【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
本発明はＬ−セリンの製造法に関し、さらに詳
しくは、グリシンとホルムアルデヒドから微生物
の生産するセリンヒドロキシメチルトランスフエ
ラーゼを利用して、反応液に添加したグリシンに
対し高収率にＬ−セリンを製造する方法に関する
ものである。
Ｌ−セリンは医薬品、化粧品等に利用されるア
ミノ酸であり、現在は化学合成法またはグリシン
を前駆体とする発酵法により製造されている。化
学合成法の場合はDL体が合成されるためＬ体の
みを得るのには光学分割をしなければならないと
いう欠点があり、又、グリシンを前駆体とする発
酵法でも蓄積量、収率、精製、廃水処理等に欠点
があり、実用上有利な方法とは言い難い。これら
の方法に代つて最近は、セリンヒドロキシメチル
トランスフエラーゼを利用し、酵素法でＬ−セリ
ンを製造する方法が注目されている。セリンヒド
ロキシメチルトランスフエラーゼ（E.C.2.1.2.1）
はセリントランスヒドロキシメチラーゼまたはセ
リンアルドラーゼとも呼ばれ、哺乳動物、鳥類、
高等植物、エシエリヒア属を含む微生物等に広く
分布しており、テトラヒドロ葉酸とピリドキサル
リン酸を補酵素とし、グリシンとホルムアルデヒ
ドからＬ−セリンを生成せしめる反応を触媒する
ことも既に知られている。しかし従来の、微生物
のセリンヒドロキシメチルトランスフエラーゼを
利用し酵素法によりＬ−セリンを製造する方法と
して知られていることはプロテウス属（特公昭58
−2677）、サルシナ属、フラボバクテリウム属、
シユードモナス属、ミクロバクテリウム属（特開
昭53−81691）などの微生物を用い、グリシン単
独でまたはグリシンと微量のホルムアルデヒドよ
りＬ−セリンを製造する方法が知られているので
ある。そしてこれらの方法において使用された微
生物は、いづれもグリシンそのものからＬ−セリ
ンを生成せしめる強い活性を持つものであり、反
応液にホルムアルデヒドを添加した場合でも生成
したＬ−セリンのモル数と反応に添加したホルム
アルデヒドのモル数の比を見ると凡そ10対１にす
ぎず、反応にはセリンヒドロキシメチルトランス
フエラーゼの関与もさることながらこれに加えて
グリシンを開裂する反応を触媒する酵素が強く関
与しているものと理解され、そのため生成したＬ
−セリンの対グリシン収率は10％モル／モル以下
と著しく低い。なおこの場合Ｌ−セリンの蓄積濃
度は高々５ｇ／程度でしかなく到底実用的な方
法とは言い難い。
本発明は、微生物の生産するセリンヒドロキシ
メチルトランスフエラーゼを利用し、グリシンの
存在下特にホルムアルデヒドを有効に利用してＬ
−セリンをグリシンに対し収率よく、しかも高い
反応液中の濃度で製造する方法について鋭意研究
の結果得られたものである。その結果我々はエシ
エリヒア属に属し、セリンヒドロキシメチルトラ
ンスフエラーゼ生産能を有し、かつグリシン単独
からはＬ−セリンを生成する能力が低いか又は能
力を有しない微生物の培養液、菌体もしくはそれ
らの処理物の存在下グリシンとホルムアルデヒド
を、反応系中のホルムアルデヒド濃度を20mM以
下に保つようにホルムアルデヒドを連続または間
けつ的に添加して反応させると添加したグリシン
に対し80％モル／モル以上の著しく高い収率で、
しかも50ｇ／以上の著しく高い濃度でＬ−セリ
ンが生成することを見出し、本発明に完成するに
至つた。
本発明の方法により得られるこのような高収
率・高濃度でＬ−セリンを生成せしめる方法は全
く知られていない。更に、本発明の方法によれ
ば、反応終了時に残存するグリシンが著しく少な
く、このことは反応液からのＬ−セリンの単離精
製にかゝる負担を著しく軽減するものであり、本
発明の方法は酵素法によるＬ−セリンの工業的製
法として極めて優れている。
本発明において用いられる微生物は、エシエリ
ヒア属に属し、セリンヒドロキシメチルトランス
フエラーゼ生産能を有し、かつ、グリシン単独か
らはＬ−セリンを生成する能力を実質的に有しな
い菌株である。この性質を有する菌株であれば自
然界から分離されたものでも、突然変異、遺伝子
組み替え等の手段により創製されたものでも本発
明に使用できる訳であるが例えば、エシエリヒ
ア・コリ（Escherichia coli）MT−10350（微工
研菌寄第7437号）、エシエリヒア・コリMT−
10351（微工研菌寄第7438号）をあげることができ
る。
本発明に言う「実質的に有しない」とは、全く
有しない場合は勿論含むものであるが、本発明の
実施を妨げない程度の微弱な活性を有する場合は
格別本発明の効果をもたらすことに支障はない訳
であるからそのような場合も含む意味を示すもの
である。
又「酵素的処理物」とは、本発明の実施におい
て主役を果すものは、微生物に由来するセリンヒ
ドロキシメチルトランスフエラーゼであるから、
この酵素の活性を損うことのないように微生物そ
れ自体又はその培養液などを処理した一切の物を
示すものである。
本発明の実施につき微生物の培養に当つては、
培地およびその他の培養条件に特に制限はなく、
使用菌株の利用しうる炭素源、窒素源、無機塩
類、有機栄養物質などを含有するものであれば合
成培地、天然培地のいずれも使用できる。培養は
好気的条件下、PH５〜９、25〜40℃で行なうのが
好ましい。
そして得られる培養液はそのままでも、培養液
から遠心分離、過等により集菌した生菌体、そ
の乾燥菌体あるいは菌体処理物（例えば、生菌体
を磨砕、超音波、自己消化等により処理したも
の、菌体抽出液、該抽出物より得られる酵素区
分）などでも酵素源として用いることが出来る。
本発明の酵素反応は、PH６〜９、温度20〜60℃
で振とうもしくは撹拌条件下で行なうのが好まし
い。
セリンヒドロキシメチルトランスフエラーゼは
補酵素としてテトラヒドロ葉酸とピリドキサルリ
ン酸を要求するため、これらの物質を反応系に添
加することにより反応が高められることがある。
本発明の反応は、還元剤の添加又は窒素の通気
により高められることがある。この還元剤として
は、アスコルビン酸、ジチオスレイト−ル、２−
メルカプトエタノール、ジチオエリスリトール、
還元型グルタチオン、システイン、亜硫酸ナトリ
ウムなどがあり、使用濃度は通常0.1〜10mMが
好適である。
反応基質であるグリシンの使用濃度には特に制
限はなく、通常１〜40％程度であり、反応開始時
に全量添加しておいてもよく、反応の進行にとも
ない分割添加してもよい。
もう一つの反応基質であるホルムアルデヒドは
気体のまゝ、水溶液にして、アルコール溶液とし
て、更には固形重合物のパラホルムアルデヒドな
どで反応液に供給して使用できるが、37％程度の
水溶液であるホルマリンの使用が好適である。ホ
ルマリンは、そのまま反応液に添加しても、更に
希釈したのち添加してもよい。
反応液中のホルムアルデヒド濃度を20mM以下
に保つ手段としては、ホルムアルデヒドを連続的
にまたは間けつ的に添加する方法でよく、この場
合反応液中のホルムアルデヒド濃度を直接または
間接的な方法で随時測定して反応液へのホルムア
ルデヒド添加量を制御する。反応液中のホルムア
ルデヒド濃度の測定は、例えば、ガスクロマトグ
ラフイーによつても良いし、クロモトロプ酸、ア
セチルアセトンまたは４−アミノ−３−ヒドラジ
ノ−５−メルカプト−１，２，４−トリアゾール
等とホルムアルデヒドによる発色をそれぞれ固有
の波長の吸光度で測定してもよい。
反応液中に生成したＬ−セリンを単離するに
は、濃縮、イオン交換樹脂や活性炭による吸脱着
処理など常法が適用できる。
生成したＬ−セリンの確認および定量は、ペー
パークロマトグラフイーによるニンヒドリン発色
位置、液体クロマトグラフイーおよびロイコノス
トツク・メゼンテロイデスによるバイオアツセイ
法により行なうことができる。
以下、実施例により本発明を具体的に説明す
る。
実施例 １
エシエリヒア・コリMT−10350（微工研菌寄第
7437号）をブイヨンスラント上にて37℃、40時間
生育させたのち、第１表に示す栄養素を含む液体
培地（PH7.2）100mlに１白金耳づつ接種し、37℃
で40時間振とう培養した（５本）。この培養液を
20ジヤーフアメンタ−中の上記組成の培地10
に接種し、PH7.2、37℃で30時間通気撹拌培養し
た。培養液を遠心分離して菌体を集め、更にこの
菌体を生理食塩水にて洗浄し、湿菌体約50ｇを得
た。この湿菌体を−15℃で２日間凍結し反応直前
に解凍したものを酵素源として使用した。第２表
に示す栄養素を含む組成の反応液500mlに凍結菌
体40ｇを加え、反応液中のホルムアルデヒド濃度
をガスクロマトグラフイーで分析しその濃度が７
〜12mMの範囲であるようにホルマリンをペリス
タポンプで連続的に供給した。反応は50℃、PH
7.0、反応液中に１ml／minで窒素ガスを通じ、
ゆるやかな撹拌条件下で実施した。反応液へのホ
ルマリンの供給は37時間継続し、反応液に供給し
たホルマリン（37％ｗ／ｗホルムアルデヒド溶
液）の総量は、24mlであつた。反応終了時には反
応液中に、29ｇのＬ−セリンが蓄積し、Ｌ−セリ
ンの蓄積濃度は55ｇ／、生成したＬ−セリンの
反応液に添加したグリシンに対する収率はモル比
で83％、ホルムアルデヒドに対する収率はモル比
で86％であつた。
第１表
グルコース １％ MgSO4・7H2O 0.05％
クエン酸 0.2％ 酵母エキス 0.05％
NaNH4HPO4・4H2O 0.3％
K2HPO4 0.5％
第２表
グリシン ５％
テトラヒドロ葉酸 0.1％
ピリドキサルリン酸 0.01％
実施例 ２
実施例１と同様の方法で、使用した微生物を代
えてエシエリヒア・コリMT−10350（微工研菌寄
第7438号）を用い反応を行なつた。反応液へのホ
ルマリン供給は57時間継続し、反応液に供給した
ホルマリンの総量は25mlであつた。反応液中には
28ｇのＬ−セリンが蓄積し、Ｌ−セリンの蓄積濃
度は53ｇ／、生成したＬ−セリンの反応液に添
加したグリシンに対する収率はモル比で80％、反
応液に添加したホルムアルデヒドに対する収率は
モル比で80％であつた。
本発明に用いる微生物がグリシンよりＬ−セリ
ンを産生する能力につき、ホルムアルデヒドの存
在下と不存在下で比較した結果は次の実験例に示
す通りである。
実験例
エシエリヒア・コリMT−10350およびMT−
10351をそれぞれ肉エキス10ｇ／、ペプトン10
ｇ／、NaCl5ｇ／を含む液体培地（PH7.0）
100mlに接種し、30℃で24時間振とう培養を行な
つた。培養終了菌体を遠心分離し、生理食塩水で
２度洗浄し湿菌体約0.4ｇを得た。この湿菌体0.2
ｇをグリシン5000μmoleホルムアルデヒド
150μmole、テトラヒドロ葉酸10μmole、ピリド
キサルリン酸0.1μmoleを含む50mMリン酸緩衝液
（PH7.0）10mlに懸濁し、37℃で２時間振とうしな
がら反応させた。
第３表に示すようにＬ−セリンの蓄積がみられ
た。
一方上記と全く同様の操作でそのうちホルムア
ルデヒドの添加のみを行わずに行なつた実験の結
果も第３表のとうりであつた。
The present invention relates to a method for producing L-serine, and more specifically, a method for producing L-serine in high yield from glycine added to a reaction solution by using serine hydroxymethyltransferase produced by microorganisms from glycine and formaldehyde. It relates to a manufacturing method. L-serine is an amino acid used in pharmaceuticals, cosmetics, etc., and is currently produced by chemical synthesis or fermentation using glycine as a precursor. In the case of chemical synthesis, the DL form is synthesized, so optical resolution is required to obtain only the L form.Also, even with the fermentation method using glycine as a precursor, the amount of accumulation, yield, It has drawbacks in purification, wastewater treatment, etc., and cannot be said to be a practically advantageous method. As an alternative to these methods, a method of producing L-serine by an enzymatic method using serine hydroxymethyltransferase has recently attracted attention. Serine hydroxymethyltransferase (EC2.1.2.1)
is also called serine transhydroxymethylase or serine aldolase, and is used in mammals, birds,
It is widely distributed in higher plants and microorganisms including the genus Escherichia, and is already known to catalyze the reaction that produces L-serine from glycine and formaldehyde using tetrahydrofolic acid and pyridoxal phosphate as coenzymes. However, the conventional method for producing L-serine by an enzymatic method using microbial serine hydroxymethyltransferase is based on the Proteus genus (Special Publication No. 58).
-2677), Sarcina sp., Flavobacterium sp.
A method is known for producing L-serine from glycine alone or from glycine and a trace amount of formaldehyde using microorganisms such as Pseudomonas and Microbacterium (Japanese Patent Laid-Open No. 53-81691). The microorganisms used in these methods all have a strong activity of producing L-serine from glycine itself, and even when formaldehyde is added to the reaction solution, the number of moles of L-serine produced and the reaction are Looking at the molar ratio of formaldehyde added, it is only about 10:1, and in addition to the involvement of serine hydroxymethyltransferase, an enzyme that catalyzes the reaction that cleaves glycine is strongly involved. It is understood that L
-The yield of serine to glycine is extremely low at less than 10% mol/mol. In this case, the accumulated concentration of L-serine is only about 5 g/at most, and it is difficult to say that this is a practical method. The present invention utilizes serine hydroxymethyltransferase produced by microorganisms and effectively utilizes formaldehyde in the presence of glycine to produce L.
- This was obtained as a result of intensive research on a method for producing serine in high yield relative to glycine and at a high concentration in the reaction solution. As a result, we found a culture solution, bacterial cells, or microorganisms that belong to the genus Escherichia and have the ability to produce serine hydroxymethyltransferase, but have low or no ability to produce L-serine from glycine alone. When glycine and formaldehyde are reacted in the presence of a treated product by continuously or intermittently adding formaldehyde to keep the formaldehyde concentration in the reaction system below 20mM, a reaction of 80% mol/mol or more relative to the added glycine occurs. with significantly higher yields,
Moreover, it was discovered that L-serine was produced at a significantly high concentration of 50 g/or more, leading to the completion of the present invention. There is no known method for producing L-serine in such a high yield and concentration as obtained by the method of the present invention. Furthermore, according to the method of the present invention, there is significantly less glycine remaining at the end of the reaction, which significantly reduces the burden of isolating and purifying L-serine from the reaction solution. The method is extremely superior as an industrial method for producing L-serine using an enzymatic method. The microorganism used in the present invention is a strain that belongs to the genus Escherichia and has the ability to produce serine hydroxymethyltransferase, and has substantially no ability to produce L-serine from glycine alone. Any strain having this property can be used in the present invention, whether it is isolated from nature or created by means such as mutation or genetic recombination. For example, Escherichia coli MT- 10350 (Feikoken Bacteria No. 7437), Escherichia coli MT-
10351 (Feikoken Bibori No. 7438) can be mentioned. "Substantially not having" as used in the present invention includes, of course, not having any activity at all, but having a weak activity that does not interfere with the implementation of the present invention is a particular hindrance to bringing about the effects of the present invention. Since there is no translation, the meaning includes such cases as well. Furthermore, the term "enzymatically treated product" refers to serine hydroxymethyltransferase derived from microorganisms, which plays a leading role in the implementation of the present invention.
This refers to any product that has been treated with the microorganism itself or its culture solution so as not to impair the activity of this enzyme. When culturing microorganisms in carrying out the present invention,
There are no particular restrictions on the medium and other culture conditions;
Either a synthetic medium or a natural medium can be used as long as it contains carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts, organic nutrients, etc. that can be utilized by the strain used. Cultivation is preferably carried out under aerobic conditions at pH 5-9 and 25-40°C. The resulting culture solution can be used as it is, or live bacteria collected from the culture solution by centrifugation, filtration, etc., dried bacteria, or processed bacteria (for example, live bacteria can be ground, ultrasonicated, autolyzed, etc.). , bacterial cell extracts, and enzyme fractions obtained from the extracts) can also be used as enzyme sources. The enzyme reaction of the present invention is performed at a pH of 6 to 9 and a temperature of 20 to 60°C.
