JPH05192144A - Gel substance having durability, its production and method for culturing cell using the same - Google Patents
Gel substance having durability, its production and method for culturing cell using the sameInfo
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明はアルギン酸アルカリ金属
塩（アルギン酸アンモニウム塩を含む、以下同じ）とポ
リアニオンとの混合液を、多価金属塩と接触させること
により形成される耐久性のある新規なゲル体及びその製
造方法に関する。本発明で提供されるゲル体は高い耐久
性を示し、その中に生細胞、酵素等を封入することがで
き、細胞培養や、酵素の固定化などに好適に用いられ
る。FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to a novel and durable metal salt formed by contacting a mixed solution of an alkali metal alginate (including ammonium alginate; the same applies hereinafter) and a polyanion with a polyvalent metal salt. A gel body and a method for producing the same. The gel body provided by the present invention has high durability and can enclose live cells, enzymes and the like therein, and is suitably used for cell culture, immobilization of enzymes and the like.
【０００２】[0002]
【従来の技術】アルギン酸は、褐藻類の海藻などから抽
出される多糖類で、アルギン酸ナトリウムなどのアルカ
リ金属塩の形で水に溶解し、きわめて粘性の高い液体と
なる。アルギン酸アルカリ金属塩の水溶液は、カルシウ
ムなどのアルカリ土類あるいはその他の多価金属塩水溶
液と接触して、強固なゲルを形成する。この特性を利用
して、ゲル体を形成させ、酵素や細胞を包括させること
により、バイオリアクターの担体や、細胞培養等に使用
される。2. Description of the Related Art Alginic acid is a polysaccharide extracted from brown algae such as seaweed. It is dissolved in water in the form of an alkali metal salt such as sodium alginate to form an extremely viscous liquid. The aqueous solution of alkali metal alginate contacts with alkaline earth metal such as calcium or other polyvalent metal salt solution to form a firm gel. By utilizing this characteristic, a gel body is formed and an enzyme and cells are entrapped, so that it can be used for a carrier of a bioreactor, a cell culture and the like.
【０００３】特開昭５８−１６６９３号公報及び特開昭
６０−２２４６２７号公報には、アルギン酸ナトリウム
水溶液中に動物細胞を浮遊させ、この溶液を塩化カルシ
ウムによりゲル皮膜を形成させ、得られるゲルを用い細
胞を培養し、物質を生産させる方法が開示されている。
このアルギン酸によるゲル体は、簡便に調製できるが、
ゲルを形成しているカルシウムイオンが遊離し、次第に
強度が低下することが指摘されている。また特開昭６０
−２５８１２１号公報には、アルギン酸ゲルにより細胞
をカプセル化し、該ゲル体の表面にポリカチオンを反応
させ、膜を形成させる方法が開示されている。こうし
た、ゲル体表面に形成された薄い膜は剪断力に対して弱
いことが観察されている。In JP-A-58-16693 and JP-A-60-224627, animal cells are suspended in an aqueous solution of sodium alginate, and a gel film is formed from this solution with calcium chloride to obtain a gel. A method of culturing cells for use to produce a substance is disclosed.
This alginic acid gel can be easily prepared,
It is pointed out that the calcium ions forming the gel are released and the strength gradually decreases. In addition, JP-A-60
Japanese Patent Publication No. 258121 discloses a method of encapsulating cells with an alginate gel and reacting a polycation on the surface of the gel body to form a membrane. It has been observed that such a thin film formed on the surface of the gel body is weak against shearing force.
【０００４】[0004]
【発明が解決しようとする課題】本発明では、従来のゲ
ル化では実現していないアルギン酸アルカリ金属塩とポ
リアニオンとの混合物溶液と、多価金属塩、特にアルカ
リ土類金属塩との接触により形成されたゲル体を提供す
ることを課題とする。本発明で得られるゲル体は、強固
であり、従来のゲル体と異なり、ゲルを形成させるため
に使用した多価金属塩、特にアルカリ土類金属塩が脱離
しても、耐久性を失なわない。このため得られるゲル体
は、長期間ゲルを維持する必要のあるバイオリアクター
や、細胞培養に適するものとなる。DISCLOSURE OF THE INVENTION In the present invention, a solution of a mixture of an alkali metal alginate and a polyanion, which has not been realized by conventional gelation, is contacted with a polyvalent metal salt, particularly an alkaline earth metal salt. It is an object of the present invention to provide a gel body that has been prepared. The gel body obtained in the present invention is strong, and unlike the conventional gel body, even if the polyvalent metal salt used for forming the gel, particularly the alkaline earth metal salt is released, the durability is lost. Absent. Therefore, the obtained gel body is suitable for a bioreactor that needs to maintain the gel for a long period of time and a cell culture.
【０００５】[0005]
【課題を解決するための手段】本発明で提供されるゲル
体は、アルギン酸アルカリ金属塩とポリアニオンとの混
合溶液と多価金属塩、特にアルカリ土類金属塩との接触
により形成されたものである。The gel body provided by the present invention is formed by contacting a mixed solution of an alkali metal alginate and a polyanion with a polyvalent metal salt, particularly an alkaline earth metal salt. is there.
【０００６】本発明に使用するアルギン酸アルカリ金属
塩としては、一般的にアルカリ塩であればどのようなも
のでも使用できる。また、アンモニウム塩も使用するこ
とができる。しかし、普通はナトリウム塩あるいはカリ
ウム塩が用いられる。又ポリアニオンとしては、天然由
来のカルボキシメチルセルロース、カラギーナンや、合
成品のポリグルタミン酸、ポリアクリル酸、ポリリン酸
などがあげられる。これらは弱酸高分子体である。本発
明においては、ポリアクリル酸など合成ポリマーの使用
がゲルにいちじるしい耐久性を与えるので特に好まし
い。アルギン酸アルカリ金属塩は０．２〜２％、好まし
くは０．５〜１．２％に、ポリアニオンは０．０５〜５
％、好ましくは０．２〜１％の濃度になるように蒸留
水、もしくはリン酸緩衝液等の緩衝液に溶解する。この
溶解液中に目的に応じ、生細胞懸濁液や、酵素溶液を混
合することにより、生細胞封入ゲルや、酵素封入ゲルを
調製することができる。As the alkali metal alginate used in the present invention, generally any alkali salt can be used. Also, ammonium salts can be used. However, sodium or potassium salts are commonly used. Examples of polyanions include naturally-occurring carboxymethyl cellulose, carrageenan, and synthetic polyglutamic acid, polyacrylic acid, polyphosphoric acid, and the like. These are weak acid polymers. In the present invention, the use of a synthetic polymer such as polyacrylic acid is particularly preferable because it imparts remarkable durability to the gel. The alkali metal alginate is 0.2 to 2%, preferably 0.5 to 1.2%, and the polyanion is 0.05 to 5%.
%, Preferably 0.2 to 1%, dissolved in distilled water or a buffer such as a phosphate buffer. A live cell-encapsulated gel or an enzyme-encapsulated gel can be prepared by mixing a live cell suspension or an enzyme solution into the lysate depending on the purpose.
【０００７】この溶解液を小ノズルから、緩やかに撹拌
されている多価金属塩水溶液中に滴下することにより、
ゲル体が形成される。多価金属塩としては、アルカリ土
類金属塩、アルミニウム塩、鉄塩、コバルト塩等を例示
することができる。このなかでアルカリ土類金属塩が好
ましく、さらにアルカリ土類のなかでもカルシウム塩や
ストロンチウム塩が一般的に使用されており、これらは
塩化カルシウムや塩化ストロンチウムの水溶液として用
いられる。アルカリ土類塩水溶液として塩化カルシウム
や塩化ストロンチウムを使用する場合には、０．５〜２
％濃度に調整するのが好ましい。滴下によりゲルを形成
させる場合にはノズルの口径や、撹拌速度を変えること
により、ゲルの形状や、大きさを調整することができ
る。This solution is dropped from a small nozzle into the aqueous solution of the polyvalent metal salt which is gently stirred,
A gel body is formed. Examples of polyvalent metal salts include alkaline earth metal salts, aluminum salts, iron salts, cobalt salts and the like. Of these, alkaline earth metal salts are preferable, and among alkaline earth metals, calcium salts and strontium salts are generally used, and these are used as an aqueous solution of calcium chloride or strontium chloride. When calcium chloride or strontium chloride is used as the alkaline earth salt aqueous solution, it is 0.5 to 2
It is preferable to adjust the concentration to%. When the gel is formed by dropping, the shape and size of the gel can be adjusted by changing the diameter of the nozzle and the stirring speed.
【０００８】アルギン酸アルカリ金属塩は、カルシウム
などのアルカリ土類イオンと反応し、ゲル化するととも
に、ポリアニオンの遊離基がアルギン酸ゲルのゲル化に
関与しなかった遊離基とカルシウムイオンを介して結合
し、相互の分子がからみあい、アルギン酸ゲルのマトリ
ックスを架橋し、複雑なマトリックス構造を形成し、耐
久性のあるゲル体を形成する。特にポリアクリル酸との
組み合せにより形成したゲル体は、ゲル化に関与したカ
ルシウムの脱離をうけても、架橋構造のためゲル体が破
壊されることはない。得られたゲル体は、リン酸緩衝液
で洗浄後、目的とする用途に使用する。例えば、細胞封
入ゲル体の場合は、封入細胞に適した培養液に移し、培
養を行う。このゲルのマトリックス構造は、培養液中の
成長因子、細胞の生産する蛋白質、低分子の代謝産物等
は通過させることができるため、ゲル体を破壊せずに物
質生産を行うことができる。さらに細胞培養において
は、撹拌培養や流動層、充填層型の培養装置を使用し、
連続的に培養を行うことも可能である。Alkali metal alginate reacts with alkaline earth ions such as calcium and gels, and at the same time, the free radicals of the polyanion are bound to the free radicals not involved in the gelation of the alginate gel through the calcium ions. , The mutual molecules are entangled with each other, cross-linking the matrix of alginate gel, forming a complicated matrix structure and forming a durable gel body. In particular, the gel body formed by the combination with polyacrylic acid does not break due to the cross-linking structure even if it undergoes desorption of calcium involved in gelation. The gel body thus obtained is washed with a phosphate buffer and then used for the intended purpose. For example, in the case of a cell-encapsulated gel body, it is transferred to a culture medium suitable for the encapsulated cells and cultured. The matrix structure of this gel allows growth factors, proteins produced by cells, low-molecular-weight metabolites, etc. in the culture medium to pass therethrough, and thus allows substance production without destroying the gel body. Furthermore, in cell culture, stirring culture, fluidized bed, packed bed type culture equipment is used,
It is also possible to continuously culture.
【０００９】以下に実施例、実験例を示しさらに本発明
を詳細に説明する。The present invention will be described in more detail below by showing Examples and Experimental Examples.
【実施例１】本実施例においては、ゲル体形成の実例を
示す。蒸留水にアルギン酸ナトリウム及びポリアニオン
を、アルギン酸ナトリウム０．５％、ポリアニオン０．
２５％の濃度になるように溶解し、ゲル体の母液を調製
した。ポリアニオンは１Ｎの水酸化ナトリウムを用いて
中性にしたものを用いた。ポリアニオンとしては、ポリ
アクリル酸、デキストラン硫酸、ペクチン、カルボキシ
メチルセルロース、ポリグルタミン酸、ポリビニル硫酸
をそれぞれ使用した。この母液を１％塩化カルシウム水
溶液中に、２ｌＧの注射針を用いて滴下し、直径３ｍｍ
のゲルを形成させた。形成したゲル体は、リン酸緩衝液
で洗浄した後、ゲル体の状態を観察した。いずれのゲル
も、良好な球形の形態を有していた。Example 1 In this example, an actual example of gel body formation is shown. Sodium alginate and polyanion were added to distilled water, sodium alginate 0.5%, polyanion 0.
It was dissolved to have a concentration of 25% to prepare a mother liquor of gel body. The polyanion was neutralized with 1N sodium hydroxide. As the polyanion, polyacrylic acid, dextran sulfate, pectin, carboxymethyl cellulose, polyglutamic acid, and polyvinyl sulfate were used, respectively. This mother liquor was dropped into a 1% calcium chloride aqueous solution using a 2 lG injection needle, and the diameter was 3 mm.
Formed a gel. The formed gel body was washed with a phosphate buffer, and then the state of the gel body was observed. Both gels had good spherical morphology.
【０００１０】[00010]
【実施例２】本実施例においては生細胞封入ゲル体の調
製の実施例を示す。実施例１と同様に、蒸留水にアルギ
ン酸ナトリウム及びポリアクリル酸を加え、アルギン酸
ナトリウム１．１％、ポリアクリル酸０．５％濃度にな
るようにしてゲル体の母液を調製した。さらに別途Ｉｇ
Ｇを生産するマウスハイブリドーマＥＰＯ−２Ｃ株をＴ
−フラスコで培養し、細胞密度を２×１０6 ｃｅｌｌ／
ｍｌの細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液を母液と
１：２の割合で混合した。混合液を１％塩化カルシウム
水溶液中に、２ＩＧの注射針を用いて滴下し、直径３ｍ
ｍの球形の細胞封入ゲル体を作製した。Example 2 In this example, an example of preparation of a gel body encapsulating live cells will be shown. In the same manner as in Example 1, sodium alginate and polyacrylic acid were added to distilled water to prepare a mother liquor of gel so that the concentrations of sodium alginate and polyacrylic acid were 0.5% and 1.1%, respectively. Further Ig
Mouse hybridoma EPO-2C strain producing G
-Incubate in a flask and increase the cell density to 2 x 10 6 cells /
ml cell suspension was prepared. This cell suspension was mixed with mother liquor in a ratio of 1: 2. The mixed solution was dropped into a 1% calcium chloride aqueous solution using a 2IG injection needle, and the diameter was 3m.
A spherical cell-containing gel body of m was prepared.
【０００１１】[00011]
【実験例１】本実験例１においては、実施例１で調製し
たゲル体の耐久性試験の結果を示す。実施例１で調製し
たゲル体およびアルギン酸ナトリウムのみで調製したゲ
ル体を、約３ｍｌ容採取し、試験管に入れ、次いで０．
０５Ｍ ｐＨ７．４のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）１０ｍｌ
を加え、１６時間６０行程／分の割合で振盪した。振盪
により、ゲル形成に関与したカルシウムイオンが脱離し
た。このときのゲル体の状態について肉眼で観察したと
ころ、アルギン酸ナトリウムのみのゲルは崩壊していた
のに対し、ポリアクリル酸を使用したゲルは、全くゲル
の崩壊は観察されず、耐久性を有することが観察され
た。[Experimental Example 1] In Experimental Example 1, the results of the durability test of the gel body prepared in Example 1 are shown. About 3 ml of the gel body prepared in Example 1 and the gel body prepared only with sodium alginate was placed in a test tube, and then, a volume of 0.
05M pH7.4 phosphate buffer (PBS) 10ml
And was shaken at a rate of 60 strokes / minute for 16 hours. The shaking released the calcium ions involved in gel formation. When the state of the gel body at this time was visually observed, the gel of sodium alginate alone was disintegrated, whereas the gel using polyacrylic acid had no gel disintegration and was durable. It was observed.
【０００１２】[00012]
【実験例２】本実験例においては実施例２において得た
ＩｇＧ生産株ＥＰＯ−２Ｃ株を封入したゲル体を用いた
モノクローナル抗体生産の例を示す。実施例２で得たポ
リアクリル酸を使用したゲル体、比較例として、アルギ
ン酸のみを使用したゲル体、アルギン酸とポリビニルア
ルコールを使用したゲル体を同様に調製した。ゲル体を
それぞれ５ｍｌとｅ−ＲＤＦ培地４５ｍｌをガラスカラ
ムに充填し、下部より、５％炭酸ガスを含む空気を１０
ｍｌ／ｍｉｎの割合で通気することによりゲル体を流動
させ培養をおこなった。培養液は３〜４日ごとに半量ず
つ交換した。培養液は毎日サンプリングを行い、生産さ
れたＩｇＧ濃度をＥＬＩＳＡ法によって測定した。ゲル
体のＩｇＧ生産速度を日々のＩｇＧ濃度から計算して求
めた。結果を図１に示す。通常のアルギン酸ゲルは１０
日目でゲル体が破壊された。しかし、ポリビニルアルコ
ールを使用したゲル体は１８日間生産が持続した。また
ポリアクリル酸を使用したゲル体は２５日間生産が持続
し、まだなお、ゲル体の状態にも変化がみとめられなか
った。[Experimental Example 2] In this Experimental Example, an example of monoclonal antibody production using a gel body encapsulating the IgG producing strain EPO-2C strain obtained in Example 2 is shown. A gel body using the polyacrylic acid obtained in Example 2, a gel body using only alginic acid, and a gel body using alginic acid and polyvinyl alcohol were similarly prepared as comparative examples. 5 ml each of the gel bodies and 45 ml of e-RDF medium were filled in a glass column, and 10% air containing 5% carbon dioxide gas was supplied from the bottom.
The gel was allowed to flow by aeration at a rate of ml / min for culturing. The culture medium was replaced by half every 3 to 4 days. The culture solution was sampled every day, and the IgG concentration produced was measured by the ELISA method. The IgG production rate of the gel body was calculated and calculated from the daily IgG concentration. The results are shown in Figure 1. Normal alginate gel is 10
The gel body was destroyed on the first day. However, the gel body using polyvinyl alcohol continued to be produced for 18 days. Further, the gel body using polyacrylic acid continued to be produced for 25 days, and the state of the gel body could not be changed.
【０００１３】[00013]
【発明の効果】本発明の実施により、耐久性のあるゲル
体を得ることができる。本発明のゲル体はこの中に各種
の細胞あるいは酵素等を含有せしめ、細胞培養やバイオ
リアクターなどに用いると、ゲル体外部にカルシウムイ
オンが存在しない条件下でも耐久性があり長期間使用す
ることができ、このような状況での使用に特に適する。By carrying out the present invention, a durable gel body can be obtained. The gel body of the present invention contains various cells or enzymes in it, and when used in cell culture or bioreactor, etc., it is durable and can be used for a long time even under the condition that calcium ion does not exist outside the gel body. And is particularly suitable for use in such situations.
【０００１４】[00014]
【図１】ＩｇＧ生産株を封入したゲル体により培養し、
培養液中に分泌生産されるＩｇＧ量の測定結果を示す。FIG. 1: Culture with a gel body encapsulating an IgG-producing strain,
The measurement result of the amount of IgG secreted and produced in the culture solution is shown.
─●─ 本発明のアルギン酸ナトリウムとポリアクリル
酸とを使用したゲル体を用いたＩｇＧの生産を示す。 ─△─ アルギン酸ナトリウムとポリビニルアルコール
によるゲル体を用いたＩｇＧの生産を示す。 ─○─ アルギン酸ナトリウムのみによるゲル体を用い
たＩｇＧの生産を示す。--- shows production of IgG using a gel body using sodium alginate of the present invention and polyacrylic acid. -△-shows production of IgG using a gel with sodium alginate and polyvinyl alcohol. -○-shows the production of IgG using a gel with sodium alginate alone.
Claims (6)
アンモニウム塩を含む）とポリアニオンとの混合液と、
多価金属塩水溶液との接触により形成されたゲル体。1. A mixed solution of an alkali metal alginate (including ammonium alginate) and a polyanion,
A gel body formed by contact with an aqueous solution of a polyvalent metal salt.
価金属塩が二価金属塩である請求項１記載のゲル体。2. The gel body according to claim 1, wherein the polyanion is a weak acid polymer and the polyvalent metal salt is a divalent metal salt.
多価金属塩がカルシウム塩である請求項１または請求項
２記載のゲル体。3. The weak acid polymer is polyacrylic acid,
The gel body according to claim 1 or 2, wherein the polyvalent metal salt is a calcium salt.
１、請求項２または請求項３記載のゲル体。4. The gel body according to claim 1, 2 or 3, wherein live cells are dispersed in the gel body.
カリ金属塩（アルギン酸アンモニウム塩を含む）とポリ
アニオンとの混合液を滴下せしめ、ゲルを形成させるこ
とを特徴とする請求項１、請求項２、請求項３及び請求
項４のいずれかに記載のゲル体の製造方法。5. A gel is formed by dropping a mixed solution of an alkali metal alginate (including ammonium alginate) and a polyanion into a polyvalent metal salt aqueous solution to form a gel. The method for producing a gel body according to any one of claims 3 and 4.
細胞の生育に適した培養液中に浸漬し、細胞培養するこ
とを特徴とするゲル体を用いる細胞培養方法。6. A cell culture method using a gel body, which comprises immersing the live cell-encapsulated gel body according to claim 4 in a culture solution suitable for growing the live cells, and culturing the cells.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3053707A JPH05192144A (en) | 1991-02-27 | 1991-02-27 | Gel substance having durability, its production and method for culturing cell using the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3053707A JPH05192144A (en) | 1991-02-27 | 1991-02-27 | Gel substance having durability, its production and method for culturing cell using the same |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05192144A true JPH05192144A (en) | 1993-08-03 |
Family
ID=12950304
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3053707A Pending JPH05192144A (en) | 1991-02-27 | 1991-02-27 | Gel substance having durability, its production and method for culturing cell using the same |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05192144A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1981001759A1 (en) * | 1979-12-12 | 1981-06-25 | Mitsubishi Electric Corp | Device for monitoring abnormality in sampled signals |
-
1991
- 1991-02-27 JP JP3053707A patent/JPH05192144A/en active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1981001759A1 (en) * | 1979-12-12 | 1981-06-25 | Mitsubishi Electric Corp | Device for monitoring abnormality in sampled signals |
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