0021]
【0022】この表から明らかなように本発明のクリソ
スポリンのHMG−CoA還元酵素阻害活性値(I
C50)は約50μg/mlである。As is apparent from this table, the HMG-CoA reductase inhibitory activity value (I of chrysosporin of the present invention
C 50 ) is about 50 μg / ml.
【0023】2. 抗酸化活性
本発明のクリソスポリンの抗酸化活性を測定方法ととも
に示す。30mMトリス塩酸緩衝液、0.2mMブレオ
マイシン硫酸塩、0.2mM硫酸第2鉄、1.3mMア
ラキドン酸ナトリウムを含む全量600μlの反応液を
37℃5分間反応し、過酸化脂質を生成させる。過酸化
脂質の定量は八木法(ビタミン37、105−112、
1968年)に従い、チオバルビツール酸(TBA)で
定量した。抗酸化活性の結果を第2表に示す。2. Antioxidant activity The antioxidant activity of chrysosporin of the present invention is shown together with the measuring method. A total of 600 μl of a reaction solution containing 30 mM Tris-hydrochloric acid buffer, 0.2 mM bleomycin sulfate, 0.2 mM ferric sulfate and 1.3 mM sodium arachidonate is reacted at 37 ° C. for 5 minutes to produce lipid peroxide. The Yagi method (vitamin 37 , 105-112,
1968) and quantified with thiobarbituric acid (TBA). The results of antioxidant activity are shown in Table 2.
【0024】 [0024]
【0025】この表から明らかなように本発明のクリソ
スポリンは比活性でビタミンEの約3.5倍の抗酸化活
性を有する。As is apparent from this table, the chrysosporin of the present invention has an antioxidant activity which is about 3.5 times as high as that of vitamin E in specific activity.
【0026】[0026]
【発明の効果】以上の結果から明らかなように本発明の
クリソスポリンはHMG−CoA還元酵素を阻害するこ
と及び抗酸化作用を有することにより、新規な動脈硬化
治療薬として期待できる。以下、本発明の実施例を示す
が、これに単なる1例示であって何等本発明を限定する
ものではなく、種々の変法が可能である。As is clear from the above results, the chrysosporin of the present invention can be expected as a novel therapeutic agent for arteriosclerosis by inhibiting HMG-CoA reductase and having an antioxidant action. Examples of the present invention will be shown below, but this is merely an example and does not limit the present invention in any way, and various modifications are possible.
【0027】[0027]
実施例1.
(1) 発 酵
500ml容坂口フラスコに、グリコース2%を含むポテ
ト・デキストロース培地80mlを分注し、120℃、2
0分間オートクレーブ滅菌した。これにクリソスポリウ
ム・パノラム・ヒューズM10539株(微工研菌寄第
12279号)の一白金耳を摂取しレシプロ・シェーカ
ーで120ストローク/分25℃で4日間培養し、これ
を種培養液とする。これに前述した同じ組成の培地を1
0リットル調製し、これを500ml容坂口フラスコに各
80ml宛分注し120℃、20分間滅菌したものに種培
養液を2%の割合で植菌した。25℃で12日間振温を
行なった。得られた培養液を遠心分離(10,000×
g,20min)し、上清を得た。Example 1. (1) 80 ml of potato-dextrose medium containing 2% of glucose was dispensed into a fermentation 500 ml Sakaguchi flask, and the temperature was kept at 120 ° C for 2
It was autoclaved for 0 minutes. A platinum loop of Chrysosporium panorum Hughes M10539 strain (Microtechnological Research Institute No. 12279) was ingested into this, and cultured at 120 strokes / min at 25 ° C for 4 days on a reciprocal shaker. To do. Add 1 medium of the same composition as above.
0 liter was prepared, and this was dispensed into a 500 ml Sakaguchi flask for each 80 ml and sterilized at 120 ° C. for 20 minutes, and seed culture was inoculated at a rate of 2%. Shaking was carried out at 25 ° C for 12 days. The obtained culture solution is centrifuged (10,000 ×
(g, 20 min) to obtain a supernatant.
