JPH05176658A - 哺乳動物胚のガラス化低温保存液 - Google Patents
哺乳動物胚のガラス化低温保存液Info
- Publication number
- JPH05176658A JPH05176658A JP35675291A JP35675291A JPH05176658A JP H05176658 A JPH05176658 A JP H05176658A JP 35675291 A JP35675291 A JP 35675291A JP 35675291 A JP35675291 A JP 35675291A JP H05176658 A JPH05176658 A JP H05176658A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- solution
- vitrification
- embryo
- embryos
- vsi
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 title claims abstract description 38
- 238000004017 vitrification Methods 0.000 claims abstract description 53
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 51
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 51
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 34
- 239000003761 preservation solution Substances 0.000 claims abstract description 7
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 claims description 34
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 29
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 abstract description 14
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 abstract description 6
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 abstract 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 abstract 1
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 25
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 24
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 description 14
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 12
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 8
- 210000000472 morula Anatomy 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 6
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 6
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 6
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 5
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 5
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 5
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 4
- 230000012173 estrus Effects 0.000 description 4
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 4
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 4
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000009027 insemination Effects 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N Acetamide Chemical compound CC(N)=O DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 2
- 240000000249 Morus alba Species 0.000 description 2
- 235000008708 Morus alba Nutrition 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 2
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 2
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 238000003325 tomography Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 239000005662 Paraffin oil Substances 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- DVKFVGVMPLXLKC-PUGXJXRHSA-N [(2s,3r,4s,5s,6r)-2-[(2s,3s,4s,5r)-3,4-dihydroxy-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl] dihydrogen phosphate Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@]1(CO)[C@@]1(OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DVKFVGVMPLXLKC-PUGXJXRHSA-N 0.000 description 1
- 239000007798 antifreeze agent Substances 0.000 description 1
- 210000004952 blastocoel Anatomy 0.000 description 1
- 210000001172 blastoderm Anatomy 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 1
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 エチレングリコール、ジメチルスルフォキシ
ド及びさらに必要に応じて血清アルブミン及び／または
培養液を混合溶解してなる哺乳動物胚のガラス化低温保
存液。 【効果】 ガラス化の前処理工程における平衡時間を短
縮し、ガラス化低温保存液の胚に対する毒性を低減する
ことができる。また、どのような発育ステージの胚でも
その活性を維持した状態でガラス化することができる。
ド及びさらに必要に応じて血清アルブミン及び／または
