JPH05178757A - トロンボスポンジン−様活性を有するペプチド及びその治療のための使用 - Google Patents

トロンボスポンジン−様活性を有するペプチド及びその治療のための使用

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JPH05178757A JP4151190A JP15119092A JPH05178757A JP H05178757 A JPH05178757 A JP H05178757A JP 4151190 A JP4151190 A JP 4151190A JP 15119092 A JP15119092 A JP 15119092A JP H05178757 A JPH05178757 A JP H05178757A
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【構成】 一般式 Ｒ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｃｙｓ−Ｒ２ で示されるヒトトロンボスポンジンの断片及びその合成
同族体からなる化合物とその組成物、トロンボスポンジ
ン様試薬としての使用法の提供。〔式中Ｒ１は好ましく
はアルギニン残基であり、Ｘ１，Ｘ２は好ましくはバリ
ン、トレオニン、セリンから選ばれるアミノ酸残基であ
り、Ｒ２は（保護）カルボキル末端またはそのアシド型
をもつアミノ酸残基で好ましくはリシン、グリシン、ア
ルギニンから選ばれる〕 【効果】 上記ペプチドはたとえば腫瘍治療に有用であ
る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は一般にトロンボスポンジ
ン-様活性を保有するトロンボスポンジン（ＴＳＰ）の
ペプチド断片及び合成類似体に関する。同ペプチドはＴ
ＳＰの生物活性を保持し、類似の挙動をして、細胞接着
及び異なる細胞系への付着を強力に促進したりあるいは
阻害する。同ペプチドは恐らくＴＳＰの細胞接着領域
（ドメイン）が関与するメカニズムによってであると考
えられるが、腫瘍細胞転移を仲介することが以前から知
られており、転移阻害剤としての用途が期待されてい
る。これらのペプチドは又別な生物学的及び薬学的用
途、例えば（ａ）細胞の組織培養用フラスコへの付着の
促進又は阻害、（ｂ）傷の癒合促進、血管新生促進、及
び移植組織の受容促進、及び（ｃ）抗血小板凝集用試薬
としての使用、及び種種の病気治療での診断薬としての
用途がある。
【０００２】
【従来の技術（背景）】トロンボスポンジン（トロンビ
ン感受性蛋白質又はＴＳＰとして知られる）は３個の同
一でジスルフィド結合したポリペプチド鎖からなる分子
量450,000の蛋白質である(Lawler et al., J. Cell Bio
l. (1986) 101:1059ー71)。ＴＳＰは生理学的活性物質、
例えばトロンビン及びコラーゲンに反応して血小板によ
り分泌される(Lawler, J. Blood (1986) 67:112ー123)。
ＴＳＰは３％の血小板全蛋白質と２５％の全血小板 α-
粒状蛋白質(granular protein)からなる(Tuszynski, G.
P. et al., (1985) J. Biol. Chem. 260:12240ー1224
5)。他の細胞、例えば繊維芽細胞(Jaffe, E.A. et al.,
(1983) Natl. Acad. Sci. USA 80:999-1002)、平滑筋
細胞(Raugi, G.J. et al., (1982) J. Cell Biol. 95:3
51ー354)及び内皮細胞（McPhearson, J. et al., J. Bio
l. Chem. 256:11330-11336)でもＴＳＰが合成される。
ＴＳＰはある種の腫瘍組織、例えばメラノーマ細胞(Var
ani, J. et al., (1989) Clin. Expl. Metastasis 7:31
9-329)、偏平(squamous)肺癌腫(Riser, B.L. et al.,
(1988) Exp. Cell Res. 174:319-329)、及び乳癌腫(Pra
tt, D.A. et al., (1989) Eur. J. Cancer Clin. Onco
l. 25:343-350) 中で発見されている。更に以下の培養
腫瘍細胞、即ち繊維肉腫、横紋筋肉腫、グリオブラスト
ーマ、ウィルム(Wilm's)腫瘍、神経芽細胞腫、奇形癌
腫、絨毛膜癌腫、メラノーマ、及び肺癌腫がＴＳＰを合
成することが示された(Mosher, D.F., (1990) Annu. Re
v. Med. 41:85-97)。最近多くの研究がなされて、ＴＳ
Ｐが細胞−細胞間及び細胞−基層間接着で主要な役割を
演ずることが示された(Tuszynski, G.P. et al., (198
7) Seminars in Thrombosis Hemostasis 13:361-368; M
osher, D.F., (1990) Annu. Rev. Med. 41:85-97)。Ｔ
ＳＰは細胞付着、血小板凝集、及び転移動物実験モデル
のマウス中で肺癌腫コロニー生成を促進する(Tuszynsk
i, G.P. etal., (1987) Science 236:1570-1573, Tuszy
nski G.P. et al., (1988) Blood 72:109-115)。ＴＳＰ
の接着での役割は更に大部分の組織の細胞外マトリック
スがＴＳＰを含むことが観察されて支持されている。
【０００３】ＴＳＰは、種々の巨大分子例えば血漿及び
マトリックス成分と特定的に相互作用する線状のポリペ
プチド領域からなっている。例えばＴＳＰはヘパリン(Y
abkowitz, R. et al., (1989) J. Biol. Chem. 264:108
88-10896)、フィブリノーゲン(Tuszynski, G.P. et a
l., (1985) J. Biol. Chem. 260:12240ー12245)、コラー
ゲン(Mumby, S.M. et al., (1984) J. Cell Biol. 98:1
0888-10896)、及びプラスミノーゲン(Depoli, P. et a
l., (1989) Blood 73:976-902)と錯体を形成する。ＴＳ
Ｐの構造は種々の動物種中で保持されることは、ヒト蛋
白質に対する抗体がマウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツ
ジ、イヌ及びシチメンチョウからのＴＳＰと交差反応す
るという事実からも示される(Switalska, H.I. etal.,
J.Lab Clin. Med. 106:690-700)。
【０００４】トロンボスポンジンは、排除クロマトグラ
フィ(Lawler et al., J.Biol. Chem. (1978) 253:8609-
16)、ヘパリンアフィニティクロマトグラフィ(Tuszynsk
i et al., J. Biol. Chem. (1985) 260:12240ー12245)、
塩化バリウム沈殿法(Alexander et al., Biochem. J.
(1984) 217:67ー71)及びアニオン交換ＨＰＬＣ (Clezaro
lin et al., J. Chromatog. (1984) 296:249-56)をはじ
めとして多くの方法によって精製されている。
【０００５】ＴＳＰの完全なアミノ酸配列はLawler et
al., J. Cell Biol. (1986) 103:1635-48; Kobayashi e
t al., Biochemistry (1986) 25:8418-25; Dixitet a
l., Proc. Ntl. Acad. Sci. (1986) 83:5449-53; 及びH
ennessy et al., J.Cell Biol. (1989) 108:729ー36)を
初めとして多くの研究グループによって作成されたＤＮ
Ａクローンから推論されている。
【０００６】細胞接着は多細胞生体の発達及び生存にと
って重要である。細胞接着過程は複雑で多くの細胞外蛋
白質例えばフィブロネクチン、ビトロネクチン、コラー
ゲン、ラミニン及びＴＳＰ、及び多くの細胞レセプター
ファミリー、例えばインテグリン及び細胞接着分子(Ｃ
ＡＭ)を必要とする。これらの分子は正常細胞及び腫瘍
細胞の両方に含まれ、近年非常に強力に研究されてい
る。
【０００７】アミノ酸配列、Ａrg-Ｇly-Ａsp(ＲＧＤ)は
フィブロネクチン中の細胞付着領域として確認された(P
ierschbacher, M.D. 及びRuoslahti, Ek., (1984) Natu
re (London) 309:30-32)。 これと同一か又は関連した配
列が多くの蛋白質中で発見され、フィブリノーゲンのよ
うな巨大分子の細胞結合部位として作用する(Ginsberg,
M.D. et al., (1985) J. Biol. Cehm. 260:11891-1189
6)。しかし、ラミニンの接着機能はＲＧＤ配列に基づか
ず、アミノ酸配列チロシン-イソロイシン-グリシン-グ
リシン-セリン-アルギニン(ＹＩＧＳＲ)を含むＢ１鎖の
ペプチド断片によるもののようである(Sasaki, M. (198
7) Proc. Natl. Acad. Sci 84:935-938)。ＲＧＤ及びＹ
ＩＧＳＲ配列を含む合成ペプチドは細胞接着を促進す
る。
【０００８】フィブロネクチン及びラミニンの接着領域
を基本として含んだ合成ペプチドと医療に使用すること
は最近報告されている。Humphries et al. (1986) Scie
nce233：467-470が初めてペンタペプチドＧＲＧＤＳを
Ｂ16-Ｆ10マウスメラノーマ細胞と一緒に注射してC57BL
/6マウス中の肺コロニー形成を劇的に阻害することを示
した。ラミニン(ＹＩＧＳＲ)から誘導された別の合成ペ
プチドも又C57BL/6マウス中でＢ16-Ｆ10メラノーマ細胞
の転移を劇的に妨害した。(Kleinman, H.K.et al., (19
87) Science 238:1132-1133; Kleinman, H.K. et al.,