【0028】(2) 精 製
前述した上清5リットリに塩酸を加えpH2.5とし、
酢酸エチル2リットルで3回抽出した。無水硫酸ナトリ
ウムで脱水後、ロータリーエバポレーターで1リットル
にまで減圧濃縮した。これを1リットルの5%NaHC
O3 溶液(pH8.5)で3回抽出した。 5%NaH
CO3 層は塩酸でpH2.5に調整後、生じた沈殿を遠
心で集め、蒸留水で洗浄し、凍結乾燥機により乾燥した
(5.53g)。得られた沈殿乾燥物は100mlの蒸留
水を加え、3N NaON溶液を少しずつ加えながら溶
解させた後、3N HCLでpH3に調製し等量の酢酸
ブチルで3回抽出した。酢酸ブチル層を無水硫酸ナトリ
ウムで脱水後、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮、
乾固させた(1.88g)。(2) Purification By adding hydrochloric acid to 5 liters of the above-mentioned supernatant to adjust the pH to 2.5,
It was extracted 3 times with 2 liters of ethyl acetate. After dehydration with anhydrous sodium sulfate, the mixture was concentrated under reduced pressure to 1 liter with a rotary evaporator. Add 1 liter of 5% NaHC
It was extracted 3 times with an O 3 solution (pH 8.5). 5% NaH
The CO 3 layer was adjusted to pH 2.5 with hydrochloric acid, and the resulting precipitate was collected by centrifugation, washed with distilled water, and dried by a freeze dryer (5.53 g). The dried precipitate obtained was dissolved by adding 100 ml of distilled water while adding 3N NaON solution little by little, adjusting the pH to 3 with 3N HCL, and extracting 3 times with an equal amount of butyl acetate. The butyl acetate layer was dehydrated with anhydrous sodium sulfate, and then concentrated under reduced pressure with a rotary evaporator.
It was dried (1.88 g).
【0029】酢酸ブチル抽出物を20mMリン酸カリウ
ム溶液(pH7.4)で100mg/mlになるように溶か
し、その1mlを300mM NaCl及び0.02%N
aN 3 を含む20mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.
4)で平衡化したバイオーゲル・P−6(分画範囲)
1,000〜6,000ダルトン)カラム(26×40
0mm) に乗せ、上述の平衡化緩衝液で溶出した(25ml
/h)。4.2mlずつ150のフラクションに分けて分
取した。低分子側で阻害活性が強いフラクションNo.
100から125までを集め、6N HClでpH3.
0に調製し等量の酢酸エチルで3回抽出した。分離した
酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで脱水後、ローター
エバポレーターで減圧濃縮し、乾固した(310.4m
g) 。Bio−Gel P−6活性画分乾固物をアセトニト
リル/0.1%リン酸水(40:60)に溶解(20mg
/ml) した。その200μlずつをsilica ODSカラ
ム(10×250mm)を用いたHPLCにかけ、アセト
ニトリル/0.1%リン酸水(40:60)で溶出し、
活性画分を分取した。分取した活性画分を酢酸エチルで
抽出し、無機硫酸ナトリウムで脱水後、ロータリーエバ
ポレーターで減圧濃縮乾固し、クリソスポリンを精製標
品35mgを得た。The butyl acetate extract was added to 20 mM potassium phosphate.
Dissolve in 100 mg / ml with a glucose solution (pH 7.4)
And add 1 ml of it to 300 mM NaCl and 0.02% N
aN 320 mM potassium phosphate buffer (pH 7.
Biogel P-6 equilibrated in 4) (fractionation range)
1,000-6,000 Dalton) column (26 x 40
0 mm) and eluted with the above equilibration buffer (25 ml)
/ H). Divided into 150 fractions of 4.2 ml each
I took it. Fraction No. with strong inhibitory activity on the low-molecular side
Collect 100 to 125 and pH 3 with 6N HCl.
It was adjusted to 0 and extracted 3 times with an equal volume of ethyl acetate. separated
After dehydrating the ethyl acetate layer with anhydrous sodium sulfate, rotate the rotor.
It was concentrated under reduced pressure with an evaporator and dried (310.4m
g). Bio-Gel P-6 active fraction dried product was acetonited.
Lil / dissolved in 0.1% phosphoric acid water (40:60) (20 mg
/ Ml). 200 μl each of which is silica ODS color
Mu (10 x 250mm) Was used to
Elute with nitrile / 0.1% phosphoric acid water (40:60),
The active fraction was collected. The active fraction collected was taken up with ethyl acetate.
Extracted, dehydrated with inorganic sodium sulfate, and then rotary evaporated.
Concentrate to dryness under reduced pressure with a porator and purify chrysosporin.
35 mg of the product was obtained.
【図1】クリソスポリンの紫外部吸収スペクトルを示
す。FIG. 1 shows an ultraviolet absorption spectrum of chrysosporin.
【図2】クリソスポリンの赤外部吸収スペクトル(臭化
カリウム錠剤で測定)を示す。FIG. 2 shows an infrared absorption spectrum of chrysosporin (measured with a potassium bromide tablet).
【図3】クリソスポリンの水素核磁気共鳴スペクトル
(重ジメチルスルホキシド中で測定)を示す。FIG. 3 shows a hydrogen nuclear magnetic resonance spectrum of chrysosporin (measured in deuterated dimethyl sulfoxide).
【図4】クリソスポリンの炭素核磁気共鳴スペクトル
(重ジメチルスルホキシド中で測定)を示す。FIG. 4 shows a carbon nuclear magnetic resonance spectrum of chrysosporin (measured in deuterated dimethyl sulfoxide).
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12R 1:645) Continuation of front page (51) Int.Cl. 5 Identification code Office reference number FI technical display area C12R 1: 645)
Claims (4)
する新規薬理活性物質クリソスポリン: (a) 外 観 ; 暗褐色粉末 (b) 分子量 ; 502FAB−MS(m/z)5
01、08323(M−H) - (c) 示性式 ; C27H18O10 (d) 溶解性 ; 低級アルコール、クロロホルム、
酢酸エステルに可溶 (e) 紫外部吸収スペクトル ; 図1に示す。 (f) 赤外部吸収スペクトル ; 臭化カリウム錠剤
で測定したスペクトルを図2に示す。 (g) 水素核磁気共鳴スペクトル ; 重ジメチルス
ルホキシド中で測定したスペクトルを図3に示す。 (h) 炭素核磁気共鳴スペクトル ; 重ジメチルス
ルホキシド中で測定したスペクトルを図4に示す。1. A novel pharmacologically active substance, chrysosporin, having the following physicochemical properties: (a) appearance; dark brown powder (b) molecular weight; 502FAB-MS (m / z) 5
01,08323 (M-H) - ( c) rational formula; C 27 H 18 O 10 ( d) solubility; lower alcohol, chloroform,
Soluble in acetic ester (e) Ultraviolet absorption spectrum; shown in FIG. (F) Red external absorption spectrum: The spectrum measured with a potassium bromide tablet is shown in FIG. (G) Hydrogen nuclear magnetic resonance spectrum: The spectrum measured in deuterated dimethyl sulfoxide is shown in FIG. (H) Carbon nuclear magnetic resonance spectrum: The spectrum measured in deuterated dimethyl sulfoxide is shown in FIG.
ン生産菌を培養し、培養液中にクリソスポリンを蓄積さ
せ、ついで培養液からクリソスポリンを採取することを
特徴とするクリソスポリンの製造法2. A method for producing chrysosporin, which comprises culturing a chrysosporin-producing bacterium belonging to the genus Chrysosporium, accumulating chrysosporin in the medium, and then collecting chrysosporin from the medium.
スポリウムパノラムM10539株(微工研菌寄第12
279号)である請求項2項記載の製造法3. A strain belonging to the genus Chrysosporium is Chrysosporium panoram M10539 strain
279).
(微工研菌寄第12279)及びクリソスポリウムを生
産するその変異株4. Chrysosporium panoram M10539 strain (Microtechnological Research Institute No. 12279) and its mutant strain producing chrysosporium
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP3203607A JPH0525190A (en) | 1991-07-19 | 1991-07-19 | Novel pharmacologically active substance chrysosporin and production thereof |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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JP3203607A JPH0525190A (en) | 1991-07-19 | 1991-07-19 | Novel pharmacologically active substance chrysosporin and production thereof |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0525190A true JPH0525190A (en) | 1993-02-02 |
Family
ID=16476846
Family Applications (1)
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JP3203607A Pending JPH0525190A (en) | 1991-07-19 | 1991-07-19 | Novel pharmacologically active substance chrysosporin and production thereof |
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Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0525190A (en) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014209563A (en) * | 2013-03-28 | 2014-11-06 | 日東電工株式会社 | Sheet for sealing hollow type electronic device, and method of manufacturing hollow type electronic device package |
JP2018133589A (en) * | 2013-03-28 | 2018-08-23 | 日東電工株式会社 | Sheet for sealing hollow type electronic device, and method for manufacturing hollow type electronic device package |
-
1991
- 1991-07-19 JP JP3203607A patent/JPH0525190A/en active Pending
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