It is preferable to carry out the reaction under conditions of shaking or stirring. Since serine hydroxymethyltransferase requires tetrahydrofolic acid and pyridoxal phosphate as coenzymes, the reaction may be enhanced by adding these substances to the reaction system. The reaction of the present invention may be enhanced by the addition of a reducing agent or by bubbling with nitrogen. Examples of the reducing agent include ascorbic acid, dithiothreitol, 2-
Mercaptoethanol, dithioerythritol,
These include reduced glutathione, cysteine, sodium sulfite, etc., and the preferred concentration is usually 0.1 to 10mM. There is no particular restriction on the concentration of glycine, which is a reaction substrate, and is usually about 1 to 40%, and the entire amount may be added at the start of the reaction, or may be added in portions as the reaction progresses. Formaldehyde, another reaction substrate, can be used as a gas, as an aqueous solution, as an alcohol solution, or as a solid polymer such as paraformaldehyde, which can be supplied to the reaction solution. It is preferable to use Formalin may be added to the reaction solution as it is, or may be added after further dilution. As a means of keeping the formaldehyde concentration in the reaction solution below 20mM, formaldehyde may be added continuously or intermittently, and in this case, the formaldehyde concentration in the reaction solution can be measured at any time by direct or indirect methods. Control the amount of formaldehyde added to the reaction solution. The formaldehyde concentration in the reaction solution may be measured, for example, by gas chromatography, or by measuring formaldehyde with chromotropic acid, acetylacetone, or 4-amino-3-hydrazino-5-mercapto-1,2,4-triazole, etc. Color development may be measured by absorbance at each specific wavelength. In order to isolate L-serine produced in the reaction solution, conventional methods such as concentration, adsorption/desorption treatment using an ion exchange resin or activated carbon can be applied. The produced L-serine can be confirmed and quantified by paper chromatography using ninhydrin coloring, liquid chromatography, and bioassay using Leuconostoc mesenteroides. Hereinafter, the present invention will be specifically explained with reference to Examples. Example 1 Escherichia coli MT-10350
7437) on a bouillon slant at 37℃ for 40 hours, one platinum loopful was inoculated into 100ml of a liquid medium (PH7.2) containing the nutrients shown in Table 1, and the culture was grown at 37℃.
The cells were cultured with shaking for 40 hours (5 bottles). This culture solution
Medium 10 with the above composition in a 20 jar fermentor
and cultured with aeration and agitation for 30 hours at 37°C and pH 7.2. The culture solution was centrifuged to collect bacterial cells, which were further washed with physiological saline to obtain about 50 g of wet bacterial cells. The wet bacterial cells were frozen at -15°C for 2 days and thawed immediately before the reaction, and used as an enzyme source. Add 40 g of frozen bacterial cells to 500 ml of the reaction solution containing the nutrients shown in Table 2, and analyze the formaldehyde concentration in the reaction solution using gas chromatography.
Formalin was continuously supplied with a peristaltic pump to be in the range of ~12mM. Reaction at 50℃, PH
7.0, nitrogen gas was passed through the reaction solution at 1 ml/min,
It was carried out under gentle stirring conditions. The supply of formalin to the reaction solution continued for 37 hours, and the total amount of formalin (37% w/w formaldehyde solution) supplied to the reaction solution was 24 ml. At the end of the reaction, 29 g of L-serine was accumulated in the reaction solution, and the accumulated concentration of L-serine was 55 g/molar ratio of L-serine to glycine added to the reaction solution. The yield on a molar basis was 86%. Table 1 Glucose 1% MgSO 4・7H 2 O 0.05% Citric acid 0.2% Yeast extract 0.05% NaNH 4 HPO 4・4H 2 O 0.3% K 2 HPO 4 0.5% Table 2 Glycine 5% Tetrahydrofolic acid 0.1% Pyridoxal phosphate 0.01% