JPH051800B2 - - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は魚類の新規成長ホルモンポリペプチド
をコードするDNA、該DNAを組み込んだ組換え
体DNA、該組換え体DNAを含む微生物および該
微生物を用いる魚類の成長ホルモンポリペプチド
の製造法に関する。魚類の成長ホルモンは魚類の
養殖産業分野において広い用途が期待される。
従来の技術
哺乳類の成長ホルモンは脳下垂体において生産
されるが、それらの活性ならびに構造は公知であ
る。たとえば、ヒト成長ホルモンについては、ユ
ー・ジエイ・レビイス（U.J.Lewis）らによつて
ジヤーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサ
イエテイ（J.Am.Chem.Soc.）80，4429（1958）
に、エイ・エス・ハートリー（A.S.Hartree）に
よつてバイオケミカル・ジヤーナル（Biochem.
J.），100，754（1966）に、シー・エイチ・リー
（C.H.Li）らによつてアーチブス・オブ・バイオ
ケミストリイ・アンド・バイオフイジクス・（サ
プルメント）〔Arch.Biochem.Biophys.
（Suppl.）〕，１，327（1962）に報告されている。
魚類の成長ホルモンについても、これまでに単
離されたという報告は多く見られるが、その生理
活性と蛋白化学的な性質で信頼性のあるものは数
が少ない。信頼性のある報告の例には次のような
ものがある。
テイラピアよりの単離例：エス・ダブリユ・フ
アーマー（S.W.Farmer）ら、ジエネラル・ア
ンド・コンパラテイブ・エンドクリノロジイ
（Gen.Comp.Endocrin.，30，91（1976）．
チヨウザメよりの単離例：エス・ダブリユ・フア
ーマー（S.W.Farmer）ら、エンドクリノロジ
イ（Edocrinology），108，377（1981）．
コイよりの単離例：エイ・エフ・クツク（A.F.
Cook）ら、ジエネラル・アンド・コンパラテ
イブ・エンドクリノロジイ（Gen.Comp.
Endocrin.），50，335（1983）．
一方哺乳動物の成長ホルモン遺伝子については
ラツト成長ホルモン遺伝子〔ピー・エイチ・シー
バーグ（P.H.Seeburg）ら、ネイチヤー
（Nature）270486（1977）〕、ウシおよびブタの成
長ホルモン遺伝子〔ピー・エイチ・シーバーグ
（P.H.See−burg）ら：デイー・エヌ・エイ
（DNA），２，37（1983）〕、ヒト成長ホルモン遺伝
子〔ジエイ・エイ・マーシヤル（J.A.Martial）
ら：サイエンス（Science），205，602（1979）〕な
どがすでに知られており、魚類の成長ホルモン遺
伝子についても本発明者らにより既に単離されて
いる〔特願昭59−134536および同59−213360〕。
該遺伝子によりコードされる魚類成長ホルモンポ
リペプチドは、川内らにより先にサケ脳下垂体よ
り調製され、硬骨魚類における成長促進効果を有
することも確認されているサケ成長ホルモンポリ
ペプチド〔特願昭59−68670〕で、Ｎ末端（40
個）、Ｃ末端（21個）のアミノ酸配列が完全に一
致していた。
発明が解決しようとする問題点
魚類の成長ホルモンは魚類の成長促進効果を有
するので、養魚用餌料の組成物として有用である
が、魚類の脳下垂体からの採取は供給量が限られ
ている。従つて魚類の成長ホルモンを安価に大量
に供給する方法の開発が望まれている。
問題点を解決するための手段
本発明者らは、組換えDNA技法により魚類の
成長ホルモンを製造する方法について研究を行つ
た。その結果、魚類の成長ホルモン製造に使用す
ることができる、魚類の成長ホルモンポリペプチ
ドに相補的なDNAの採取ならびにこれを含む組
換え体DNAおよび微生物の製造に成功した。即
ちサケ脳下垂体からメツセンジヤーRNA
（mRNA）を抽出し、これと相補的なDNA
（cDNA）を合成し、次いでサケの成長ホルモン
のＮ末端付近のアミノ酸配列に対応するDNAプ
ローブを合成し、このDNAとハイブリダイズす
るcDNAを選択することにより、サケ成長ホルモ
ン遺伝子をクローン化することに成功し、すでに
特許出願した（特願昭59−134536および同59−
213360）。さらにいくつかのサケ成長ホルモン遺
伝子を詳細に検討する仮定で、先に特許出願した
ものと相関性の高い別の遺伝子があることがわか
り、そのcDNAの全塩基配列を決定した。本発明
者らはさらに研究を進め、該新規サケの成長ホル
モンをコードするDNAを組み込んだ組換え体
DNAを含む微生物を培養することにより、培養
物中にサケ成長ホルモンポリペプチドが著量生産
蓄積することを見い出し、本発明を完成するに到
つた。
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明は、魚類の新規成長ホルモンポリペプチ
ド、とくに第１表に示されたペプチド配列を有す
るポリペプチドを提供する。該ポリペプチドは、
組換えDNA技法を用いて下記のごとく製造する
ことができる。
即ち、魚類成長ホルモンのmRNAを鋳型とし
て用いて該mRNAに相補性を示すDNA（cDNA）
を調製し、該cDNAを組み込んだ組換え体プラス
ミドを調製する。さらに、該組換え体プラスミド
を宿主微生物に挿入する。該DNAおよび組換え
体プラスミドは、とくにエツシエリヒア・コリの
ような細菌中で新規成長ホルモン遺伝子の増幅に
使用することができる。該組換え体プラスミドを
有する微生物は魚類の新規成長ホルモンポリペプ
チドを安価に大量に製造するために有用である。
従つて、本発明は、魚類の新規成長ホルモンポ
リペプチドをコードするDNA、該DNAを組み込
んだ組換え体DNA、該組換え体DNAを含む微生
物および該微生物を用いる新規成長ホルモンポリ
ペプチドの製造法を提供する。
本発明のDNAと組換え体プラスミドは下記の
一般的手法で調製される。
シロザケ脳下垂体より全RNAを調製し、これ
をオリゴ（dT）セルロース〔oligo（dT）
cellulose〕カラムを通すことによりポリアデニ
ル酸〔ポリ(A)〕を有するRNA〔ポリ(A)RNA〕を
分離する。このポリ(A)RNAを鋳型とし、逆転写
酵素により二重鎖DNAを合成する。組換え体は
試験管内DNA組換え技法を用い、大腸菌のプラ
スミドDNAのようなベクターDNAに該合成
DNAを挿入して得られる。
次に本発明のDNAおよび組換え体プラスミド
の製法について具体的に説明する。
捕獲されたシロザケより脳下垂体を摘出し、即
座に液体窒素中にて凍結する。この凍結脳下垂体
にグアニジウム・イソチオシアネート
（guanidium isothiocyanate）を加え破砕し、可
溶化する。次いでCsCl溶液層に重層し、超遠心
後、沈殿物とし全細胞質RNAを得る。またグア
ニジウム・イソチオシアネート可溶化物にLiClを
加えてRNAのみを沈殿させ回収することもでき
る。
抽出したRNAをNaClまたはKClの高塩濃度
（たとえば0.5M）溶液に溶解し、オリゴ（dT）
セルロースのカラムに通塔してポリ(A)を有する
mRNAをカラムに吸着させる。水、10mMトリ
ス−HCl緩衝液のような低塩濃度溶液を用いて溶
出し、ポリ(A)を有するmRNAを単離する。
以下、オカヤマ−バーグ（Okayama−Berg）
の方法〔オカヤマ・アンド・バーグ（Okayama
＆ Berg）；モレキユラー・アンド・セルラ
ー・バイオロジイ（Mol.Cell.Biol.）２，161
（1982）〕に従い、cDNAの合成および、そのベク
ターへの組み込みを行う。
まずベクタープライマーを合成する。ベクター
としてはたとえばpCDV1を適当な溶液、たとえ
ばトリス−HCl緩衝液（たとえばPH7.5，
10mM），MgCl2（たとえば6mM），NaCl（たとえ
ば10mM）を含む溶液中でKpnIで処理し、
pCDV1のKpnI部位を切断する。このDNAをト
リス−HCl緩衝液（たとえばPH6.8，30mM）、カ
コジル酸ナトリウム（たとえば140mM）、CoCl2
（たとえば1mM）、ジチオスレイトール（たとえ
ば0.1mM）およびdTTP（たとえば0.25mM）中、
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエ
ラーゼとともに一定温度（たとえば37℃）で一定
時間（たとえば20分間）インキユベートし、ベク
ターDNAの両3′末端に60個前後のチミジル残基
を付加する。さらにこのDNAをトリス−HCl緩
衝液（たとえばPH7.5，10mM）、MgCl2（たとえ
ば6mM）、NaCl（たとえば100mM）を含む溶液
中EcoRIで切断後、低融点アガロースゲル電気泳
動〔ラルス・ウイスランダー（Lars
Wieslander）：アナリテイカル・バイオケミスト
リイ（Analytical Biochmistry），98，305
（1979）〕にて分画し、約3.1キロベースの断片を
回収する。次いで該DNAをNaClまたはKClの高
塩濃度（たとえば0.5M）溶液に溶解し、ポリ
（dA）セルロースカラムに通塔してポリ（Ｔ）を
有するベクタープライマー分子のみをカラムに吸
着させる。水、10mMトリス−HCl緩衝液のよう
な低塩濃度溶液を用いて溶出し、ポリ（Ｔ）の付
加したベクタープライマー分子のみを単離する。
次にリンカーDNAを合成する。たとえば
pL1DNAを適当な溶液、たとえばトリス−HCl
緩衝液（たとえばPH7.5，10mM），MgCl2（たと
えば6mM）、NaCl（たとえば50mM）を含む溶液
中でPstIで処理し、pL1のPstI部位を切断する。
このDNAを、dTTPの代わりにdGTPを加える
以外はベクタープライマー合成の場合と同様に処
理し、15個前後のオリゴ（dG）鎖を付加する。
該DNAを適当な溶液たとえばトリス−HCl緩衝
液（たとえばPH7.5，10mM）、MgCl2（たとえば
6mM）、NaCl（たとえば60mM）を含む溶液中
Hindにて切断する。アガロースゲル電気泳動
にて約0.5キロベースのDNA断片を分画し、
DEAEペーパーにて回収する。このようにしてリ
ンカ−DNAを得る。
以上のようにして得たポリ(A)RNA、ベクター
プライマー、リンカ−DNAを用い、cDNA合成
を行う。ポリ(A)RNA、ベクタープライマーDNA
をトリス−HCl緩衝液（たとえばPH8.3，
50mM）、MgCl2（たとえば8mM）、KCl（たとえ
ば30mM）、ジチオスレイトール（たとえば
0.3mM）、dATR，dTTP，dCTP，dGTP（たと
えば各々2mM）を含む溶液中、逆転写酵素を一
定温度（たとえば37℃）、一定時間（たとえば40
分間）反応させる。こうして得たRNA−DNA二
重鎖の3′末端に、dTTPがdCTPに変わる以外は
ベクタープライマーに（dT）鎖を付加した条件
と同様の操作でオリゴ（dC）鎖を15個前後付加
する。このDNAをトリス−HCl緩衝液（たとえ
ばPH7.5，10mM）、MgCl2（たとえば6mM）、
NaCl（たとえば60mM）を含む溶液中Hindで
切断する。このDNAに、先に調製したリンカ−
DNAを混合し、トリス−HCl緩衝液（たとえば
PH7.5，20mM）、MgCl2（たとえば4mM）、
（NH4）2SO4（たとえば10mM）、KCl（たとえば
0.1M）、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チド（β−NAD）（たとえば0.1mM）を含む溶
液中、大腸菌DNAリガーゼとともに一定時間
（たとえば16時間）、一定温度（たとえば12℃）で
インキユベートする。こうしてcDNAとリンカ−
DNAとの環状化が行われる。この反応液に
dATP，dTTP，dGTP，dCTPを各々、終濃度
40μMとなるよう加え、大腸菌DNAリガーゼ、
大腸菌DNAポリメラーゼＩ、大腸菌リボヌクレ
アーゼＨを加え、RNA部分をDNAに変換するこ
とにより、完全な二重鎖cDNAを含む組換えプラ
スミドを得る。
こうして得た組換えプラスミドを用い大腸菌、
たとえば大腸菌c600SF8株を、たとえばスコツト
（Scott）らの方法〔重定勝哉：細胞工学 ２，
616（1983）〕により形質転換する。上記で得た組
換え体プラスミド上にはアンピシリン耐性遺伝子
が存在するため、形質転換した大腸菌はアンピシ
リン耐性を示す。以下の手法はこれらアンピシリ
ン耐性（Apr）菌株から魚類の成長ホルモン
mRNAに相補性を示す遺伝子を持つ新規組換え
体プラスミドDNAを保有する菌株を選択するの
に一般的に用いられる。すなわち、上記で得られ
た形質転換株をニトロセルロースフイルター上に
固定し、既知のシロザケ成長ホルモンのアミノ酸
配列より予想されるDNA配列を有する合成DNA
プローブと会合させ、強く会合するものを選択す
る〔グルンステイン−ホグネス（Grunstein−
Hogness）の方法、プロシーデイング・オブ・
ザ・ナシヨナル・アカデミイ・オブ・サイエンス
（Proc.Natl.Acad.Sci）．，USA.，72，3961
（1975）〕。プローブDNAは通常のトリエステル法
〔ジヤーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソ
サイエテイ（J.Am.Chem.Soc.），97，7327
（1975）〕で合成される。合成DNAプローブによ
る選択はサザーン（Southern）らの方法〔ジヤ
ーナル・オブ・モレキユラー・バイオロジイ（J.
Mol.Biol.）98，503（1975）〕によつてさらに確実
にでき、この方法でシロザケ成長ホルモン
mRNAに相補性を示す遺伝子を有する組換え体
プラスミドDNAを同定できる。
このようにして得られる組換え体プラスミドの
１例がpSGH14である。このプラスミドをサケ成
長ホルモンをコードするDNAの供給源として用
いることができる。
微生物中でのサケ成長ホルモンをコードする
DNAの発現による魚類の成長ホルモンポリペプ
チドの生産：
サケ成長ホルモンをコードするDNAを含むプ
ラスミドから該DNAを切り出し、これをベクタ
ーDNAに組み込み、得られる組換え体DNAを微
生物に導入し、得られる形質転換体を培養するこ
とによつてサケ成長ホルモンポリペプチドを培養
物中に生成蓄積させ、これを採取することによつ
てサケ成長ホルモンポリペプチドを製造すること
ができる。
サケ成長ホルモンをコードするDNAを含むプ
ラスミドとしては、上記pSGH14が好適な例とし
てあげられる。
ベクターDNAとしては、挿入したDNAを微生
物中で発現させることができるものなら、いかな
るものでも用いることができる。好ましくは、適
当なプロモーター、たとえばトリプトフアン
（trp）系、ラクトース（lac）系、PL系などのプ
ロモーターを持ち、その下流にDNAを挿入でき、
しかも内在するシヤインダルガーノ配列（以下
SD配列と略記する）と翻訳開始コドン（ATG）
との間を適当な距離たとえば６〜18塩基対に調節
したベクターDNAが用いられる。具体的に好適
なベクターDNAとしては、プラスミドpGEL1を
あげることができる。pGEL1は第３図に示すプ
ラスミドで、それを含む大腸菌はEscherichia
coli IGEL1（FERM BP−629）として昭和59年
10月６日付で工業技術院微生物工業技術研究所
（微工研）に寄託されている。ポリペプチドをコ
ードするDNAとベクターDNAとの組換えは、制
限酵素を用いて両DNAを消化後、T4DNAリガ
ーゼを用いて結合する一般的組換えDNA手法を
用いて行うことができる。
具体例として示したpSGH14とpGEL1の場合は
第３図に示したごとく２段階の造成を行う。すな
わちpSGH14よりサケ成長ホルモン成熟ペプチド
Ｎ末端付近をコードするMbo−Pvu断片と、
cDNAの残りの部分およびベクター部分を含む
Pvu−Hind断片を別々に得る。一方、以下
のような合成DNAリンカーを作製する。
上記DNA断片と合成DNAリンカーとを
T4DNAリガーゼで結合し、第３図に示した組換
え体プラスミドpSGHB9を得る。
次にpSGHB9よりサケ成長ホルモン成熟ペ
プチドをコードするHind−BamHI消化断片を
得、pGEL1からはトリプトフアンプロモーター
を含むHind−BamHI消化断片を得る。上記２
つのDNA断片をT4DNAリガーゼで結合し、第
３図に示した組換え体プラスミドpSGHC2を得
る。本プラスミドはトリプトフアンプロモーター
下流に、成熟サケ成長ホルモンをコードする領域
が連結した形を有する。
上記組換え技法における反応の条件は、一般的
に下記のとおりである。
DNAの制限酵素による消化反応は、通常0.1〜
20μgのDNAを２〜200mM（好ましくは10〜
40mM）のトリス−HCl（PH6.0〜9.5好ましくはPH
7.0〜8.0）、０〜200mMのNaCl、２〜30mM（好
ましくは５〜10mM）のMgCl2を含む反応液中
で、制限酵素0.1〜100単位（好ましくは1μgの
DNAに対して１〜３単位）を用い、20〜70℃
（至適温度は用いる制限酵素により異なる）にお
いて、15分間〜24時間行う。反応の停止は、通常
55〜75℃で、５〜30分間加熱することによるが、
フエノールまたはジエチルピロカーボネートなど
の試薬により制限酵素を失活させる方法も用いる
ことができる。
制限酵素消化によつて生じたDNA断片の精製
は、低融点アガロースゲル電気泳動法〔エル・ウ
イスランダー（L.Wieslander）：アナリテイカ
ル・バイオケミストリイ（Analytical
Biochemistry）98，305，（1979），以下LGT法と
いう〕やポリアクリルアミドゲル電気泳動法など
によつて行う。
DNA断片の結合反応は、２〜200mM（好まし
くは10〜40mM）のトリス−HCl（PH6.1〜9.5、好
ましくはPH7.0〜8.0）、２〜20mM（好ましくは５
〜10mM）のMgCl2、0.1〜10mM（好ましくは0.5
〜2.0mM）のATP、１〜50mM（好ましくは５〜
10mM）のジチオスレイトールを含む反応液中
で、T4DNAリガーゼ0.3〜10単位を用い、１〜
37℃（好ましくが３〜20℃）で15分間〜72時間
（好ましくは２〜20時間）行う。
結合反応によつて生じた組換え体プラスミド
DNAは、必要によりCohenらの形質転換法〔エ
ス・エヌ・コーエン（S.N.Cohen）ら：プロシー
デイング・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミイ・
オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.），USA
69，2110（1972）〕によつて、大腸菌に導入する。
組換え体プラスミドDNAを持つ大腸菌から該
DNAの単離は、後に述べる実施例１に示した方
法あるいはバーンボイム（Birnboim）らの方法
〔エイチ・シー・バーンボイム（H.C.Birnboim）
ら：ヌクレイツク・アシド・リサーチ（Nucleic
Acids Res.）７，1513（1979）〕などを用いて行
う。
プラスミドDNAを１〜10種類の制限酵素で消
化後アガロースゲル電気泳動あるいはポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動により切断部位を調べる。
さらにDNAの塩基配列を決定する必要がある時
はマキサム・ギルバード法〔プロシーデイング・
オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミイ・オブ・サイ
エンス（Proc.Natl.Acad.Sci.），74，560（1977）〕
またはM13フアージを用いたサンガー（Sanger）
法〔サンガー（Sanger）らプロシーデイング・
オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミイ・オブ・サイ
エンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA，74，5463
（1977）；アマーシヤム（Amersham）社M13ク
ローニング・アンド・シークエンシング・ハンド
ブツク（cloning and sequencing handbook）〕
によつて決定する。
以上のような条件で組換え体プラスミドDNA
を製造することができる。
本発明の魚類の成長ホルモンペプチドは以下の
とおりに製造できる。
すなわち、プラスミド（例えばpSGHC2）を
用いて大腸菌Ｋ−12 HB101を形質転換させ、ア
ンピシリン耐性のコロニーの中からpSGHC2を
有する大腸菌を選びだす。pSGHC2を有する大
腸菌を培地に培養することにより培養物中に魚類
の成長ホルモンポリペプチドを生成させることが
できる。
ここで用いる培地としては大腸菌の生育ならび
に魚類の成長ホルモンポリペプチドの生産に好適
なものならば合成培地、天然培地のいずれも使用
できる。
炭素源としては、グルコース、フラクトース、
ラクトース、グリセロール、マンニトール、ソル
ビトールなどが、窒素源としては、NH4Cl，
（NH4）2SO4、カザミノ酸、酵母エキス、ポリペ
プトン、肉エキス、バクトリプトン、コーン・ス
テイープリカーなどが、その他の栄養源として
は、K2HPO4，KH2PO4，NaCl，MgSO4、ビタ
ミンB1、MgCl2などが使用できる。
培養はPH5.5〜8.5、温度18〜40℃で通気攪拌培
養により行われる。
培養５〜90時間で培養菌体中にシロザケ成長ホ
ルモンポリペプチドが蓄積するので、培養物から
菌体を集菌し、菌体をリゾチーム処理後、凍結、
融解を繰り返して菌体を破砕し、遠心してえられ
る上清から通常のポリペプチドの抽出方法に従つ
てポリペプチドを採取する。
また該ポリペプチドの検出は培養菌体を直接レ
ムリ（Laemmli）のサンプルバツフアー〔レム
リ（Laemmli）、ネイチヤー（Nature），227，
680（1970）〕に加熱、溶解後、SDS−ポリアクリ
ルアミドゲル〔レムリ（Laemmli）の方法：同
上文献〕にかけ、クマシーブリリアントブルー染
色によつて行う。
以下に本発明の実施例を示す。
実施例 １
シロザケ脳下垂体よりのポリ(A)RNAの調製：
シロザケ脳下垂体よりグアニジウムチオシアネ
ート−セシウムクロライド法〔マニアテイス
（Maniatis）ら編、モレキユラー。クローニング
（Molecular Cloning），p196、コールド・スプリ
ング・ハーバー（Cold Spring Harbor）刊；重
定勝哉、細胞工学、２，616（1983）〕に従いポリ
(A)を有するRNAを下記のごとく調製した。
シロザケの凍結脳下垂体２ｇ（約30個体分）を
4Mグアニジウムチオシアネート、0.5％ザルコシ
ン、5mMクエン酸ナトリウム（PH７）および
0.1mβ−メルカプトエタノールからなる溶液10ml
中でテフロンホモゲナイザー（5rpm）にて破砕
し可溶化した。このホモジネートを18G注射針に
数回通してDNAを分断した。5.7MCsCl、0.1M
EDTA（PH８）の溶液各1.2mlを超遠心管中に分注
しておき、前記ホモジネートを重層した。
Hitachi RPS40ローターにて35000rpm、15時間
遠心後、RNAを沈殿として回収した。RNAの沈
殿を1mM EDTAを含むトリス−HCl（PH8.0）溶
液10mlに溶解し、フエノール−クロロホルムで抽
出後、エタノール沈殿により回収した。得られた
RNA約１mgを10mMトリス−HCl（PH8.0）および
1mM EDTAからなる溶液１mlに溶かした。65
℃、５分間インキユベートし、0.1mlの5M NaCl
を加えた。混合物をオリゴ（dT）セルロース・
カラム（Ｐ−Ｌ Biochemicals社製）クロマト
グラフイー（カラム体積0.5ml）にかけた。吸着
したポリ(A)を有するmRNAを10mMトリス−
HCl（PH7.5）および1mM EDTAからなる溶液で
溶出し０，２mlずつ分画した。３〜５番目の画分
を回収し、ポリ(A)を有するmRNA約10μgを得た。
実施例 ２
cDNA合成と該DNAのベクターへの挿入：
オカヤマ−バーグ（Okayama−Berg）の方法
〔モレキユラー・アンド・セルラー・バイオロジ
イ（Mol.Cell.Biol.），２，161（1982）〕に従い、
cDNAの合成とそれを組み込んだ組換え体プラス
ミドの造成を行つた。その工程の概略を第１図に
示す。
pCDV1〔オカヤマ・アンド・バーグ（Okaya−
ma ＆ Berg）：モレキユラー・アンド・セル
ラー・バイオロジイ（Mol.Cell.Biol.），３，280
（1983）〕400μgを100mMトリス−HCl（PH7.5）、
6mM MgCl2および10mM NaClからなる溶液
300μlに加え、さらに500単位のKpnI（宝酒造社
製、以下特記しない限り制限酵素はすべて宝酒造
社製）を加えて、37℃、６時間反応させ、プラス
ミド中のKpnI部位で切断した。フエノール−ク
ロロホルム抽出後、エタノール沈殿によりDNA
を回収した。KpnI切断した該DNA約200μgを
40mMカコジル酸ナトリウム、30mMトリス−
HCl（PH6.8）、1mM CaCl2および0.1mMジチオス
レイトール（以下DTTと略記する）からなる緩
衝液（以下TdT緩衝液と略記する）にdTTPを
0.25mMとなるよう加えた溶液200μlに加え、さ
らに81単位のターミナルデオキシヌクレオチジル
トランスフエラーゼ（以下TdTと略記する）（Ｐ
−Ｌ Biochemicals社製）を加えて、37℃11分
間反応させた。ここで、pCDV1のKpnI切断部位
の3′末端にポリ（dT）鎖が約67個付加された。
該溶液からフエノール−クロロホルム抽出、エタ
ノール沈殿により、ポリ（dT）鎖の付加した
pCDV1DNA約100μgを回収した。該DNAを
10mMトリス−HCl（PH7.5）、6mM MgCl2，
100mM NaClからなる緩衝液150μlに加え、さら
に360単位のEcoRIを加え、37℃２時間反応させ
た。該反応物をLGT法で処理後、約3.1Kbの
DNA断片を回収し、約60μgのポリ（dT）鎖付加
pCDV1を得た。該DNAを10mMトリス−HCl
（PH8.0）および1mM EDTAからなる溶液500μl
に溶解し、65℃５分間インキユベート後、氷冷し
て50μlの5M NaClを加えた。混合物をオリゴ
（dA）セルロースカラムコラボラテイブリサーチ
社製）クロマトグラフイーにかけた。ポリ（dT）
鎖長が充分なものはカラムに吸着し、これを
10mMトリス−HCl（PH8.0）および1mM EDTA
からなる溶液で溶出し、ポリ（dT）鎖の付加し
たpCDV1（以下ベクタープライマーと略記する）
27μgを得た。
次にリンカーDNAの調製を行なう。
pL1〔オカヤマ・アンド・バーグ（Okayama
＆ Berg）：モレキユラー・アンド・セルラー・
バイオロジイ（Mol.Cell.Biol.），３，280（1983）〕
約14μgを10mMトリス−HCl（PH7.5）、6mM
MgCl2および50mM NaClからなる緩衝液200μl
に加え、さらに50単位のPstIを加え、37℃４時間
反応させ、pL1DNA中のPstI部位で切断させた。
該反応物をフエノール−クロロホルム抽出後、エ
タノール沈殿を行い、PstIで切断したpL1DNA
約13μgを回収した。該DNA約13μgをTdT緩衝液
に終濃度0.25mMのdGTPを含む溶液50μlに加え、
さらにTdT（Ｐ−Ｌ Biochemicals社製）54単位
に加えて37℃13分間インキユベートし、pL1の
PstI切断部位3′末端に（dG）鎖を約14個付加し
た。フエノール−クロロホルム抽出後エタノール
沈殿にてDNAを回収した。該DNAを100μlの
10mMトリス−HCl（PH7.5）、6mM MgCl2および
60mM NaClからなる緩衝液100μlに加え、さら
に80単位のHindを加えて37℃３時間インキユ
ベートし、pL1DNAのHind部位で切断した。
該反応物をアガロースゲル電気泳動にて分画し、
約0.5KbのDNA断片をDEAEペーパー法〔ドレ
ツエン（Dretzen）ら、アナリテイカル・バイオ
ケミストリイ（Anal.Biochem.），112，295
（1981）〕にて回収し、オリゴ（dG）鎖付きのリ
ンカーDNA（以下単にリンカーDNAと略記する）
を得た。
上記で調製したポリ(A)RNA約2μg、ベクター
プライマー約1.4μgを50mMトリス−HCl（PH8.3）、
8mM MgCl2，30mM KCl，0.3mM DTT，
2mM dNTP（dATP，dTTP，dGTPおよび
dCTP）および10単位のリボヌクレアーゼインヒ
ビター（Ｐ−Ｌ Biochemicals社製）からなる
溶液22.3μlに溶解し、10単位の逆転写酵素（生化
学工業社製）を加え、37℃40分間インキユベート
し、mRNAに相補的なDNAを合成させた。該反
応物をフエノール−クロロホルム抽出、エタノー
ル沈殿を行ない、RNA−DNA二重鎖の付加した
ベクターポライマーDNAを回収した。該DNAを
66μMdCTPおよび0.2μgポリ(A)を含むTdT緩衝液
20μlに溶かし、14単位のTdT（Ｐ−Ｌ
Biochemicals社製）を加えて37℃８分間インキ
ユベートし、cDNA3′末端に12個の（dC）鎖を付
加した。該反応物をフエノール−クロロホルム抽
出し、エタノール沈殿により（dC）鎖の付加し
たcDNA−ベクタープライマーDNAを回収した。
該DNAを10mMトリス−HCl（PH7.5）、6mM
MgCl2および60mM NaClからなる液400μlに溶
かし、20単位のHindを加え、37℃２時間イン
キユベートし、Hind部位で切断した。該反応
物をフエノール−クロロホルム抽出、エタノール
沈殿して0.5pmoleの（dC）鎖付加cDNA−ベク
タープライマーDNAを得た。該DNA0.08pmole
および前記のリンカーDNA0.16pmoleを10mMト
リス−HCl（PH7.5）、0.1M NaClおよび1mM
EDTAからなる溶液40μlに溶かし、65℃，42℃，
０℃でそれぞれ10分、25分、30分間インキユベー
トした。20mMトリス−HCl（PH7.5）、4mM
MgCl2，10mM（NH4）2SO4，0.1M KClおよび
0.1mMβ−NADの組成で、全量400μlとなるよう
反応液を調製した。該反応液に10単位の大腸菌
DNAリガーゼ（New England Biolabs社製）を
加え、11℃一夜インキユベートした。該反応液を
各40μMのdNTP，0.15mMβ−NADとなるよう
成分を追加調製し、５単位の大腸菌DNAリガー
ゼ、７単位の大腸菌DNAポリメラーゼＩ（Ｐ−Ｌ
Bio−chemicals社製）および２単位の大腸菌
リボヌクレアーゼＨ（Ｐ−Ｌ Biochemicals社
製）を加え、12℃、25℃で順次１時間ずつインキ
ユベートした。上記反応で、cDNAを含む組換え
DNAの環状化と、RNA−DNA二重鎖のRNA部
分がDNAに置換され、完全な二重鎖DNAの組換
え体プラスミドが生成した。
実施例 ３
シロザケ成長ホルモンcDNAを含む組換え
DNAの選択：
実施例２で得た組換え体プラスミドを用い、大
腸菌c600SF8株〔カメロン（Cameron）：プロシ
ーデイング・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミ
イ・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）
USA，72，3416（1975）〕をスコツト（Scott）ら
の方法〔重定勝哉：細胞工学、２，616（1983）〕
に従い形質転換した。得られた約１万個のコロニ
ーのうち4800個をニトロセルロース上に固定し
た。シロザケ成長ホルモンのＮ末端から23番目−
28番目のアミノ酸配列に対応する合成DNA、す
なわち
（３番目の塩基はＡまたはＧ、９番目はＴまたは
Ｃ、12番目はＣまたはＴ、15番目はＣまたはＴで
あり、組み合わせて16通りの合成DNAの混合物
となる）を32Pで標識したプローブに40℃で強く
会合した８菌株を選んだ〔グルンステイン−ホグ
ネス（Grunstein−Hogness）の方法、プロシー
デイング・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミイ・
オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA，
72，3961（1975）〕。得られた８菌株についてサザ
ーン（Southern）の方法〔ジヤーナル・オブ・
モレキユラー・バイオロジイ（J.Mol.Biol.），
98，503（1975）〕により、上記プローブおよびＣ
末端付近のアミノ酸配列に対応する合成DNAプ
ローブ
（３番目の塩基はＣまたはＴ、６番目はＡまたは
Ｇ、９番目はＡ，Ｔ，Ｇ，Ｃのいずれか、12番目
はＧまたはＡであり、組み合わせて32通りの合成
DNAの混合物となる）とも会合が確認された。
これらのプラスミドはpSGH1，３，６，８，９，
10，14，17と命名したが、いずれも、シロザケ成
長ホルモンのアミノ酸配列から予想されるDNA
配列を有することから成長ホルモンcDNAを含ん
でいるものと考えられた。
実施例 ４
該プラスミドpSGH14の塩基配列：
上記で得られたプラスミド８種につき、種々の
制限酵素で消化し、cDNA部分の切断地図を決定
した。制限酵素部位の存在位置から、得られたプ
ラスミドは３群に分類でき、pSGH1，６，９，
10，17の群、pSGH3の群、pSGH8，14の群と分
けられた。それぞれの群の制限酵素地図を第２図
に示す。
これらのうち、pSGH1の群のプラスミド、と
くにpSGH1についてはすでに全塩基配列が決定
されており、そのcDNA配列から予想されるアミ
ノ酸配列は、シロザケ成長ホルモンペプチドから
決定されているＮ末端付近およびＣ末端付近のア
ミノ酸配列と完全に一致し、該cDNAはシロザケ
成長ホルモンをコードしていることが確認されて
いる。〔特願昭59−134536および同59−213360〕。
さらにこの群とは制限酵素切断部位の異なるプ
ラスミドであるpSGH8，pSGH14のうち、ほぼ
完全長を有すると思われるより長いcDNAを含む
pSGH14について、その翻訳領域の全ヌクレオチ
ド配列をM13フアージを用いたサンガー法〔サン
ガー（Sanger）ら、プロシーデイング・オブ・
ザ・ナシヨナル・アカデミイ・オブ・サイエンス
（Proc.Natl.Acad.Sci.），USA，74，5463
（1977）：アマーシヤム（Amersham）社 M13
クローニング・シークエンシング・ハンドブツク
（cloning and sequencing handbook）〕に従つ
て決定した。配列を第１表に示す。
【表】
【表】
第１表中、既知のシロザケ成長ホルモンとの比
較から、塩基数１−66がシグナルペプチドを、67
−630がシロザケ新規成長ホルモンの成熟ペプチ
ドをコードすると考えられる。
該cDNAによりコードされるポリペプチドは、
pSGH1によりコードされるポリペプチドとはシ
グナルペプチドの22個のアミノ酸配列は完全に一
致しているが、成熟ペプチド部分では、188個中
第１表に下線で示してある12個のアミノ酸が異な
つている。またシロザケ成長ホルモンポリペプチ
ドから決定されたＮ末端40個のアミノ酸配列に限
つても５個のアミノ酸が明らかに異なつており、
pSGH14に含まれるcDNAはpSGH1の群とは異
なる魚類の新規成長ホルモンをコードしていると
考えられる。pSGH14を組込んだ組換え体プラス
ミドを含む大腸菌はEscherichia coli ESGH14
（FERMBP−611）として微工研に昭和59年９月
20日付で寄託してある。
実施例 ５
新規シロザケ成長ホルモンをコードする組換え
体プラスミドの造成：
(1) pSGH14から成熟シロザケ成長ホルモンをコ
ードする組換え体プラスミドpSGHB9の造
成：
新規シロザケ成長ホルモンをコードするDNA
を含むプラスミドpSGH14 5μgを20mMトリス−
HCl（PH7.5）、10mM MgCl2、および10mM
NaClを含む溶液100mlに溶かし、制限酵素Mbo
（New England Bio Labs社製）10単位を加
え、37℃３時間消化反応を行つた。続いてNaCl
濃度を50mMとなるよう調製し、Pvu 10単位
を加え、37℃３時間消化反応を行つた。この反応
液はポリアクリルアミドゲル電気泳動後、DEAE
−ペーパー法によりＮ末端付近に相当する108bp
のDNA断片約0.05μgを得た。
次にpSGH14 5μgを20mMトリス−HCl（PH
7.5）、10mM MgCl2および50mM NaClを含む溶
液（以下“Ｙ−50緩衝液”と略記する）40μlに溶
かし、Pvu，Hind各々10単位を加え、37℃
３時間消化反応を行つた。該反応液からLGT法
により、pSGH14でコードされる成長ホルモンの
Ｃ末端側、3′−非翻訳領域およびベクター部分を
含む約3.3KbのDNA断片約0.5μgを得た。
一方成熟シロザケ成長ホルモンをコードする
DNAの発現に必要な翻訳開始コドンATGを付加
し、さらにベクターDNAと上記DNAを連結する
目的で下記のDNAリンカーを合成した。
まず一本鎖DNA、14merと9merを通常のトリ
エステル法〔アール・クレア（R.Crea）ら：プ
ロシーデイング・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデ
ミイ・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）
USA.，75，5765（1978）〕により合成した。
14merおよび9merの一本鎖DNA各々39pmoleを
50mMトリス−HCl（PH7.5）、10mM MgCl2，
10mMジチオスレイトールおよび1mM ATPを
含む溶液20μlに溶かし、T4ポリヌクレオチドキ
ナーゼ（宝酒造社製）６単位を加え、37℃、60分
間リン酸化反応を行つた。
上記で得たpSGH14由来のMbo−Pvu断片
（108bP）0.08pmole，Pvu−Hind断片（約
3.7Kb）0.02pmoleを5mMトリス−HCl（PH7.5）、
10mM MgCl2、10mMジチオスレトールおよび
1mM ATPを含む溶液30μlに溶かし、これに上
記の合成DNAリン酸化反応液5μlを加えた。この
混合液にT4DNAリガーゼ６単位を加え、４℃、
18時間結合反応を行つた。
該反応液を用いて大腸菌HB101〔ボリバー
（Bolivar）ら、ジーン（Gene，２，75（1977）〕
株を形質転換しAprnoコロニーを得、このコロニ
ーよりプラスミドDNAを回収し、第３図に示し
たpSGHB9を得た。pSGHB9の構造はHind
，XbaI，Bgl，BamHIで切断してアガロー
スゲル電気泳動にて確認した。
(2) pSGHB9の成熟シロザケ成長ホルモンを
コードする領域の発現ベクターpGEL1への組
み込み：
pSGHB9 5μgを40μlのＹ−50緩衝液に溶か
し、BamHIとHindを各々10単位加え、37℃３
時間消化反応を行つた。該反応液からLGT法に
より、成熟シロザケ成長ホルモン全体をコードす
る約1200bpのDNA断片約0.1μgを得た。
別にpGEL1 5μgを40μlのＹ−50緩衝液に溶か
し、BamHIとHindとを各々10単位加え、37℃
３時間消化反応を行つた。この反応液からLGT
法によりトリプトフアンプロモーターを含む約
2.7KbのDNA断片約0.1μgを得た。
上記で得たpSGHB9のHind−BamHI断片
（約1200bp）0.01μgとpGELのHind−BamHI断
片（約2.7Kb）0.015μgを50mMトリス−HCl（PH
7.5）、10mM MgCl2、10mMジチオスレイトール
および1mM ATPを含む溶液30μlに溶かし、
T4DNAリガーゼ（宝酒造社製）６単位を加え、
４℃、18時間結合反応を行つた。
該反応液を用いて大腸菌HB101株を形質転換
しAprのコロニーを得、このコロニーよりプラス
ミドDNAを回収し、第３図に示したpSGHC2
を得た。pSGHC2の構造はEcoRI，Hind，
ClaI，Bgl，BamHIで切断してアガロースゲ
ル電気泳動にて確認した。
pSGHB9，pSGHC2を含む大腸菌菌株は
Escherichia coli ESGHC2 FERM BP−
708および同ESGHB9 FERM BP−707とし
て、それぞれ微工研に寄託されている。
実施例 ６
pSGHC2を含む大腸菌によるシロザケ新規成
長ホルモンペプチドの生産：
実施例５で得た組換え体プラスミドpSGHC2
を用い常法により大腸菌W3110strA株（FERM
BP−732）を形質転換した。得られたAprコロニ
ーを８mlのMCG培地〔0.6％ Na2HPO4，0.3％
KH2PO4，0.5％ NaCl，0.1％ NH4Cl，0.5
％グルコース、0.5％ カザミノ酸、1mM
MgSO4，4μg／mlビタミンB1、PH7.2〕に接種し、
30℃で18時間培養した。得られた培養液を
8000rpm、10分間遠心して菌体を回収した。この
菌体をLaemmliのサンプルバツフアーに懸濁後、
SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、
クマシーブリリアントブルーにて染色して、分子
量約25000の部位のポリペプチドバンドを検出し
た。このバンドは該プラスミドを含まないに大腸
菌を用いた場合には存在しなかつた。この結果、
pSGHC2を保有する大腸菌はシロザケ成長ホル
モンポリペプチドを大量に生産していることがわ
かつた。
発明の効果
本発明によれば、魚類の新規成長ホルモンポリ
ペプチドをコードするDNAを組み込んだ組換え
体DNA、該組換え体DNAを含む微生物が得ら
れ、これら魚類の新規成長ホルモンポリペプチド
の大量生産に利用することができる。 Detailed Description of the Invention Industrial Field of Application The present invention uses a DNA encoding a novel fish growth hormone polypeptide, a recombinant DNA incorporating the DNA, a microorganism containing the recombinant DNA, and the microorganism. This invention relates to a method for producing a fish growth hormone polypeptide. Fish growth hormones are expected to have wide applications in the fish aquaculture industry. BACKGROUND OF THE INVENTION Mammalian growth hormones are produced in the pituitary gland, and their activity and structure are known. For example, regarding human growth hormone, U.J. Lewis et al., Journal of American Chemical Society (J.Am.Chem.Soc.) 80 , 4429 (1958)
published by ASHartree in the Biochem.