培養液を混合溶解してなる哺乳動物胚のガラス化低温保
存液。 【効果】 ガラス化の前処理工程における平衡時間を短
縮し、ガラス化低温保存液の胚に対する毒性を低減する
ことができる。また、どのような発育ステージの胚でも
その活性を維持した状態でガラス化することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ウシ等の哺乳動物胚を
低温保存することのできるガラス化低温保存液に関す
る。
低温保存することのできるガラス化低温保存液に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】従来、高濃度に耐凍剤を含む溶液を直接
液体窒素中あるいは液体窒素ガス中に投入すると、溶液
が氷晶化せずにガラス化と呼ばれる状態を形成すること
が知られている。ガラス化は本質的に結晶を形成せずに
溶液が固体化することであり、いろいろな方法でその存
在が確かめられている。Rall and Fahy 〔Nature 313,5
73-575 (1985)〕は、ジメチルスルフォキシド、プロピ
レングリコール、ポリエチレングリコールおよびアセト
アミドで構成されたガラス化溶液(VS1) を用い、世界で
初めてマウス胚の低温保存に成功した。その後、胚のガ
ラス化低温保存について研究が行なわれているが、胚の
ガラス化低温保存に有効な溶液は、グリセロールとプロ
ピレングリコールの混合液〔Scheffen et al. Cryo-Let
ters ７,260-269 (1986)〕、グリセロールあるいはプ
ロピレングリコールとポリエチレングリコールの混合液
〔Rall, Cryobiology 24, 387-402 (1987)〕、エチレン
グリコール、フィコールおよびシュクロースの混合液
〔Kasai et al. Byodynamica 10, 321-331 (1990)〕等
数種類報告されているに過ぎない。
液体窒素中あるいは液体窒素ガス中に投入すると、溶液
が氷晶化せずにガラス化と呼ばれる状態を形成すること
が知られている。ガラス化は本質的に結晶を形成せずに
溶液が固体化することであり、いろいろな方法でその存
在が確かめられている。Rall and Fahy 〔Nature 313,5
73-575 (1985)〕は、ジメチルスルフォキシド、プロピ
レングリコール、ポリエチレングリコールおよびアセト
アミドで構成されたガラス化溶液(VS1) を用い、世界で
初めてマウス胚の低温保存に成功した。その後、胚のガ
ラス化低温保存について研究が行なわれているが、胚の
ガラス化低温保存に有効な溶液は、グリセロールとプロ
ピレングリコールの混合液〔Scheffen et al. Cryo-Let
ters ７,260-269 (1986)〕、グリセロールあるいはプ
ロピレングリコールとポリエチレングリコールの混合液
〔Rall, Cryobiology 24, 387-402 (1987)〕、エチレン
グリコール、フィコールおよびシュクロースの混合液
〔Kasai et al. Byodynamica 10, 321-331 (1990)〕等
数種類報告されているに過ぎない。
【０００３】ガラス化による低温保存は、氷晶が形成さ
れないために細胞内氷晶形成による細胞障害、および冷
却過程で溶液が浸透圧上昇することによる細胞障害 (溶
液効果) を防ぐことができる。さらに、ガラス化溶液に
浸漬された胚を直接液体窒素あるいは液体窒素ガスに投
入するため、冷却に必要な時間が短く、適切な冷却速
度、融解速度を気にしなくてよく、高価な凍結器を必要
としない利点がある。
れないために細胞内氷晶形成による細胞障害、および冷
却過程で溶液が浸透圧上昇することによる細胞障害 (溶
液効果) を防ぐことができる。さらに、ガラス化溶液に
浸漬された胚を直接液体窒素あるいは液体窒素ガスに投
入するため、冷却に必要な時間が短く、適切な冷却速
度、融解速度を気にしなくてよく、高価な凍結器を必要
としない利点がある。
【０００４】しかし、ガラス化溶液は、細胞毒性を有す
る透過型耐凍剤を高濃度に含むために、胚に対して強い
毒性作用を示すことが報告されている〔Rall et al. Na
ture313, 573-575 (1985), Rall, Cryobiology 24, 387
-402 (1987), Scheffen etal. Cryo-Letters 7, 260-26
9 (1986), Massip et al. Cryo-Letters 7, 270-273 (1
986)〕。Rall et al. (1985)やMassip et al. (1986)
は、この毒性作用を低めるために、胚のガラス化溶液へ
の浸漬を４℃の低温下で行う必要があることを報告して
いる。あるいは、ガラス化溶液へシュクロースのような
非透過型耐凍剤(Kasai et al. 1989) 、ポリエチレング
リコールのような高分子物質 (Rall etal. 1985; Rall,
1987; Ficoll; Kasai et al. 1989)の添加が毒性を低
めるという報告もされている。また、桑実胚より発育の
進んだ胚盤胞を用いてガラス化低温保存すると、ガラス
化後の生存率は桑実胚に比べて低いことが、マウス胚
〔Scheffen et al. 1986, Kono et al. Jpn. J. Anim.
Reprod. 33, 77-81 (1987),Bielanski et al. Cryo-Let
ters ８, 294-301 (1987), Valdez et al.Therioge-nol
ogy 33, 627-636 (1990) 〕とウシ胚〔Massip et al. C
ryo-Letters 7,270-273 (1986), Gatius et al. Zuchty
g. 24, 255-258 (1989), Douchi et al.Jpn. J. Amin.
Reprod. 36, 69-72 (1990) 〕で報告されている。Van D
er Zwalmenet al.〔Therigenology 31, 270 (1989)〕
は、Massip et al. の方法を一部修正することにより、
ウシ胚盤胞のガラス化に成功している。しかし、その方
法は胚盤胞より若い発育ステージの胚では成功しなかっ
た。
る透過型耐凍剤を高濃度に含むために、胚に対して強い
毒性作用を示すことが報告されている〔Rall et al. Na
ture313, 573-575 (1985), Rall, Cryobiology 24, 387
-402 (1987), Scheffen etal. Cryo-Letters 7, 260-26
9 (1986), Massip et al. Cryo-Letters 7, 270-273 (1
986)〕。Rall et al. (1985)やMassip et al. (1986)
は、この毒性作用を低めるために、胚のガラス化溶液へ
の浸漬を４℃の低温下で行う必要があることを報告して
いる。あるいは、ガラス化溶液へシュクロースのような
非透過型耐凍剤(Kasai et al. 1989) 、ポリエチレング
リコールのような高分子物質 (Rall etal. 1985; Rall,
1987; Ficoll; Kasai et al. 1989)の添加が毒性を低
めるという報告もされている。また、桑実胚より発育の
進んだ胚盤胞を用いてガラス化低温保存すると、ガラス
化後の生存率は桑実胚に比べて低いことが、マウス胚
〔Scheffen et al. 1986, Kono et al. Jpn. J. Anim.
Reprod. 33, 77-81 (1987),Bielanski et al. Cryo-Let
ters ８, 294-301 (1987), Valdez et al.Therioge-nol
ogy 33, 627-636 (1990) 〕とウシ胚〔Massip et al. C
ryo-Letters 7,270-273 (1986), Gatius et al. Zuchty
g. 24, 255-258 (1989), Douchi et al.Jpn. J. Amin.
Reprod. 36, 69-72 (1990) 〕で報告されている。Van D
er Zwalmenet al.〔Therigenology 31, 270 (1989)〕
は、Massip et al. の方法を一部修正することにより、
ウシ胚盤胞のガラス化に成功している。しかし、その方
法は胚盤胞より若い発育ステージの胚では成功しなかっ
た。
【０００５】更に、Rall et al. (1985)により報告され
たガラス化法はガラス化を行う前の胚の溶液への平衡時
間を約30分間必要とする。Scheffen et al. (1986)の方
法でも平衡時間は10分以上必要である。このように冷却
にかかる時間は短いが、冷却の前の平衡にある程度の時
間が必要とされる。
たガラス化法はガラス化を行う前の胚の溶液への平衡時
間を約30分間必要とする。Scheffen et al. (1986)の方
法でも平衡時間は10分以上必要である。このように冷却
にかかる時間は短いが、冷却の前の平衡にある程度の時
間が必要とされる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、このように
哺乳動物胚をガラス化低温保存する場合のこのような問
題点を解決しようとしてなされたものである。すなわ
ち、本発明は、（１）ガラス化低温保存液の胚に対する
強い毒性の低減をはかり、（２）いかなる発育ステージ
の胚でもガラス化に成功することができ、さらに（３）
ガラス化前の前処理工程における胚をガラス化平衡液に
浸漬する時間を短縮することを目的としてなされたもの
である。
哺乳動物胚をガラス化低温保存する場合のこのような問
題点を解決しようとしてなされたものである。すなわ
ち、本発明は、（１）ガラス化低温保存液の胚に対する
強い毒性の低減をはかり、（２）いかなる発育ステージ
の胚でもガラス化に成功することができ、さらに（３）
ガラス化前の前処理工程における胚をガラス化平衡液に
浸漬する時間を短縮することを目的としてなされたもの
である。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は上記課題を解決
するための手段について種々検討を重ねたところ、エチ
レングリコールとジメチルスルフォキシドと混合してな
るガラス化低温保存液を用いると、前記課題を解決する
ことができることを見出し、本発明をなすに至った。ま
た、本発明では前記保存液に培養液及び／またはさらに
これに血清アルブミンを加えるとガラス化低温保存液の
毒性が緩和されることを見出した。
するための手段について種々検討を重ねたところ、エチ
レングリコールとジメチルスルフォキシドと混合してな
るガラス化低温保存液を用いると、前記課題を解決する
ことができることを見出し、本発明をなすに至った。ま
た、本発明では前記保存液に培養液及び／またはさらに
これに血清アルブミンを加えるとガラス化低温保存液の
毒性が緩和されることを見出した。
【０００８】すなわち、本発明は、次のような哺乳動物
胚のガラス化低温保存液に関する。 （１）エチレングリコールとジメチルスルフォキシドと
を混合してなる哺乳動物胚のガラス化低温保存液。 （２）エチレングリコールとジメチルスルフォキシドと
を培養液に溶解してなる哺乳動物胚のガラス化低温保存
液。 （３）エチレングリコール、ジメチルスルフォキシド及
び血清アルブミンを培養液に溶解してなる哺乳動物胚の
ガラス化低温保存液。
胚のガラス化低温保存液に関する。 （１）エチレングリコールとジメチルスルフォキシドと
を混合してなる哺乳動物胚のガラス化低温保存液。 （２）エチレングリコールとジメチルスルフォキシドと
を培養液に溶解してなる哺乳動物胚のガラス化低温保存
液。 （３）エチレングリコール、ジメチルスルフォキシド及
び血清アルブミンを培養液に溶解してなる哺乳動物胚の
ガラス化低温保存液。
【０００９】本発明における哺乳動物胚は、ウシ、ブ
タ、ヒツジ、ヤギ等の胚が用いられる。これらの胚の中
で特に好ましいものは、過排卵処置されたホルスタイン
あるいは和牛雌ウシより、人工授精から７日後に非手術
的に回収された桑実胚から胚盤胞までの胚である。しか
し、本発明では、どのような時期の胚でも用いることが
できる。
タ、ヒツジ、ヤギ等の胚が用いられる。これらの胚の中
で特に好ましいものは、過排卵処置されたホルスタイン
あるいは和牛雌ウシより、人工授精から７日後に非手術
的に回収された桑実胚から胚盤胞までの胚である。しか
し、本発明では、どのような時期の胚でも用いることが
できる。
【００１０】本発明のエチレングリコールとジメチルス
ルフォキシドとは、エチレングリコール20〜35容量％と
ジメチルスルフォキシド20〜35容量％を混合することが
好ましい。
ルフォキシドとは、エチレングリコール20〜35容量％と
ジメチルスルフォキシド20〜35容量％を混合することが
好ましい。
【００１１】このような混合割合で使用することによっ
て室温で短時間平衡した後、ガラス化した場合でも高い
受胎率を得ることができる。さらに、従来、ガラス化前
の平衡を低温下で行い、桑実胚と胚盤期の胚とでは平衡
する方法を変える必要があったことにくらべて、いかな
る時期の胚でも室温下で平衡を行うことができ、著しい
利点を有するものである。
て室温で短時間平衡した後、ガラス化した場合でも高い
受胎率を得ることができる。さらに、従来、ガラス化前
の平衡を低温下で行い、桑実胚と胚盤期の胚とでは平衡
する方法を変える必要があったことにくらべて、いかな
る時期の胚でも室温下で平衡を行うことができ、著しい
利点を有するものである。
【００１２】本発明では、このようなエチレングリコー
ル及びジメチルスルフォキシドを培養液、例えば修正ダ
ルベッコリン酸緩衝液に40〜70容量％混合することが好
ましい。混合液の濃度が40％以下では、ガラス化低温保
存液を溶解したときに一時的に氷の結晶を生成し、胚を
損傷するおそれがあり、また70％以上では毒性が強くな
り、胚が死滅するおそれが生ずる。このような理由から
40〜70容量％の範囲で使用するとよい。
ル及びジメチルスルフォキシドを培養液、例えば修正ダ
ルベッコリン酸緩衝液に40〜70容量％混合することが好
ましい。混合液の濃度が40％以下では、ガラス化低温保
存液を溶解したときに一時的に氷の結晶を生成し、胚を
損傷するおそれがあり、また70％以上では毒性が強くな
り、胚が死滅するおそれが生ずる。このような理由から
40〜70容量％の範囲で使用するとよい。
【００１３】また、本発明におけるエチレングリコール
及びジメチルスルフォキシドに血清アルブミンを少量添
加するとその緩衝作用によってガラス化低温保存液の毒
性を緩和し、胚を傷つけることなくガラス化して保存す
ることができる。
及びジメチルスルフォキシドに血清アルブミンを少量添
加するとその緩衝作用によってガラス化低温保存液の毒
性を緩和し、胚を傷つけることなくガラス化して保存す
ることができる。
【００１４】本発明における培養液には、修正ダルベッ
コリン酸緩衝液等が用いられる。また、本発明における
希釈液は、その凍結点のガラス化低温保存液の凝固点と
相違し、ガラス化低温保存液の凝固点より高く、好まし
くは−20〜−25℃付近に凝固点をもつ希釈液が用いられ
る。−20〜−25℃付近に凝固点をもつものを使用すると
ガラス化低温保存液が液体窒素でガラス化され、両者の
間に凝固点が明確に区別され、ガラス化低温保存液注入
時に両者が溶液の形で混ざり合うことがないので好まし
い。このような溶液には蔗糖−リン酸塩緩衝液、トレハ
ロース−リン酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝液等がある。本
発明のガラス化低温保存液は、これを胚移植用ストロー
のなかに入れて使用される。次に、本発明のガラス化低
温保存液について胚移植用ストローに注入する方法を説
明したものを詳述する。
コリン酸緩衝液等が用いられる。また、本発明における
希釈液は、その凍結点のガラス化低温保存液の凝固点と
相違し、ガラス化低温保存液の凝固点より高く、好まし
くは−20〜−25℃付近に凝固点をもつ希釈液が用いられ
る。−20〜−25℃付近に凝固点をもつものを使用すると
ガラス化低温保存液が液体窒素でガラス化され、両者の
間に凝固点が明確に区別され、ガラス化低温保存液注入
時に両者が溶液の形で混ざり合うことがないので好まし
い。このような溶液には蔗糖−リン酸塩緩衝液、トレハ
ロース−リン酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝液等がある。本
発明のガラス化低温保存液は、これを胚移植用ストロー
のなかに入れて使用される。次に、本発明のガラス化低
温保存液について胚移植用ストローに注入する方法を説
明したものを詳述する。
【００１５】本発明における哺乳動物胚は、ウシ、ブ
タ、ヒツジ、ヤギ等の胚が用いられる。これらの胚の中
で特に好ましいものは、過排卵処置されたホルスタイン
あるいは和牛雌ウシより、人工授精から７日後に非手術
的に回収された桑実胚から胚盤胞までの胚である。ま
た、ガラス化溶液には、エチレングリコール、ジメチル
スルフォキシドあるいは、これに４mg/ml 程度のウシ血
清アルブミンが添加された修正ダルベッコのリン酸緩衝
液(PBS) を、容積比１：１：２で混合した溶液をガラス
化低温保存液(VSi) として用いるとよい。また、VSi を
PBS で50％に希釈した溶液（50％-VSi）を平衡溶液とし
た。
タ、ヒツジ、ヤギ等の胚が用いられる。これらの胚の中
で特に好ましいものは、過排卵処置されたホルスタイン
あるいは和牛雌ウシより、人工授精から７日後に非手術
的に回収された桑実胚から胚盤胞までの胚である。ま
た、ガラス化溶液には、エチレングリコール、ジメチル
スルフォキシドあるいは、これに４mg/ml 程度のウシ血
清アルブミンが添加された修正ダルベッコのリン酸緩衝
液(PBS) を、容積比１：１：２で混合した溶液をガラス
化低温保存液(VSi) として用いるとよい。また、VSi を
PBS で50％に希釈した溶液（50％-VSi）を平衡溶液とし
た。
【００１６】本発明では、まず前記した胚を平衡化溶液
〔ガラス化低温保存液(VSi) を希釈液に溶解して希釈し
たもの、例えば50％-VSi〕に浸漬し、次いでこの胚を、
微細ストロー中にガラス化低温保存液(VSi) とともに入
れて平衡化する。通常の胚の平衡化溶液は４℃前後の低
温で行われるが、本発明のエチレングリコールとジメチ
ルスルフォキシドのガラス化低温保存液を使用すると室
温でも平衡化は可能である。まず、50％-VSi中での浸漬
は、室温（約22〜25℃）で数分間（約１〜５分間）浸漬
することによって行ない、次いでこれを前記微細ストロ
ー中にVSi とともに入れて室温付近で短時間（約10秒〜
１分）平衡を行なう。微細ストローは通常、胚移植用に
使用されるものを使用する。図１に示すように、このス
トロー中に通常は胚１個を、VSi 数10μl 、好ましくは
10〜20μl と共に封入することが望ましい。その外側に
空気層を設け、必要によりさらにその外側に少量のVSi
を入れて凍結保存工程中、胚と希釈液とが混合されるこ
とを防止する。予め、希釈液を凍結し、その上に接する
ようにガラス化低温保存液(VSi) を封入することもでき
る。そして、さらにその外側に空気層を設け、希釈液を
入れて希釈液層を設け、密封する。
〔ガラス化低温保存液(VSi) を希釈液に溶解して希釈し
たもの、例えば50％-VSi〕に浸漬し、次いでこの胚を、
微細ストロー中にガラス化低温保存液(VSi) とともに入
れて平衡化する。通常の胚の平衡化溶液は４℃前後の低
温で行われるが、本発明のエチレングリコールとジメチ
ルスルフォキシドのガラス化低温保存液を使用すると室
温でも平衡化は可能である。まず、50％-VSi中での浸漬
は、室温（約22〜25℃）で数分間（約１〜５分間）浸漬
することによって行ない、次いでこれを前記微細ストロ
ー中にVSi とともに入れて室温付近で短時間（約10秒〜
１分）平衡を行なう。微細ストローは通常、胚移植用に
使用されるものを使用する。図１に示すように、このス
トロー中に通常は胚１個を、VSi 数10μl 、好ましくは
10〜20μl と共に封入することが望ましい。その外側に
空気層を設け、必要によりさらにその外側に少量のVSi
を入れて凍結保存工程中、胚と希釈液とが混合されるこ
とを防止する。予め、希釈液を凍結し、その上に接する
ようにガラス化低温保存液(VSi) を封入することもでき
る。そして、さらにその外側に空気層を設け、希釈液を
入れて希釈液層を設け、密封する。
【００１７】次にこれを低温処理して胚をガラス化す
る。低温処理は、従来知られている種々の低温処理方法
が用いられるが、液体窒素ガス中に放置するかあるいは
液体窒素中に投入すると直ちにガラス化して胚に対する
VSi の毒性の低減がはかられ、作業効率が高まるので液
体窒素で処理することが望ましい。使用時に融解して使
用する。融解方法に特に制限はないが、通常はこのスト
ローを水に浸漬することによって行なわれる。融解後ス
トロー中の内容物を混和し、発情後のレシピエント動物
に頸管法等により注入する。
る。低温処理は、従来知られている種々の低温処理方法
が用いられるが、液体窒素ガス中に放置するかあるいは
液体窒素中に投入すると直ちにガラス化して胚に対する
VSi の毒性の低減がはかられ、作業効率が高まるので液
体窒素で処理することが望ましい。使用時に融解して使
用する。融解方法に特に制限はないが、通常はこのスト
ローを水に浸漬することによって行なわれる。融解後ス
トロー中の内容物を混和し、発情後のレシピエント動物
に頸管法等により注入する。
【００１８】本発明ではこのような材料を用いて、次の
実験を行って本発明の効果を確認した。 〔実験１〕50％-VSiへの平衡時間がガラス化胚の生存性
に及ぼす影響について検討した。胚は室温下（22〜25
℃）で、50％-VSiに１、２、５分間平衡、次いでVSi に
0.5分間平衡後、液体窒素ガス中に２分間静置され、液
体窒素中に投入した。胚の50％-VSiへの平衡はシャーレ
内で、VSi への平衡はストロー内で20μl のVSi のカラ
ムの中で行われた。そのカラムは数mmの空気層で仕切ら
れた0.5Mシュクロース-PBS液（希釈溶液）に挟まれてい
る（図１参照）。融解はストローを20℃の水に15秒間浸
漬することにより行われた。融解後ストロー内容はプラ
スチックシャーレに移され、混和されることにより耐凍
剤の希釈が行われた。胚の培養は、パラフィンオイル下
の10％ウシ胎仔血清添加TCM-199 の 100μl 小滴中で、
５％CO2 、95％空気、38℃下で行われた。生存性は培養
24時間で胞胚腔の形成により判定された。50％-VSiで
１、２および５分間平衡された後ガラス化された胚の生
存率は、表１に示すようにそれぞれ88％ (7/8)、90％
(9/10) および60％ (3/5)であった。
実験を行って本発明の効果を確認した。 〔実験１〕50％-VSiへの平衡時間がガラス化胚の生存性
に及ぼす影響について検討した。胚は室温下（22〜25
℃）で、50％-VSiに１、２、５分間平衡、次いでVSi に
0.5分間平衡後、液体窒素ガス中に２分間静置され、液
体窒素中に投入した。胚の50％-VSiへの平衡はシャーレ
内で、VSi への平衡はストロー内で20μl のVSi のカラ
ムの中で行われた。そのカラムは数mmの空気層で仕切ら
れた0.5Mシュクロース-PBS液（希釈溶液）に挟まれてい
る（図１参照）。融解はストローを20℃の水に15秒間浸
漬することにより行われた。融解後ストロー内容はプラ
スチックシャーレに移され、混和されることにより耐凍
剤の希釈が行われた。胚の培養は、パラフィンオイル下
の10％ウシ胎仔血清添加TCM-199 の 100μl 小滴中で、
５％CO2 、95％空気、38℃下で行われた。生存性は培養
24時間で胞胚腔の形成により判定された。50％-VSiで
１、２および５分間平衡された後ガラス化された胚の生
存率は、表１に示すようにそれぞれ88％ (7/8)、90％
(9/10) および60％ (3/5)であった。
【００１９】
【表１】 50％-VSiへの平衡時間が融解後の胚の生存性に及ぼす影響 ───────────────────────────── 平衡時間（分） 供試胚数 生存胚数（％） ───────────────────────────── １ 8 7 （88） ２ 10 9 （90） ５ 5 3 （60） ───────────────────────────── この結果、平衡時間は１〜２分間が好ましいという結論
を得た。
を得た。
【００２０】〔実験２〕ガラス化胚の移植。50％-VSiに
１分間平衡後にガラス化された桑実胚、初期胚盤胞およ
び胚盤胞が、発情後７日目のレシピエントウシに頸管法
により１頭あたり１個の胚が移植された。受胎は、移植
後21〜35日目に超音波断層診断装置により診断された。
その結果は表２に示すように受胎率は桑実胚と初期胚盤
胞で50％ (3/6)、胚盤胞で75％ (6/8)、平均64％ (9/1
4) であった。
１分間平衡後にガラス化された桑実胚、初期胚盤胞およ
び胚盤胞が、発情後７日目のレシピエントウシに頸管法
により１頭あたり１個の胚が移植された。受胎は、移植
後21〜35日目に超音波断層診断装置により診断された。
その結果は表２に示すように受胎率は桑実胚と初期胚盤
胞で50％ (3/6)、胚盤胞で75％ (6/8)、平均64％ (9/1
4) であった。
【００２１】
【表２】 胚の発育ステージでの受胎率 ──────────────────────────── 胚の発育ステージ 移植頭数 受胎頭数（％） ──────────────────────────── 桑実胚と初期胚盤胞 6 3 （50） 胚盤胞 8 6 （75） 計 14 9 （64） ────────────────────────────
【００２２】本発明は次の特徴を有する。 １．ガラス化溶液の組成が簡単である。 ２．ガラス化する前の平衡を室温下で行えることで操作
が容易になった。 ３．平衡に必要な時間は、50％-VSiに１分間、VSi に0.
5 分間と短く、操作時間が短縮できた。 ４．ウシの桑実胚から胚盤胞までの胚を同じ方法でガラ
ス化することが可能になり、より実用的になった。
が容易になった。 ３．平衡に必要な時間は、50％-VSiに１分間、VSi に0.
5 分間と短く、操作時間が短縮できた。 ４．ウシの桑実胚から胚盤胞までの胚を同じ方法でガラ
ス化することが可能になり、より実用的になった。
【００２３】
【実施例１】エチレングリコール、ジメチルスルフォキ
シド及び4mg/mlのウシ血清アルブミンを添加した修正ダ
ルベッコのリン酸緩衝液(PBS) を、容積比１：１：２で
混合した溶液をガラス化低温保存液(VSi) とした。ウシ
胚を、PBS で50％希釈したガラス化低温保存液に１分間
浸漬した。次いで、図１の様にストロー内の20μl のガ
ラス化低温保存液カラム中に、ピペットにより胚を注入
し、ストローを密封した。 0.5分後にストローを液体窒
素ガス中に２分間静置し冷却した後、液体窒素中で保存
した。使用時に20℃の水中に浸漬し融解し、ストロー内
容をシャーレに移した。５分間静置し耐凍剤の希釈を行
った後、胚をPBS に移した。この胚を、発情後、７日目
のレシピエントウシに頸管法により移植した。移植後35
日目に超音波断層診断装置により、受胎が確認された。
シド及び4mg/mlのウシ血清アルブミンを添加した修正ダ
ルベッコのリン酸緩衝液(PBS) を、容積比１：１：２で
混合した溶液をガラス化低温保存液(VSi) とした。ウシ
胚を、PBS で50％希釈したガラス化低温保存液に１分間
浸漬した。次いで、図１の様にストロー内の20μl のガ
ラス化低温保存液カラム中に、ピペットにより胚を注入
し、ストローを密封した。 0.5分後にストローを液体窒
素ガス中に２分間静置し冷却した後、液体窒素中で保存
した。使用時に20℃の水中に浸漬し融解し、ストロー内
容をシャーレに移した。５分間静置し耐凍剤の希釈を行
った後、胚をPBS に移した。この胚を、発情後、７日目
のレシピエントウシに頸管法により移植した。移植後35
日目に超音波断層診断装置により、受胎が確認された。
【００２３】
【実施例２】図２に示すように0.25mlストローを縦にし
て一方の端を密封するとともに空気層10〜20μl を設け
て、0.5M蔗糖-PBS（希釈液） 140〜160 μl を注入し、
これを縦方向の状態で−20〜−25℃のメタノールに浸漬
して0.5M蔗糖-PBSを凍結した。実施例１のガラス化低温
保存液(VSi) 20μl を前記凍結した希釈液上に直接接す
るように注入した。一方、過排卵処理されたホルスタイ
ンより、人工授精から７日後に非手術的に回収された胚
を、ガラス化低温保存液をPBS で50％希釈した平衡溶液
に、室温で１分間浸漬した。この平衡化された胚をガラ
ス化低温保存液を注入した前記のストローの中にピペッ
トで入れ、ストローの上端をプラスチックプラグで密封
し、液体窒素ガス中で２分間冷却した。その後、このス
トローを液体窒素中で保存した。この胚をウシに移植す
るさいに、凍結ストローを取り出し、20℃の水に浸漬し
て融解し、ストローをガラス化保存液の方を下にして垂
直に立て、５分間放置してガラス化低温保存液と混合し
た。これの融解胚をストローから取り出すことなく、移
植用ストローのまま、発情から７日目の受卵牛に移植し
た。移植後21〜35日目に超音波診断装置により妊娠鑑定
を行ったところ、妊娠が確認された。
て一方の端を密封するとともに空気層10〜20μl を設け
て、0.5M蔗糖-PBS（希釈液） 140〜160 μl を注入し、
これを縦方向の状態で−20〜−25℃のメタノールに浸漬
して0.5M蔗糖-PBSを凍結した。実施例１のガラス化低温
保存液(VSi) 20μl を前記凍結した希釈液上に直接接す
るように注入した。一方、過排卵処理されたホルスタイ
ンより、人工授精から７日後に非手術的に回収された胚
を、ガラス化低温保存液をPBS で50％希釈した平衡溶液
に、室温で１分間浸漬した。この平衡化された胚をガラ
ス化低温保存液を注入した前記のストローの中にピペッ
トで入れ、ストローの上端をプラスチックプラグで密封
し、液体窒素ガス中で２分間冷却した。その後、このス
トローを液体窒素中で保存した。この胚をウシに移植す
るさいに、凍結ストローを取り出し、20℃の水に浸漬し
て融解し、ストローをガラス化保存液の方を下にして垂
直に立て、５分間放置してガラス化低温保存液と混合し
た。これの融解胚をストローから取り出すことなく、移
植用ストローのまま、発情から７日目の受卵牛に移植し
た。移植後21〜35日目に超音波診断装置により妊娠鑑定
を行ったところ、妊娠が確認された。
【図１】本発明のガラス化低温保存液と希釈液との微細
ストロー内の配置図を示す。
ストロー内の配置図を示す。
【図２】本発明のストロー内の他の配置図を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 佐伯 和弘 北海道千歳市柏陽４丁目２番地の４ (72)発明者 貝沼 平敏 北海道千歳市信濃２丁目31 ニューシティ ー信濃Ｂ−201
Claims (4)
- 【請求項１】 エチレングリコール及びジメチルスルフ
ォキシドよりなる哺乳動物胚のガラス化低温保存液。 - 【請求項２】 エチレングリコール及びジメチルスルフ
ォキシドを培養液に混合してなる哺乳動物胚のガラス化
低温保存液。 - 【請求項３】 エチレングリコールが20〜35容量％及び
ジメチルスルフォキシドが20〜35容量％である請求項１
または２記載の保存液。 - 【請求項４】 培養液が血清アルブミンを含む哺乳動物
胚の培養液である請求項１または２記載の保存液。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35675291A JP2999876B2 (ja) | 1991-12-26 | 1991-12-26 | 哺乳動物胚のガラス化低温保存液 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35675291A JP2999876B2 (ja) | 1991-12-26 | 1991-12-26 | 哺乳動物胚のガラス化低温保存液 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05176658A true JPH05176658A (ja) | 1993-07-20 |
| JP2999876B2 JP2999876B2 (ja) | 2000-01-17 |
Family
ID=18450598
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP35675291A Expired - Fee Related JP2999876B2 (ja) | 1991-12-26 | 1991-12-26 | 哺乳動物胚のガラス化低温保存液 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2999876B2 (ja) |
-
1991
- 1991-12-26 JP JP35675291A patent/JP2999876B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2999876B2 (ja) | 2000-01-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kasai et al. | High survival of rabbit morulae after vitrification in an ethylene glycol-based solution by a simple method | |
| Vajta et al. | Vitrification of porcine embryos using the Open Pulled Straw (OPS) method | |
| Tachikawa et al. | Successful vitrification of bovine blastocysts, derived by in vitro maturation and fertilization | |
| Oberstein et al. | Cryopreservation of equine embryos by open pulled straw, cryoloop, or conventional slow cooling methods | |
| Zhu et al. | Cryopreservation of expanded mouse blastocysts by vitrification in ethylene glycol-based solutions | |
| Ishimori et al. | Vitrification of bovine embryos in a mixture of ethylene glycol and dimethyl sulfoxide | |
| Otoi et al. | Cryopreservation of mature bovine oocytes by vitrification in straws | |
| Kasai et al. | Effects of various cryoprotective agents on the survival of unfrozen and frozen mouse embryos | |
| Ali et al. | Successful vitrification of day-6 sheep embryos | |
| Vajta et al. | Factors affecting survival rates of in vitro produced bovine embryos after vitrification and direct in-straw rehydration | |
| Saito et al. | Effect of sugars-addition on the survival of vitrified bovine blastocysts produced in vitro | |
| US8435730B2 (en) | Semen extender composition and methods for manufacturing and using | |
| US6982172B2 (en) | Oocyte vitrification technique | |
| Kasai | Vitrification: refined strategy for the cryopreservation of mammalian embryos | |
| Ishimori et al. | Viability of vitrified mouse embryos using various cryoprotectant mixtures | |
| Garg et al. | Effect of different cryoprotectant concentrations for ultrarapid freezing of immature goat follicular oocytes on their subsequent maturation and fertilization in vitro | |
| Kobayashi et al. | The survival of whole and bisected rabbit morulae after cryopreservation by the vitrification method | |
| Squires et al. | Transfer of cryopreserved equine embryos to progestin‐treated ovariectomised mares | |
| Si et al. | Cryopreservation of rhesus macaque (Macaca mulatta) spermatozoa and their functional assessment by in vitro fertilization | |
| Le Gal et al. | In vivo and in vitro survival of goat embryos after freezing with ethylene glycol or glycerol | |
| Bui-Xuan-Nguyen et al. | Direct freezing of cattle embryos after partial dehydration at room temperature | |
| JP3672201B2 (ja) | 哺乳動物胚移植用ストロー及びその製造法 | |
| Williams et al. | A method for one-step freezing of mouse embryos | |
| US5504002A (en) | Cryopreserving bovine embryos with a composition comprising 4% ethylen E glycol, 4% propanediol, and bovine albumin having a lipid content of 2.5 ug or more | |
| Miyamoto et al. | Liquid nitrogen vapour freezing of mouse embryos |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |