JPH05200315A - 液体クロマトグラフィー中の固定相としての硼酸錯体 - Google Patents
液体クロマトグラフィー中の固定相としての硼酸錯体Info
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- JPH05200315A JPH05200315A JP4271793A JP27179392A JPH05200315A JP H05200315 A JPH05200315 A JP H05200315A JP 4271793 A JP4271793 A JP 4271793A JP 27179392 A JP27179392 A JP 27179392A JP H05200315 A JPH05200315 A JP H05200315A
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- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J39/00—Cation exchange; Use of material as cation exchangers; Treatment of material for improving the cation exchange properties
- B01J39/26—Cation exchangers for chromatographic processes
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2220/00—Aspects relating to sorbent materials
- B01J2220/50—Aspects relating to the use of sorbent or filter aid materials
- B01J2220/54—Sorbents specially adapted for analytical or investigative chromatography
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 液体クロマトグラフィー用の新規なカチオ
ン交換体。 【構成】 ヒドロキシル基を含有するマトリクス中に
硼酸および／またはその塩を錯体の形で含有する液体ク
ロマトグラフィー用のカチオン交換体。
ン交換体。 【構成】 ヒドロキシル基を含有するマトリクス中に
硼酸および／またはその塩を錯体の形で含有する液体ク
ロマトグラフィー用のカチオン交換体。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は液体クロマトグラフィー
用の新規なイオン交換体に関係する。
用の新規なイオン交換体に関係する。
【０００２】
【従来技術】イオン性分析物のクロマトグラフィーによ
る分離用の固定相としてイオン交換体は共通している。
カチオン交換体はポリアニオンから成り立っている。そ
の活性グループとしては、これらのポリアニオンは例え
ばCOOH, SO3H, PO4H2 を含有している。これらの基のた
めの多量の支持材料は公知である。これらは更に、例え
ばセルロース、ポリスチレン、架橋化デキストラン、ポ
リメチル（メタ）アクリル酸、シリカゲルの誘導体を包
含している。
る分離用の固定相としてイオン交換体は共通している。
カチオン交換体はポリアニオンから成り立っている。そ
の活性グループとしては、これらのポリアニオンは例え
ばCOOH, SO3H, PO4H2 を含有している。これらの基のた
めの多量の支持材料は公知である。これらは更に、例え
ばセルロース、ポリスチレン、架橋化デキストラン、ポ
リメチル（メタ）アクリル酸、シリカゲルの誘導体を包
含している。
【０００３】当業界に通暁している方は分離問題に応じ
てこれらの圧倒的多数の分離素材から選別を行ってい
る。この方法では、往々にして妥当な選別によって当面
の分離問題を実行に移せるのである。従って選別の余地
の拡大が望ましいことになる。新規な、あるいは従来満
足出来るようには解決していなかった分離問題を解決す
ることが新たな余地として提示されている。本発明は液
体クロマトグラフィー用の新規なイオン交換用の基の製
造および使用を記載している。
てこれらの圧倒的多数の分離素材から選別を行ってい
る。この方法では、往々にして妥当な選別によって当面