J.), 100 , 754 (1966), Archives of Biochemistry and Biophysics (Supplement) [Arch.Biochem.Biophys.
(Suppl.)], 1 , 327 (1962). There have been many reports that fish growth hormones have been isolated, but there are only a few that are reliable in terms of their physiological activity and protein chemical properties. Examples of reliable reporting include: Isolation example from tilapia: SW Farmer et al., Gen. Comp. Endocrin., 30 , 91 (1976). Isolation example from sturgeon shark: S.・SWFarmer et al., Endocrinology, 108 , 377 (1981). Isolation example from carp: AF Kutsuku (AF
Cook) et al., General and Comparative Endocrinology (Gen.Comp.
Endocrin.), 50 , 335 (1983). On the other hand, regarding mammalian growth hormone genes, the rat growth hormone gene [PHSeeburg et al., Nature 270 486 (1977)], the bovine and pig growth hormone gene [PHSeeburg et al., Nature 270 486 (1977)], -burg) et al.: DNA, 2 , 37 (1983)], human growth hormone gene [JAMartial
et al.: Science, 205 , 602 (1979)], and a fish growth hormone gene has also been isolated by the present inventors [Patent Application No. 59-134536 and No. 134-59]. −213360].
The fish growth hormone polypeptide encoded by this gene is a salmon growth hormone polypeptide previously prepared from the salmon pituitary gland by Kawauchi et al., and which has also been confirmed to have a growth-promoting effect in teleosts [Patent Application No. 1983] -68670], N-terminus (40
The C-terminal (21 amino acid sequences) were completely identical. Problems to be Solved by the Invention Fish growth hormone has a growth-promoting effect on fish, and is therefore useful as a composition for fish feed, but the supply of it from the pituitary gland of fish is limited. . Therefore, it is desired to develop a method for supplying fish growth hormone in large quantities at low cost. Means for Solving the Problems The present inventors conducted research on a method for producing fish growth hormone using recombinant DNA technology. As a result, we succeeded in collecting DNA complementary to fish growth hormone polypeptide, which can be used in the production of fish growth hormone, and in producing recombinant DNA and microorganisms containing this DNA. That is, Metsenjar RNA from the salmon pituitary gland.
(mRNA) and complementary DNA to this
Cloning the salmon growth hormone gene by synthesizing (cDNA), then synthesizing a DNA probe corresponding to the amino acid sequence near the N-terminus of salmon growth hormone, and selecting cDNA that hybridizes with this DNA. and has already applied for a patent (Japanese Patent Application No. 59-134536 and No. 59-134).
213360). Furthermore, by examining several salmon growth hormone genes in detail, they discovered that there was another gene that had a high correlation with the one for which they had previously applied for a patent, and determined the entire base sequence of its cDNA. The present inventors further conducted research and developed a recombinant product incorporating the DNA encoding the new salmon growth hormone.
The present inventors have discovered that salmon growth hormone polypeptide can be produced and accumulated in significant amounts in the culture by culturing DNA-containing microorganisms, and have completed the present invention. The present invention will be explained in detail below. The present invention provides novel fish growth hormone polypeptides, particularly polypeptides having the peptide sequences shown in Table 1. The polypeptide is
It can be produced using recombinant DNA techniques as described below. That is, DNA (cDNA) complementary to fish growth hormone mRNA is used as a template.
A recombinant plasmid incorporating the cDNA is prepared. Furthermore, the recombinant plasmid is inserted into a host microorganism. The DNA and recombinant plasmids can be used for the amplification of new growth hormone genes, especially in bacteria such as E. coli. A microorganism having the recombinant plasmid is useful for producing a novel fish growth hormone polypeptide in large quantities at low cost. Therefore, the present invention provides a DNA encoding a novel fish growth hormone polypeptide, a recombinant DNA incorporating the DNA, a microorganism containing the recombinant DNA, and a method for producing a novel growth hormone polypeptide using the microorganism. I will provide a. The DNA and recombinant plasmid of the present invention are prepared by the following general method. Total RNA was prepared from the pituitary gland of chum salmon, and this was added to oligo(dT) cellulose [oligo(dT)
RNA containing polyadenylic acid [poly(A)] [poly(A) RNA] is separated by passing it through a [cellulose] column. Using this poly(A) RNA as a template, double-stranded DNA is synthesized using reverse transcriptase. Recombinants are synthesized into vector DNA such as E. coli plasmid DNA using in vitro DNA recombination techniques.
Obtained by inserting DNA. Next, the method for producing the DNA and recombinant plasmid of the present invention will be specifically explained. The pituitary gland is removed from a captured chum salmon and immediately frozen in liquid nitrogen. Guanidium isothiocyanate is added to the frozen pituitary gland to crush it and solubilize it. Next, it is layered on a CsCl solution layer, and after ultracentrifugation, it is precipitated and total cytoplasmic RNA is obtained. Alternatively, only RNA can be precipitated and recovered by adding LiCl to the guanidium isothiocyanate solubilized product. Dissolve the extracted RNA in a high salt concentration (e.g. 0.5M) solution of NaCl or KCl and add oligo(dT)
Pass through a cellulose column to contain poly(A)
Adsorb mRNA onto the column. Elute with a low salt solution such as water, 10 mM Tris-HCl buffer to isolate the mRNA with poly(A). Below is Okayama-Berg.
method [Okayama & Berg (Okayama
&Berg); Molecular and Cellular Biology (Mol.Cell.Biol.) 2 , 161
(1982)], cDNA was synthesized and integrated into the vector. First, vector primers are synthesized. As a vector, for example, pCDV1 can be dissolved in a suitable solution, such as Tris-HCl buffer (e.g. PH7.5,
10mM), MgCl2 (e.g. 6mM), and NaCl (e.g. 10mM),
Cut pCDV1 at the KpnI site. This DNA was added to Tris-HCl buffer (e.g. PH6.8, 30mM), sodium cacodylate (e.g. 140mM), CoCl2
(e.g. 1mM), dithiothreitol (e.g. 0.1mM) and dTTP (e.g. 0.25mM).
By incubating with terminal deoxynucleotidyl transferase at a constant temperature (for example, 37°C) for a certain period of time (for example, 20 minutes), approximately 60 thymidyl residues are added to both 3' ends of the vector DNA. This DNA was further digested with EcoRI in a solution containing Tris-HCl buffer (e.g. PH7.5, 10mM), MgCl2 (e.g. 6mM), NaCl (e.g. 100mM), and then subjected to low melting point agarose gel electrophoresis [Larus Wisslander (Lars
Wieslander: Analytical Biochmistry, 98 , 305
(1979)] and collect a fragment of approximately 3.1 kilobases. The DNA is then dissolved in a high salt concentration (for example, 0.5M) solution of NaCl or KCl and passed through a poly(dA) cellulose column to adsorb only vector primer molecules having poly(T) onto the column. Elution is performed using a low salt solution such as water, 10mM Tris-HCl buffer to isolate only the poly(T)-attached vector primer molecules. Next, linker DNA is synthesized. for example
pL1DNA in a suitable solution, e.g. Tris-HCl.
The PstI site of pL1 is cleaved by treatment with PstI in a solution containing a buffer (eg, PH7.5, 10mM), MgCl 2 (eg, 6mM), and NaCl (eg, 50mM).
This DNA is treated in the same manner as for vector primer synthesis, except that dGTP is added instead of dTTP, and approximately 15 oligo (dG) strands are added.
The DNA is dissolved in a suitable solution such as Tris-HCl buffer (e.g. PH7.5, 10mM), MgCl2 (e.g.
6mM), in a solution containing NaCl (e.g. 60mM)
Cut at Hind. Fractionate approximately 0.5 kilobase DNA fragments by agarose gel electrophoresis.
Collect with DEAE paper. In this way, linker DNA is obtained. cDNA synthesis is performed using the poly(A) RNA, vector primer, and linker DNA obtained as described above. Poly(A)RNA, vector primer DNA
in Tris-HCl buffer (e.g. PH8.3,
50mM), MgCl2 (e.g. 8mM), KCl (e.g. 30mM), dithiothreitol (e.g.
0.3mM), dATR, dTTP, dCTP, and dGTP (e.g., 2mM each), reverse transcriptase was incubated at a constant temperature (e.g., 37°C) for a certain period of time (e.g., 40°C).
(minutes). Approximately 15 oligo (dC) strands are added to the 3' end of the RNA-DNA duplex thus obtained using the same procedure as when adding (dT) strands to the vector primer, except that dTTP is changed to dCTP. This DNA was added to Tris-HCl buffer (e.g. PH7.5, 10mM), MgCl 2 (e.g. 6mM),
Cut with Hind in a solution containing NaCl (e.g. 60mM). Add the previously prepared linker to this DNA.
Mix the DNA and add Tris-HCl buffer (e.g.
PH7.5, 20mM), MgCl2 (e.g. 4mM),
( NH4 ) 2SO4 (e.g. 10mM) , KCl (e.g.
0.1 M), β-nicotinamide adenine dinucleotide (β-NAD) (eg, 0.1 mM) with E. coli DNA ligase for a certain period of time (eg, 16 hours) at a constant temperature (eg, 12° C.). In this way cDNA and linker
Circularization with DNA takes place. In this reaction solution
Final concentration of dATP, dTTP, dGTP, dCTP, respectively
Add E. coli DNA ligase to 40 μM,
By adding E. coli DNA polymerase I and E. coli ribonuclease H and converting the RNA portion into DNA, a recombinant plasmid containing a complete double-stranded cDNA is obtained. Using the thus obtained recombinant plasmid, E. coli
For example, the E. coli c600SF8 strain was prepared using the method of Scott et al. [Katsuya Shigesada: Cell Engineering 2 ,
616 (1983)]. Since the ampicillin resistance gene is present on the recombinant plasmid obtained above, the transformed E. coli exhibits ampicillin resistance. The following method is used to extract fish growth hormone from these ampicillin-resistant ( Apr ) strains.
It is commonly used to select strains that carry novel recombinant plasmid DNA with genes that are complementary to mRNA. That is, the transformed strain obtained above was immobilized on a nitrocellulose filter, and a synthetic DNA having a DNA sequence predicted from the known amino acid sequence of chum salmon growth hormone was obtained.
associate with the probe and select those that associate strongly [Grunstein-Hognes
Hogness) Method, Proceedings of
The National Academy of Science (Proc.Natl.Acad.Sci). , USA., 72 , 3961
(1975)]. Probe DNA was obtained using the usual triester method [J.Am.Chem.Soc., 97 , 7327
(1975)]. Selection using synthetic DNA probes was performed using the method of Southern et al. [Journal of Molecular Biology (J.
Mol.Biol.) 98 , 503 (1975)], and this method was used to improve chum salmon growth hormone.
Recombinant plasmid DNA having genes complementary to mRNA can be identified. An example of a recombinant plasmid thus obtained is pSGH14. This plasmid can be used as a source of DNA encoding salmon growth hormone. Encodes salmon growth hormone in microorganisms
Production of fish growth hormone polypeptide by expression of DNA: Cut out the DNA from a plasmid containing the DNA encoding salmon growth hormone, integrate it into vector DNA, and introduce the resulting recombinant DNA into microorganisms. Salmon growth hormone polypeptide can be produced and accumulated in the culture by culturing the transformant, and salmon growth hormone polypeptide can be produced by collecting this. A suitable example of a plasmid containing DNA encoding salmon growth hormone is the above pSGH14. Any vector DNA can be used as long as the inserted DNA can be expressed in microorganisms. Preferably, it has a suitable promoter, such as a tryptophan (trp), lactose (lac), or PL promoter, and DNA can be inserted downstream thereof.
Moreover, the inherent Shear In-Dalgarno sequence (hereinafter
(abbreviated as SD sequence) and translation initiation codon (ATG)
A vector DNA is used in which the distance between the two is adjusted to an appropriate distance, for example, 6 to 18 base pairs. A specific example of suitable vector DNA is plasmid pGEL1. pGEL1 is the plasmid shown in Figure 3, and the Escherichia coli containing it is Escherichia
coli IGEL1 (FERM BP-629) in 1981
It was deposited with the Institute of Microbial Technology (Feikoken) of the Agency of Industrial Science and Technology on October 6th. Recombination between DNA encoding a polypeptide and vector DNA can be performed using a general recombinant DNA technique in which both DNAs are digested using restriction enzymes and then ligated using T4 DNA ligase. In the case of pSGH14 and pGEL1 shown as specific examples, construction is performed in two stages as shown in FIG. That is, an Mbo-Pvu fragment encoding the N-terminal region of salmon growth hormone mature peptide from pSGH14,
Contains the rest of the cDNA and the vector part
The Pvu-Hind fragment is obtained separately. Meanwhile, create a synthetic DNA linker as shown below. The above DNA fragment and synthetic DNA linker
This is ligated with T4 DNA ligase to obtain the recombinant plasmid pSGHB9 shown in FIG. Next, a Hind-BamHI digested fragment encoding salmon growth hormone mature peptide was obtained from pSGHB9, and a Hind-BamHI digested fragment containing the tryptophan promoter was obtained from pGEL1. Above 2
The two DNA fragments are ligated using T4 DNA ligase to obtain the recombinant plasmid pSGHC2 shown in FIG. This plasmid has a region encoding mature salmon growth hormone linked downstream of the tryptophan promoter. The reaction conditions in the above recombinant technique are generally as follows. The digestion reaction of DNA with restriction enzymes is usually 0.1~
20μg of DNA at 2-200mM (preferably 10-200mM)
40mM) Tris-HCl (PH6.0-9.5 preferably PH
7.0-8.0), 0-200mM NaCl, 2-30mM (preferably 5-10mM) MgCl2 , 0.1-100 units of restriction enzyme (preferably 1 μg).
1 to 3 units per DNA) at 20 to 70°C.
(The optimal temperature varies depending on the restriction enzyme used) for 15 minutes to 24 hours. Stopping the reaction is usually
Depends on heating at 55-75℃ for 5-30 minutes,
A method of inactivating the restriction enzyme with a reagent such as phenol or diethylpyrocarbonate can also be used. Purification of DNA fragments generated by restriction enzyme digestion was performed using low melting point agarose gel electrophoresis [L. Wieslander: Analytical Biochemistry].
Biochemistry) 98 , 305, (1979), hereinafter referred to as the LGT method], polyacrylamide gel electrophoresis, etc. The binding reaction of DNA fragments is carried out using 2 to 200 mM (preferably 10 to 40 mM) Tris-HCl (PH6.1 to 9.5, preferably PH7.0 to 8.0), 2 to 20 mM (preferably 5 to 5
~10mM) MgCl2 , 0.1-10mM (preferably 0.5
~2.0mM) ATP, 1~50mM (preferably 5~
Using 0.3 to 10 units of T4 DNA ligase in a reaction solution containing 10 mM dithiothreitol,
It is carried out at 37°C (preferably 3 to 20°C) for 15 minutes to 72 hours (preferably 2 to 20 hours). Recombinant plasmid generated by ligation reaction
If necessary, DNA can be obtained using the transformation method of Cohen et al. [SNCohen et al.: Proceedings of the National Academy of Sciences]
of Science (Proc.Natl.Acad.Sci.), USA
69, 2110 (1972)] into E. coli. extracted from E. coli with recombinant plasmid DNA.
DNA can be isolated by the method shown in Example 1 described later or by the method of Birnboim et al.
et al.: Nucleitsk Acid Research (Nucleic
Acids Res.) 7 , 1513 (1979)]. After digesting plasmid DNA with 1 to 10 types of restriction enzymes, the cleavage site is examined by agarose gel electrophoresis or polyacrylamide gel electrophoresis.
Furthermore, when it is necessary to determine the base sequence of DNA, the Maxam-Gilbert method [proceduring method]
of the National Academy of Sciences (Proc. Natl. Acad. Sci.), 74 , 560 (1977)]
Or Sanger with M13 Fuage
Law [Sanger et al. Proceedings]
of the National Academy of Sciences (Proc. Natl. Acad. Sci.) USA, 74 , 5463
(1977); Amersham M13 cloning and sequencing handbook]
Determined by. Recombinant plasmid DNA under the above conditions.
can be manufactured. The fish growth hormone peptide of the present invention can be produced as follows. That is, E. coli K-12 HB101 is transformed using a plasmid (for example, pSGHC2), and E. coli harboring pSGHC2 is selected from ampicillin-resistant colonies. By culturing E. coli containing pSGHC2 in a medium, fish growth hormone polypeptide can be produced in the culture. As the medium used here, either a synthetic medium or a natural medium can be used as long as it is suitable for the growth of E. coli and the production of fish growth hormone polypeptide. Carbon sources include glucose, fructose,
Lactose, glycerol, mannitol, sorbitol, etc. are nitrogen sources, but NH 4 Cl,
(NH 4 ) 2 SO 4 , casamino acids, yeast extract, polypeptone, meat extract, bactryptone, corn staple liquor, etc. Other nutritional sources include K 2 HPO 4 , KH 2 PO 4 , NaCl, MgSO 4 , vitamin B1 , MgCl2 , etc. can be used. Cultivation is carried out at pH 5.5-8.5 and temperature 18-40°C by aerated agitation. Since chum salmon growth hormone polypeptide accumulates in the cultured cells after 5 to 90 hours of culture, the cells are collected from the culture, treated with lysozyme, frozen,
The cells are disrupted by repeated thawing, and polypeptides are collected from the supernatant obtained by centrifugation according to a conventional polypeptide extraction method. The polypeptide can also be detected by directly incubating the cultured bacterial cells in a Laemmli sample buffer [Laemmli, Nature, 227 ,
680 (1970)] and then applied to SDS-polyacrylamide gel (Laemmli's method: Ibid.) and stained with Coomassie brilliant blue. Examples of the present invention are shown below. Example 1 Preparation of poly(A) RNA from chum salmon pituitary gland: Guanidium thiocyanate-cesium chloride method from chum salmon pituitary gland [Maniatis et al., eds., Molecular. Polymerization according to Molecular Cloning, p196, Cold Spring Harbor; Katsuya Shigesada, Cell Engineering, 2 , 616 (1983)].
RNA containing (A) was prepared as follows. 2g frozen pituitary gland of chum salmon (approx. 30 individuals)
4M guanidinium thiocyanate, 0.5% sarcosine, 5mM sodium citrate (PH7) and
10 ml of a solution consisting of 0.1 m β-mercaptoethanol
The mixture was crushed and solubilized using a Teflon homogenizer (5 rpm). This homogenate was passed through an 18G needle several times to fragment the DNA. 5.7MCsCl, 0.1M
1.2 ml of each EDTA (PH8) solution was dispensed into ultracentrifuge tubes, and the homogenate was layered thereon.
After centrifugation at 35,000 rpm for 15 hours in a Hitachi RPS40 rotor, RNA was collected as a precipitate. The RNA precipitate was dissolved in 10 ml of Tris-HCl (PH8.0) solution containing 1 mM EDTA, extracted with phenol-chloroform, and recovered by ethanol precipitation. obtained
Approximately 1 mg of RNA was added to 10 mM Tris-HCl (PH8.0) and
It was dissolved in 1 ml of a solution consisting of 1 mM EDTA. 65
℃, incubate for 5 minutes and add 0.1 ml of 5M NaCl.
added. Add the mixture to oligo(dT) cellulose.
The mixture was subjected to column chromatography (column volume: 0.5 ml) (manufactured by PL Biochemicals). mRNA with adsorbed poly(A) was added to 10mM Tris-
It was eluted with a solution consisting of HCl (PH7.5) and 1mM EDTA and fractionated into 0.2ml portions. The 3rd to 5th fractions were collected to obtain about 10 μg of poly(A)-containing mRNA. Example 2 cDNA synthesis and insertion of the DNA into a vector: According to the method of Okayama-Berg [Molecular and Cellular Biology, 2 , 161 (1982)],
We synthesized cDNA and constructed a recombinant plasmid incorporating it. An outline of the process is shown in FIG. pCDV1 [Okaya & Berg
Ma & Berg): Molecular and Cellular Biology (Mol.Cell.Biol.), 3 , 280
(1983)] 400μg of 100mM Tris-HCl (PH7.5),
Solution consisting of 6mM MgCl2 and 10mM NaCl
In addition to 300 μl, 500 units of KpnI (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.; all restriction enzymes are manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd. unless otherwise specified) were added, and the mixture was reacted at 37°C for 6 hours to cleave at the KpnI site in the plasmid. After phenol-chloroform extraction, DNA was extracted by ethanol precipitation.
was recovered. Approximately 200 μg of the KpnI-cleaved DNA was
40mM sodium cacodylate, 30mM Tris-
Add dTTP to a buffer solution (hereinafter abbreviated as TdT buffer) consisting of HCl (PH6.8), 1mM CaCl 2 and 0.1mM dithiothreitol (hereinafter abbreviated as DTT).
In addition to 200 μl of the solution added to give a concentration of 0.25 mM, add 81 units of terminal deoxynucleotidyl transferase (hereinafter abbreviated as TdT) (P
-L Biochemicals) and reacted at 37°C for 11 minutes. Here, approximately 67 poly(dT) chains were added to the 3' end of the KpnI cleavage site of pCDV1.
From this solution, poly(dT) chains were added by phenol-chloroform extraction and ethanol precipitation.
Approximately 100 μg of pCDV1 DNA was recovered. the DNA
10mM Tris-HCl (PH7.5), 6mM MgCl2 ,
In addition to 150 μl of a buffer consisting of 100 mM NaCl, 360 units of EcoRI were added, and the mixture was reacted at 37° C. for 2 hours. After processing the reactant with the LGT method, approximately 3.1 Kb of
Collect DNA fragments and add approximately 60μg of poly(dT) strands
pCDV1 was obtained. The DNA was diluted with 10mM Tris-HCl.
(PH8.0) and 500μl of a solution consisting of 1mM EDTA
After incubating at 65°C for 5 minutes, the mixture was cooled on ice and 50 μl of 5M NaCl was added. The mixture was subjected to oligo(dA) cellulose column chromatography (manufactured by Collaborative Research). Poly(dT)
Those with sufficient chain length are adsorbed on the column and
10mM Tris-HCl (PH8.0) and 1mM EDTA
pCDV1 with a poly(dT) chain added (hereinafter abbreviated as vector primer) was eluted with a solution consisting of
27 μg was obtained. Next, prepare linker DNA. pL1 [Okayama & Berg
& Berg): Molecular & Cellular
Biology (Mol.Cell.Biol.), 3 , 280 (1983)]
Approximately 14μg in 10mM Tris-HCl (PH7.5), 6mM
200 μl of buffer consisting of MgCl 2 and 50 mM NaCl
In addition, 50 units of PstI were added, and the reaction was carried out at 37°C for 4 hours to cleave at the PstI site in pL1 DNA.
After extracting the reaction product with phenol-chloroform, ethanol precipitation was performed, and pL1DNA was cut with PstI.
Approximately 13 μg was recovered. Approximately 13 μg of the DNA was added to 50 μl of a solution containing dGTP at a final concentration of 0.25 mM in TdT buffer.
In addition, 54 units of TdT (manufactured by P-L Biochemicals) were added and incubated at 37°C for 13 minutes.
Approximately 14 (dG) chains were added to the 3' end of the PstI cleavage site. After phenol-chloroform extraction, DNA was recovered by ethanol precipitation. 100 μl of the DNA
10mM Tris-HCl (PH7.5), 6mM MgCl2 and
In addition to 100 μl of a buffer consisting of 60 mM NaCl, 80 units of Hind was added, and the mixture was incubated at 37° C. for 3 hours to cleave pL1DNA at the Hind site.
The reaction product was fractionated by agarose gel electrophoresis,
Approximately 0.5 Kb DNA fragments were collected using the DEAE paper method [Dretzen et al., Anal.Biochem., 112 , 295
(1981)] and linker DNA with oligo (dG) strands (hereinafter simply referred to as linker DNA).
I got it. Approximately 2 μg of poly(A) RNA prepared above and approximately 1.4 μg of vector primer were added to 50 mM Tris-HCl (PH8.3),
8mM MgCl2 , 30mM KCl, 0.3mM DTT,
2mM dNTP (dATP, dTTP, dGTP and
dCTP) and 10 units of ribonuclease inhibitor (P-L Biochemicals), added 10 units of reverse transcriptase (Seikagaku Corporation), and incubated at 37°C for 40 minutes. Complementary DNA was synthesized. The reaction product was subjected to phenol-chloroform extraction and ethanol precipitation to recover vector polymer DNA to which RNA-DNA double strands had been added. the DNA
TdT buffer containing 66 μM dCTP and 0.2 μg poly(A)
Dissolve 14 units of TdT (P-L) in 20 μl.
Biochemicals) and incubated at 37°C for 8 minutes to add 12 (dC) strands to the 3' end of the cDNA. The reaction product was extracted with phenol-chloroform, and the cDNA-vector primer DNA with the (dC) strand added was recovered by ethanol precipitation.
The DNA was dissolved in 10mM Tris-HCl (PH7.5), 6mM
It was dissolved in 400 μl of a solution consisting of MgCl 2 and 60 mM NaCl, 20 units of Hind was added, incubated at 37° C. for 2 hours, and cleaved at the Hind site. The reaction product was extracted with phenol-chloroform and precipitated with ethanol to obtain 0.5 pmole of (dC) strand-added cDNA-vector primer DNA. 0.08pmole of said DNA
and 0.16 pmole of the above linker DNA in 10mM Tris-HCl (PH7.5), 0.1M NaCl and 1mM
Dissolve in 40 μl of a solution consisting of EDTA and incubate at 65℃, 42℃,
The cells were incubated at 0°C for 10 minutes, 25 minutes, and 30 minutes, respectively. 20mM Tris-HCl (PH7.5), 4mM
MgCl 2 , 10mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.1M KCl and
A reaction solution was prepared with a composition of 0.1 mM β-NAD and a total volume of 400 μl. Add 10 units of E. coli to the reaction solution.
DNA ligase (manufactured by New England Biolabs) was added and incubated overnight at 11°C. Components were added to the reaction solution to give 40 μM each of dNTP and 0.15 mM β-NAD, and 5 units of E. coli DNA ligase and 7 units of E. coli DNA polymerase I (P-L) were added.
Bio-chemicals) and 2 units of Escherichia coli ribonuclease H (P-L Biochemicals) were added and incubated at 12°C and 25°C for 1 hour each. In the above reaction, the recombinant containing cDNA
The DNA was circularized and the RNA portion of the RNA-DNA duplex was replaced with DNA, producing a complete double-stranded DNA recombinant plasmid. Example 3 Recombination containing chum salmon growth hormone cDNA
Selection of DNA: Using the recombinant plasmid obtained in Example 2, Escherichia coli c600SF8 strain [Cameron: Proceedings of the National Academy of Sciences (Proc. Natl. Acad. Sci.)]
USA, 72 , 3416 (1975)] and the method of Scott et al. [Katsuya Shigesada: Cell Engineering, 2 , 616 (1983)]
Transformation was performed according to the following. Of the approximately 10,000 colonies obtained, 4,800 were fixed on nitrocellulose. 23rd position from the N-terminus of chum salmon growth hormone
Synthetic DNA corresponding to the 28th amino acid sequence, i.e. (3rd base is A or G, 9th base is T or C, 12th base is C or T, 15th base is C or T, resulting in 16 combinations of synthetic DNA mixtures) was labeled with 32P. Eight bacterial strains that strongly associated with the probe at 40°C were selected [Grunstein-Hogness method, Proceedings of the National Academy of Sciences].
of Science (Proc. Natl. Acad. Sci.) USA,
72, 3961 (1975)]. The Southern method [Journal of
Molecular Biology (J.Mol.Biol.),
98, 503 (1975)], the above probe and C
Synthetic DNA probe corresponding to amino acid sequence near the end (The 3rd base is C or T, the 6th base is A or G, the 9th base is A, T, G, or C, and the 12th base is G or A. There are 32 possible combinations.
An association was also confirmed with the DNA (resulting in a mixture of DNA).
These plasmids are pSGH1, 3, 6, 8, 9,
10, 14, and 17, all of which are DNA predicted from the amino acid sequence of chum salmon growth hormone.
It was thought that it contained the growth hormone cDNA because it had the same sequence. Example 4 Base sequence of the plasmid pSGH14: The eight plasmids obtained above were digested with various restriction enzymes, and the cleavage map of the cDNA portion was determined. Based on the location of the restriction enzyme site, the obtained plasmids can be classified into three groups: pSGH1, 6, 9,
They were divided into groups 10 and 17, pSGH3 group, and pSGH8 and 14 group. The restriction enzyme map of each group is shown in Figure 2. Among these, the entire nucleotide sequence of the plasmids of the pSGH1 group, especially pSGH1, has already been determined, and the amino acid sequence predicted from the cDNA sequence is the near N-terminus and C-terminus determined from the chum salmon growth hormone peptide. The cDNA completely matches the nearby amino acid sequence, and it has been confirmed that the cDNA encodes chum salmon growth hormone. [Patent application No. 59-134536 and No. 59-213360]. Furthermore, among the plasmids pSGH8 and pSGH14, which have different restriction enzyme cleavage sites from this group, they contain longer cDNAs that are thought to have almost full-length cDNAs.
Regarding pSGH14, the entire nucleotide sequence of the translated region was determined using the Sanger method using M13 phage [Sanger et al.
The National Academy of Science (Proc. Natl. Acad. Sci.), USA, 74 , 5463
(1977): Amersham M13
The determination was made according to the Cloning and Sequencing Handbook. The sequences are shown in Table 1. [Table] [Table] In Table 1, from a comparison with known chum salmon growth hormone, base numbers 1-66 are signal peptides, 67
-630 is thought to encode the mature peptide of the new chum salmon growth hormone. The polypeptide encoded by the cDNA is
The 22 amino acid sequence of the signal peptide is completely identical to the polypeptide encoded by pSGH1, but the mature peptide part differs in 12 amino acids out of 188, which are underlined in Table 1. There is. Furthermore, in the N-terminal 40 amino acid sequences determined from chum salmon growth hormone polypeptide, five amino acids are clearly different.
The cDNA contained in pSGH14 is thought to encode a new growth hormone for fish that is different from the pSGH1 group. Escherichia coli containing the recombinant plasmid containing pSGH14 is Escherichia coli ESGH14.
(FERMBP-611) to the Microtech Institute in September 1981.
It was deposited on the 20th. Example 5 Construction of a recombinant plasmid encoding a novel chum salmon growth hormone: (1) Construction of a recombinant plasmid pSGHB9 encoding a mature chum salmon growth hormone from pSGH14: DNA encoding a novel chum salmon growth hormone
5μg of plasmid pSGH14 containing 20mM Tris-
HCl (PH7.5), 10mM MgCl2 , and 10mM
Dissolve restriction enzyme Mbo in 100 ml of solution containing NaCl.
(manufactured by New England Bio Labs) was added, and the digestion reaction was performed at 37°C for 3 hours. followed by NaCl
The concentration was adjusted to 50mM, 10 units of Pvu was added, and a digestion reaction was performed at 37°C for 3 hours. This reaction solution was subjected to polyacrylamide gel electrophoresis and DEAE
-108bp corresponding to the N-terminus by paper method
Approximately 0.05 μg of DNA fragment was obtained. Next, 5μg of pSGH14 was added to 20mM Tris-HCl (PH
7.5), dissolved in 40 μl of a solution containing 10 mM MgCl 2 and 50 mM NaCl (hereinafter abbreviated as “Y-50 buffer”), added 10 units each of Pvu and Hind, and incubated at 37°C.
Digestion reaction was carried out for 3 hours. About 0.5 μg of a DNA fragment of about 3.3 Kb containing the C-terminal side of growth hormone encoded by pSGH14, the 3'-untranslated region, and the vector portion was obtained from the reaction solution by the LGT method. while encoding adult chum salmon growth hormone.
The following DNA linker was synthesized for the purpose of adding the translation initiation codon ATG necessary for DNA expression and further connecting the vector DNA and the above DNA. First, single-stranded DNA, 14mer and 9mer were extracted using the usual triester method [R.Crea et al.: Proceedings of the National Academy of Sciences (Proc.Natl.Acad.Sci.)]
USA., 75 , 5765 (1978)].
39 pmole each of 14mer and 9mer single-stranded DNA
50mM Tris-HCl (PH7.5), 10mM MgCl2 ,
It was dissolved in 20 μl of a solution containing 10 mM dithiothreitol and 1 mM ATP, 6 units of T4 polynucleotide kinase (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was added, and a phosphorylation reaction was performed at 37° C. for 60 minutes. 0.08pmole of the Mbo-Pvu fragment (108bP) derived from pSGH14 obtained above, 0.08pmole of the Pvu-Hind fragment (approximately
3.7Kb) 0.02pmole in 5mM Tris-HCl (PH7.5),
10mM MgCl2 , 10mM dithiothretol and
It was dissolved in 30 μl of a solution containing 1 mM ATP, and 5 μl of the above synthetic DNA phosphorylation reaction solution was added thereto. Add 6 units of T4 DNA ligase to this mixture and heat at 4°C.
The binding reaction was carried out for 18 hours. Using the reaction solution, Escherichia coli HB101 [Bolivar et al., Gene, 2 , 75 (1977)]
The strain was transformed to obtain an Ap r no colony, and plasmid DNA was recovered from this colony to obtain pSGHB9 shown in FIG. The structure of pSGHB9 is Hind
, XbaI, Bgl, and BamHI and confirmed by agarose gel electrophoresis. (2) Integration of the region encoding mature chum salmon growth hormone of pSGHB9 into the expression vector pGEL1: Dissolve 5 μg of pSGHB9 in 40 μl of Y-50 buffer, add 10 units each of BamHI and Hind, and add 10 units each of BamHI and Hind at 37°C.
A time digestion reaction was performed. About 0.1 μg of a DNA fragment of about 1200 bp encoding the entire mature chum salmon growth hormone was obtained from the reaction solution by the LGT method. Separately, 5 μg of pGEL1 was dissolved in 40 μl of Y-50 buffer, 10 units each of BamHI and Hind were added, and the mixture was heated at 37°C.
Digestion reaction was carried out for 3 hours. From this reaction solution, LGT
Containing tryptophan promoter by law
Approximately 0.1 μg of a 2.7 Kb DNA fragment was obtained. Add 0.01 μg of the Hind-BamHI fragment of pSGHB9 (approximately 1200 bp) obtained above and 0.015 μg of the Hind-BamHI fragment of pGEL (approximately 2.7 Kb) to 50 mM Tris-HCl (PH
7.5), dissolved in 30μl of a solution containing 10mM MgCl 2 , 10mM dithiothreitol and 1mM ATP,
Add 6 units of T4 DNA ligase (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.),
The binding reaction was carried out at 4°C for 18 hours. E. coli HB101 strain was transformed using the reaction solution to obtain Ap r colonies, and plasmid DNA was recovered from these colonies to transform pSGHC2 shown in Figure 3.
I got it. The structure of pSGHC2 is EcoRI, Hind,
It was cut with ClaI, Bgl, and BamHI and confirmed by agarose gel electrophoresis. E. coli strains containing pSGHB9 and pSGHC2 are
Escherichia coli ESGHC2 FERM BP−
708 and ESGHB9 FERM BP-707, respectively, have been deposited at the Institute of Fine Technology. Example 6 Production of a new chum salmon growth hormone peptide using Escherichia coli containing pSGHC2: Recombinant plasmid pSGHC2 obtained in Example 5
Escherichia coli W3110strA strain (FERM
BP-732) was transformed. The obtained Ap r colony was transferred to 8 ml of MCG medium [0.6% Na 2 HPO 4 , 0.3%
KH 2 PO 4 , 0.5% NaCl, 0.1% NH 4 Cl, 0.5
% glucose, 0.5% casamino acids, 1mM
MgSO 4 , 4μg/ml vitamin B 1 , PH7.2]
Culture was carried out at 30°C for 18 hours. The obtained culture solution
The cells were collected by centrifugation at 8000 rpm for 10 minutes. After suspending this bacterial body in Laemmli sample buffer,
Perform SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,
A polypeptide band with a molecular weight of approximately 25,000 was detected by staining with Coomassie brilliant blue. This band was not present when E. coli without the plasmid was used. As a result,
It was found that Escherichia coli harboring pSGHC2 produces large amounts of chum salmon growth hormone polypeptide. Effects of the Invention According to the present invention, a recombinant DNA incorporating a DNA encoding a novel fish growth hormone polypeptide and a microorganism containing the recombinant DNA can be obtained, and a large amount of these new fish growth hormone polypeptides can be obtained. Can be used for production.
第１図(1)および(2)はオカヤマーバーグ法による
cDNA合成と該DNAを含む組換え体プラスミド
の造成過程の概略を示す。第２図はpSGH1，
pSGH3，pSGH14に含まれるcDNAの制限酵素
地図を示す。第３図は組換え体プラスミドpSGH
B9，pSGHC2の造成過程を示す。
Figure 1 (1) and (2) are based on the Okayamberg method.
An outline of the process of cDNA synthesis and construction of a recombinant plasmid containing the DNA is shown. Figure 2 shows pSGH1,
Restriction enzyme maps of cDNAs contained in pSGH3 and pSGH14 are shown. Figure 3 shows recombinant plasmid pSGH
The construction process of B9 and pSGHC2 is shown.
Claims (1)
ルモンポリペプチド。 【表】 ２ 魚類の成長ホルモンがニシン類
（Clupeiformes）の新規成長ホルモンである特許
請求の範囲第１項のポリペプチド。 ３ 下記のペプチド配列を含む魚類の新規成長ホ
ルモンポリペプチドをコードするDNAを組み込
んだ組換え体DNAを含む細菌を栄養培地に培養
し、該培養物中に魚類の成長ホルモンポリペプチ
ドを蓄積せしめ、該培養物から該ポリペプチドを
採取することを特徴とする下記のペプチド配列を
含む魚類の成長ホルモンポリペプチドの製造法。 【表】[Scope of Claims] 1. A novel growth hormone polypeptide for fish comprising the following peptide sequence. [Table] 2. The polypeptide of claim 1, wherein the fish growth hormone is a novel growth hormone of herring (Clupeiformes). 3. Cultivating a bacterium containing a recombinant DNA into which a DNA encoding a novel fish growth hormone polypeptide containing the following peptide sequence has been incorporated in a nutrient medium, accumulating the fish growth hormone polypeptide in the culture, A method for producing a fish growth hormone polypeptide comprising the following peptide sequence, which comprises collecting the polypeptide from the culture. 【table】
Priority Applications (9)
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| CA000485108A CA1272144A (en) | 1984-06-29 | 1985-06-25 | Fish growth hormone polypeptide |
| NO852568A NO174717C (en) | 1984-06-29 | 1985-06-26 | A method for producing a fish growth hormone polypeptide from Oncorhynchus keta as well as expression vectors for use in the method |
| AU44195/85A AU575961B2 (en) | 1984-06-29 | 1985-06-26 | Salmon fish growth hormone by genetic engeneering |
| EP85107987A EP0166444B1 (en) | 1984-06-29 | 1985-06-27 | Fish growth hormone polypeptide |
| SU853913602A RU1825376C (en) | 1984-06-29 | 1985-06-28 | Method for producing deoxyribonucleic acid coding salmon growth hormone: method of constructing intermediate recombination plasmide dna including dna fragment coding salmon growth hormone for producing p s g h1, p s g h3, p s b h9, p s g h10, p s g h14 and p s g h17 plasmides: method of producing recombination plasmi |
| US06/750,587 US4689402A (en) | 1984-06-29 | 1985-07-01 | Fish growth hormone polypeptide |
| CN 85104988 CN85104988A (en) | 1984-10-12 | 1985-07-01 | Fish growth hormone polypeptide |
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| JPS61210100A JPS61210100A (en) | 1986-09-18 |
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ID=12849529
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Country Status (1)
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Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE119573T1 (en) * | 1986-12-31 | 1995-03-15 | Lucky Ltd | METHOD FOR PRODUCING A SALMON GROWTH HORMONE USING AN ARTIFICIAL GENE. |
-
1985
- 1985-03-13 JP JP60050096A patent/JPS61210100A/en active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61210100A (en) | 1986-09-18 |
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