JPH048299A - Measurement of alkali phosphatase - Google Patents
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Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、例えばＥＩＡ （エンザイムイムノアッセイ
）等の酵素を指標として試料中の特定物質を測定する方
法において頻繁に使用されるアルカリ性フォスファター
ゼ（ＥＣ３，１Ｊ、１．）の、発光法による測定方法を
提供するものである。Detailed Description of the Invention (Industrial Application Field) The present invention is directed to the use of alkaline phosphatase (EC3, 1J, 1.) by a luminescence method.
また、例えば前記ＥＩＡ等の手法においては、測定され
るべきＡＬＰの量は即ち試料中の特定物質の量に相関し
ている。従って本発明は更に、ＡＬＰの発光法による測
定工程を含む試料中の特定物質の測定方法をも提供する
ものである。Furthermore, for example, in methods such as the above-mentioned EIA, the amount of ALP to be measured is correlated with the amount of a specific substance in the sample. Therefore, the present invention further provides a method for measuring a specific substance in a sample, which includes a step of measuring by ALP luminescence method.
（発明の背景）
ＥＩＡ等の酵素を標識として試料中の特定物質を測定す
る方法において、安定性が良い、比活性が高い、ターン
・オーバー数が高い（検出感度が高い）という理由から
、ＡＬＰが頻繁に使用されている。(Background of the invention) In methods such as EIA that measure specific substances in samples using enzymes as labels, ALP is used because of its good stability, high specific activity, and high turnover number (high detection sensitivity). is frequently used.
ＡＬＰの測定は、従来、パラニトロフェニルフォスフｘ
−） （ｐ−ｎ１ｔｏｒｏｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈ
ａｔｅ）等を使用する比色法（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ
Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ａｎａ
ｌｙｓｊｓ、（１９７８）ＰＬ５１〜１Ｇ［Ｉ Ｍａｒ
ｃｅｌｌ Ｄｅｃｋｋｅｒ、Ｉｎｃ、（Ｎ、Ｙ） ）
、４−メチルウンベリフェリルフォスフニー ） （４
−＋ｇｅｔｈｙｌｕｎｂｅｒ１ｆ’ｆ’ｅｒｉｒｕｐｈ
ｏｓｐｈａｔｅ）を使用する蛍光法（Ｈａｎｄｂｏｏｋ
ｏｆ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ
Ａｎａｌｙｓｉｓ、（１９７Ｂ）Ｐ１５１＝ＩＢＯＭａ
ｒｅｅｌｌ Ｄｅｃｋｋｅｒ、Ｉｎｃ、（Ｎ、Ｙ） ）
等により行われている。Conventionally, ALP measurement has been carried out using paranitrophenylphosph
-) (p-n1torophenylphosph
Colorimetric method (Handbook of
Enzymatic Methods of Ana
lysjs, (1978) PL51-1G [I Mar
cell Decker, Inc. (N,Y))
, 4-methylumbelliferyl phosphini) (4
-+gethylumber1f'f'eriruph
Fluorescence method using osphate (Handbook
of Enzymatic Methods of
Analysis, (197B) P151=IBOMa
reell Decker, Inc. (N,Y))
etc.
ところでＡＬＰのような酵素を測定する方法においては
、−数的に蛍光法では比色法の１００倍の感度を達成可
能であり、更に発光法は蛍光法の１００倍の感度を達成
することが可能であると言われている（Ｊ、Ｃｌ１ｎ、
Ｌａｂ、Ａｎａｌ、３３１６−３２２（１９８９） Ｉ
。By the way, in the methods of measuring enzymes such as ALP, numerically the fluorescence method can achieve 100 times the sensitivity of the colorimetric method, and the luminescence method can also achieve 100 times the sensitivity of the fluorescence method. It is said that it is possible (J, Cl1n,
Lab, Anal, 3316-322 (1989) I
.
Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ ＆、 Ｌ、Ｊ、Ｋｒ１ｃｋａ）。Bronstein & L. J. Kr1cka).
従って、より高感度の測定方法を提供する目的で発光法
による測定方法が検討されている。Therefore, in order to provide a measurement method with higher sensitivity, a measurement method using a luminescence method is being considered.
（発明の構成）
以上のような状況に鑑みて本発明者は、アスコルビン酸
をアルカリ性条件下でルシゲニント接触させることで化
学的な発光が生じることに注目し、本発明を完成させる
に至った。即ち本発明は、測定されるべきＡＬＰにアス
コルビン酸−２−リン酸エステルを接触させてアスコル
ビン酸を生じさせる工程、生じたアスコルビン酸にルシ
ゲニンを接触させて光を生じさせる工程及び生じた光を
測定する工程とからなるＡＬＰの測定方法を提供するも
のである。(Structure of the Invention) In view of the above-mentioned circumstances, the present inventors have focused on the fact that chemical luminescence occurs when ascorbic acid is brought into contact with lucigenin under alkaline conditions, and have completed the present invention. That is, the present invention comprises a step of bringing ascorbic acid-2-phosphate into contact with ALP to be measured to produce ascorbic acid, a step of bringing the produced ascorbic acid into contact with lucigenin to produce light, and a step of bringing the produced light into contact with lucigenin. The present invention provides a method for measuring ALP, which comprises a step of measuring.