の分離問題を実行に移せるのである。従って選別の余地
の拡大が望ましいことになる。新規な、あるいは従来満
足出来るようには解決していなかった分離問題を解決す
ることが新たな余地として提示されている。本発明は液
体クロマトグラフィー用の新規なイオン交換用の基の製
造および使用を記載している。
【０００４】
【発明が解決しようとしている課題】本発明は硼酸およ
び隣接するジオール化合物から硼酸エステルを形成する
ことに基いている。この方法では安定なアルコクソ酸が
生成し、この物は硼酸自身よりもはるかに酸性である。
ヒドロキシル基を含有する化合物、例えば糖分の構造を
求めるための操作はそれ自身公知の反応順序に基いてい
る。この反応は更にグリコシル化した蛋白質のクロマト
グラフィーによる分離にも利用されている。すなわち、
硼酸誘導体は共有結合によってマトリックスに結合して
いる。分析物がシス配置でジオール基を持っているなら
ば、この分子は可逆的に結合しており、通常は遅延して
いる。このクロマトグラフィーの方法では、硼酸−ジオ
ール錯体のための安定性の要求は低い。ジオール含有化
合物は溶液中で自由に動きうるので、硼酸錯体の生成に
必要なヒドロキシル基の立体的に必要な要求は満足され
ている。これらの硼酸錯体はイオン交換クロマトグラフ
ィーには不向きである。
び隣接するジオール化合物から硼酸エステルを形成する
ことに基いている。この方法では安定なアルコクソ酸が
生成し、この物は硼酸自身よりもはるかに酸性である。
ヒドロキシル基を含有する化合物、例えば糖分の構造を
求めるための操作はそれ自身公知の反応順序に基いてい
る。この反応は更にグリコシル化した蛋白質のクロマト
グラフィーによる分離にも利用されている。すなわち、
硼酸誘導体は共有結合によってマトリックスに結合して
いる。分析物がシス配置でジオール基を持っているなら
ば、この分子は可逆的に結合しており、通常は遅延して
いる。このクロマトグラフィーの方法では、硼酸−ジオ
ール錯体のための安定性の要求は低い。ジオール含有化
合物は溶液中で自由に動きうるので、硼酸錯体の生成に
必要なヒドロキシル基の立体的に必要な要求は満足され
ている。これらの硼酸錯体はイオン交換クロマトグラフ
ィーには不向きである。
【０００５】従って隣接しているジオール基を含有する
クロマトグラフィー支持体に硼酸あるいは硼素を含有す
る溶液を作用させたときに、安定な硼酸錯体を生成する
ことを確認できたことは驚異であった。得られた負に帯
電した錯体は硼酸の痕跡量存在下では極めて安定である
ことが明らかになっているので、カチオン交換体の中心
としてクロマトグラフィーには妥当である。硼酸−ジオ
ール錯体は上述のように長年公知であり、しかもこれら
の錯体が支持体と結合した硼酸を含有している限り、イ
オン交換クロマトグラフィー用の支持体としては不適当
であったので、この知見は特に全く期待外であった
クロマトグラフィー支持体に硼酸あるいは硼素を含有す
る溶液を作用させたときに、安定な硼酸錯体を生成する
ことを確認できたことは驚異であった。得られた負に帯
電した錯体は硼酸の痕跡量存在下では極めて安定である
ことが明らかになっているので、カチオン交換体の中心
としてクロマトグラフィーには妥当である。硼酸−ジオ
ール錯体は上述のように長年公知であり、しかもこれら
の錯体が支持体と結合した硼酸を含有している限り、イ
オン交換クロマトグラフィー用の支持体としては不適当
であったので、この知見は特に全く期待外であった
【０００６】
【課題を解決する手段】したがって、本発明は液体クロ
マトグラフィー用のカチオン交換体に関係し、硼酸が脂
肪族ヒドロキシル基を含むマトリックス中に錯体化され
ていることを特徴としている。以下には、「硼酸」とい
う用語は硼酸および／またはその塩を意味すると解する
ことにする。脂肪族ヒドロキシル基を含有する適当なマ
トリックスはクロマトグラフィー用の固定相として当該
技術者には公知である。これらはデクストランおよびア
ガロースを含有し、特に架橋化したこれらの誘導体を含
有し、さらにセルロース、シチン、脂肪族ヒドロキシル
基を含有するポリ（メタ）アクリル酸誘導体を含む。さ
らにこれらは、例えばジオール置換シリカゲル、ガラ
ス、シリコンカーバイドのような脂肪族のヒドロキシル
基を含有する置換基をを持つ無機の支持体をも含有する
ものである。脂肪族のヒドロキシル基を含有するシリカ
ゲル誘導体、特に2,3-ジヒドロキシプロピル基で、グル
コナマイド、モノ−、オリゴ−、ポリサッカライドで置
換したシリカゲルは特に好ましい。
マトグラフィー用のカチオン交換体に関係し、硼酸が脂
肪族ヒドロキシル基を含むマトリックス中に錯体化され
ていることを特徴としている。以下には、「硼酸」とい
う用語は硼酸および／またはその塩を意味すると解する
ことにする。脂肪族ヒドロキシル基を含有する適当なマ
トリックスはクロマトグラフィー用の固定相として当該
技術者には公知である。これらはデクストランおよびア
ガロースを含有し、特に架橋化したこれらの誘導体を含
有し、さらにセルロース、シチン、脂肪族ヒドロキシル
基を含有するポリ（メタ）アクリル酸誘導体を含む。さ
らにこれらは、例えばジオール置換シリカゲル、ガラ
ス、シリコンカーバイドのような脂肪族のヒドロキシル
基を含有する置換基をを持つ無機の支持体をも含有する
ものである。脂肪族のヒドロキシル基を含有するシリカ
ゲル誘導体、特に2,3-ジヒドロキシプロピル基で、グル
コナマイド、モノ−、オリゴ−、ポリサッカライドで置
換したシリカゲルは特に好ましい。
【０００７】さらに本発明はイオン交換クロマトグラフ
ィー用の固定相の製造方法にも関係しており、脂肪族ヒ
ドロキシル基を含有する支持体材料を硼酸を含有する溶
液で処理することも特徴としている。妥当な支持体材料
は既に上に記載した。本発明によれば、硼酸は余分に緩
衝液イオンおよび／または中性塩を含有することができ
る水溶液中で支持体材料に作用することができるのであ
る。好ましくは5.5 〜9.5 のpHがこの場合に設定され
る。硼酸は好ましくは50〜300 ミリモル／l の濃度の溶
液中で使用される。硼酸の濃度の変動は結合容量を分離
問題に適合させることを認めている。硼酸−ジオ−ル錯
体の生成が可逆的であるので、多孔質のジオール含有ク
ロマトグラフィー支持体材料は、出来ることならば、ゲ
ル浸透クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグ
ラフィー用に使用することも可能である。
ィー用の固定相の製造方法にも関係しており、脂肪族ヒ
ドロキシル基を含有する支持体材料を硼酸を含有する溶
液で処理することも特徴としている。妥当な支持体材料
は既に上に記載した。本発明によれば、硼酸は余分に緩
衝液イオンおよび／または中性塩を含有することができ
る水溶液中で支持体材料に作用することができるのであ
る。好ましくは5.5 〜9.5 のpHがこの場合に設定され
る。硼酸は好ましくは50〜300 ミリモル／l の濃度の溶
液中で使用される。硼酸の濃度の変動は結合容量を分離
問題に適合させることを認めている。硼酸−ジオ−ル錯
体の生成が可逆的であるので、多孔質のジオール含有ク
ロマトグラフィー支持体材料は、出来ることならば、ゲ
ル浸透クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグ
ラフィー用に使用することも可能である。
【０００８】本発明はイオン交換クロマトグラフィーに
よるカチオン性物質の分離方法に関係しており、その際
に錯体状で硼酸を含有しているジオ−ル基を含有する固
定相が使用される。カチオン性物質をイオン交換クロマ
トグラフィーによって分離することの基礎は本技術に習
熟した担当者には公知である。物質の混合物は例えば食
塩、塩化カリ、硫酸ソーダのような中性塩を余分に含有
することができる緩衝液化した水溶液で分離カラムに適
用する。妥当な緩衝液系は、例えば燐酸ソーダおよび／
または燐酸カリ、トリス、例えば、HEPES(N-2-ヒドロキ
シエチルピペラジン-N'-2-エタンスルフォニックアシッ
ド) のような両性イオン緩衝液、および硼酸塩である。
硼酸塩緩衝液が使用されないならば、分離は好ましくは
緩衝液に硼酸少量添加（すなわち1-50ミリモル／１）を
使用して分離を行う。緩衝液のpHは分離する物質の解離
定数、すなはち等電点によって変動し、さらに好ましく
は5.5 〜9.5 である。通常の緩衝液濃度は10〜100mモル
／ｌである。クロマトグラフィー分離はアイソクラチッ
ク、すなはち適用条件下で、あるいは好ましくは傾斜溶
離によって行われる。傾斜溶離の場合には、中性塩濃度
は典型的には0.5 〜１モル／ｌに増加し、および／また
はそのpHが変化する。選択枝として、水と混合しうる有
機溶媒を傾斜液として利用することも可能である。妥当
な溶媒の例はテトラヒドロフラン、メタノ−ル、あるい
はアセトニトリルである。傾斜液は典型的には0 〜70、
好ましくは0 〜50体積パーセントにわたっっている。
よるカチオン性物質の分離方法に関係しており、その際
に錯体状で硼酸を含有しているジオ−ル基を含有する固
定相が使用される。カチオン性物質をイオン交換クロマ
トグラフィーによって分離することの基礎は本技術に習
熟した担当者には公知である。物質の混合物は例えば食
塩、塩化カリ、硫酸ソーダのような中性塩を余分に含有
することができる緩衝液化した水溶液で分離カラムに適
用する。妥当な緩衝液系は、例えば燐酸ソーダおよび／
または燐酸カリ、トリス、例えば、HEPES(N-2-ヒドロキ
シエチルピペラジン-N'-2-エタンスルフォニックアシッ
ド) のような両性イオン緩衝液、および硼酸塩である。
硼酸塩緩衝液が使用されないならば、分離は好ましくは
緩衝液に硼酸少量添加（すなわち1-50ミリモル／１）を
使用して分離を行う。緩衝液のpHは分離する物質の解離
定数、すなはち等電点によって変動し、さらに好ましく
は5.5 〜9.5 である。通常の緩衝液濃度は10〜100mモル
／ｌである。クロマトグラフィー分離はアイソクラチッ
ク、すなはち適用条件下で、あるいは好ましくは傾斜溶
離によって行われる。傾斜溶離の場合には、中性塩濃度
は典型的には0.5 〜１モル／ｌに増加し、および／また
はそのpHが変化する。選択枝として、水と混合しうる有
機溶媒を傾斜液として利用することも可能である。妥当
な溶媒の例はテトラヒドロフラン、メタノ−ル、あるい
はアセトニトリルである。傾斜液は典型的には0 〜70、
好ましくは0 〜50体積パーセントにわたっっている。
【０００９】本発明はさらに固定相のジオ−ル含有量を
求める方法に関係している。この目的のためには、固定
相は硼酸とまず錯体化する。得られたイオン交換体相の
結合容量は妥当な試料分析物（例えばリゾチーム）を含
有する溶液を分析物が溶離液中に現われるまでカラムに
適用することによって求められる。この場合にはクロマ
トグラフィー条件は試料分析物がイオン交換支持体に結
合されるように選定される。今迄の通常の分析方法、例
えば元素分析あるいは過ヨウ素酸塩滴定とは対照的に、
この方法は非破壊的であり、その理由はジオ−ルを含有
する、例えばグリセリンを含有する溶液を使って、硼酸
を再び固定相から洗い出すことが出来るからである。
求める方法に関係している。この目的のためには、固定
相は硼酸とまず錯体化する。得られたイオン交換体相の
結合容量は妥当な試料分析物（例えばリゾチーム）を含
有する溶液を分析物が溶離液中に現われるまでカラムに
適用することによって求められる。この場合にはクロマ
トグラフィー条件は試料分析物がイオン交換支持体に結
合されるように選定される。今迄の通常の分析方法、例
えば元素分析あるいは過ヨウ素酸塩滴定とは対照的に、
この方法は非破壊的であり、その理由はジオ−ルを含有
する、例えばグリセリンを含有する溶液を使って、硼酸
を再び固定相から洗い出すことが出来るからである。
【００１０】本発明は最後にヒドロキシル基を含有する
固定相の構造を求めるための方法に関係し、固定相が硼
酸と結合していることをその特徴としている。この方法
では試料分析物、例えばリゾチームの溶離挙動は硼酸の
存在した場合と、しない場合とで検討されている。溶離
挙動は隣接するジオ−ル基が存在する場合にのみ異なっ
ている。図１は実施例による溶離図を示している（詳細
は実施例９を参照すること）。
固定相の構造を求めるための方法に関係し、固定相が硼
酸と結合していることをその特徴としている。この方法
では試料分析物、例えばリゾチームの溶離挙動は硼酸の
存在した場合と、しない場合とで検討されている。溶離
挙動は隣接するジオ−ル基が存在する場合にのみ異なっ
ている。図１は実施例による溶離図を示している（詳細
は実施例９を参照すること）。
【００１１】
【図１】
【００１２】
【実施例】以下の実施例は本発明を明解にする意図であ
り、その範囲を制限するためのものではない。特に断わ
らない限り、試験は50×10mmカラム、0.5ml/min の流速
で行われた。 実施例１ カチオン交換体の製造（ジオ−ル改質済みシリカゲルに
よる） 硼酸溶液（硼酸0.1 モル／１、カセイソーダでｐＨ7.5
に調節済）をリクロスファ−（LiChrospher 登録商標）
100 DIOL 5μm( 10nm の平均細孔直径を有し、5 μm の
平均粒子直径を有する球場シリカゲル、2,3-ジヒドロキ
シプロピル基で置換されている）を充填したカラムを通
じて汲み上げる。ただし、その伝導度がその流れの間中
には変化しなくなるまで（１時間）とする。カラムはそ
の後に目的とする利用媒体によって平衡化する（使用例
を参照すること）。 実施例２ カチオン交換体の製造（グルコナマイド改質済みシリカ
ゲルによる） 実施例１に記載したように、硼酸溶液をグルコナマイド
で置換されているリクロスファ−（登録商標）100 5μ
m ( 10nmの平均細孔直径を有し、 5 μm の平均粒子直径
を有する球形シリカゲル) を充填したカラムを通じて汲
み上げる。その後の製造工程は実施例１と同一である。 実施例３ カチオン交換体の製造（ヒドロキシル基を含有するポリ
メタクリル酸誘導体による） 実施例１に記載したように、硼酸溶液をフラクトゲル
（Fractogel 登録商標）TSK-HW 40(S) (オリゴエチレン
グリコ−ルグリシヂルメタクリレ−トとペンタエリスリ
ト−ルジメタクリレ−トの多孔質共重合体であって、そ
の球形粒子は25〜40μm の直径を有する) を充填したカ
ラムを通じて汲み上げる。その後の製造工程は実施例１
と同一である。 実施例４ 結合容量の測定 検討しようとする吸着剤を充填したカラムを硼酸溶液
（0.1 モル／ｌ，カセイソ−ダでpH7.5 に調節済）平衡
化する。卵白リゾチ−ムを同じ硼酸溶液に溶解した溶液
（10mg/ml ）をその後にカラムを通じて汲み上げ（0.5m
l/min)、蛋白質が溶離液に現われるまで（280 nmでの光
学密度測定による）行う。カラムの容量は（ゲル体積に
比して）この時点までに使用した液体の体積から求め
る。
り、その範囲を制限するためのものではない。特に断わ
らない限り、試験は50×10mmカラム、0.5ml/min の流速
で行われた。 実施例１ カチオン交換体の製造（ジオ−ル改質済みシリカゲルに
よる） 硼酸溶液（硼酸0.1 モル／１、カセイソーダでｐＨ7.5
に調節済）をリクロスファ−（LiChrospher 登録商標）
100 DIOL 5μm( 10nm の平均細孔直径を有し、5 μm の
平均粒子直径を有する球場シリカゲル、2,3-ジヒドロキ
シプロピル基で置換されている）を充填したカラムを通
じて汲み上げる。ただし、その伝導度がその流れの間中
には変化しなくなるまで（１時間）とする。カラムはそ
の後に目的とする利用媒体によって平衡化する（使用例
を参照すること）。 実施例２ カチオン交換体の製造（グルコナマイド改質済みシリカ
ゲルによる） 実施例１に記載したように、硼酸溶液をグルコナマイド
で置換されているリクロスファ−（登録商標）100 5μ
m ( 10nmの平均細孔直径を有し、 5 μm の平均粒子直径
を有する球形シリカゲル) を充填したカラムを通じて汲
み上げる。その後の製造工程は実施例１と同一である。 実施例３ カチオン交換体の製造（ヒドロキシル基を含有するポリ
メタクリル酸誘導体による） 実施例１に記載したように、硼酸溶液をフラクトゲル
（Fractogel 登録商標）TSK-HW 40(S) (オリゴエチレン
グリコ−ルグリシヂルメタクリレ−トとペンタエリスリ
ト−ルジメタクリレ−トの多孔質共重合体であって、そ
の球形粒子は25〜40μm の直径を有する) を充填したカ
ラムを通じて汲み上げる。その後の製造工程は実施例１
と同一である。 実施例４ 結合容量の測定 検討しようとする吸着剤を充填したカラムを硼酸溶液
（0.1 モル／ｌ，カセイソ−ダでpH7.5 に調節済）平衡
化する。卵白リゾチ−ムを同じ硼酸溶液に溶解した溶液
（10mg/ml ）をその後にカラムを通じて汲み上げ（0.5m
l/min)、蛋白質が溶離液に現われるまで（280 nmでの光
学密度測定による）行う。カラムの容量は（ゲル体積に
比して）この時点までに使用した液体の体積から求め
る。
【００１３】以下の結合容量は実施例１〜３に記載した
カラムについて求めた。 実施例 材料 結合容量（リゾチ−ムmg/ ゲルml） １ ジオ−ル 38.2 ２ グルコナマイド 145 ３ フラクトゲル 26.1 実施例５ 硼酸濃度の変更による結合容量の変動 Bio GPC-DIOL 250 ( 25nm の平均細孔直径を有し、5μm
の平均粒子直径を有する球形シリカゲル、2,3-ジヒドロ
キシプロピル基で置換されている）を充填したカラムを
実施例１にならって製造する。しかし、硼酸の濃度を変
動させる。その後に結合容量は実施例４に記載したよう
にして求めた。 硼酸濃度( mmol/l ) 結合容量（リゾチ−ムmg/ ゲルml ) 50 28.7 100 57.7 200 64.5 300 73.3 実施例６ 硼酸−ジオ−ル錯体相の安定性 実施例１によって製造され（硼酸濃度100mモル/l)、 NaH
2PO4緩衝液( 20m モル/l、 pH 7.5、 H3BO3 1 m モル/l )
で平衡化したカラムを使用する。同一の緩衝液にキモト
リプシノ−ゲンを( ４mg/ml)、チトクロ−ムＣ(4mg/ml)
を含有する溶液200 μl を使用し、食塩0 〜0.2 モル/l
の線形食塩傾斜溶離液（上記の燐酸塩緩衝液、傾斜溶離
時間20分）中に溶離した。カラムはその後再び燐酸塩緩
衝液で平衡化され、その後に同一の緩衝液がカラムを通
じて汲み上げられた（継続時間２時間）。後の試料がそ
の後に適用され、分離された。以下の溶離時間（min ）
が観測された。 物質 実行番号 1 2 3 4 キモトリプシノ−ゲン 2.80 2.78 2.76 2.64 チトクロ−ムＣ 5.62 5.60 5.53 5.52 当然のこととして、緩衝液中の極めて低い硼酸溶液では
硼酸−ジオ−ル錯体は安定であって、カラムをその後に
繰返し使用することも可能である。 実施例７ 分離試料Ａ，Ｂ，Ｃ 実施例５によって製造され（硼酸濃度100mモル／ｌ）、
及び種々の溶離緩衝液によって平衡化されたカラムが使
用された。キモトリプシノ−ゲン（4mg/ml）、チトクロ
−ムＣ（4mg/ml）、リゾチ−ム（4mg/ml）それぞれを同
一の緩衝液のなかに含む溶液 200μl を適用し、食塩0
〜0.2 モル／ｌの線形食塩傾斜溶離液中に溶離した（上
記の緩衝液、傾斜溶離継続時間20分）。
カラムについて求めた。 実施例 材料 結合容量（リゾチ−ムmg/ ゲルml） １ ジオ−ル 38.2 ２ グルコナマイド 145 ３ フラクトゲル 26.1 実施例５ 硼酸濃度の変更による結合容量の変動 Bio GPC-DIOL 250 ( 25nm の平均細孔直径を有し、5μm
の平均粒子直径を有する球形シリカゲル、2,3-ジヒドロ
キシプロピル基で置換されている）を充填したカラムを
実施例１にならって製造する。しかし、硼酸の濃度を変
動させる。その後に結合容量は実施例４に記載したよう
にして求めた。 硼酸濃度( mmol/l ) 結合容量（リゾチ−ムmg/ ゲルml ) 50 28.7 100 57.7 200 64.5 300 73.3 実施例６ 硼酸−ジオ−ル錯体相の安定性 実施例１によって製造され（硼酸濃度100mモル/l)、 NaH
2PO4緩衝液( 20m モル/l、 pH 7.5、 H3BO3 1 m モル/l )
で平衡化したカラムを使用する。同一の緩衝液にキモト
リプシノ−ゲンを( ４mg/ml)、チトクロ−ムＣ(4mg/ml)
を含有する溶液200 μl を使用し、食塩0 〜0.2 モル/l
の線形食塩傾斜溶離液（上記の燐酸塩緩衝液、傾斜溶離
時間20分）中に溶離した。カラムはその後再び燐酸塩緩
衝液で平衡化され、その後に同一の緩衝液がカラムを通
じて汲み上げられた（継続時間２時間）。後の試料がそ
の後に適用され、分離された。以下の溶離時間（min ）
が観測された。 物質 実行番号 1 2 3 4 キモトリプシノ−ゲン 2.80 2.78 2.76 2.64 チトクロ−ムＣ 5.62 5.60 5.53 5.52 当然のこととして、緩衝液中の極めて低い硼酸溶液では
硼酸−ジオ−ル錯体は安定であって、カラムをその後に
繰返し使用することも可能である。 実施例７ 分離試料Ａ，Ｂ，Ｃ 実施例５によって製造され（硼酸濃度100mモル／ｌ）、
及び種々の溶離緩衝液によって平衡化されたカラムが使
用された。キモトリプシノ−ゲン（4mg/ml）、チトクロ
−ムＣ（4mg/ml）、リゾチ−ム（4mg/ml）それぞれを同
一の緩衝液のなかに含む溶液 200μl を適用し、食塩0
〜0.2 モル／ｌの線形食塩傾斜溶離液中に溶離した（上
記の緩衝液、傾斜溶離継続時間20分）。
【００１４】 分離試料 Ａ Ｂ Ｃ 緩衝液：50m モル／ｌ トリス×HCl HEPES NaH2PO4 H3BO3 100mモル／ｌ、 pH 8.0を含有する。 溶離時間(min) : キモトリプシノ−ゲン 11.16 12.19 4.18 チトクロームＣ 15.10 16.23 6.82 リゾチーム 18.39 19.02 11.62 実施例８ 分離試料Ｄ 実施例５によって製造され（硼酸濃度100mモル／ｌ）、
及び溶離緩衝液として硼酸溶液（100mモル／ｌ、pH 5.
5）によって平衡化されたカラムを使用した。マイオグ
ロビン（4mg/ml）、α−キモトリプシン（4mg/ml）を同
一の緩衝液の中に溶解した溶液 200μl を適用し、食塩
0 〜0.2 モル／ｌの線形食塩傾斜溶離液中に溶離した
（上記の緩衝液、傾斜溶離継続時間20分）。以下の溶離
時間（min ）を求めた。 マイオグロビン 8.51 α−キモトリプシン 10.55 実施例９ 分離試料Ｅ 実施例５によって製造され（硼酸濃度100mモル／ｌ）、
および溶離緩衝液として硼酸溶液（100mモル／ｌ、pH
7.5）によって平衡化されていたカラムを使用した。キ
モトリプシノ−ゲン（4mg/ml）、リボヌクレアーゼ(10m
g/ml) 、チトクロ−ムＣ（4mg/ml）、リゾチ−ム（4mg/
ml）を同一の緩衝液のなかに溶解した溶液200 μl を適
用し、食塩0 〜0.2 モル／ｌの線形食塩傾斜溶離液中に
溶離（上記の緩衝液、傾斜溶離継続時間20分）した。以
下の溶離時間(min) を求めた。 (1) キモトリプシノーゲン 9.90 (2) リボヌクレアーゼ 12.11 (3) チトクロ−ムＣ 15.80 (4) リゾチーム 19.72 その溶離線図を図１に示す。 実施例１０ 分離試料Ｆ 実施例５によって製造され（硼酸濃度100mモル／ｌ）、
および溶離緩衝液として燐酸塩緩衝液50 mモル/lおよび
硼酸溶液 100m モル／ｌ、pH 7.5 によって平衡化され
ていたカラムを使用した。リボヌクレアーゼ(12mg/ml)
、キモトリプシノ−ゲン（4mg/ml）、チトクロ−ムＣ
（4mg/ml）、リゾチ−ム（4mg/ml）を同一の緩衝液の中
に溶解した溶液 200μl を適用し、上記緩衝液に0%〜50
% のテトラヒドロフラン(THF) を含有する線形傾斜溶離
液中に20分かかって溶離した。
及び溶離緩衝液として硼酸溶液（100mモル／ｌ、pH 5.
5）によって平衡化されたカラムを使用した。マイオグ
ロビン（4mg/ml）、α−キモトリプシン（4mg/ml）を同
一の緩衝液の中に溶解した溶液 200μl を適用し、食塩
0 〜0.2 モル／ｌの線形食塩傾斜溶離液中に溶離した
（上記の緩衝液、傾斜溶離継続時間20分）。以下の溶離
時間（min ）を求めた。 マイオグロビン 8.51 α−キモトリプシン 10.55 実施例９ 分離試料Ｅ 実施例５によって製造され（硼酸濃度100mモル／ｌ）、
および溶離緩衝液として硼酸溶液（100mモル／ｌ、pH
7.5）によって平衡化されていたカラムを使用した。キ
モトリプシノ−ゲン（4mg/ml）、リボヌクレアーゼ(10m
g/ml) 、チトクロ−ムＣ（4mg/ml）、リゾチ−ム（4mg/
ml）を同一の緩衝液のなかに溶解した溶液200 μl を適
用し、食塩0 〜0.2 モル／ｌの線形食塩傾斜溶離液中に
溶離（上記の緩衝液、傾斜溶離継続時間20分）した。以
下の溶離時間(min) を求めた。 (1) キモトリプシノーゲン 9.90 (2) リボヌクレアーゼ 12.11 (3) チトクロ−ムＣ 15.80 (4) リゾチーム 19.72 その溶離線図を図１に示す。 実施例１０ 分離試料Ｆ 実施例５によって製造され（硼酸濃度100mモル／ｌ）、
および溶離緩衝液として燐酸塩緩衝液50 mモル/lおよび
硼酸溶液 100m モル／ｌ、pH 7.5 によって平衡化され
ていたカラムを使用した。リボヌクレアーゼ(12mg/ml)
、キモトリプシノ−ゲン（4mg/ml）、チトクロ−ムＣ
（4mg/ml）、リゾチ−ム（4mg/ml）を同一の緩衝液の中
に溶解した溶液 200μl を適用し、上記緩衝液に0%〜50
% のテトラヒドロフラン(THF) を含有する線形傾斜溶離
液中に20分かかって溶離した。
【００１５】試験はTHF の代わりにメタノールおよびア
セトニトリルを使ってそれぞれ繰返して行われた。以下
の溶離時間(min) を求めた。
セトニトリルを使ってそれぞれ繰返して行われた。以下
の溶離時間(min) を求めた。
【００１６】 THF メタノ−ル アセトニトリル リボヌクレアーゼ 3.44 3.36 実行せず キモトリプシノ−ゲン 4.10 4.01 3.92 チトクロ−ムＣ 6.68 6.55 6.04 リゾチ−ム 10.96 14.72 12.18 実施例１１ 分離試料Ｇ β−グリコデキストリンによって改質されたゲルを含有
し、実施例５によって製造された（硼酸濃度100mモル／
ｌ）カラムを使用した。そのカラムは溶離緩衝液として
ナトリウム硼酸塩、100mモル／ｌ、 pH7.5 によって平衡
化された。リボヌクレアーゼ(12mg/ml) 、チトクロ−ム
Ｃ（4mg/ml）、リゾチ−ム（4mg/ml）を同一の緩衝液の
なかに溶解した溶液 200μl を適用し、上記緩衝液中に
0 〜0.4mol/l 線形食塩傾斜溶離液中に40分かかって溶
離した。以下の溶離時間(min) を求めた。 (1) リボヌクレアーゼ 23.66 (2) チトクロ−ムＣ 25.67 (3) リゾチ−ム 30.27 実施例１２ カチオン交換体の製造（ジオ−ル置換されたメタクリレ
ートポリマ−で改質されたシリカゲルの硼酸錯体によ
る）。
し、実施例５によって製造された（硼酸濃度100mモル／
ｌ）カラムを使用した。そのカラムは溶離緩衝液として
ナトリウム硼酸塩、100mモル／ｌ、 pH7.5 によって平衡
化された。リボヌクレアーゼ(12mg/ml) 、チトクロ−ム
Ｃ（4mg/ml）、リゾチ−ム（4mg/ml）を同一の緩衝液の
なかに溶解した溶液 200μl を適用し、上記緩衝液中に
0 〜0.4mol/l 線形食塩傾斜溶離液中に40分かかって溶
離した。以下の溶離時間(min) を求めた。 (1) リボヌクレアーゼ 23.66 (2) チトクロ−ムＣ 25.67 (3) リゾチ−ム 30.27 実施例１２ カチオン交換体の製造（ジオ−ル置換されたメタクリレ
ートポリマ−で改質されたシリカゲルの硼酸錯体によ
る）。
【００１７】エポキサイド基を含有する線形メタクリレ
−トポリマ−で改質されたシリカゲル（リクロプレプ
（LiChroprep 登録商標) 、15-25 μm の粒子直径、80
nm細孔直径）による支持材料を90℃で5%の硫酸溶液で１
時間処理した。カチオン交換体はその後に実施例４に記
載したように製造し、その結合容量を求めた。支持材料
はゲルmlあたりリゾチ−ム31.2mgを結合している。
−トポリマ−で改質されたシリカゲル（リクロプレプ
（LiChroprep 登録商標) 、15-25 μm の粒子直径、80
nm細孔直径）による支持材料を90℃で5%の硫酸溶液で１
時間処理した。カチオン交換体はその後に実施例４に記
載したように製造し、その結合容量を求めた。支持材料
はゲルmlあたりリゾチ−ム31.2mgを結合している。
【図１】実施例９による溶離線図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｂ０１Ｊ 45/00 Ｒ 8017−4Ｇ (72)発明者 マルゴット マック ドイツ連邦共和国 デー−6100 ダルムシ ュタット フランクフルター シュトラー セ 250 (72)発明者 ヴェルナー ミュラー ドイツ連邦共和国 デー−6100 ダルムシ ュタット フランクフルター シュトラー セ 250
Claims (5)
- 【請求項１】 ヒドロキル基を含有するマトリックス中
に硼酸が錯体化されていることを特徴とする液体クロマ
トグラフィー用のカチオン交換体。 - 【請求項２】 請求項１によるカチオン交換体を使用す
ることを特徴とするイオン交換クロマトグラフィーによ
るカチオン性物質の分離方法 - 【請求項３】 固定相が硼酸で錯体化されていることを
特徴とする固定相のジオ−ル含有量を求める方法。 - 【請求項４】 固定相が硼酸を含有する溶液で処理する
ことを特徴とするヒドロキシル基を含有する固定相の構
造を求める方法。 - 【請求項５】 ヒドロキシル基を含有する固定相が硼酸
を含有する溶液で処理することを特徴とするイオン交換
クロマトグラフィー用の固定相の製造方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4133806/5 | 1991-10-12 | ||
| DE19914133806 DE4133806A1 (de) | 1991-10-12 | 1991-10-12 | Borsaeurekomplexe als stationaere phase in der fluessigkeitschromatographie |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05200315A true JPH05200315A (ja) | 1993-08-10 |
Family
ID=6442546
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4271793A Pending JPH05200315A (ja) | 1991-10-12 | 1992-10-09 | 液体クロマトグラフィー中の固定相としての硼酸錯体 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0537586A1 (ja) |
| JP (1) | JPH05200315A (ja) |
| DE (1) | DE4133806A1 (ja) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0036303B1 (en) * | 1980-03-13 | 1986-02-05 | Hitachi, Ltd. | Process for analyzing anions and process for treating radioactive liquid waste utilizing the same |
| US5002991A (en) * | 1988-04-07 | 1991-03-26 | Mitsubishi Petrochemical Company Limited | Permanent antistatic resin composition |
-
1991
- 1991-10-12 DE DE19914133806 patent/DE4133806A1/de not_active Withdrawn
-
1992
- 1992-10-05 EP EP92116987A patent/EP0537586A1/de not_active Withdrawn
- 1992-10-09 JP JP4271793A patent/JPH05200315A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0537586A1 (de) | 1993-04-21 |
| DE4133806A1 (de) | 1993-04-15 |
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