JPH05149953A - イオン交換樹脂を用いた放射性標識した生物学的分子の安定化法 - Google Patents
イオン交換樹脂を用いた放射性標識した生物学的分子の安定化法Info
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- JPH05149953A JPH05149953A JP10436792A JP10436792A JPH05149953A JP H05149953 A JPH05149953 A JP H05149953A JP 10436792 A JP10436792 A JP 10436792A JP 10436792 A JP10436792 A JP 10436792A JP H05149953 A JPH05149953 A JP H05149953A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 放射性標識した生物学的分子の安定化方法を
提供する。 【構成】 放射性標識した生物学的分子をイオン交換樹
脂と接触させ、ついで該放射性標識した生物学的分子を
該イオン交換樹脂と接触させたままにして該放射性標識
した生物学的分子を安定化する、ことを特徴とする放射
性標識した生物学的分子の安定化方法。
提供する。 【構成】 放射性標識した生物学的分子をイオン交換樹
脂と接触させ、ついで該放射性標識した生物学的分子を
該イオン交換樹脂と接触させたままにして該放射性標識
した生物学的分子を安定化する、ことを特徴とする放射
性標識した生物学的分子の安定化方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、放射性標識した生物学
的分子の安定化法に関する。
的分子の安定化法に関する。
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】放射
性標識した生物学的分子は、診断剤および治療剤として
ますます有用になってきている。たとえば、放射性標識
したモノクローナル抗体は腫瘍の収縮を引き起こすこと
が示されている。さらに、放射性標識した生物学的分子
はまた診断用造影剤としても利用されてきている。しか
しながら、放射性標識した生物学的分子の安定性に関し
ては常に問題であった。これら分子を安定化するために
種々のアプローチが用いられてきている。たとえば、放
射性標識した生物学的分子を−７０℃で凍結することが
行われている。しかしながら、放射性標識した生物学的
分子の安定化のための新たな方法が、なお必要とされて
いる。
性標識した生物学的分子は、診断剤および治療剤として
ますます有用になってきている。たとえば、放射性標識
したモノクローナル抗体は腫瘍の収縮を引き起こすこと
が示されている。さらに、放射性標識した生物学的分子
はまた診断用造影剤としても利用されてきている。しか
しながら、放射性標識した生物学的分子の安定性に関し
ては常に問題であった。これら分子を安定化するために
種々のアプローチが用いられてきている。たとえば、放
射性標識した生物学的分子を−７０℃で凍結することが
行われている。しかしながら、放射性標識した生物学的
分子の安定化のための新たな方法が、なお必要とされて
いる。
【０００２】
【課題を解決するための手段】本発明は、イオン交換樹
脂を用いた放射性標識した生物学的分子の安定化法に関
する。さらに詳しくは、本発明は、放射性標識した生物
学的分子をイオン交換樹脂と接触させ、ついで該放射性
標識した生物学的分子を該イオン交換樹脂と接触させた
ままにして該放射性標識した生物学的分子を安定化す
る、ことを特徴とする放射性標識した生物学的分子の安
定化方法に関する。
脂を用いた放射性標識した生物学的分子の安定化法に関
する。さらに詳しくは、本発明は、放射性標識した生物
学的分子をイオン交換樹脂と接触させ、ついで該放射性
標識した生物学的分子を該イオン交換樹脂と接触させた
ままにして該放射性標識した生物学的分子を安定化す
る、ことを特徴とする放射性標識した生物学的分子の安
定化方法に関する。
【０００３】本発明の方法に従い、種々の放射性標識し
た生物学的分子を安定化することができる。たとえば、
放射性標識した核酸分子(たとえば、リボ核酸[ＲＮＡ]
分子およびデオキシリボ核酸[ＤＮＡ]分子)、ペプチ
ド、ポリペプチド、ホルモン、ポリクローナル抗体、モ
ノクローナル抗体およびその断片を安定化することがで
きる。安定化するために好ましい放射性標識した生物学
的分子は、放射性標識したモノクローナル抗体である。
本発明の方法に従い、種々の放射性標識を安定化するこ
とができる。たとえば、125Ｉ、131Ｉおよび90Ｙや64Ｃ
ｕなどの他のベータ線放射体、および212Ｂｉなどの他
のアルファ線放射体などを安定化することができる。
た生物学的分子を安定化することができる。たとえば、
放射性標識した核酸分子(たとえば、リボ核酸[ＲＮＡ]
分子およびデオキシリボ核酸[ＤＮＡ]分子)、ペプチ
ド、ポリペプチド、ホルモン、ポリクローナル抗体、モ
ノクローナル抗体およびその断片を安定化することがで
きる。安定化するために好ましい放射性標識した生物学
的分子は、放射性標識したモノクローナル抗体である。
本発明の方法に従い、種々の放射性標識を安定化するこ
とができる。たとえば、125Ｉ、131Ｉおよび90Ｙや64Ｃ
ｕなどの他のベータ線放射体、および212Ｂｉなどの他
のアルファ線放射体などを安定化することができる。
【０００４】安定化しようとする特定の放射性標識した
生物学的分子に従って、イオン交換樹脂は陽イオン交換
樹脂または陰イオン交換樹脂のいずれかを用いることが
できる。生物学的分子上の荷電が、陽イオン交換樹脂上
の陽イオン性基と該生物学的分子が相互反応しないよう
なものである場合には、陽イオン交換樹脂を用いる。ま
た生物学的分子上の荷電が、陰イオン交換樹脂上の陰イ
オン性基と該生物学的分子が相互反応しないようなもの
である場合には、陰イオン交換樹脂を用いる。好ましい
イオン交換樹脂は、陰イオン交換樹脂のＤＥＡＥ−セフ
ァデックス[ファルマシア−ＬＫＢ・バイオテクノロジ
ー(Pharmacia−LKB Biotechnology Inc.)、ピスカタウ
エイ、ニュージャージー州、０８８５５]である。他の
適当なイオン交換樹脂としては、たとえば、Ｌ１１ Ｄ
Ｅ ５２[ファットマン・ラブ・セールズ(Whatman Lab S
ales,Inc.)、ヒルズボロ、オレゴン州、９７１２３]お
よびカルボキシメチルセルロース[バイオ−ラド・ラボ
ラトリーズ(Bio−Rad Laboratories)、リッチモンド、
カリフォルニア州]が挙げられる。
生物学的分子に従って、イオン交換樹脂は陽イオン交換
樹脂または陰イオン交換樹脂のいずれかを用いることが
できる。生物学的分子上の荷電が、陽イオン交換樹脂上
の陽イオン性基と該生物学的分子が相互反応しないよう
なものである場合には、陽イオン交換樹脂を用いる。ま
た生物学的分子上の荷電が、陰イオン交換樹脂上の陰イ
オン性基と該生物学的分子が相互反応しないようなもの
である場合には、陰イオン交換樹脂を用いる。好ましい
イオン交換樹脂は、陰イオン交換樹脂のＤＥＡＥ−セフ
ァデックス[ファルマシア−ＬＫＢ・バイオテクノロジ
ー(Pharmacia−LKB Biotechnology Inc.)、ピスカタウ
エイ、ニュージャージー州、０８８５５]である。他の
適当なイオン交換樹脂としては、たとえば、Ｌ１１ Ｄ
Ｅ ５２[ファットマン・ラブ・セールズ(Whatman Lab S
ales,Inc.)、ヒルズボロ、オレゴン州、９７１２３]お
よびカルボキシメチルセルロース[バイオ−ラド・ラボ
ラトリーズ(Bio−Rad Laboratories)、リッチモンド、
カリフォルニア州]が挙げられる。
【０００５】本発明の方法を実施するに際しては、まず
放射性標識した生物学的分子をイオン交換樹脂と接触さ
せなければならない。このことは、種々の仕方で行うこ
とができる。たとえば、放射性標識した生物学的分子を
適当な緩衝溶液中に溶解し、ついでイオン交換樹脂と接
触させることができる。種々の緩衝液、たとえば、リン
酸緩衝食塩水(ＰＢＳ；１０ｍＭリン酸、ｐＨ７.２、
０.１５Ｍ ＮａＣｌ)、ＴＲＩＳ[トリス(ヒドロキシメ
チル)アミノメタン]、およびＨＥＰＥＳ(Ｎ−[２−ヒド
ロキシエチル]ペペラジン−Ｎ'−[２−エタンスルホン
酸])を用いることができる。緩衝溶液の濃度は、約１０
〜約５０ｍＭの範囲であってよく、また緩衝溶液のｐＨ
は約６.５〜約７.５の範囲であってよい。
放射性標識した生物学的分子をイオン交換樹脂と接触さ
せなければならない。このことは、種々の仕方で行うこ
とができる。たとえば、放射性標識した生物学的分子を
適当な緩衝溶液中に溶解し、ついでイオン交換樹脂と接
触させることができる。種々の緩衝液、たとえば、リン
酸緩衝食塩水(ＰＢＳ；１０ｍＭリン酸、ｐＨ７.２、
０.１５Ｍ ＮａＣｌ)、ＴＲＩＳ[トリス(ヒドロキシメ
チル)アミノメタン]、およびＨＥＰＥＳ(Ｎ−[２−ヒド
ロキシエチル]ペペラジン−Ｎ'−[２−エタンスルホン
酸])を用いることができる。緩衝溶液の濃度は、約１０
〜約５０ｍＭの範囲であってよく、また緩衝溶液のｐＨ
は約６.５〜約７.５の範囲であってよい。
【０００６】一般に、緩衝液の濃度およびｐＨは、生物
学的分子がイオン交換樹脂に結合しないように選択す
る。緩衝溶液の温度は、約−７０℃〜約４０℃の範囲で
ある。緩衝溶液にはまた、他の物質が含まれていてもよ
い。たとえば、ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)を他の安定
化剤として約１％〜約５％の濃度にて加えることができ
る。緩衝溶液に加えることのできる他の物質としては、
たとえば、マンニトールおよび還元剤が挙げられる。放
射性標識した生物学的分子を溶解するのに用いる緩衝液
の容量は最小にすべきである。一般に、使用する緩衝液
の容量は、イオン交換樹脂の容量の約５０％〜約９０％
であるが、イオン交換樹脂の容量の約８０％の容量の緩
衝液を用いるのが好ましい。
学的分子がイオン交換樹脂に結合しないように選択す
る。緩衝溶液の温度は、約−７０℃〜約４０℃の範囲で
ある。緩衝溶液にはまた、他の物質が含まれていてもよ
い。たとえば、ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)を他の安定
化剤として約１％〜約５％の濃度にて加えることができ
る。緩衝溶液に加えることのできる他の物質としては、
たとえば、マンニトールおよび還元剤が挙げられる。放
射性標識した生物学的分子を溶解するのに用いる緩衝液
の容量は最小にすべきである。一般に、使用する緩衝液
の容量は、イオン交換樹脂の容量の約５０％〜約９０％
であるが、イオン交換樹脂の容量の約８０％の容量の緩
衝液を用いるのが好ましい。
【０００７】放射性標識した生物学的分子をイオン交換
樹脂に接触させたら、所望とする目的にもはや必要でな
くなるまで貯蔵させておく。たとえば、131Ｉ ＣhiＬ６
などの放射性標識したモノクローナル抗体は、該放射性
標識した抗体がもはや治療に用いることができない程度
に放射性標識が崩壊するまで貯蔵しておくことができ
る。貯蔵温度としては約−７０℃〜約４℃の範囲であれ
ばよいが、約４℃の貯蔵温度が好ましい。
樹脂に接触させたら、所望とする目的にもはや必要でな
くなるまで貯蔵させておく。たとえば、131Ｉ ＣhiＬ６
などの放射性標識したモノクローナル抗体は、該放射性
標識した抗体がもはや治療に用いることができない程度
に放射性標識が崩壊するまで貯蔵しておくことができ
る。貯蔵温度としては約−７０℃〜約４℃の範囲であれ
ばよいが、約４℃の貯蔵温度が好ましい。
【０００８】放射性標識した生物学的分子は、もちろ
ん、使用前にイオン交換樹脂から回収する必要がある。
たとえば、放射性標識した生物学的分子およびイオン交
換樹脂がカラム中に入れてあるときは、放射性標識した
生物学的分子を緩衝溶液を用いてカラムから溶出するこ
とができる。一般に、放射性標識した生物学的分子を溶
解するのに用いたのと同じ緩衝液を用いることができる
が、異なる緩衝溶液を用いることもできる。
ん、使用前にイオン交換樹脂から回収する必要がある。
たとえば、放射性標識した生物学的分子およびイオン交
換樹脂がカラム中に入れてあるときは、放射性標識した
生物学的分子を緩衝溶液を用いてカラムから溶出するこ
とができる。一般に、放射性標識した生物学的分子を溶
解するのに用いたのと同じ緩衝液を用いることができる
が、異なる緩衝溶液を用いることもできる。
【０００９】本発明の方法を行うのに使用する装置を図
１に示してあり、該装置はカラム装置６、溶出緩衝液バ
イアル１および回収バイアル１２からなる。図１に従っ
て説明すると、カラム装置６には、粗フィルター９およ
び０.２２μＭフィルター１０との間に挟まれた放射性
標識した生物学的分子に接触したイオン交換樹脂８が入
れてある。カラム装置６の入り口はシール７および通常
のコック栓５で密封してあり、またカラム装置６の出口
は通常のコック栓１１で密封してある。溶出緩衝液バイ
アル１には圧力がかけてあり、溶出緩衝液２を入れてあ
り、アルミニウムの波形模様のついたゴム栓１３で密封
してある。回収バイアル１２は、通気孔１４を有するア
ルミニウムの波形模様のついたゴム栓１３で密封してあ
る。
１に示してあり、該装置はカラム装置６、溶出緩衝液バ
イアル１および回収バイアル１２からなる。図１に従っ
て説明すると、カラム装置６には、粗フィルター９およ
び０.２２μＭフィルター１０との間に挟まれた放射性
標識した生物学的分子に接触したイオン交換樹脂８が入
れてある。カラム装置６の入り口はシール７および通常
のコック栓５で密封してあり、またカラム装置６の出口
は通常のコック栓１１で密封してある。溶出緩衝液バイ
アル１には圧力がかけてあり、溶出緩衝液２を入れてあ
り、アルミニウムの波形模様のついたゴム栓１３で密封
してある。回収バイアル１２は、通気孔１４を有するア
ルミニウムの波形模様のついたゴム栓１３で密封してあ
る。
【００１０】放射性標識した生物学的分子をイオン交換
樹脂８から溶出するため、下記手順を用いることができ
る。 １．針１５(たとえば、２１ゲージの金属針)をカラム装
置６のコック栓１１中にねじ込む； ２．アルミニウムの波形模様のついたゴム栓１３中に針
１５を挿入して、針１５が回収バイアル１２の内部まで
延びるようにする； ３．コック栓４に連結した針１７をアルミニウムの波形
模様のついたゴム栓３中に挿入して、針１７が溶出緩衝
液バイアル１の内部まで延びるようにする。 ４．コック栓４とコック栓５との間に管１６をつなぐこ
とにより、カラム装置６と溶出緩衝液バイアル１とを連
結する；そして ５．コック栓４,５,１１を１１、５および４の順に開け
る。
樹脂８から溶出するため、下記手順を用いることができ
る。 １．針１５(たとえば、２１ゲージの金属針)をカラム装
置６のコック栓１１中にねじ込む； ２．アルミニウムの波形模様のついたゴム栓１３中に針
１５を挿入して、針１５が回収バイアル１２の内部まで
延びるようにする； ３．コック栓４に連結した針１７をアルミニウムの波形
模様のついたゴム栓３中に挿入して、針１７が溶出緩衝
液バイアル１の内部まで延びるようにする。 ４．コック栓４とコック栓５との間に管１６をつなぐこ
とにより、カラム装置６と溶出緩衝液バイアル１とを連
結する；そして ５．コック栓４,５,１１を１１、５および４の順に開け
る。
【００１１】本発明の方法に対して特別の作用機構を断
言することはできないが、イオン交換樹脂の機能として
考えられることは、(１)放射性標識した生物学的分子か
ら放出される遊離の放射性標識のスカベンジャーとして
の機能；(２)放射性標識した生物学的分子の可能な安定
化剤としての機能[放射性標識した生物学的分子は、イ
オン交換樹脂のマトリックスの多数の穴内に均一に分散
する。このような分散により、放射性標識した生物学的
分子間での相互作用が減少し、このことにより最終的に
放射性標識分子間の放射能衝撃が減少する]；および
(３)遊離ラジカルのスカベンジャーとしての機能[この
ことにより、遊離ラジカルにより引き起こされる放射性
標識した生物学的分子の損害が最小となる]である。
言することはできないが、イオン交換樹脂の機能として
考えられることは、(１)放射性標識した生物学的分子か
ら放出される遊離の放射性標識のスカベンジャーとして
の機能；(２)放射性標識した生物学的分子の可能な安定
化剤としての機能[放射性標識した生物学的分子は、イ
オン交換樹脂のマトリックスの多数の穴内に均一に分散
する。このような分散により、放射性標識した生物学的
分子間での相互作用が減少し、このことにより最終的に
放射性標識分子間の放射能衝撃が減少する]；および
(３)遊離ラジカルのスカベンジャーとしての機能[この
ことにより、遊離ラジカルにより引き起こされる放射性
標識した生物学的分子の損害が最小となる]である。
【００１２】
【実施例】つぎに、実施例に基づいて本発明をさらに詳
しく説明するが、本発明はこれらに限られるものではな
い。実施例１ 131 Ｉ−キメラＬ６モノクローナル抗体の安定化：キメ
ラＬ６抗体(ＣhiＬ６)は、マウスモノクローナル抗体で
あるＭｕＬ６に由来するモノクローナル抗体である。Ｍ
ｕＬ６は、ヒトの肺癌、乳癌および結腸癌に認められる
膜抗原(Ｌ６)を認識する。ＣhiＬ６を生成するため、Ｍ
ｕＬ６のＣ領域をヒトＩｇＧ１のＣ領域と置換した。得
られたキメラＬ６抗体は、約７０％がヒト由来であり、
約３０％はマウス由来である。Ｎａ131Ｉで標識したＣh
iＬ６は、乳癌を有するヒトにおいて骨髄を殆ど損なう
ことなく良好な腫瘍取込みを有することが示されてい
る。この抗体はまた、胸腺、肺、前立腺、卵巣および結
腸中の腫瘍にも結合することが示されている。
しく説明するが、本発明はこれらに限られるものではな
い。実施例１ 131 Ｉ−キメラＬ６モノクローナル抗体の安定化：キメ
ラＬ６抗体(ＣhiＬ６)は、マウスモノクローナル抗体で
あるＭｕＬ６に由来するモノクローナル抗体である。Ｍ
ｕＬ６は、ヒトの肺癌、乳癌および結腸癌に認められる
膜抗原(Ｌ６)を認識する。ＣhiＬ６を生成するため、Ｍ
ｕＬ６のＣ領域をヒトＩｇＧ１のＣ領域と置換した。得
られたキメラＬ６抗体は、約７０％がヒト由来であり、
約３０％はマウス由来である。Ｎａ131Ｉで標識したＣh
iＬ６は、乳癌を有するヒトにおいて骨髄を殆ど損なう
ことなく良好な腫瘍取込みを有することが示されてい
る。この抗体はまた、胸腺、肺、前立腺、卵巣および結
腸中の腫瘍にも結合することが示されている。
【００１３】131Ｉ−ＣhiＬ６をイオン交換樹脂で安定
化するため、異なる濃度のヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)
を用い、ＤＥＡＥ−セファデックスを使用しまたは使用
せずに、リン酸緩衝食塩水中で131Ｉ−ＣhiＬ６の試料
を調製し、栓をした試験管中に４℃または−７０℃で貯
蔵した。131Ｉ−ＣhiＬ６の濃度は、０.５〜１.５ｍｇ
／ｍｌおよび５〜１５ｍＣｉ／ｍｌの範囲であった。
131Ｉ−ＣhiＬ６の安定性をモニターするため、２つの
アッセイを行った。まず、ＴＳＫ３０００ＳＷゲル排除
カラム[フェノメネックス(Phenomenex)、トランス、カ
リフォルニア州]を用いたＨＰＬＣにより、131Ｉ−Ｃhi
Ｌ６の放射化学的純度(ＲＣＰ)を分析した。リン酸緩衝
食塩水(ｐＨ７.２)を用い、１ｍｌ／分の流速にてカラ
ムを均等に(isocratically)展開した。
化するため、異なる濃度のヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)
を用い、ＤＥＡＥ−セファデックスを使用しまたは使用
せずに、リン酸緩衝食塩水中で131Ｉ−ＣhiＬ６の試料
を調製し、栓をした試験管中に４℃または−７０℃で貯
蔵した。131Ｉ−ＣhiＬ６の濃度は、０.５〜１.５ｍｇ
／ｍｌおよび５〜１５ｍＣｉ／ｍｌの範囲であった。
131Ｉ−ＣhiＬ６の安定性をモニターするため、２つの
アッセイを行った。まず、ＴＳＫ３０００ＳＷゲル排除
カラム[フェノメネックス(Phenomenex)、トランス、カ
リフォルニア州]を用いたＨＰＬＣにより、131Ｉ−Ｃhi
Ｌ６の放射化学的純度(ＲＣＰ)を分析した。リン酸緩衝
食塩水(ｐＨ７.２)を用い、１ｍｌ／分の流速にてカラ
ムを均等に(isocratically)展開した。
【００１４】第二に、Ｈ３３４７細胞[ブリストル−マ
イヤーズ・スクイブ(Bristol−MyersSquibb)、癌遺伝子
部、シアトル、ワシントン州](Ｌ６抗体の抗原を発現す
る)の部分精製膜調製物から調製したアフィニティーカ
ラムを用い、131Ｉ−ＣhiＬ６抗体の免疫反応性を測定
した[リウ(Liu,A.Y.)ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA８
４、３４３９〜３４４３(１９８７)参照]。Ｌ６抗体の
抗原を発現する腫瘍および他の細胞株から得た膜調製物
も、この目的のために用いることができる[ヘルストロ
ーム(Hellstrom,I.)ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA８３、
７０５９〜７０６３(１９８６)]。
イヤーズ・スクイブ(Bristol−MyersSquibb)、癌遺伝子
部、シアトル、ワシントン州](Ｌ６抗体の抗原を発現す
る)の部分精製膜調製物から調製したアフィニティーカ
ラムを用い、131Ｉ−ＣhiＬ６抗体の免疫反応性を測定
した[リウ(Liu,A.Y.)ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA８
４、３４３９〜３４４３(１９８７)参照]。Ｌ６抗体の
抗原を発現する腫瘍および他の細胞株から得た膜調製物
も、この目的のために用いることができる[ヘルストロ
ーム(Hellstrom,I.)ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA８３、
７０５９〜７０６３(１９８６)]。
【００１５】膜調製物は下記の手順で調製した。フラス
コまたはローラーボトルからのＨ３３４７細胞を標準Ｅ
ＤＴＡ溶液を用いて回収し、ＰＢＳで洗浄した。細胞を
直ちに用いるか、または液体窒素中で凍結させ−７０℃
にて貯蔵した(凍結した細胞は、使用前に３７℃で解凍
した)。充填細胞１ｍｌ当たり４ｍｌの緩衝液を用い、
細胞を１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ(ｐＨ７.４)、５００μ
Ｍ ＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌアプロチニン中に懸濁
し、氷上で１５分間冷却した。ついで、５０ストローク
のダウンスホモジナイザーを用いてダウンスホモジナイ
ズした。別法として、動力ホモジナイザーを用いること
もできる。
コまたはローラーボトルからのＨ３３４７細胞を標準Ｅ
ＤＴＡ溶液を用いて回収し、ＰＢＳで洗浄した。細胞を
直ちに用いるか、または液体窒素中で凍結させ−７０℃
にて貯蔵した(凍結した細胞は、使用前に３７℃で解凍
した)。充填細胞１ｍｌ当たり４ｍｌの緩衝液を用い、
細胞を１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ(ｐＨ７.４)、５００μ
Ｍ ＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌアプロチニン中に懸濁
し、氷上で１５分間冷却した。ついで、５０ストローク
のダウンスホモジナイザーを用いてダウンスホモジナイ
ズした。別法として、動力ホモジナイザーを用いること
もできる。
【００１６】溶解液を２５００×ｇで５分間遠心分離に
かけて核および破砕物を除去し、上澄み液を別の試験管
に移し、１２,０００×ｇで３０分間遠心分離にかけ
た。膜はペレット中に存在した。５００μＭ ＰＭＳＦ
および１０μｇ／ｍｌアプロチニンを含有するＰＢＳ中
に膜ペレットを懸濁し、ブラッドフォードアッセイを用
いてタンパク質濃度を測定した。この膜懸濁液を凍結
し、−７０℃に保持して貯蔵した。ついで、これら膜調
製物をリアクティ(Reacti)−ゲルアガロースマトリック
ス[ピアス・ケミカル(Pierce Chemical Co.,)、ロック
フォード、イリノイ州、６１１０５]に結合させてアフ
ィニティーカラムを調製した。Ｈ３３４７細胞膜調製物
を室温にて０.１Ｍホウ酸ナトリウム(ｐＨ８.５)に対し
て６〜８時間透析した(２回緩衝液を交換した)。リアク
ティ−ゲルアガロースマトリックスをファットマン＃１
濾紙上で濾過し、２容量の０.１Ｍホウ酸ナトリウム(ｐ
Ｈ８.５)で５回洗浄した。
かけて核および破砕物を除去し、上澄み液を別の試験管
に移し、１２,０００×ｇで３０分間遠心分離にかけ
た。膜はペレット中に存在した。５００μＭ ＰＭＳＦ
および１０μｇ／ｍｌアプロチニンを含有するＰＢＳ中
に膜ペレットを懸濁し、ブラッドフォードアッセイを用
いてタンパク質濃度を測定した。この膜懸濁液を凍結
し、−７０℃に保持して貯蔵した。ついで、これら膜調
製物をリアクティ(Reacti)−ゲルアガロースマトリック
ス[ピアス・ケミカル(Pierce Chemical Co.,)、ロック
フォード、イリノイ州、６１１０５]に結合させてアフ
ィニティーカラムを調製した。Ｈ３３４７細胞膜調製物
を室温にて０.１Ｍホウ酸ナトリウム(ｐＨ８.５)に対し
て６〜８時間透析した(２回緩衝液を交換した)。リアク
ティ−ゲルアガロースマトリックスをファットマン＃１
濾紙上で濾過し、２容量の０.１Ｍホウ酸ナトリウム(ｐ
Ｈ８.５)で５回洗浄した。
【００１７】ゲル(充填容量)１ｍｌ当たり細胞膜１ｍｇ
の濃度にてＨ３３４７細胞膜調製物をリアクティ−ゲル
に加え、ゆるやかに撹拌しながら４℃にて一夜インキュ
ベートした。Ｈ３３４７細胞膜が結合したゲルをホウ酸
緩衝液で洗浄し、１％エタノールアミン(２−エタノー
ルアミン)を含有するホウ酸緩衝液中に再懸濁して残留
する活性部位をブロックし、ゆるやかに撹拌しながら４
℃にて一夜インキュベートした。得られたＨ３３４７リ
アクティ−ゲルアフィニティーマトリックスをＴＢＳ緩
衝液(２０ｍＭトリスＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐ
Ｈ７.２)で洗浄し、使用するときまで４℃で貯蔵した。
上記アフィニティーマトリックスをレイニンレーア−ロ
ック(Rainin Leur−Lock)カラムに充填することにより
２.５ｍｌＨ３３４７リアクティ−ゲルアフィニティー
カラムを調製した。このカラムを０.０２％ＮａＮ3を含
有するＰＢＳ緩衝液中に貯蔵した。
の濃度にてＨ３３４７細胞膜調製物をリアクティ−ゲル
に加え、ゆるやかに撹拌しながら４℃にて一夜インキュ
ベートした。Ｈ３３４７細胞膜が結合したゲルをホウ酸
緩衝液で洗浄し、１％エタノールアミン(２−エタノー
ルアミン)を含有するホウ酸緩衝液中に再懸濁して残留
する活性部位をブロックし、ゆるやかに撹拌しながら４
℃にて一夜インキュベートした。得られたＨ３３４７リ
アクティ−ゲルアフィニティーマトリックスをＴＢＳ緩
衝液(２０ｍＭトリスＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐ
Ｈ７.２)で洗浄し、使用するときまで４℃で貯蔵した。
上記アフィニティーマトリックスをレイニンレーア−ロ
ック(Rainin Leur−Lock)カラムに充填することにより
２.５ｍｌＨ３３４７リアクティ−ゲルアフィニティー
カラムを調製した。このカラムを０.０２％ＮａＮ3を含
有するＰＢＳ緩衝液中に貯蔵した。
【００１８】このアフィニティーカラムを用いて免疫反
応性を決定するため、約０.１μＣｉの標識抗体を該ア
フィニティーカラム上に適用した。この抗体を０.５ｍ
ｌの１０ｍＭリン酸緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ
７.２(ＰＢＳ)で洗浄し、ついで４５分間インキュベー
トした。このカラムを標準量(約１５ｍｌ)のＰＢＳ緩衝
液、ついで標準量(約６ｍｌ)の６Ｍグアニジン−ＨＣｌ
で洗浄した。このカラムからの溶出液をフラクションコ
レクターを用いてすべて回収し、すべてのチューブをカ
ウントした。免疫反応性の決定は、グアニジン−ＨＣｌ
の添加により回収した放射能カウントをカラムから溶出
した全カウントで除して１００倍することにより行い、
パーセントとして報告した。
応性を決定するため、約０.１μＣｉの標識抗体を該ア
フィニティーカラム上に適用した。この抗体を０.５ｍ
ｌの１０ｍＭリン酸緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ
７.２(ＰＢＳ)で洗浄し、ついで４５分間インキュベー
トした。このカラムを標準量(約１５ｍｌ)のＰＢＳ緩衝
液、ついで標準量(約６ｍｌ)の６Ｍグアニジン−ＨＣｌ
で洗浄した。このカラムからの溶出液をフラクションコ
レクターを用いてすべて回収し、すべてのチューブをカ
ウントした。免疫反応性の決定は、グアニジン−ＨＣｌ
の添加により回収した放射能カウントをカラムから溶出
した全カウントで除して１００倍することにより行い、
パーセントとして報告した。
【００１９】Ｈ３３４７アフィニティーカラムのための
最適アフィニティーカラム手順は、以下の工程からなっ
ていた：(１)１％ＨＳＡを含有するＰＢＳ緩衝液(１０
ｍｌ）でカラムを洗浄し；（２)放射性標識Ｌ６(１０
０,０００ｃｐｍ)をカラムに適用し、溶出液を回収し；
(３)カラムをＰＢＳ緩衝液(０.５ｍｌ)で洗浄し、溶出
液を回収し；(４)ＰＢＳ緩衝液(０.５ｍｌ)をカラム上
に適用し、該カラムを室温にて４５分間インキュベート
し；(５)カラムをＰＢＳ緩衝液(１５ｍｌ)で洗浄し、１
０×１ｍｌフラクションを回収し；(６)６Ｍグアニジン
ＨＣｌで抗体を溶出し、６×１ｍｌフラクションを回収
し；(７)カラムをＰＢＳ緩衝液(９ｍｌ)で洗浄し、９×
１ｍｌフラクションを回収し；(８)ＮａＮ3を含有する
ＰＢＳ緩衝液中でカラムを貯蔵し；ついで(９)結合％
(結合％＝グアニジンにより溶出したｃｐｍ／回収した
全ｃｐｍ)を計算する。
最適アフィニティーカラム手順は、以下の工程からなっ
ていた：(１)１％ＨＳＡを含有するＰＢＳ緩衝液(１０
ｍｌ）でカラムを洗浄し；（２)放射性標識Ｌ６(１０
０,０００ｃｐｍ)をカラムに適用し、溶出液を回収し；
(３)カラムをＰＢＳ緩衝液(０.５ｍｌ)で洗浄し、溶出
液を回収し；(４)ＰＢＳ緩衝液(０.５ｍｌ)をカラム上
に適用し、該カラムを室温にて４５分間インキュベート
し；(５)カラムをＰＢＳ緩衝液(１５ｍｌ)で洗浄し、１
０×１ｍｌフラクションを回収し；(６)６Ｍグアニジン
ＨＣｌで抗体を溶出し、６×１ｍｌフラクションを回収
し；(７)カラムをＰＢＳ緩衝液(９ｍｌ)で洗浄し、９×
１ｍｌフラクションを回収し；(８)ＮａＮ3を含有する
ＰＢＳ緩衝液中でカラムを貯蔵し；ついで(９)結合％
(結合％＝グアニジンにより溶出したｃｐｍ／回収した
全ｃｐｍ)を計算する。
【００２０】上記方法を用い、ＤＥＡＥ−セファデック
スおよび種々の濃度のＨＳＡ(１％、２％および５％)の
存在下、ＤＥＡＥ−セファデックスを用いまたは用いな
い場合の４℃での131Ｉ−ＣhiＬ６抗体の安定性を、１
％ＨＳＡの存在下、ＤＥＡＥ−セファデックスの不在下
で−７０℃での131Ｉ−ＣhiＬ６抗体の安定性と比較し
た。表１から明らかなように、131Ｉ−ＣhiＬ６抗体は
ＤＥＡＥ−セファデックスによって有意の程度安定化さ
れ、５％ＨＳＡおよびＤＥＡＥ−セファデックスを含有
する試料は７日後に最大の安定性を示し、この安定性は
−７０℃で７日後に観察された安定性に匹敵するもので
あった。125Ｉ−ＣhiＬ６の安定性についても、種々の
量のＤＥＡＥ−セファデックスの存在下で調べた。詳し
くは、充填ゲルに対する抗体比が１：０.５および１：
１(ｖ：ｖ)にて、１％ＨＳＡを含有する125Ｉ−ＣhiＬ
６溶液(比活性は１３.９ｍＣｉ／ｍｇ)にＤＥＡＥ−セ
ファデックスを加えた。表２から明らかなように、両方
の濃度のＤＥＡＥ−セファデックスとも125Ｉ−ＣhiＬ
６抗体を安定化した。
スおよび種々の濃度のＨＳＡ(１％、２％および５％)の
存在下、ＤＥＡＥ−セファデックスを用いまたは用いな
い場合の４℃での131Ｉ−ＣhiＬ６抗体の安定性を、１
％ＨＳＡの存在下、ＤＥＡＥ−セファデックスの不在下
で−７０℃での131Ｉ−ＣhiＬ６抗体の安定性と比較し
た。表１から明らかなように、131Ｉ−ＣhiＬ６抗体は
ＤＥＡＥ−セファデックスによって有意の程度安定化さ
れ、５％ＨＳＡおよびＤＥＡＥ−セファデックスを含有
する試料は７日後に最大の安定性を示し、この安定性は
−７０℃で７日後に観察された安定性に匹敵するもので
あった。125Ｉ−ＣhiＬ６の安定性についても、種々の
量のＤＥＡＥ−セファデックスの存在下で調べた。詳し
くは、充填ゲルに対する抗体比が１：０.５および１：
１(ｖ：ｖ)にて、１％ＨＳＡを含有する125Ｉ−ＣhiＬ
６溶液(比活性は１３.９ｍＣｉ／ｍｇ)にＤＥＡＥ−セ
ファデックスを加えた。表２から明らかなように、両方
の濃度のＤＥＡＥ−セファデックスとも125Ｉ−ＣhiＬ
６抗体を安定化した。
【００２１】高比活性131Ｉ−ＣhiＬ６(表３)および低
比活性131Ｉ−ＣhiＬ６(表４)を安定化するＤＥＡＥ−
セファデックスの安定性についても調べた。ＤＥＡＥ−
セファデックスは高比活性および低比活性131Ｉ−Ｃhi
Ｌ６の両方とも安定化することができ、２＋容量のＤＥ
ＡＥ−セファデックスを用いた試料が４℃で最も高い安
定性の増大を示した。
比活性131Ｉ−ＣhiＬ６(表４)を安定化するＤＥＡＥ−
セファデックスの安定性についても調べた。ＤＥＡＥ−
セファデックスは高比活性および低比活性131Ｉ−Ｃhi
Ｌ６の両方とも安定化することができ、２＋容量のＤＥ
ＡＥ−セファデックスを用いた試料が４℃で最も高い安
定性の増大を示した。
【００２２】
【表１】
【００２３】
【表２】
【００２４】
【表３】
【００２５】
【表４】
【図１】 図１は、本発明の方法に用いる、イオン交換
樹脂を用いた放射性標識した生物学的分子の安定化のた
めの装置である。
樹脂を用いた放射性標識した生物学的分子の安定化のた
めの装置である。
１ 溶出緩衝液バイアル ２ 溶出緩衝液 ３,１３ ゴム栓 ４,５,１１ コック栓 ６ カラム装置 ７ シール ８ イオン交換樹脂 ９ 粗フィルター １０ ０.２２μＭフィルター １２ 回収バイアル １４ 通気孔 １５,１７ 針 １６ 管
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 フレツド・ヨスト アメリカ合衆国ニユージヤージー州ロン グ・バリー、クエイル・ラン３番 (72)発明者 メイ−リ・ウエン アメリカ合衆国ニユージヤージー州ノー ス・ブランズウイツク、キヤツスル・コー ト６番 (72)発明者 エレーヌ・ジヤゴダ アメリカ合衆国ニユージヤージー州ノー ス・ブランズウイツク、バーゲン・アベニ ユー965番
Claims (15)
- 【請求項１】 放射性標識した生物学的分子をイオン交
換樹脂と接触させ、ついで該放射性標識した生物学的分
子を該イオン交換樹脂と接触させたままにして該放射性
標識した生物学的分子を安定化する、ことを特徴とする
放射性標識した生物学的分子の安定化方法。 - 【請求項２】 該放射性標識した生物学的分子が、放射
性標識した抗体またはその断片である、請求項１に記載
の方法。 - 【請求項３】 該放射性標識した抗体が放射性標識した
モノクローナル抗体である、請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 該放射性標識した生物学的分子が、放射
性標識したＤＮＡ分子、放射性標識したＲＮＡ分子、放
射性標識したペプチド、放射性標識したポリペプチド、
放射性標識したホルモンおよび放射性標識したタンパク
質よりなる群から選ばれたものである、請求項１に記載
の方法。 - 【請求項５】 該放射性標識した生物学的分子の放射性
標識が、125Ｉ、131Ｉ、90Ｙ、64Ｃｕおよび212Ｂｉよ
りなる群から選ばれたものである、請求項１に記載の方
法。 - 【請求項６】 該イオン交換樹脂が陰イオン交換樹脂で
ある、請求項１に記載の方法。 - 【請求項７】 該陰イオン交換樹脂がＤＥＡＥ−セファ
デックスである、請求項６に記載の方法。 - 【請求項８】 該放射性標識した生物学的分子を緩衝溶
液中に溶解し、ついで該イオン交換樹脂と接触させる、
請求項１に記載の方法。 - 【請求項９】 該緩衝溶液がリン酸緩衝食塩水である、
請求項８に記載の方法。 - 【請求項１０】 該緩衝溶液中の緩衝液の濃度が約１０
ｍＭ〜約５０ｍＭである、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１１】 該緩衝溶液のｐＨが約６.５〜約７.５
である、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１２】 該緩衝溶液の容量が該イオン交換樹脂
の容量の約５０％〜約９０％である、請求項８に記載の
方法。 - 【請求項１３】 該緩衝溶液の容量が該イオン交換樹脂
の容量の約８０％である、請求項１２に記載の方法。 - 【請求項１４】 該放射性標識した生物学的分子を該イ
オン交換樹脂から回収する工程をさらに含む、請求項１
に記載の方法。 - 【請求項１５】 該イオン交換樹脂からの該放射性標識
した生物学的分子の回収を緩衝溶液を用いて溶出するこ
とにより行う、請求項１４に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US69417491A | 1991-05-01 | 1991-05-01 | |
| US694174 | 1991-05-01 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05149953A true JPH05149953A (ja) | 1993-06-15 |
Family
ID=24787713
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10436792A Withdrawn JPH05149953A (ja) | 1991-05-01 | 1992-04-23 | イオン交換樹脂を用いた放射性標識した生物学的分子の安定化法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0513510A1 (ja) |
| JP (1) | JPH05149953A (ja) |
| CA (1) | CA2065771A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010538762A (ja) * | 2007-09-13 | 2010-12-16 | モレキュラ インサイト ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド | 放射性物質とともに使用するための輸注および移送システム |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| HU225723B1 (en) | 2001-03-21 | 2007-07-30 | Izotop Intezet Kft | Method for covering of plastic material |
| HUP0101921A2 (hu) * | 2001-05-10 | 2004-01-28 | Izotóp Intézet Kft | Radioaktívan jelzett nukleotido/ka/t tartalmazó preparátumok és eljárás azok előállítására |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4390517A (en) * | 1979-12-19 | 1983-06-28 | New England Nuclear Corporation | Method, composition and kit for stabilizing radiolabeled compounds |
| US4935222A (en) * | 1986-06-13 | 1990-06-19 | University Of Cincinnati | Procedure for isolating and purifying radioactive ligated rhenium pharmaceuticals and use thereof and kit |
| ATE157262T1 (de) * | 1989-10-12 | 1997-09-15 | Mallinckrodt Medical Inc | Radiosynovektomiezusammensetzungen |
-
1992
- 1992-04-01 EP EP92105598A patent/EP0513510A1/en not_active Withdrawn
- 1992-04-10 CA CA002065771A patent/CA2065771A1/en not_active Abandoned
- 1992-04-23 JP JP10436792A patent/JPH05149953A/ja not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010538762A (ja) * | 2007-09-13 | 2010-12-16 | モレキュラ インサイト ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド | 放射性物質とともに使用するための輸注および移送システム |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2065771A1 (en) | 1992-11-02 |
| EP0513510A1 (en) | 1992-11-19 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 19990706 |