また前述したように、ＡＬＰの測定は例えば血液中の特
定抗原や試料中の特定の塩基配列を有するＤＮＡの測定
といった、試料中の特定物質の測定の一部分として実施
されることがある。従って本発明は、試料中の特定物質
の測定方法であって、少なくとも特定物質、特定物質に
対して親和性を有する物質及び測定されるべきＡＬＰか
らなる複合体を形成させる工程、複合体を形成していな
い測定されるべきＡＬＰを分離する工程、複合体を形成
しているかあるいは複合体を形成していないＡＬＰのい
ずれか又は両方にアスコルビン酸−２−リン酸エステル
を接触させてアスコルビン酸を生じさせる工程、生じた
アスコルビン酸にルシゲニンを接触させて光を生じさせ
る工程及び生じた光を測定する工程とからなる方法又は
試料中の特定物質の測定方法であって、特定物質又は特
定物質に対して親和性を有する物質との結合において特
定物質と同等の能力を有する物質、と測定されるべきＡ
ＬＰから形成される既知量の複合体を特定物質に対して
親和性を有する物質に対し特定物質と共に競合的に結合
させる工程、特定物質に対して親和性を有する物質と結
合しなかった、特定物質又は特定物質に対して親和性を
有する物質との結合において特定物質と同等の能力を有
するる物質、と測定されるべきＡＬＰから形成された前
記複合体を分離する工程、特定物質に対して親和性を有
する物質と結合しなかった、特定物質あるいは特定物質
に対して親和性を有する物質との結合において特定物質
と同等の能力を有する物質、と測定されるべきＡＬＰか
ら形成された前記複合体又は特定物質に対して親和性を
有する物質と結合した測定されるべきＡＬＰのいずれか
一方又は両方にアスコルビン酸−２−リン酸エステルを
接触させてアスコルビン酸を生じさせる工程、生じたア
スコルビン酸にルシゲニンを接触させて光を生じさせる
工程及び生じた光を測定する工程とからなる方法。Furthermore, as described above, ALP measurement may be performed as part of the measurement of a specific substance in a sample, such as measurement of a specific antigen in blood or DNA having a specific base sequence in a sample. Therefore, the present invention provides a method for measuring a specific substance in a sample, comprising a step of forming a complex consisting of at least a specific substance, a substance having an affinity for the specific substance, and ALP to be measured; The step of separating ALP to be measured that has not been carried out is ascorbic acid by contacting ascorbic acid-2-phosphate with either or both of ALP that has formed a complex and that has not formed a complex. A method for measuring a specific substance in a sample, comprising a step of bringing lucigenin into contact with the generated ascorbic acid to generate light, and a step of measuring the generated light, or a method for measuring a specific substance in a sample. A that should be measured as a substance that has the same ability as a specific substance in binding with substances that have an affinity for
A process in which a known amount of a complex formed from LP is competitively bound to a substance that has an affinity for a specific substance together with a specific substance; a step of separating the complex formed from ALP to be measured as a substance or a substance having the same ability as the specific substance in binding to a substance having an affinity for the specific substance; The complex formed from ALP to be measured as a specific substance that did not bind to a substance that has affinity or a substance that has the same ability as a specific substance in binding to a substance that has affinity for a specific substance. A step of producing ascorbic acid by bringing an ascorbic acid-2-phosphate into contact with one or both of ALP to be measured bound to a substance having an affinity for the body or a specific substance, the produced ascorbic acid A method comprising the steps of: contacting lucigenin to produce light; and measuring the produced light.
本発明は更に、これらの測定方法を実施するための測定
キットを提供するものである。以下、本発明の詳細な説
明する。The present invention further provides a measurement kit for carrying out these measurement methods. The present invention will be explained in detail below.
本発明は、アスコルビン酸２−リン酸エステルをＡＬＰ
の酵素基質として使用し、生じるアルコルビン酸とルシ
ゲニンが接触して生じる発光の光量からＡＬＰの量を測
定するものである。The present invention provides a method for converting ascorbic acid 2-phosphate into ALP.
The amount of ALP is measured from the amount of light emitted when ascorbic acid and lucigenin come into contact with each other.
アスコルビン酸２−リン酸エステルは、例えば特公昭５
２−１８１９１号公報、特公昭５９−４４３８号公報、
特公昭６３−２１４１９０号公報、昭和６３年度農芸化
学会講演要旨集第４８頁、平成２年度農芸化学会講演要
旨集電１３７頁等の記載から合成することが可能である
。Ascorbic acid 2-phosphate ester, for example,
Publication No. 2-18191, Japanese Patent Publication No. 59-4438,
It is possible to synthesize it from the descriptions in Japanese Patent Publication No. 63-214190, the 1986 Society of Agricultural Chemistry Abstracts, page 48, the 1990 Society of Agricultural Chemistry Abstracts, page 137, etc.
アスコルビン酸２−リン酸エステルとＡＬＰはＡＬＰが
酵素活性を発現し得る範囲のｐＨ（８，０〜１１．０）
で接触させれば良く、その際の他の反応液の組成等に特
別の制限はない。ここで、アスコルビン酸２−リン酸エ
ステルとＡＬＰを接触させた後、アスコルビン酸が十分
生じるような反応時間を与えると良い。Ascorbic acid 2-phosphate ester and ALP are used at a pH within the range where ALP can express enzymatic activity (8.0 to 11.0).
There is no particular restriction on the composition of other reaction liquids at that time. Here, after bringing the ascorbic acid 2-phosphate ester and ALP into contact, it is preferable to give a reaction time that is sufficient to generate ascorbic acid.
以上の工程により生じるアスコルビン酸が、アルカリ性
条件下でルシゲニンと接触することで発光が生じるが、
この際の反応溶液はルシゲニンが発光を生じる範囲の＄
））Ｉ（１１以上）であればその他の組成等に特別の制
限はない。Luminescence occurs when the ascorbic acid produced in the above steps comes into contact with lucigenin under alkaline conditions.
The reaction solution at this time is $ within the range where lucigenin emits light.
)) There are no particular restrictions on other compositions as long as I (11 or more).
以上の工程は、アスコルビン酸２−リン酸を含む第１の
反応溶液及びルシゲニンを含む第２の反応溶液を別途準
備し、測定されるべきＡＬＰを含む試料溶液について順
次これらを添加することて実施することが出来る。一方
、これら２つの工程は、単一の操作で実施することも出
来る。即ち、測定されるべきＡＬＰと含む試料に対して
アスコルビン酸２−リン酸及びルシゲニンを添加し、少
なくとも測定されるべきＡＬＰＮアスコルビン酸２−リ
ン酸エステル及びルシゲニンが共存させ、アルコルビン
酸を生じさせかつ生じたアスコルビン酸とルシゲニンの
接触により発光を生じさせることも出来るのである。こ
のように、２つの工程を１つの操作で行うことにより、
より簡便、迅速に本発明を実施することが可能となる。The above steps are carried out by separately preparing a first reaction solution containing ascorbic acid 2-phosphate and a second reaction solution containing lucigenin, and sequentially adding these to the sample solution containing ALP to be measured. You can. On the other hand, these two steps can also be performed in a single operation. That is, ascorbic acid 2-phosphate and lucigenin are added to a sample containing ALP to be measured, and at least ALPN ascorbic acid 2-phosphate and lucigenin to be measured coexist to produce ascorbic acid and Luminescence can also be caused by contact between the resulting ascorbic acid and lucigenin. In this way, by performing two steps in one operation,
It becomes possible to implement the present invention more easily and quickly.
ルシゲニンとアスコルビン酸が接触して生じる発光の測
定は、通常のルシノメーター等を用いてルシゲニン試薬
を分注後、一定時間後からの一定時間の発光を積算して
＃Ｊ定するなどすれば良く、特別の操作は必要としない
。ま゛た、測定結果からＡＬＰ量を決定するには、既知
量のＡＬＰに由来する発光を測定することで作成される
標準曲線と比較するなどすれば良い。The luminescence produced when lucigenin and ascorbic acid come into contact can be measured by dispensing the lucigenin reagent using an ordinary lucinometer, and then calculating #J by integrating the luminescence over a given period of time. No special operation is required. Furthermore, in order to determine the amount of ALP from the measurement results, it is sufficient to compare it with a standard curve created by measuring luminescence derived from a known amount of ALP.
以上の工程からなる本発明の方法は、測定されるべきＡ
ＬＰが単独で存在している場合は勿論、ＡＬＰが核酸、
抗原、抗体、アビジン、リガンド又はレセプターと結合
していても、その結合がＡＬＰの酵素活性を阻害しない
ものである限り可能である。The method of the present invention, which consists of the above steps, is based on the A to be measured.
Of course, when LP exists alone, ALP is a nucleic acid,
It is possible to bind to an antigen, antibody, avidin, ligand, or receptor as long as the binding does not inhibit the enzymatic activity of ALP.
本発明が提供するＡＬＰの測定方法は、前述のように、
試料中の特定物質を測定する場合の一部分でもある。以
下に、本発明のＡＬＰの測定方法を含む試料中の特定物
質の測定方法について説明する。As mentioned above, the method for measuring ALP provided by the present invention includes:
It is also a part of measuring a specific substance in a sample. Below, methods for measuring a specific substance in a sample, including the method for measuring ALP of the present invention, will be explained.
本発明でいう特定物質とは、例えば抗原、抗体、アビジ
ン、リガンド、レセプター、核酸等の、血液や細胞抽出
液等の生体試料中に天然に又は何らかの疾病やウィルス
感染に相関して観察される物質等を意味するものである
。The specific substances referred to in the present invention are, for example, antigens, antibodies, avidin, ligands, receptors, nucleic acids, etc. that are observed naturally in biological samples such as blood or cell extracts or in correlation with some disease or virus infection. It means substance, etc.
本発明で提供される試料中の特定物質の測定方法は、前
述したＡＬＰの測定方法における２つの工程に先立ち、
更に、少なくとも特定物質、特定物質に対して親和性を
有する物質および測定されるべきＡＬＰからなる複合体
を形成させる工程及び複合体を形成していない測定され
るべきＡＬＰを分離する工程を行うものである。The method for measuring a specific substance in a sample provided by the present invention includes, prior to the two steps in the method for measuring ALP described above,
Furthermore, a method that performs a step of forming a complex consisting of at least a specific substance, a substance having an affinity for the specific substance, and ALP to be measured, and a step of separating ALP to be measured that does not form a complex. It is.
特定物質に対して親和性を有する物質とは、例えば特定
物質が蛋白質性の物質である場合には抗体や抗原等が例
示でき、核酸である場合には当該核酸に相補的な核酸が
例示できる。また例えば特定物がサイトカイニンである
場合にはそのレセプター等をも意味する。更には特定物
質が薬物や酵素である場合には、阻害作用を有する化学
物質や低分子蛋白質等も例示できる。Examples of substances that have an affinity for a specific substance include antibodies and antigens when the specific substance is a proteinaceous substance, and examples of substances that have an affinity for a specific substance include a nucleic acid complementary to the nucleic acid when the specific substance is a proteinaceous substance. . For example, when the specific substance is cytokinin, it also means its receptor, etc. Further, when the specific substance is a drug or an enzyme, chemical substances having an inhibitory effect, low molecular weight proteins, etc. can also be exemplified.
以下、本発明が提供する試料中の特定物質の測定方法を
、ＥＩＡにおけるサンドイツチ法又は競合法を例として
より具体的に説明する。Hereinafter, the method for measuring a specific substance in a sample provided by the present invention will be explained in more detail using the Sanderuch method or the competitive method in EIA as an example.
まず、サンドイツチ法においては、測定されるべきＡＬ
Ｐを特定物質に対して親和性を有する前記の物質に直接
又は間接的に結合させ、これを特定物質と接触させる。First, in the Sanderuch method, the AL to be measured is
P is directly or indirectly bound to the above-mentioned substance that has an affinity for the specific substance, and this is brought into contact with the specific substance.
この操作により、特定物質と特定物質に対して親和性を
有する物質及びα１定されるべきＡＬＰにより複合体が
形成される。Through this operation, a complex is formed by the specific substance, the substance having an affinity for the specific substance, and the ALP to be α1 determined.
好ましくはＡＬＰと特定物質に対して親和性を有する物
質は予め結合されていると良いが、例えばＡＬＰに対し
、特定物質に対して親和性を有する物質と結合し得る物
質を結合させておき、特定物質と特定物質に対して親和
性を有する物質で構成される複合体に、更に測定される
べきＡＬＰを結合させても良い。Preferably, ALP and a substance that has an affinity for a specific substance are bound in advance; for example, a substance that can bind to a substance that has an affinity for a specific substance is bound to ALP, ALP to be measured may be further bound to a complex composed of a specific substance and a substance having an affinity for the specific substance.
続いて前述のような複合体を形成していない測定されべ
きＡＬＰを分離する。なお、本発明において、一定の条
件下では複合体を形成したＡＬＰのみならず、複合体を
形成していない、分離されるべきＡＬＰを測定すること
によっても特定物質を測定することが可能な場合がある
。従って本明細書では、分離されるされるＡＬＰをも便
宜上測定されるべきＡＬＰと記載する。Subsequently, the ALP to be measured that does not form a complex as described above is separated. In addition, in the present invention, when it is possible to measure a specific substance under certain conditions not only by measuring ALP that has formed a complex, but also by measuring ALP that has not formed a complex and is to be separated. There is. Therefore, in this specification, the ALP to be separated is also referred to as the ALP to be measured for convenience.
複合体を形成していないＡＬＰは、例えば特定物質に対
して親和性を有する物質であり、当該複合体中の特定物
質に対して親和性を有する物質とは異なる部位で特定物
質と結合する物質を用いることで容品に除去することが
できる。即ち、特定物質、特定物質に対して親和性を有
する物質及び測定されるべきＡＬＰから形成される複合
体を、例えば反応空間を提供する反応管やビーズ等の固
相に固定化することで不溶化した、いわば第２の特定物
質に対して親和性を有する物質と反応させて不溶化する
のである。一方、複合体を形成していない、測定される
べきＡＬＰは、なお反応溶液中に溶解しているから、例
えば当該反応溶液を除去したりすることでこの工程は達
成される。その他にも、複合体と複合体を形成していな
い測定されるべきＡＬＰの分子量の差を利用して、例え
ばゲル濾過等の方法を適用しても良い。ALP that does not form a complex is, for example, a substance that has an affinity for a specific substance, and a substance that binds to the specific substance at a site different from that of the substance that has an affinity for the specific substance in the complex. It can be removed into the container by using . That is, a complex formed from a specific substance, a substance with an affinity for the specific substance, and ALP to be measured is insolubilized by immobilizing it on a solid phase such as a reaction tube or beads that provides a reaction space. In other words, the second specific substance is made insoluble by reacting with a substance that has an affinity for it. On the other hand, since the ALP to be measured that has not formed a complex is still dissolved in the reaction solution, this step is accomplished, for example, by removing the reaction solution. In addition, a method such as gel filtration may be applied by utilizing the difference in molecular weight between the complex and non-complexed ALP to be measured.
以上のようにして、特定物質と複合体を形成したＡＬＰ
と複合体を形成していない複合体を分離した後に、前述
したようにしてアスコルビン酸２−リン酸エステルを接
触させ、続いて生じたアスコルビン酸にルシゲニンを接
触させる。通常は特定物質と複合体を形成している測定
されるべきＡＬＰに対してこの工程を実施するが、特定
物質と複合体を形成させる際に使用した測定されるべき
ＡＬＰの量が既知である場合には、分離された測定され
るべきＡＬＰに対してこの工程を実施しても良い。ALP formed into a complex with a specific substance as described above
After separating the non-complexed complex, ascorbic acid 2-phosphate is contacted with the ascorbic acid 2-phosphate as described above, and the resulting ascorbic acid is then contacted with lucigenin. Usually, this step is performed on ALP to be measured that has formed a complex with a specific substance, but the amount of ALP to be measured used to form a complex with a specific substance is known. In some cases, this step may be performed on the separated ALP to be measured.
以上のような試料中の特定物質の測定方法においては、
特定物質、特定物質に対して親和性を有する物質及び測
定されるべきＡＬＰが形成する複合体中の特定物質とさ
れるべきＡＬＰの比率を容易に一定制御することが可能
である。従って、前述のようにルシゲニンからの発光の
光量を測定し、既知のＡＬＰを使用して作成された標準
曲線等からＡＬＰ量を決定することができれば、複合体
を形成した特定物質の量をも決定することができるので
ある。以上のサンドイツチ法及び以下の競合法の原理に
ついては、例えば５ｃａｎｄ、Ｊ、 １ｍｍｕｎ。In the method for measuring a specific substance in a sample as described above,
It is possible to easily control the ratio of the specific substance to ALP in the complex formed by the specific substance, the substance having an affinity for the specific substance, and the ALP to be measured. Therefore, if it is possible to measure the amount of light emitted from lucigenin as described above and determine the amount of ALP from a standard curve created using known ALP, it is possible to determine the amount of the specific substance that has formed the complex. It is possible to decide. Regarding the principle of the above Sanderuch method and the following competing method, see, for example, 5cand, J, 1mmun.
１、Ｉｌ、７．（１９７Ｂ）Ｅ、１ｓｈｉｋａｖａ ｅ
ｔ ａｌ、）等に記載されている。1, Il, 7. (197B) E, 1shikava e
tal, ) etc.
本発明の試料中の特定物質の測定方法は、前記したサン
ドイツチ法以外にも例えば次のような競合法によっても
実施することが可能である。The method of measuring a specific substance in a sample according to the present invention can be carried out by, for example, the following competitive method in addition to the Sanderch method described above.
競合法においては、測定されるべきＡＬＰをまず別途調
製された特定物質と結合させ、まず、既知量の特定物質
及び測定されるべきＡＬＰからなる複合体と試料中の特
定物質を特定物質に対して親和性を有する物質に対して
競合的に結合させる工程を実施する。ここで、測定され
るべきＡＬＰと結合させる特定物質は、試料中に存在す
る特定物質と完全に同一の物理学的性質を有する必要は
なく、前記特定物質に対して親和性を有する物質との結
合において特定物質と同等の能力を有するものであれば
良い。例えば、特定物質が蛋白質であり特定物質に対し
て親和性を有する物質が抗体である場合には、特定物質
と同等の能力を有する物質としては当該抗体との免疫反
応において特定物質と同等の結合性を有するペプチド（
ハブテン）を使用することが例示できる。In the competitive method, ALP to be measured is first combined with a specific substance prepared separately, and a complex consisting of a known amount of the specific substance and the ALP to be measured and the specific substance in the sample are combined with the specific substance. A step of competitively binding to a substance with affinity is carried out. Here, the specific substance to be bound to ALP to be measured does not need to have completely the same physical properties as the specific substance present in the sample, and it is not necessary to have the same physical properties as the specific substance that is present in the sample. Any material having the same binding ability as the specific substance may be used. For example, if the specific substance is a protein and the substance that has affinity for the specific substance is an antibody, a substance that has the same ability as the specific substance can bind to the specific substance in an immune reaction with the antibody. Peptides with sexual properties (
An example of this is to use a
以上の工程により、使用した特定物質及び測定されるべ
きＡＬＰからなる複合体量と試料中の特定物質量の比に
相関して、特定物質に対して親和性を有する物質、特定
物質及び測定されるべきＡＬＰから構成される複合体と
特定物質に対して親和性を有する物質及び特定物質から
構成される複合体が形成される。Through the above steps, a substance having an affinity for a specific substance, a specific substance, and a specific substance to be measured are determined in correlation with the ratio of the amount of a complex consisting of the specific substance used and ALP to be measured and the amount of the specific substance in the sample. A complex composed of ALP, a substance having an affinity for the specific substance, and a complex composed of the specific substance is formed.
次に、特定物質に対し親和性を有する物質と結合しなか
った、特定物質と結合した測定されるべきＡＬＰ複合体
を分離する。この操作は、例えば前記特定物質に対して
親和性を有する物質をあらかじめ不溶化しておくか、ま
たは前記特定物質に対して親和性を存する物質と結合し
得る物質を不溶化しておくなどすれば良い。Next, the ALP complexes to be measured bound to the specific substance and not bound to the substance having affinity for the specific substance are separated. This operation may be performed, for example, by insolubilizing a substance that has an affinity for the specific substance in advance, or by insolubilizing a substance that can bind with a substance that has an affinity for the specific substance. .
この方法では、既知量の特定物質及び測定されるべきＡ
ＬＰからなる複合体を使用することから、前述したよう
にして分離された成分中のＡＬＰ量を測定しても良いし
、分離されなかったＡＬＰ量を測定しても良い。In this method, a known amount of a specific substance and a
Since a complex consisting of LP is used, the amount of ALP in the components separated as described above may be measured, or the amount of ALP that has not been separated may be measured.
以上説明してきた本発明の測定方法を実施するための測
定キットは、少なくとも測定されるべきＡＬＰＮアスコ
ルビン酸２−リン酸エステル及びルシゲニンを含んでな
るものである。これらは、例えば固定化された特定物質
に対して親和性を有、する物質等とともに凍結乾燥され
た状態で単一の反応容器に収納されていても良いし、ま
たは先に説明したように第１の反応液、第２の反応液と
いうような形で別々の容器に収納されていても良い。The measurement kit for implementing the measurement method of the present invention described above contains at least ALPN ascorbic acid 2-phosphate and lucigenin to be measured. These may be stored in a single reaction container in a freeze-dried state together with, for example, a substance that has an affinity for an immobilized specific substance, or may be stored in a single reaction container as described above. The first reaction solution and the second reaction solution may be stored in separate containers.
（発明の効果）
本発明は、従来とは異なる発光法によるＡＬＰの測定方
法を提供するものである。本発明の方法で使用するアス
コルビン酸２−リン酸エステルは安定性の高い試薬であ
り、かつ比較的簡単な操作により合成し得る物質である
。従って、本発明は低コストにて実施可能であり、しか
も前述の如く他の比色法、蛍光法に比較して高感度の測
定を実現するものである。(Effects of the Invention) The present invention provides a method for measuring ALP using a luminescence method different from conventional methods. Ascorbic acid 2-phosphate used in the method of the present invention is a highly stable reagent and a substance that can be synthesized by relatively simple operations. Therefore, the present invention can be implemented at low cost and, as mentioned above, achieves measurement with high sensitivity compared to other colorimetric methods and fluorescence methods.
本発明の測定方法は、単にＡＬＰの測定方法であるばか
りでなく、例えば従来から知られているＥＩＡやＤＮＡ
の測定のうち、ＡＬＰを標識酵素として使用する、試料
中の特定成分の測定方法に適用することも可能である。The measurement method of the present invention is not only a method for simply measuring ALP, but also a method for measuring conventionally known EIA and DNA.
Of these measurements, it is also possible to apply this method to a method of measuring a specific component in a sample using ALP as a labeling enzyme.
このような測定方法によれば、放射性同位元素を使用し
ないために実施者の被爆の可能性がなく、かつ従来の比
色法や蛍光法に比較して高感度の測定を実現することが
可能である。This measurement method does not use radioactive isotopes, so there is no possibility of radiation exposure for the person performing the measurement, and it is possible to achieve highly sensitive measurements compared to conventional colorimetric and fluorescence methods. It is.
しかもこれら本発明の方法は、例えば従来実施されてい
るＥＩＡやＤＮＡの測定方法やそのためのキットにおい
て、その仕様を変えることなしに実施可能である。Moreover, these methods of the present invention can be implemented, for example, in conventional EIA and DNA measurement methods and kits therefor without changing the specifications thereof.
（実施例）
以下に本発明を実施するために実施例を記載するが、本
発明はこれら実施例に限定されるものではない。(Examples) Examples are described below to carry out the present invention, but the present invention is not limited to these Examples.
実施例Ｉ
ＡＬＰの測定
アスコルビン酸−２−リン酸とルシゲニンを用いてＡＬ
Ｐの測定を行った。２Ｘ１０ ＭのＡＬＰＮ１００
ｍＭ）リス塩酸緩衝液、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．
０１％牛血清アルブミン、ｐＨ９，８の溶液を用い、１
００ｍＭ）リス塩酸緩衝液、１ｍＭ塩化マグネシウム、
０．０１％牛血清アルブミン溶液で倍倍希釈を行いその
溶液を試料とした。このＡＬＰの＃１定試料５０μｌに
１０ｍＭアスコルビン酸−２−リン酸の１００ ｍ Ｍ
）リス塩酸緩衝液、１ｍＭ塩化マグネシウム、０゜０
１％牛血清アルブミン溶液を加え室温で２時間インキュ
ベートを行った。その溶液に測定前に調製した０、１Ｍ
水酸化カリウム、Ｏ０１μＭルシゲニン、０．０５％ト
ライトンＸ１００溶液５００μｍをルミノメータの中で
分注し、一定時間後から一定時間発光強度を積算した。Example I Measurement of ALP AL using ascorbic acid-2-phosphate and lucigenin
P was measured. 2X10M ALPN100
mM) Lis-HCl buffer, 1 mM magnesium chloride, 0.
Using a solution of 01% bovine serum albumin, pH 9.8,
00mM) Lis-HCl buffer, 1mM magnesium chloride,
The sample was diluted with a 0.01% bovine serum albumin solution and the resulting solution was used as a sample. Add 100 mM of 10mM ascorbic acid-2-phosphate to 50μl of this ALP #1 constant sample.
) Lis-HCl buffer, 1mM magnesium chloride, 0°0
A 1% bovine serum albumin solution was added and incubated at room temperature for 2 hours. 0, 1M prepared in the solution before measurement
Potassium hydroxide, 01 μM lucigenin, and 500 μm of a 0.05% Triton
その結果、ＡＬＰは１．６Ｘ１０ Ｍまで測定でき
た。即ち、絶対量は８Ｘ１０ ｍｏｌ （０，８μ
ｍｏｌ）までの測定が可能であった。As a result, ALP could be measured up to 1.6×10 M. That is, the absolute amount is 8X10 mol (0.8μ
It was possible to measure up to mol).
結果を図１に示す。The results are shown in Figure 1.
実施例２
サンドイッチＥＩＡ法を用いたＴＳＨ（甲状腺刺激ホル
モン）の測定
ＡＩＡ−１２００（商品名 東ソー■製）を用いてＴＳ
Ｈの測定を行った。試料としてはＥテス） ｒＴＯ５Ｏ
ＨＪ ＴＳＨ標準液（４９，９μＩＵ／ ｍｌ ）とＥ
テストｒＴＯ５ＯＨＪ ＴＳＨゼロ（０）標準液を混合
することにより作製した。この試料をＡＩＡ−１２００
とＥテストｒＴＯ５ＯＨＪ ＴＳＨ免疫反応試薬を用い
通常の測定方法に従い免疫反応を行った。ただし洗浄後
分注する基質は加えなかった。洗浄を行った後に２００
μｍの１０ｍＭアスコルビン酸−２−リン酸、１００ｍ
Ｍ）リス塩酸緩衝液、１ｍＭ塩化マグネシウム、０゜０
１％牛血清アルブミン溶液、ｐＨ９，８を加え３７度で
１時間保温を行った。次に測定前に調製した２００μｍ
の０．１Ｍ水酸化カリウム、０゜１μＭルシゲニン、０
．０５％トライトンＸ１００溶液を反応容器に加えＡＩ
Ａ−１２００の検出器にホトマルを用いた装置により測
定を行った。Example 2 Measurement of TSH (thyroid stimulating hormone) using sandwich EIA method TS was measured using AIA-1200 (trade name manufactured by Tosoh).
H was measured. The sample is Etes) rTO5O
HJ TSH standard solution (49,9μIU/ml) and E
Test rTO5OHJ was made by mixing TSH zero (0) standard solution. Transfer this sample to AIA-1200
Immunoreaction was performed using the E-test rTO5OHJ TSH immunoreaction reagent according to a conventional measurement method. However, the substrate to be dispensed after washing was not added. 200 after cleaning
10mM ascorbic acid-2-phosphate, 100m
M) Lis-HCl buffer, 1mM magnesium chloride, 0°0
A 1% bovine serum albumin solution, pH 9.8, was added and kept at 37 degrees for 1 hour. Next, 200μm prepared before measurement
of 0.1 M potassium hydroxide, 0°1 μM lucigenin, 0
．． Add 05% Triton X100 solution to the reaction vessel and add AI
Measurement was carried out using an A-1200 device using a photomal detector.
測定はＡＩＡ−１２００にパーソナルコンピューターを
つなぎ４０秒間に２秒毎の発光量をデータとして取り込
みその積算量を測定して行った。この測定には容量１
ｍｌの黒いポリプロピレン性の容器を用い、撹拌には磁
性ビーズを用い３７度の条件で行った。その結果０．０
５μＩ Ｕ ／ ｍｌまでのＴＳＨの測定がされた。The measurement was carried out by connecting a personal computer to the AIA-1200, capturing the amount of light emitted every 2 seconds as data for 40 seconds, and measuring the cumulative amount. This measurement requires a capacity of 1
A ml black polypropylene container was used, and stirring was carried out at 37 degrees using magnetic beads. The result is 0.0
Measurements of TSH up to 5 μI U/ml were made.
結果を図２に示す。The results are shown in Figure 2.
実施例３
競合ＥＩＡ法を用いた１ ７−０ＨＰ
（１７ａ −Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ
）の測定１７ａ −Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｇｅｓｔｅｒ
ｏｎｅ （１７−ＯＨＰ ）抗体溶液１００μｌと、
種々の濃度の１７−０ＨＰ標準液１００μｍ、１７−０
ＨＰＡＬＰ結合物溶液５０μｍをガラス管に加え、さら
にこの溶液に第２抗体を結合させたビーズ１コを加え４
℃、−昼夜反応させた。その後、洗浄液で４回洗浄した
後、ビーズを新しいガラス管に移し、これに１０ｍＭの
アスコルビン酸−２−リン酸、５０ｍＭＤＥＡ緩衝液、
ｐＨ９，５，１ｍＭ塩化マグネシウムを３００μｍ加え
、室温で２時間反応させた後、その１００μｍに０．１
Ｍ水酸化カリウム、６Ｘ１０−’％ルシゲニン、１０−
３ＭトライトンＸ−１００溶液５００μｌをルミノメー
タの中で分注し、一定時間後から一定時間発光強度を積
算した。その結果、１７−ｏｈｐは１０ｐｇ／ｍｌまで
測定できた。Example 3 17-0HP (17a-Hydroxyprogesterone) using competitive EIA method
) Measurement 17a - Hydroxyprogester
100 μl of one (17-OHP) antibody solution,
17-0HP standard solution 100 μm, 17-0 at various concentrations
Add 50 μm of HPALP conjugate solution to the glass tube, and add 1 bead conjugated with the second antibody to this solution.
°C, - the reaction was carried out day and night. Thereafter, after washing four times with washing solution, the beads were transferred to a new glass tube and added with 10mM ascorbic acid-2-phosphate, 50mM DEA buffer,
Add 300 μm of pH 9.5, 1 mM magnesium chloride, react at room temperature for 2 hours, and then add 0.1 μm to 100 μm.
M Potassium Hydroxide, 6X 10-'% Lucigenin, 10-
500 μl of 3M Triton As a result, 17-ohp could be measured up to 10 pg/ml.
結果を図３に示す。The results are shown in Figure 3.
図１〜３はそれぞれ、本発明の実施例１〜３の結果を示
すものである。1 to 3 show the results of Examples 1 to 3 of the present invention, respectively.
Claims (1)
ＬＰ）にアスコルビン酸−２−リン酸エステルを接触さ
せてアスコルビン酸を生じさせる工程、生じたアスコル
ビン酸にルシゲニンを接触させて光を生じさせる工程及
び生じた光を測定する工程とからなるＡＬＰの測定方法
。 （２）前記全ての工程が、少なくとも測定されるべきＡ
ＬＰＮアスコルビン−２−リン酸及びルシゲニンの共存
下で実施されることを特徴とする請求項第１項に記載の
測定方法。（３）測定されるべきＡＬＰが、核酸、抗原
、抗体、アビジン、リガンドはレセプターと結合してい
ることを特徴とする請求項第１又は２項に記載の測定方
法。 （４）試料中の特定物質の測定方法であって、少なくと
も特定物質、特定物質に対して親和性を有する物質及び
測定されるべきＡＬＰからなる複合体を形成させる工程
、複合体を形成していない測定されるべきＡＬＰを分離
する工程、複合体を形成しているかあるいは複合体を形
成していないＡＬＰのいずれか又は両方にアスコルビン
酸−２−リン酸エステルを接触させてアスコルビン酸を
生じさせる工程、生じたアスコルビン酸にルシゲニンを
接触させて光を生じさせる工程及び生じた光を測定する
工程とからなる方法。 （５）測定されるべきＡＬＰが特定物質に対して親和性
を有する物質と直接又は間接的に結合しており、複合体
を形成しているＡＬＰと複合体を形成していないＡＬＰ
の分離が特定物質に対して親和性を有する物質とは異な
る部位で特定物質と結合する物質であり水に不溶化され
ているものにより達成されることを特徴とする請求項第
４項に記載の方法。 （６）試料中の特定物質の測定方法であって、特定物質
又は特定物質に対して親和性を有する物質との結合にお
いて特定物質と同等の能力を有する物質、と測定される
べきＡＬＰから形成される既知量の複合体を特定物質に
対して親和性を有する物質に対し特定物質と共に競合的
に結合させる工程、特定物質に対して親和性を有する物
質と結合しなかった、特定物質又は特定物質に対して親
和性を有する物質との結合において特定物質と同等の能
力を有する物質、と測定されるべきＡＬＰから形成され
た前記複合体を分離する工程、特定物質に対して親和性
を有する物質と結合しなかった、特定物質あるいは特定
物質に対して親和性を有する物質との結合において特定
物質と同等の能力を有する物質、と測定されるべきＡＬ
Ｐから形成された前記複合体又は特定物質に対して親和
性を有する物質と結合した測定されるべきＡＬＰのいず
れか一方又は両方にアスコルビン酸−２−リン酸エステ
ルを接触させてアスコルビン酸を生じさせる工程、生じ
たアスコルビン酸にルシゲニンを接触させて光を生じさ
せる工程及び生じた光を測定する工程とからなる方法。 （７）特定物質に対して親和性を有する物質が、核酸、
抗原、抗体、アビジン、リガンド又はレセプターとを特
徴とする請求項第４〜６いずれかの項に記載の測定方法
。 （８）請求項第１〜７いずれかの項記載の測定方法を実
施するための測定キット。[Claims] (1) Alkaline phosphatase (A) to be measured
LP) is brought into contact with ascorbic acid-2-phosphate ester to produce ascorbic acid, the produced ascorbic acid is brought into contact with lucigenin to produce light, and the produced light is measured. Measuring method. (2) All of the above steps should be measured at least A
The measuring method according to claim 1, characterized in that it is carried out in the coexistence of LPN ascorbic-2-phosphate and lucigenin. (3) The measuring method according to claim 1 or 2, wherein the ALP to be measured is bound to a nucleic acid, an antigen, an antibody, avidin, and a ligand is bound to a receptor. (4) A method for measuring a specific substance in a sample, comprising a step of forming a complex consisting of at least a specific substance, a substance having an affinity for the specific substance, and ALP to be measured; A step of separating ALP to be measured without contacting complexed or non-complexed ALP or both with ascorbic acid-2-phosphate to produce ascorbic acid. A method comprising the steps of: contacting the produced ascorbic acid with lucigenin to produce light; and measuring the produced light. (5) ALP to be measured is bound directly or indirectly to a substance that has an affinity for a specific substance, and ALP that forms a complex and ALP that does not form a complex
Claim 4, wherein the separation is achieved by a substance that binds to the specific substance at a site different from that of the substance that has an affinity for the specific substance and is insolubilized in water. Method. (6) A method for measuring a specific substance in a sample, which is formed from ALP that is to be measured as a substance that has the same ability as a specific substance in binding with a specific substance or a substance that has an affinity for a specific substance. The process of competitively binding a known amount of the complex with a specific substance to a substance that has an affinity for a specific substance, or a step of separating the complex formed from ALP to be measured from a substance that has the same ability as a specific substance in binding to a substance that has an affinity for the substance, and has an affinity for the specific substance; AL that should be measured as a substance that has the same ability as a specific substance in binding to a specific substance or a substance that has an affinity for a specific substance, but does not bind to a substance.
Ascorbic acid is produced by bringing ascorbic acid-2-phosphate into contact with either or both of the complex formed from P or the ALP to be measured bound to a substance having an affinity for a specific substance. A method comprising the steps of: contacting the generated ascorbic acid with lucigenin to generate light; and measuring the generated light. (7) The substance that has affinity for a specific substance is a nucleic acid,
The measuring method according to any one of claims 4 to 6, comprising an antigen, an antibody, avidin, a ligand, or a receptor. (8) A measurement kit for carrying out the measurement method according to any one of claims 1 to 7.
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