(1990) Proc. Natl．Acad. Sci. USA 87:2279-2283)。
これらペプチドの阻害活性は、腫瘍細胞が転移を開始し
て内因性ラミニン及びフィブロネクチンによって標的臓
器の血管床へ接着しようとするのに対し、これらペプチ
ドがそれと競合するために起こるものであろう。
【０００９】転移は腫瘍細胞が一つの場所から他の場所
へリンパ液又は血液循環によって移動することを含んだ
段階的過程であり、動物中の血小板が減少することによ
り動物中の転移が効果的に抑えられる(Gasic et al, (1
968) Proc. Natl.Acad. Sci．USA 48:46ー52)ので、血小
板が転移進行で特殊な役割を演じていると考えられてい
た。ＴＳＰは全アルファ粒状血小板-分泌蛋白質２５％
からなるので、ＴＳＰが腫瘍細胞が血液によって移動し
て遠くの臓器に転移するのに主要な役割を持っていると
考えられよう。事実、ＴＳＰはマウスモデル実験で腫瘍
細胞転移を促進することが示された(Tuszynski et al.,
(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA47:4130-4133)。
更に血小板の活性化を伴う現象、例えば接着蛋白質の分
泌、血小板凝集、蛋白質分解酵素の活性化、及び凝血の
連続反応活性化は全て腫瘍細胞転移で重要な役割を演ず
ることが示された(Gasic, G.J., (1984) Cancer Metast
asis Rev. 3:99-116)。
【００１０】細胞外マトリックスの一部である接着蛋白
質は多くの種類の細胞の移動、成長及び形態を制御す
る。細胞外マトリックス蛋白質は腫瘍細胞レセプターと
相互作用し、基底膜コラーゲンに腫瘍細胞を種々の方法
で接着する。例えばメラノーマ細胞をin vitroでラミニ
ンと一緒にすると腫瘍細胞の基底膜への接着能力が上が
り、肺腫瘍のコロニーができる(Barsky, S.H. et al.,
(1984) J. Clin. Inv. 74:843-848; Terranova, V.P. e
t al., (1984) Science 226:982-985)。
【００１１】上記の情報を検討してみると、ＴＳＰは多
様なそして臨床的に重要な過程、例えば細胞移動、傷の
癒合、神経再生、及び腫瘍細胞転移で重要な役割を演じ
ることができる。これらの過程の病態生理学を分子レベ
ルで更に良く理解するために、ＴＳＰの生物活性一つ一
つを、ＴＳＰの特定の小領域(subdomain)及びオリゴペ
プチドに帰属させることにより貴重な情報が得られよ
う。ＴＳＰ及びＴＳＰレセプター領域(ドメイン)の構造
を詳細に知ることにより、ＴＳＰの病態生理学活性、例
えばＴＳＰによる腫瘍細胞転移形成を遮断することがで
きるＴＳＰ拮抗性ペプチドを設計するのに使用すること
ができる。
【００１２】ＴＳＰは３個のI、II、及びIII型の繰り返
しを示す類似のペプチド配列を含んでいる(Lawler及びH
ynes, (1986) J. Cell Biol. 103:1635-1648)。３個の
繰り返しはそれぞれ６個のシステイン残渣を含む約６０
個のアミノ酸からなる。I型の繰り返しは、多くの種類
の蛋白質中に見られるペプチド断片を有する相同蛋白質
(homology)である。我々は、他の蛋白質中に全体的に保
持されるか、又は全体的に保持され、１個又は２個のア
ミノ酸が置換されているＴＳＰ中(ＶＴＣＧ)のテトラペ
プチド配列を同定した。保持配列の分布状態を下記表１
に示した。
【００１３】
【表１】 表 １ 蛋白質 配 列 参考文献 ＴＳＰ ＶＴＣＧ Lawler et al., (1986), (配列ＩＤＮO.１) J. Cell Biol. 103:1635-46 ＴＳＣＧ サーカムスポロゾアイト ＶＴＣＧ Dame J.B. et al., (1984) (circumsporozoite) Science 225:593-599 トラップ (Trap) ＶＴＣＧ Robson K.J.H. et al.,(1988) Nature 335:79-82 プロペルジン ＶＴＣＧ Goundis, D. et al., (1988) Nature 335:82-85 グリコプロテインＥ ＶＴＣＧ McGoech D.J. et al., (1985) ＨＳＶ-１ J. Mol. Biol. 181:1-13 シトクロームＣ ＥＴＣＧ Lawson, J.E. et al., (1985) オキシダーゼ Ckurr. Genet. 9:351-360 ポリペプチドII 呼吸酵素 ＶＴＣＫ Blasco, F. et al., (1989) 硝酸レダクターゼ Mol. Gen. Genet. 218:249-256 β-鎖 バードスパイダー１８Ｓ ＶＳＣＧ Hendriks L. et al., (1989) リボソームＲＮＡ Eur．J．Biochem．177:15ー20 チキンα-チューブリン ＶＶＣＧ Lemischka I.R. et al. (1981) J. Mol. Biol. 151:101ー120 ゼブラフィッシュ ＫＴＣＧ Njolstad P.R. et al., (1981) ホメオボックス遺伝子 EMBO J. 9:515-524 大腸菌腸管オペロン ＶＴＣＸ Yamada M. et al., (1987) Biol. Chem. 262:5455-5463 大腸菌ＡＴＰアーゼ ＶＴＣＭ Kanazawa H. et al., (1981) BBRC:103:613-620 ラット肝臓 ＶＧＣＧ Ponci J.E. et al., (1984) アポリポタンパク質 Eur. J．Biochem．140:493 Ａ-I トリプトファン ＶＴＣＧ Brosius, J. et al., (1982) シンテターゼ Gene 17:223-228 ハイランドＪウィルス ＶＴＣＬ Ou J.H. et al., (1982) J. Mol. Biol. 156:719ー730 ヒトｃ-ｍｙｂ ＶＴＣＫ Slamon D.J. et al., (1986) 癌原遺伝子 Science 233:347ー351 アンチスタシン ＫＴＣＰ Ginsberg V. et al., (1990) ＶＨＣＰ J. Biol. Chem. 264:12138- 12140 Ｅｔｐ１００ ＣＥＣＧ Tomly F. et al., (1989) ＡＴＣＧ 5th International Coccisiosis ＲＴＣＧ Conference 469-573 ＥＱＣＧ ヒトデスミン ＶＴＣＨ Li Z. et al., (1989) Gene 78:743ー749 ヒト関連乳腺腫瘍 ＶＰＣＧ May F.E.B. et al., J. Virol. ウィルス 60:743ー749 ヒト癌原遺伝子 ＲＴＣＧ Ouwelanc A.M.W. et al., EMBO ｃ-ｆｅｓ／ｆｐｓ Ｊ． 4:2897-2903 血小板ＧＰＩＩｂ ＶＴＣＲ Bray P.F. et al., (1987) J. Clin. Invest. 80:1812ー1817
本発明は広範囲な生物、予防及び治療分野で用途のある
自然のままのトロンボスポンジンの生物活性と似た活性
を有するか、又は同生物活性を阻害するトロンボスポン
ジン断片及びその同族体を提供する。
【００１４】
【発明の概要】今トロンボスポンジンの特定領域から得
られる１種のペプチド断片又はその合成同族体が広範囲
な用途を有することが発見された。これらペプチドはそ
の接着活性によって、哺乳動物体内での腫瘍細胞転移、
細胞接着及び血小板凝集を修正し、そして阻害できる。
同ペプチドはまた、傷の癒合に、診断剤として、そして
その他関連分野でも有用である。同ペプチドは細胞付着
を促進することができ、そのため最適細胞培養表面作
成、各種補綴材料の誘導、及び周囲組織の結合を促進す
ることができる。医療装置も又そのような基質を使用し
て細胞を体内表面に引き付けることができるし、あるい
は移植の前に目的の型の細胞を特定表面での成長を促進
する様設計できる。本発明のＴＳＰペプチド及び同族体
はトロンボスポンジン-様活性を有することが示されて
いる。
【００１５】それ故、本発明はその一つとして下記式
【００１６】
【化６】Ｒ1-Ｘ1-Ｘ2-Ｃｙｓ-Ｒ2 式中Ｒ1は水素、アミノ、アセチル又は少なくとも１個
のアミノ酸残基を含む保護された又は保護されない末端
アミノ基であるか、又はその脱アミノ型であり、好まし
くはアルギニンであり、Ｘ1及びＸ2は同一か又は異なる
中性／無極性／大型／非環状又は中性／極性／大型／非
環状又は中性／極性／小型アミノ酸残基であり、好まし
くはバリン、トレオニン及びセリンからなる群れから選
ばれる、Ｒ2はヒドロキシル、カルボキシル、又はカル
ボキシアミドを含む少なくとも１個のアミノ酸基を含む
保護された又は保護されない末端カルボキシル基である
か、又はそのアルキルアミド型であり、好ましくはリシ
ン、グリシン又はアルギニンからなる群れから選ばれる
によって同定される、トロンボスポンジン-様活性を有
するポリペプチドを指向したものである。
【００１７】本発明は又、上記ポリペプチド化合物を、
薬学的に受容できる液体、ゲル又は固体担体と共に薬学
的組成物である。同組成物の治療的に効果のある量を投
与すると、動物、特に脊椎動物例えば哺乳動物及び鳥類
に対するトロンボスポンジン-様活性を効果的に強化し
たり、あるいは阻害したりできる。
【００１８】
【詳細な説明】本発明によれば、哺乳動物生体内でトロ
ンボスポンジン活性を阻害するか、それに似た活性を発
揮できるある種のトロンボスポンジン断片及び同族体が
提供される。
【００１９】Ａ．定義 ”トロンボスポンジン-様活性”はここではトロンボス
ポンジンの公知の生物活性に類似している活性として定
義される。これらの活性として、細胞接着促進活性、細
胞分裂促進活性、細胞走化活性、及び止血活性、そして
これらの活性から誘導される全ての活性、例えば腫瘍細
胞、微生物又は寄生虫変態活性、血小板凝集活性、繊維
素溶解活性、及び免疫調節が挙げられる。
【００２０】”抗変態活性”はここでは腫瘍細胞変態を
防ぐか、またはその程度及び大きさを大きく低下させる
か、または一次固体腫瘍の退行を阻害するかまたは引き
起こす能力として定義される。
【００２１】”傷癒合活性”はここでは傷癒合速度を増
加させる、あるいは治癒過程の結果を改善する（即ちお
びえを少なくし、触覚刺激に対する応答を良くする等）
能力として定義される。
【００２２】”血管生成活性”はここでは血管またはリ
ンパ管生成を阻害するかまたは強化する能力として定義
される。
【００２３】”成長因子活性”はここでは細胞増殖を抑
制するか、または促進する能力として定義される。
【００２４】”細胞接着活性”はここでは細胞、好まし
くは動物細胞が基質に付着するのを促進するか、または
阻害する能力として定義される。
【００２５】本発明ポリペプチド化合物アミノ酸残基の
配列、中心テトラペプチド、及びそれらの好ましい実施
態様は特定のサブクラスのある特性を有するアミノ酸と
して定義される。
【００２６】アミノ酸残基は一般に以下の４つの主要サ
ブクラスに分類される。
【００２７】酸性：即ち残基は生理学的ｐＨの下ではＨ
を失ってマイナスに荷電しており、水溶液によって引き
付けられて、ペプチドが水性媒体中にいるときに構成す
るコンホメーション（立体配座）の表面に来る。
【００２８】塩基性：即ち、残基は生理学的ｐＨの下で
はＨと会合してプラスに荷電しており、水溶液によって
引き付けられて、ペプチドが水性媒体中にいるときに構
成するコンホメーションの内部に入って来る。
【００２９】中性／非極性：即ち、残基は生理学的ｐＨ
の下では荷電せず、水溶液によって反発されて、ペプチ
ドが水性媒体中にいるときに構成するコンホメーション
の内部に入って来る。
【００３０】中性／極性：即ち、残基は生理学的ｐＨの
下では荷電せず、水溶液によって引き付けられて、ペプ
チドが水性媒体中にいるときに構成するコンホメーショ
ンの外部に来る。
【００３１】勿論、個々の残基分子が集まっている場合
に統計的にその一部の分子が荷電し、また他の一部がし
ないことがあることは理解されよう。荷電しているとい
うことをより適切に定義すると、個々の分子がかなりの
パーセンテージで（少なくとも約２５％）が生理学的ｐ
Ｈの下で荷電している状態を指す。
【００３２】アミノ酸残基は更に環状であるか、または
非環状であるかによって、残基の側鎖置換基に関して、
そしてそれが大きいかあるいは小さいかなど、自明の分
類法でサブクラスに分類される。残基は、それが合計で
３個又はそれ以下の炭素原子を含んでいるときは小さい
と考えられている。小さな残基は勿論非環状である。上
記方式による分類を、天然に存在するアミノ酸に適用す
ると以下のようになる。
【００３３】酸性：アスパラギン酸及びグルタミン酸； 塩基性／非環状：アルギニン及びリシン； 塩基性／環状：ヒスチジン； 中性／極性／小：グリシン、セリン及びシステイン； 中性／極性／大／非環状：トレオニン、アルパラギン及
びグルタミン； 中性／極性／大／環状：チロシン； 中性／非極性／小：アラニン； 中性／非極性／大／非環状：バリン、イソロイシン、ロ
イシン、及びメチオニン； 中性／非極性／大／環状：フェニルアラニン、及びトリ
プトファン。
【００３４】蛋白アミノ酸プロリンは、中性／非極性／
大／環状の分類に入るが、その効果がペプチド鎖の２次
コンホメーションに関係のあるのであるので、別に分類
されている。
【００３５】ある種の普通に見られる非天然アミノ酸、
例えばデスアミノチロシン(des Tyr)、アグマチン(Ag
m)、ｎ-ホルミルトリプトファン(f-Trp)、α-アミノイ
ソ酪酸(Aib)、及びザルコシン(Sar)、スタチン、オルニ
チン(Orn)、ホモリシン、ホモセリン、ホモアルギニ
ン、ノルロイシン、(Nle)、 ノルバリンもまた本発明の
化合物に含めることができる。デスアミノチロシンはＮ
-末端で取り込まれる。アグマチン及びスタチンはＣ-末
端で取り込まれる。上記定義に従えば、ｎ-ホルミルト
リプトファンは中性／非極性／大／環状、ザルコシンは
中性／非極性／小、α-アミノイソ酪酸は中性／非極性
／非環状、オルニチンは塩基性／非環状、ホモリシンは
塩基性／非環状、ホモセリンは中性／極性／小、 ホモ
アルギニンは塩基性／非環状、ノルロイシンは中性／非
極性／大／非環状そしてノルバリンは中性／非極性／大
／非環状である。
【００３６】本発明のポリペプチド化合物を記載するの
に使用した命名法は、従来の慣習に従ったもので、アミ
ノ基を各アミノ酸の左側に置き、カルボキシル基を右側
に置く。本発明の選択された特定実施態様では、末端ア
ミノ基及びカルボキシル基は特に示さないが、特に断ら
なければ、生理学的ｐＨでペプチドが取ると考えられて
いる形をしているものと理解されたい。アミノ酸構造式
では各残基は一般にアミノ酸慣用名に対応した１文字、
又は３個の文字で表され、以下のようになる。 アミノ酸 ３文字記号 １文字記号 アラニン Ａla Ａ アルギニン Ａrg Ｒ アスパルギン Ａsn Ｎ アスパルギン酸 Ａsp Ｄ システイン Ｃys Ｃ グルタミン Ｇln Ｑ グルタミン酸 Ｇlu Ｅ グリシン Ｇly Ｇ ヒスチジン Ｈis Ｈ イソロイシン Ｉle Ｉ ロイシン Ｌeu Ｌ リシン Ｌys Ｋ メチオニン Ｍet Ｍ フェニルアラニン Ｐhe Ｆ プロリン Ｐro Ｐ セリン Ｓer Ｓ トレオニン Ｔhr Ｔ トリプトファン Ｔrp Ｗ チロシン Ｔyr Ｙ バリン Ｖal Ｖ 本明細書において、特に表現でことわらなければ、例え
ば "[Ｄ-Ｘn]"の記号で示さなければ、光学異性体を有
するアミノ酸残基は全てＬ-型を意味している。
【００３７】本発明の範囲内にある化合物は、開示した
式を色々な方法で修正することにより得ることができ、
その間こうして得られたポリペプチド化合物の活性は維
持される。例えばこれらの化合物のアミノ酸は正常には
天然のＬ光学異性体の形をしているが、１個又はそれ以
上、通常は２個又はそれ以下が、好ましくは１個のアミ
ノ酸が光学的異性体のＤ型で置き換えることができ、又
は同ポリペプチド化合物からなる分子中でＤ,Ｌラセミ
混合体を得ることができる。
【００３８】更に本発明の化合物中に、同活性が維持さ
れる限り、ジスルフィド結合を存在させるか又は無くす
ることができる。当技術分野の熟達者は、分枝状又は環
状鎖が、アミノ又はカルボキシル部分を含むアミノ酸側
鎖基とペプチド結合を形成することにより製造できるこ
とは認識されよう。そのような側鎖基を有するアミノ酸
として、例えばグルタミン酸（カルボキシル基）、アル
パルギン酸(カルボキシル基）、及びリシン(アミノ基）
が挙げられる。分枝鎖及び環状鎖は又硫黄を含む側鎖基
を有するアミノ残基、例えばシステインとの間で共有ジ
スルフィド結合を形成することにより製造できることが
できる。
【００３９】ここで使用されているように、”保護され
ている”末端アミノ基とは、ペプチド合成で伝統的に使
用されて来ている各種アミノ末端保護基のいずれかと結
合した末端アミノ基を指す。適当な基として、例えばホ
ルミル、アセチル、ベンゾイル、トリフルオロアセチ
ル、スクシニル、及びメトキシスクシニル、芳香族ウレ
タン保護基、例えばベンジルオキシカルボニル、及び脂
肪族ウレタン保護基、例えばtert-ブトキシカルボニル
あるいはアダマンチルオキシカルボニルなどが挙げられ
る。Gross及びMienhofer編集、The Peptides, 第３巻、
３ - ８８頁（Academic Press，New York, 1981)には適
当な末端アミノ末端保護基が数多く記載されている。
【００４０】ここで使用されているように、”保護され
ている”カルボキシル基とは、各種カルボキシル末端保
護基のいずれかと結合した末端カルボキシル基を指す。
当技術分野の熟達者にとって既に明らかなように、適当
な基としてはtert-ブチル、ベンジル、又はその他のエ
ステル又はエーテル結合を通じて末端カルボキシル基に
結合する受容可能な基が挙げられる。
【００４１】化合物内に含まれるアミノ酸残基、特にカ
ルボキシ又はアミノ末端にある残基は又、メチル化、ア
ミド化、アセチル化、又はその他の化学基、例えばそれ
らの活性に悪影響を及ぼさずに循環半減期、プロテアー
ゼに対する抵抗性、及び同化合物の溶解性を変えられる
基で置換することにより改質できる。
【００４２】上記定義に加えて、下記の略号を本発明の
記述に当たって使用してきた。
【００４３】 ＢＣＡ ビシンコニン酸 ＢＳＡ ウシ血清アルブミン t-ＢＯＣ t-ブトキシカルボニル Ｂzl ベンジル ℃ 摂氏温度 ＤＣＭ ジクロロメタン ＤＩＥＡ ジイソプロピルエチルアミン ＤＭＥＭ Dulbeccoの最少必須培地 ＤＭＦ ジメチルホルムアミド ＨＦ 弗化水素 ＨＯＢＴ 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール ＨＬＰＣ 高速液体クロマトグラフィ ｍＢＨＡ メチルベンズヒドリルアミン μｇ マイクログラム μｌ マイクロリットル ｍｌ ミリリットル ｍＭ ミリモル ｎｍ ナノメーター ＮＭＰ Ｎ-メチルピロリドン ％ パーセント ＰＡＭ フェニルアセトアミドメチル ＰＢＳ 燐酸緩衝液 ＴＦＡ 三弗化酢酸 Ｂ．好ましい実施態様 本発明のポリペプチド化合物は全て下記式
【００４４】
【化７】Ｒ1-Ｘ1-Ｘ2-Ｃｙｓ-Ｒ2 式中Ｒ1は水素、アミノ、アセチル又は少なくとも１個
のアミノ酸残基を含む保護された又は保護されない末端
アミノ基であるか、又はその脱アミノ型であり、好まし
くはアルギニンであり、Ｘ1及びＸ2は同一か又は異なる
中性／無極性／大型／非環状又は中性／極性／大型／非
環状又は中性／極性／小型アミノ酸残基であり、好まし
くはバリン、トレオニン及びセリンからなる群れから選
ばれる、Ｒ2はヒドロキシル、カルボキシル、又はカル
ボキシアミドを含む少なくとも１個のアミノ酸基を含む
保護された又は保護されない末端カルボキシル基である
か、又はそのアルキルアミド型であり、好ましくはリシ
ン、グリシン又はアルギニンからなる群れから選ばれる
からなる中核トリペプチド配列を含んでいる。
【００４５】特に好ましい実施態様は下記の配列からな
る群れから選択される配列である。 ＶＴＣＧ (配列番号Ｎo. １） ＶＴＣＧ-ＮＨ2 及び ＲＶＴＣＧ-ＮＨ2 本発明の範囲内の化合物は、当技術分野で良く知られて
いる方法、例えば固相ペプチド合成法によって化学的に
合成することができる。同合成は、α-アミノ保護アミ
ノ酸を使用してペプチドのカルボキシル末端から開始す
る。t-ブチルオキシカルボニル(Boc)が全てのアミノ基
に、たとえ他の保護機が適している場合でも、使用する
ことができる。Stewart et al., "固相ペプチド合成"、
W.H. Freeman Co., San Francisco (1969)及びMerrifie
ld, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2159(1963)、Vale et
al., Science 213, 1394-1397(1981)、及びMarke et a
l., J. Am. Chem. Soc. 103, 3178 (1981)を参照された
い。使用できるその他の合成法にはHougtonの方法、Pro
c. Natl. Acad. Sci. 82:5132 (1981)、あるいは特に小
さな分枝状又は環状鎖状ペプチドを従来の液相法に入る
方法で合成するなどが挙げられる。液相法は他の合成法
と共に、"Principle of Peptide Synthesis"M. Bodansk
y 編集（Springer-Verlag 1984)に記載されている。こ
れらの、及びその他のペプチド合成法が、米国特許第3,
862,925号、 第3,842,067号、 第3,972,859号、 第4,105,6
02号、 第4,683,291号、第4,244,946号及び第4,305,872号
にも例示されている。
【００４６】これらの化合物は手動による方法、あるい
は自動的に、例えばApplied Biosystems社430A ペプチ
ド合成器(Foster City, カリホルニア)又はBiosearch
SAM II 自動ペプチド合成器(Biosearch社、 San Rafael,
カリホルニア)を使用し、メーカーの準備したマニュア
ルの指示にしたがって合成することができる。
【００４７】合成したペプチドの純度は９５％以上が好
ましいが、それ以下でも許容できる。環状ペプチドを得
られるのは、２個のシステインアミノ酸が結合している
場合、あるいはアミノ酸残基がジスルフィド結合を含ん
でいる場合で、これはペプチドの希薄水溶液をＫ3[Ｆe
(ＣＮ)6]で酸化して形成することができる。その他の当
技術分野で公知の環化法も利用できる。本発明の安定し
た環状ペプチドは又隣あっていないアミノ酸残基間でペ
プチド結合を形成させても製造することができる。この
ようなペプチド結合形成法はSchiller et al., Int. J.
Peptide Protein Res. (1985) 25:171に示されてい
る。
【００４８】本発明の化合物を合成する過程で、本発明
の開示に従って作られる中間体がそれ自体有用な化合物
であり、従って本発明の範囲に入ることはペプチド合成
分野の通常の熟達者には直ちに理解されよう。
【００４９】もしくは本発明の選ばれた化合物は、よく
知られた方法に従って製造した組み替えＤＮＡの発現に
よって製造することができる。そのような製造法はその
ような化合物を大量に製造する場合に、あるいはその代
替実施態様として望ましい。 Ｃ．投与 本発明の化合物は、健全な動物中でトロンボスポンジン
-様活性を有する。本発明の化合物、及び同化合物を含
む組成物はトロンボスポンジン本来の効果を阻害した
り、それと同様の効果を発揮したりする生理学的効果を
有することが示されており、治療及び予防で多くの用
途、例えば癌の治療、傷の治癒、血栓又は血栓溶解、血
管形成、あるいは細胞付着で使用される。
【００５０】かくして、本発明は又、本発明の化合物を
効果量含むか、その無毒性付加塩、アミド及びエステル
を含む組成物、これらは単独でも良い、を提供し、上に
述べた医療的な恩恵を提供する。このような組成物は
又、生理学的に許容できる液体、ゲル、あるいは固体状
希釈剤、アジュバント(補佐剤)、及び賦形剤と一緒にし
て提供することもできる。
【００５１】これらの化合物及び組成物は獣医学的な用
途で動物に、例えば家畜に、ヒトにおいては臨床的な用
途で、外の治療剤と同ような方法で投与することができ
る。一般に治療的効果に必要な投与量は約１μｇないし
300 μｇ／ｋｇ、より普通には10 μｇないし30 μｇ／
ｋｇ体重である。さもなければこれらの範囲内の投与量
を長時間、通常24時間以上、目的とする医療効果が得ら
れるまで連続的に点滴して投与することができる。
【００５２】一般にはこのような組成物は注射剤として
溶液又は懸濁液の形に、溶液又は懸濁液調製に適した固
体状に調製される。液剤は注射の直前に調製することも
できる。薬剤は乳化することもできる。活性成分は場合
により、生理学的に耐性のある、そして活性成分と相溶
性である希釈剤及び賦形剤と混合することもできる。適
当な希釈剤及び賦形剤は、例えば水、食塩水、デキスト
ロース、グリセリン、その他及びそれらの混合物であ
る。更に希望されれば本組成物は少量の補助物質、例え
ば湿潤剤、乳化剤、安定剤、あるいはｐＨ緩衝剤、その
他を含むことができる。
【００５３】本組成物は従来法により、非経口的に注
射、例えば皮下又は静脈内注射により投与される。更に
その他の投与法に適した配合物には、座薬、鼻腔内エア
ロゾル及び場合によっては経口用配合物が挙げられる。
座薬用の従来の結合剤及び賦形剤には例えばポリアルキ
レングリコールあるいはトリグリセリドが挙げられ、こ
のような座薬は0.5％ないし10％、好ましくは１％ない
し２％の範囲の活性成分を含む混合物から形成すること
ができる。経口用配合物には通常使用される賦形剤、例
えば薬剤グレード（品質等級）のマンニトール、ラクト
ース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナ
トリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、その他を含
んでいる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピ
ル、カプセル、持続放出配合物、又は粉末剤の形を取
り、10％ないし95％、好ましくは25％ないし70％の活性
成分を含んでいる。これらの経口用配合物はペプチドが
吸収されるまで保護するように設計した配合物からな
る。
【００５４】本ペプチド化合物は中性又は塩の形で組成
物中に配合することができる。薬学的に受容できる無毒
性塩としては酸付加塩（遊離アミノ基と形成）が挙げら
れ、無機酸、例えば塩酸、又は燐酸又は有機酸、例えば
酢酸、オキザル酸、酒石酸、マンデル酸その他と形成す
る。遊離カルボキシル基と形成される塩は、無機塩基、
例えば水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カ
ルシウム、又は鉄及び有機塩基、例えばイソプロピルア
ミン、トリメチルアミン、2-エチルアミノエタノール、
ヒスチジン、プロカイン、その他から誘導することがで
きる。
【００５５】本発明のトロンボスポンジン-様活性を示
す化合物のほかに、本発明の化合物はまた、有用な化合
物合成の中間体として使用することもできる。
【００５６】本発明の化合物はそれ自体単独重合させる
ことができ（即ち、(ペプチド)n）るか、あるいは他の
ペプチドと相互に複合重合（即ち(ペプチド１)-(ペプチ
ド２)）できる。同化合物はまた、ジスルフィド又はそ
の他の方法によって環化することができる。同化合物は
また、生物適合性の(biocompatible)高分子化合物、例
えばＢＩＯＴＯＬTMポリマー(W.R. Grace 社、コネチカ
ット)と抱合体(conjugate)を形成することもできる。
【００５７】何かの説に縛られることを望む訳ではない
が、本発明の組成物は天然のトロンボスポンジンに対し
てアゴニスト（作動薬）又はアンタゴニスト(拮抗薬)と
して作用すると信じられている。これらの化合物はま
た、サーカムスポロゾアイト蛋白、トロンボスポンジン
関連の名称のない蛋白質、アンチスタチン、プロペルジ
ン補体蛋白質のアゴニスト又はアンタゴニストとしても
作用する。更に本発明の化合物は、（天然のトロンボス
ポンジンと比較して）形状が小さいので、それらが示す
性質は、他の一般的な接着化合物、例えばＲＧＤ-含有
化合物(その配列は100を超える蛋白質に見られる)及び
フィブロネクチンの作用とは対立するものであるので非
常に特定的なものと言える。本発明のペプチド化合物の
副作用はこれらの広範囲に接着する化合物と比較して大
きく低下している。
【００５８】Ｄ．使用 先に述べたように、本発明の化合物は各種の生物学、予
防学あるは治療学の分野で使用することができる。これ
らの化合物がトロンボスポンジン-様活性が役割を演ず
る病気状態あるは条件を防ぎあるいは治療するのに有用
であることは予期されたことである。これらの病気状態
及び条件は、転移、創傷治癒、血栓状態、血管生成、及
び細胞増殖である。勿論これらに制限されない。本発明
の化合物に対する抗体はまた、治療剤、治療剤、あるい
は他の化合物の担体としても有用である。本化合物はま
た、生物医療機器中でも使用することができる。
【００５９】多くの生体外及び生体内検査がトロンボス
ポンジン-様活性を有する化合物を証明するのに使用す
ることができる。これらの検査には、細胞接着検査、血
小板凝集検査、及び細胞増殖検査が含まれる。ただこれ
だけに制限されるものではない。
【００６０】転移 転移とは、病気が体の一つの場所から、それと関係の無
い場所へ、あたかも悪性腫瘍細胞が血流又はリンパ液に
よって移動するかのように広がる現象である。転移は腫
瘍細胞の内皮への接着、内皮の引っ込み、基底膜のマト
リックス分解、及び腫瘍細胞の血液流への侵入と連続的
に進むメカニズムによって起こると信じられている。こ
の連携をいずれかの段階で遮ることが出来れば、転移性
癌の治療及び予防に役立てることができよう。
【００６１】天然のトロンボスポンジン分子は腫瘍細胞
転移を増強することが示された(Tusuzynski et al., Ca
ncer Research (1987) 47:4130-4133)。トロンボスポン
ジンによる増強作用は、現在のところ充分には理解され
ていない。
【００６２】抗転移活性は同化合物が in vitroでメラ
ノーマ細胞と結合する能力(Tusuzynski et al., Anal.
Bio. (1990) 184:189-191)、及び腫瘍コロニーの大きさ
及び数を減少させる能力(Tusuzynski et al., Cancer R
esearch (1987) 47:4130-4133)として特徴づけられる。
【００６３】本発明の化合物は抗転移剤として有用であ
り、特に抗肺癌転移剤として有用である。これらの化合
物は転移性腫瘍細胞、特にトロンボスポンジンに反応す
る細胞の接着を阻害する。同化合物はまた、腫瘍コロニ
ーの数を減少させ、同時にその大きさを縮小させる。
【００６４】このような抗転移活性が発生するメカニズ
ムは数多くある。同ペプチドが細胞毒性であるか、又は
細胞増殖を抑制する。細胞増殖抑制剤として、同化合物
はその作用として、(１) 細胞分裂を抑制する、(２) 血
管生成を抑制する、(３) 補体経路を及びそれに関連す
るキラー細胞を活性化することができる。
【００６５】本発明の化合物はまた、生物医学機器に用
途を持っている。同化合物は転移性腫瘍細胞接着を促進
する能力を有するので、生物医学機器に同化合物を塗布
し、血液及びリンパ液から循環する腫瘍細胞を除去する
ことが可能である。生物医学機器は又肝癌細胞をつかま
えるのに有用である。
【００６６】本発明の化合物のもう一つの用途は、目的
とする毒素、医薬、ホルモン、又は転移性腫瘍細胞に対
する造影剤の担体として、診断あるいは治療目的で使用
することである。これらの担体は又肝癌細胞とも結合し
よう。
【００６７】創傷治癒 傷が治癒することは傷が塞がる過程であり、炎症、血管
生成、コラーゲンの析出、そして上皮被覆(epitheliali
zation)の４つの必須段階に分けることができる。４段
階全てが傷の治癒でそれぞれ役割を演ずる。
【００６８】創傷治癒活性は、同化合物が血管生成で示
す能力、コラーゲン析出及び in vivo スポンジモデル
中でのＤＮＡ合成を活発化する能力、あるいは 傷の深
さが部分的な、又は実際と同じ深さの in vivo 創傷モ
デルで、同化合物が傷の治癒を改善する、又は治癒時間
を短縮する能力によって確認される。
【００６９】抗血小板凝集 血小板凝集は損傷した組織からの出血を停止させる正常
な、そして有益な過程である。しかし、血小板凝集は下
記の心臓血管治療、例えば、血管生成、血栓分解治療、
又は血管移植で問題を引き起こす。血小板は、α-粒状
血小板分泌蛋白質全体の中で２５％にも及ぶＴＳＰ蛋白
を含んでいる。それゆえ、ＴＳＰ分子中に保持され、血
小板表面にあるレセプターと結合するペンタペプチド配
列を含むペプチドを導入することにより、血小板が凝集
し、そして血餅を形成するのを防ぐことができる。
【００７０】このペンタペプチドを基剤とした薬剤は、
現在市販されている他の血餅溶解剤(例えばｔＰＡ、ス
トレプトキナン）を使用する血管生成、及び血栓溶解剤
溶解治療の補助財として期待される。同補助剤は、出血
を悪化させず、又合成抗血小板薬剤に共通な副作用の危
険は持っていない。更に同ペプチドは（例えば心臓バイ
パス手術で使用される）孔直径の小さい移植血管を開い
たまま保持するのを助けることができる。卒中の危険の
ある患者にも同じように応用出来ると考えられる。
【００７１】抗血小板活性は、(１) 洗浄血小板中での
ＡＤＰ又はトロンビン-誘発血小板凝集の阻止、(２) 血
小板リッチ血漿中でのＡＤＰ-誘発血小板凝集の阻止、
及び(３) in vivo 測定のコラーゲン-誘発血小板凝集の
阻止をはじめとする、多くの検査法によって確認され
る。
【００７２】血管生成 血管生成は血管及びリンパ管の生成である。血管生成
は、発生中、創傷治癒、固形腫瘍の成長に必須である。
血管生成は複雑な過程であり、上皮細胞の出現及び移
動、その増殖及び管状構造への分化、そして管周辺基底
膜マトリッックスの製造を必要とする（Herbert et al.
1988, J. Cell, Biol. 106:1365ー1373)。血管生成は腫
瘍の発生、成長及び転移にも必須である。血管生成を防
止すれば固形腫瘍の成長を抑制できる。本発明の化合物
を使用することにより、血管生成の多段過程の中の１段
又は複数段を阻害することができ、それ故このようなペ
プチドは転移を阻害して臨床的に有用であることができ
る。本発明の化合物は血管生成の転形、特に創傷治癒を
強化するのに有用であり、腫瘍の成長を阻害するか又は
予防する。本発明の化合物は又糖尿病性網膜症、新生血
管性緑内障、関節リウマチの抑制及び予防にも有用であ
る。血管生成の標準検査法は当技術分野ではよく知られ
ている。これらの検査法としては、各種細胞系列を使用
した増殖及び移動の研究、コラーゲナーゼ阻害法、及び
in vivo チキン漿尿膜上での血管新生法(ＣＡＭ検査)
が挙げられる。
【００７３】接着及び細胞付着 本発明のぺプチドは、細胞培養に最適の表面を作成する
ために、そして周辺の組織との結合を促進する補綴材料
用に使用することができる。これらペプチドは細胞付着
蛋白質として、例えば未処理合成プラスチック樹脂、特
に異なる膜利用で使用される材料、例えばニトロセルロ
ース又はポリスルホン、及び同様の材料の疎水性表面を
同ペプチドで処理することにより、細胞付着基質を与え
るのに有用であることができる。同ペプチドの細胞付着
性は又、ポリペプチドを共有結合で固体支持体例えばゲ
ル又は合成樹脂、又は長鎖ポリサッカリドに結合させる
ことにも使用できる。この後者の方法は異なるアフィニ
ティクロマトグラフィ用途のために使用できる。このよ
うなペプチドを用いたもう一つの重要な応用は、市販細
胞付着表面でペプチドを使用することで、それにより、
粒子にゼラチンを塗布し、時計皿中で可能な量よりも遥
かに少ない量の媒体中で、同じ付着細胞の成長を可能に
している。医療装置はこのようなペプチドを使用して細
胞を in vivo表面に付着させるか、又は希望の型の細胞
が、移植前に特定表面上で成長するのを促進するよう設
計することができる。例えば膜への細胞の塊の付着、内
皮細胞の補綴用血管上、又は移植血管上での育成であ
る。このようなペプチドは創傷治癒を助ける移植用パッ
チに塗布するなどの用途がある。
【００７４】抗体 本発明のペプチド化合物を指向した抗体は、モノクロー
ナル及びポリクローナルの両方とも、同ぺプチドが誘導
される主題の蛋白質の単離及び同定で有用であり、本発
明は又このような抗体からなる。抗体を作成するために
当技術分野で公知である多くの技術のいずれをも使用す
ることができる。このような一技術で、ポリクローナル
抗体が、動物、例えばウサギに本発明の化合物１種又は
それ以上を注射することにより合成することができる。
注射後、動物は自然にこれら化合物に対する抗体を生産
する。抗体水準が充分なレベル迄上昇すると、抗体を含
む血液、抗血清と呼ばれる、は動物から取り出され、化
合物に特異的な抗体が抗血清中の他の抗体から、たくさ
んある中の一つの分離法（例えばアフィニティクロマト
グラフィ）によって単離される。モノクローナル抗体は
Kohler 及びMilstein(Nature 256, pp. 495-497 (197
5) の技術を使用して作成できる。
【００７５】本発明の化合物は又標識試薬を用いるイム
ノアッセイ（免疫検定法）で使用する抗血清を製造する
のにも使用することができる。ポリペプチドは、ジアル
デヒド、特に炭素数が４ないし６個で脂肪族であるジア
ルデヒド又はカルボジイミドを使用すると抗原と抱合さ
せるのに便利である。これらの化合物及び免疫試薬は各
種の試薬、例えば発色団、蛍光発色団、例えばフルオレ
セイン又はローダミン、放射性同位元素、例えば
125Ｉ、35Ｓ、14Ｃ、又は3Ｈ、あるいは磁気化した粒子
で、この技術分野で良く知られた方法により標識するこ
とができる。これらの標識化合物及び試薬、又はそれら
を認識し、特定的に結合できる標識試薬は、例えば診断
薬などの用途がある。生物試験片から誘導した試料は、
本発明の化合物と共通の抗原決定基を有する物質の存在
及び量について検定することができる。トロンボスポン
ジンレベルは、転移性乳癌患者及び結腸患者の血清中で
は上昇する(Tuszynski et al., Thrombosis Haemostas
(1989) 62:418、 及びSmith etal., Proceeding America
n Association of Clinical Oncology (1990) 9:6)。本
発明のペプチドに対する抗体は、各種の癌、例えば消化
管（胃、結腸、及び直腸）癌腫瘍、乳癌腫瘍、及び肝癌
腫瘍（これらに制限されない）の診断／予断検定で試薬
として有用である。
【００７６】ポリクローナル及びモノクローナル抗体は
多くの癌治療で治療薬として使用することができる。第
一番に、抗体はトロンボスポンジンを隔絶する(sequest
r)のに使用することができる。二番目に、同抗体は腫瘍
細胞表面に存在するトロンボスポンジンを遮断するのに
使用することができる。三番目に細胞毒性薬剤、ホルモ
ン、又は造影剤を抗体とカップリングさせて癌治療に使
用することができる。四番目に生物医学機器に抗体を塗
布して、血清から過剰のトロンボスポンジンを除去する
か、又はその表面に付着したトロンボスポンジンを有す
る細胞を除去するのに使用することができる。
【００７７】本発明のペプチドは又細胞抽出物、又は細
胞膜からトロンボスポンジン細胞表面レセプターを単離
するのに使用することができる。標準的にはアフィニテ
ィクロマトグラフィを使用することができる。トロンボ
スポンジン細胞表面レセプターはトロンボスポンジン同
族体をより良く発達させるために、又は過剰のトロンボ
スポンジンを血清から除去するために使用することがで
きる。
【００７８】以下、実施例によって本発明を説明する。
これらは本発明を何等制限しない。
【００７９】
【実施例】本発明のペプチドは従来のペプチド合成法に
よって合成することができる。従来法として好ましくは
Int. J. Pept. Proc. Res. 21, 57-63 (1983) に記載
されている工程を使用する。Merrifiedの固相合成法も
好ましい (J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963);
Science 150, 178-185 (1965); Ibid. 232, 341-347(19
86))。 固相法でＣ-末端カルボキシアミドを有するペプ
チドを合成するときは、一般に保護したα-アミノ酸を
適当な樹脂、例えばフェニルアセトアミドメチル(ＰＡ
Ｍ)ポリスチレン樹脂、又はp-メチルベンズヒドリルア
ミン(ｍＢＨＡ)樹脂にカップリングさせて、ペプチドの
Ｃ-末端から開始する。合成の際必要に応じて適当なア
ミノ酸側鎖保護基を使用する。かくしてアルパルギン酸
はベンジルエステルによって β-カルボキシル基上で保
護され、アルギニンはトシル基によってグアニジノ基上
で保護される。目的のペプチドを合成してからペプチド
を樹脂から外し、保護基を除くために試薬、例えば弗化
水素(ＨＦ)で処理する。得られたペプチドは次いで高速
クロマトグラフィ(ＨＰＬＣ)又は同様なペプチド精製法
によって精製することができる。固相法ペプチド合成法
の確立された操作法の背景となっている情報は Stewart
及びYoung著、"Solid Phase Peptide Synthesis" (固相
ペプチド合成法) (W.H. Freeman社、サンフランシス
コ）1969 発行でみることができる。
【００８０】上記記載に従って、以下に示す操作が新規
な合成ペプチドの化学合成で使用された。
【００８１】
【実施例１】 Ｃ-末端アミドを有するペプチド配列Ｖ
ＴＣＧ(配列ＩＤ Ｎo. １)の合成 Ｃ-末端アミド用4-メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢ
ＨＡ）の適当な樹脂をポリプロピレン製の網目パケット
(一種の小さな容器）（孔径：64 μ)内に封入した。パ
ケット全てを塩化メチレンの入っている共通の容器に入
れ、激しく撹拌して樹脂を洗浄し、膨潤させた。続く段
階は全て、激しく撹拌して充分な量の溶媒を確実に移行
させた。次いでＮ-α-ブトキシカルボニルを５５％濃度
の三弗化酢酸／塩化メチレン溶液を使用して酸分解を３
０分間実施して除き、アミノ酸基を三弗化酢酸塩の形で
残す。パケットを塩化メチレン（２回）、イソプロパノ
ール（２回）、更に塩化メチレン（２回）で洗浄して過
剰の三弗化酢酸を除去し、中性にする。三弗化酢酸塩は
パケットを５％ジイソプロピルエチルアミンの塩化メチ
レン溶液で、３回、それぞれ２分間洗浄して中和した。
続いて塩化メチレンで２回洗浄して過剰の塩基を除去し
た。パケットは共通容器から取り出し、中和に先立って
コンピュータによる情報から準備調整したそれぞれ0.2
Ｍのアミノ酸溶液に加えた。同じ量の0.2 Ｍジプロピル
カルボジイミドを添加してカップリング反応を活性化し
た。室温で１時間カップリングさせてから、パケットを
ジメチルホルムアミド及び塩化メチレンで洗浄し、共通
容器に戻した。この操作を各アミノ酸毎に繰り返した。
得られたペプチドを、92.5％弗化水素／7.5％アニソー
ルと、-１０℃ないし０℃で90分間以上反応させ、開裂
反応を行った。アニソールは側鎖保護基除去の結果生ず
るカルボカチオンと反応するスカベンジャーとして使用
した。この溶液をＮ2を強く流し、次いでアスピレータ
ー真空で除去し、その間温度は０℃に維持した。残った
アニソールはエチルエーテルで２回洗浄して除いた。得
られたペプチドは10％酢酸で抽出した。
【００８２】粗ペプチドの純度は、Vydac C-18カラムを
装備したBeckman SystemGoldを使用した分析用 RP-HPLC
により、流速１ml/minでチェックした。使用した溶媒
系は、0.05％三弗化酢酸水溶液(Ａ)と0.05％三弗化酢酸
のアセトニトリル溶液(Ｂ)とを、30分間５ - 65％Ｂの
濃度勾配で使用し、215μｍ波長で吸収を測定した。精
製は、Waters社製Pak Nodule Radial Compression C18
カラム（24cm x 5 cm、 10 - 20 μ)を装備したWaters d
elta社製、3,000 分離用 HPLCによって実施した。溶媒
系は0.05％三弗化酢酸水溶液(Ａ)と0.05％三弗化酢酸ア
セトニトリル溶液であった。各種の直線的な濃度勾配を
用いて波長230ｎｍで吸収を測定し、40ｍｌの画分を回
収した。各画分はBeckman 分析系で分析した。目的の画
分は一緒にし、凍結乾燥した。最終の乾燥製品はもう一
度分析用RP-HPLCを使用して分析した。
【００８３】
【実施例２】 ペプチド配列ＶＴＣＧ（配列ＩＤＮｏ．
１）酸の化学合成 Ｃ-末端酸用フェニルアセトアミドメチル（ＰＡＭ）の
適当な樹脂をポリプロピレン製の網目パケット(一種の
小さな容器）（孔径：64 μ)内に封入した。パケット全
てを塩化メチレンの入っている共通の容器に入れ、激し
く撹拌して樹脂を洗浄し、膨潤させた。続く段階は全
て、激しく撹拌して充分な量の溶媒を確実に移行させ
た。次いでＮ-α-ブトキシカルボニルを５５％濃度の三
弗化酢酸／塩化メチレン溶液を使用して酸分解を３０分
間実施して除き、アミノ酸基を三弗化酢酸塩の形で残
す。パケットを塩化メチレン（２回）、イソプロパノー
ル（２回）、更に塩化メチレン（２回）で洗浄して過剰
の三弗化酢酸を除去し、中性にする。三弗化酢酸塩はパ
ケットを５％ジイソプロピルエチルアミンの塩化メチレ
ン溶液で、３回、それぞれ２分間づつ洗浄して中和し
た。続いて塩化メチレンで２回洗浄して過剰の塩基を除
去した。パケットは共通容器から取り出し、中和に先立
ってコンピュータによる情報から準備調整したそれぞれ
0.2Ｍのアミノ酸溶液に加えた。同じ量の0.2 Ｍジイソ
プロピルカルボジイミドを添加してカップリング反応を
活性化した。室温で１時間カップリングさせてから、パ
ケットをジメチルホルムアミド及び塩化メチレンで洗浄
し、共通容器に戻した。この操作を各アミノ酸毎に繰り
返した。得られたペプチドを、91.5％弗化水素／7.5％
アニソールと、-１０℃ないし０℃で90分間以上反応さ
せ、開裂反応を行った。アニソールは側鎖保護基除去の
結果生ずるカルボカチオンと反応するスカベンジャーと
して使用した。この溶液をＮ2を強く流し、次いでアス
ピレーター真空で除去し、その間温度は０℃に維持し
た。残ったアニソールはエチルエーテルで２回洗浄して
除いた。得られたペプチドは10％酢酸で抽出した。
【００８４】粗ペプチドの純度は、Vydac C-18カラムを
装備したBeckman SystemGoldを使用した分析用 RP-HPLC
により、流速１ml/minでチェックした。使用した溶媒
系は、0.05％三弗化酢酸水溶液(Ａ)と0.05％三弗化酢酸
のアセトニトリル溶液(Ｂ)とを、30分間５ - 65％Ｂの
濃度勾配で使用し、215μｍ波長で吸収を測定した。精
製は、Waters社製Pak Nodule Radial Compression C18
カラム（24cm x 5 cm、 10 - 20 μ)を装備したWaters d
elta社製、3,000 分離用 HPLCによって実施した。溶媒
系は0.05％三弗化酢酸水溶液(Ａ)と0.05％三弗化酢酸ア
セトニトリル溶液であった。各種の直線的な濃度勾配を
用いて波長230ｎｍで吸収を測定し、40ｍｌの画分を回
収した。各画分はBeckman 分析系で分析した。目的の画
分は一緒にし、凍結乾燥した。最終の乾燥製品はもう一
度分析用RP-HPLCを使用して分析した。このペプチド
の、精製後の典型的な HPLC クラマトグラフィの図を図
２に示した。
【００８５】
【実施例３】 その他のペプチドの化学合成 実施例１及び２の方法、更にInt. J. Pept. Proc. Res.
21, 57-65 (1983)の方法を適当に改良した方法に従っ
て、下記のペプチドを合成した。本発明の全てのペプチ
ドは標準ＬＡＬ検査法を使用してその内部毒について試
験を行い、内部毒はないことが判った。
【００８６】ＲＶＴＣＧ-ＮＨ2 (配列ＩＤＮｏ．２）
【００８７】
【実施例４】 各種細胞のＴＳＰ及びペプチドへの接着 この実施例では一連のペプチドを試験して、ペプチドの
種々細胞への結合能力をトロンボスポンジンと比較し
た。この検査で使用した細胞はＢ16Ｆ10メラノーマ細
胞、ヒト肺癌腫瘍細胞、ウシ内皮細胞、及びウサギ平滑
筋細胞である。トロンボスポンジンは転移ではその接着
性によって作用すると信じられている。検査法は一般に
Tuszynski et al., (Anal. Bio. (1990) 184:189-91)
が、細胞の本発明のトロンボスポンジン断片又はその同
族体に接着する能力を評価するのに示した方法に従って
開発されたものである。この検査法では、(Tuszynski e
t al., J. Biol. Chem. (1985) 260:12240-5 によって
精製されたトロンボスポンジンを正の調節として使用
し、かき集めたペプチドＶＣＴＧＳＣ、ＡＮＫＫＨＹ
Ｆ、及びＴＣＶＣＧＳを負の調節として使用した。本発
明のトロンボスポンジン同族体は実施例１ないし３に記
載してあるように合成した。２μｇのペプチド又は対照
蛋白質を96個のウェルを持ったミクロタイタープレート
のウェルで一晩風乾した。ウェルはHEPES-緩衝溶液で洗
浄し、１％濃度脂肪酸フリーＢＳＡのHEPES-緩衝液溶液
でブロックした。
【００８８】各種細胞を成育させ、対数相成長期間中に
標準法で収穫した。収穫した細胞は血清を含まないDulb
eccoの最小必須培地(ＤＭＥＭ)(Flow Laboratoriesから
入手）で２回洗浄、５ｍＭのグルコースと100 μＭの塩
化マグネシウムを含む HEPES緩衝液に懸濁し、最終濃度
を２ x 105細胞／ｍｌにした。各種配位子を含むマイク
ロタイタープレートのウェル毎に200,000個の細胞を懸
濁させ、同プレートをＣＯ2インキュベーター中37℃で3
0分間培養した。非付着性細胞は吸引して取り除き、ウ
ェルは2,000 μｌのＰＢＳで３回洗浄した。細胞会合性
蛋白質の合計量を、付着している細胞を 200 μｌのPie
rce BCA 処理溶液で直接溶かし込んで測定した(Pierce
Chem. 社の冊子： Booklet No. 23225(1987))。マイク
ロタイタープレートは接着性 myler シート（ポリエス
テルシートの１種）カバーし、60℃で30分間培養した。
プレートは室温に冷却し、カバーしたシートを除き、ウ
ェル個々の吸収を波長562ｎｍでマイクロタイタープレ
ートリーダーを使用して測定した(Biotek社、 Burlingto
n, バーモント州）。吸収は経験的に決めた変換因子を
用いて付着細胞の数に変換した。
【００８９】結果を図１ないし４に示す。それによる
と、本発明のペプチドは種種の細胞系列で接着性を示す
ことが判る。
【００９０】
【実施例５】 ペプチドのＢ16Ｆ10肺癌腫瘍細胞転移へ
の効果 本発明のペプチド化合物の抗転移活性を証明するのに使
用された in vivoモデルはTuszynski et al., (Cancer
Res. (1987) 47:4130-4133)によって記載されている。
簡単に言うと、Ｃ57ブラックマウスに、制御緩衝液(Hep
es 緩衝塩溶液、 ｐＨ 7.4) 又は本発明の指示したペプ
チド化合物１ｍｇのどちらかの存在下に、１ x105個の
Ｂ16Ｆ10マウスメラノーマ細胞を注射した。各化合物に
対して５又は６匹の動物を使用した。検査で試験したペ
プチドはトリパンブルー色素排除試験法で測定したとこ
ろ、細胞生存率に対して効果を示さなかった。更に１ｍ
ｇ／ｍｌでペプチドは24時間共同培養しても細胞を成長
させなかった。14日後、マウスを屠殺して、肺癌腫瘍の
数を数えた。
【００９１】図５に示した結果は、本発明のペプチドが
抗転移活性を有していることを示している。バーグラフ
は処置グループで観察された肺癌腫瘍の平均数を示し、
エラーバーは平均標準偏差を表している。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は本発明のペプチドがＢ16Ｆ10メラノーマ
細胞の接着を阻止する能力を示している。
【図２】図２は本発明のペプチドがヒト肺癌腫瘍細胞の
接着を阻止する能力を示している。
【図３】図３は本発明のペプチドがウシ内皮細胞の接着
阻止能力を示している。
【図４】図４は本発明のペプチドがラビット平滑筋細胞
接着阻止能力を示している。
【図５】図５は本発明のペプチドが in vivo 抗転移活
性を有していることを実証している。
【表２】配列表 (1) 一般情報 （i）出願人：Eyal, Jacob Hamilton, Bruce King Tuszynski, George Paul （ii）発明の名称：トロンボスポンジン-様活性を有す
るペプチド、及びその治療学的使用 （iii）配列の数：２ （iv）通信宛て先： (Ａ) 宛て先：W. R. Grace & Co. -Conn.(コネチカット
州） (Ｂ) 通り：7379 ルート32 (Ｃ）市：Columbia (Ｄ）州：Maryland (Ｅ）国：米国 (Ｆ）ＺＩＰ（郵便番号）：21044 (v）コンピュータ可読形式： (Ａ）媒体：フロッピーディスク (Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ ＰＣコンパチブル (Ｃ）オペレイティングシステム：ＰＣ-ＤＯＳ／ＭＳ-
ＤＯＳ (Ｄ）ソフトウエア：Ｗｏｒｄ Ｐｅｒｆｅｃｔ 5.0 (vi）現出願データ： (Ａ）出願番号： (Ｂ）出願日： (Ｄ）分類：530 （vii）弁理士／代理人情報： (Ａ）名前：Appleby, Vanessa L. (Ｂ）登録番号：33223 (Ｃ）参照／審理予定番号：01-7847 (viii）通信情報： (Ａ）電話：(301) 531ー4515 (２) 配列(SEQ) ID No.１： (i）配列特性： (Ａ）長さ：４個のアミノ酸 (Ｂ）型：アミノ酸 (Ｃ）トポロジー：線状 (ii）分子の型：ペプチド (xi）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．：１ (３) 配列(SEQ) ID No.１： (i）配列特性： (Ａ）長さ：５個のアミノ酸 (Ｂ）型：アミノ酸 (Ｃ）トポロジー：線状 (ii）分子の型：ペプチド (xi）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．：２
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｅ 8413−4Ｃ Ｃ０７Ｋ 5/10 8018−4Ｈ 7/06 ＺＮＡ Ｚ 8318−4Ｈ (71)出願人 591048335 ザ・メデイカル・カレツジ・オブ・ペンシ ルベニア ＴＨＥ ＭＥＤＩＣＡＬ ＣＯＬＬＥＧＥ ＯＦ ＰＥＮＮＳＹＬＶＡＮＩＡ アメリカ合衆国ペンシルベニア州19129フ イラデルフイア・ヘンリイアベニュー3300 (72)発明者 ヤコブ・イーヤル アメリカ合衆国メリーランド州21209ボル チモア・オータムフロストレイン1803 (72)発明者 ブルース・キング・ハミルトン アメリカ合衆国メリーランド州20904シル バースプリング・ウオーターゲイトロード 15229 (72)発明者 ジヨージ・ポール・タスツインスキー アメリカ合衆国ニユージヤージイ州08094 ウイリアムズタウン・ソローレイン824

Claims (31)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 下記式 【化１】Ｒ1-Ｘ1-Ｘ2-Ｃｙｓ-Ｒ2 式中Ｒ1は水素、アミノ、アセチル又は少なくとも１個
    のアミノ酸残基を含む保護された又は保護されない末端
    アミノ基であるか、又はその脱アミノ型であり、好まし
    くはアルギニンであり、Ｘ1及びＸ2は同一か又は異なる
    中性／無極性／大型／非環状又は中性／極性／大型／非
    環状又は中性／極性／小型アミノ酸残基であり、好まし
    くはバリン、トレオニン及びセリンからなる群れから選
    ばれる、Ｒ2はヒドロキシル、カルボキシル、又はカル
    ボキシアミドを含む少なくとも１個のアミノ酸基を含む
    保護された又は保護されない末端カルボキシル基である
    か、又はそのアルキルアミド型であり、好ましくはリシ
    ン、グリシン又はアルギニンからなる群れから選ばれる
    からなるポリペプチドの効果量を投与することを特徴と
    するトロンボスポンジン-様活性の促進又は阻害法。
  2. 【請求項２】 上記請求項１の方法において、該ポリペ
    プチド化合物が、 ＶＴＣＧ [ＳＥＱ ＩＤ（アミノ酸配列登録番号）No.
    １] ＶＴＣＧ-ＮＨ2 ＲＶＴＣＧ-ＮＨ2 （ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２） からなる群れから選択されることを特徴とするトロンボ
    スポンジン-様活性の促進又は阻害法。
  3. 【請求項３】 請求項１において、該方法が腫瘍治療に
    有用であることを特徴とするトロンボスポンジン-様活
    性の促進又は阻害法。
  4. 【請求項４】 請求項３において、該方法が腫瘍細胞の
    転移を阻害することを特徴とするトロンボスポンジン-
    様活性の促進又は阻害法。
  5. 【請求項５】 請求項３において、該方法が腫瘍の成長
    を阻害することを特徴とするトロンボスポンジン-様活
    性の促進又は阻害法。
  6. 【請求項６】 請求項３において該方法が腫瘍の大きさ
    を小さくすることを特徴とするトロンボスポンジン-様
    活性の促進又は阻害法。
  7. 【請求項７】 請求項３において該方法が腫瘍コロニー
    の数を減少させることを特徴とするトロンボスポンジン
    -様活性の促進又は阻害法。
  8. 【請求項８】 請求項３において該方法が腫瘍細胞の付
    着を阻害することを特徴とするトロンボスポンジン-様
    活性の促進又は阻害法。
  9. 【請求項９】 請求項１において該方法が細胞付着を促
    進するか又は促進することを特徴とするトロンボスポン
    ジン-様活性の促進又は阻害法。
  10. 【請求項１０】 請求項１において該方法が走化性を促
    進するか又は阻害することを特徴とするトロンボスポン
    ジン-様活性の促進又は阻害法。
  11. 【請求項１１】 請求項１において該方法が血流停止を
    促進するか又は阻害することを特徴とするトロンボスポ
    ンジン-様活性の促進又は阻害法。
  12. 【請求項１２】 請求項１において該方法が血小板凝集
    を阻害することを特徴とするトロンボスポンジン-様活
    性の促進又は阻害法。
  13. 【請求項１３】 請求項１において該方法が傷の治癒を
    促進するのに有用であることを特徴とするトロンボスポ
    ンジン-様活性の促進又は阻害法。
  14. 【請求項１４】 請求項１３において該方法が細胞分裂
    (mitogenesis)を促進するか又は阻害することを特徴と
    するトロンボスポンジン-様活性の促進又は阻害法。
  15. 【請求項１５】 請求項１３において該方法が血管形成
    を促進するか又は阻害することを特徴とするトロンボス
    ポンジン-様活性の促進又は阻害法。
  16. 【請求項１６】 請求項１において該方法が基質のコラ
    ーゲンへの結合を阻害することを特徴とするトロンボス
    ポンジン-様活性の促進又は阻害法。
  17. 【請求項１７】 請求項１において該ポリペプチド化合
    物を単独重合させるか、複数重合させるか、複合化する
    か、又は環化させることを特徴とするトロンボスポンジ
    ン-様活性の促進又は阻害法。
  18. 【請求項１８】 請求項１において該ポリペプチド化合
    物を、投与の前に少なくとも１種の薬学的に受容できる
    担体と混合することを特徴とするトロンボスポンジン-
    様活性の促進又は阻害法。
  19. 【請求項１９】 下記式 【化２】Ｒ1-Ｘ1-Ｘ2-Ｃｙｓ-Ｒ2 式中Ｒ1は水素、アミノ、アセチル又は少なくとも１個
    のアミノ酸残基を含む保護された又は保護されない末端
    アミノ基であるか、又はその脱アミノ型であり、好まし
    くはアルギニンであり、Ｘ1及びＸ2は同一か又は異なる
    中性／無極性／大型／非環状又は中性／極性／大型／非
    環状又は中性／極性／小型アミノ酸残基であり、好まし
    くはバリン、トレオニン及びセリンからなる群れから選
    ばれる、Ｒ2はヒドロキシル、カルボキシル、又はカル
    ボキシアミドを含む少なくとも１個のアミノ酸基を含む
    保護された又は保護されない末端カルボキシル基である
    か、又はそのアルキルアミド型であり、好ましくはリシ
    ン、グリシン又はアルギニンからなる群れから選ばれる
    からなるポリペプチドの効果量と薬学的に受容できる担
    体とからなることを特徴とするトロンボスポンジン-様
    活性を促進するか又は阻害するのに有用である組成物。
  20. 【請求項２０】 下記式 【化３】Ｒ1-Ｘ1-Ｘ2-Ｃｙｓ-Ｒ2 式中Ｒ1は水素、アミノ、アセチル又は少なくとも１個
    のアミノ酸残基を含む保護された又は保護されない末端
    アミノ基であるか、又はその脱アミノ型であり、好まし
    くはアルギニンであり、Ｘ1及びＸ2は同一か又は異なる
    中性／無極性／大型／非環状又は中性／極性／大型／非
    環状又は中性／極性／小型アミノ酸残基であり、好まし
    くはバリン、トレオニン及びセリンからなる群れから選
    ばれる、Ｒ2はヒドロキシル、カルボキシル、又はカル
    ボキシアミドを含む少なくとも１個のアミノ酸基を含む
    保護された又は保護されない末端カルボキシル基である
    か、又はそのアルキルアミド型であり、好ましくはリシ
    ン、グリシン又はアルギニンからなる群れから選ばれる
    からなる免疫反応性ポリペプチドを認識し、そして特定
    的に同ポリペプチドに結合できることを特徴とする抗血
    清及び抗体。
  21. 【請求項２１】 診断に有用であることを特徴とする請
    求項２０記載の抗血清及び抗体。
  22. 【請求項２２】 癌を診断するのに有用であることを特
    徴とする請求項２０記載の抗血清及び抗体。
  23. 【請求項２３】 治療薬として有用であることを特徴と
    する請求項２０記載の抗血清及び抗体。
  24. 【請求項２４】 癌腫瘍の転移を治療するのに有用であ
    ることを特徴とする請求項２３記載の抗血清又は抗体。
  25. 【請求項２５】 循環体液からＴＳＰを効果的に除去す
    ることを特徴とする請求項２０記載の抗血清及び抗体。
  26. 【請求項２６】 担体として作用することを特徴とする
    請求項２０記載の抗血清及び抗体。
  27. 【請求項２７】 毒素、薬物、ホルモン、又は造影剤を
    運搬することを特徴とする請求項２６記載の抗血清及び
    抗体。
  28. 【請求項２８】 請求項２０記載の抗血清及び抗体から
    なることを特徴とする診断又は治療の目的で腫瘍細胞へ
    の化合物の放出を容易にする方法。
  29. 【請求項２９】 下記式 【化４】Ｒ1-Ｘ1-Ｘ2-Ｃｙｓ-Ｒ2 式中Ｒ1は水素、アミノ、アセチル又は少なくとも１個
    のアミノ酸残基を含む保護された又は保護されない末端
    アミノ基であるか、又はその脱アミノ型であり、好まし
    くはアルギニンであり、Ｘ1及びＸ2は同一か又は異なる
    中性／無極性／大型／非環状又は中性／極性／大型／非
    環状又は中性／極性／小型アミノ酸残基であり、好まし
    くはバリン、トレオニン及びセリンからなる群れから選
    ばれる、Ｒ2はヒドロキシル、カルボキシル、又はカル
    ボキシアミドを含む少なくとも１個のアミノ酸基を含む
    保護された又は保護されない末端カルボキシル基である
    か、又はそのアルキルアミド型であり、好ましくはリシ
    ン、グリシン又はアルギニンからなる群れから選ばれる
    からなるポリペプチド化合物からなることを特徴とする
    診断又は治療の目的で腫瘍細胞への化合物の放出を容易
    にする方法。
  30. 【請求項３０】 下記式 【化５】Ｒ1-Ｘ1-Ｘ2-Ｃｙｓ-Ｒ2 式中Ｒ1は水素、アミノ、アセチル又は少なくとも１個
    のアミノ酸残基を含む保護された又は保護されない末端
    アミノ基であるか、又はその脱アミノ型であり、好まし
    くはアルギニンであり、Ｘ1及びＸ2は同一か又は異なる
    中性／無極性／大型／非環状又は中性／極性／大型／非
    環状又は中性／極性／小型アミノ酸残基であり、好まし
    くはバリン、トレオニン及びセリンからなる群れから選
    ばれる、Ｒ2はヒドロキシル、カルボキシル、又はカル
    ボキシアミドを含む少なくとも１個のアミノ酸基を含む
    保護された又は保護されない末端カルボキシル基である
    か、又はそのアルキルアミド型であり、好ましくはリシ
    ン、グリシン又はアルギニンからなる群れから選ばれる
    からなるポリペプチド化合物を含むことを特徴とする腫
    瘍細胞の付着を促進するための生物医学装置。
  31. 【請求項３１】 請求項２０記載の抗血清及び抗体を含
    むことを特徴とするトロンボスポンジン除去の担体とし
    てための生物医学装置。
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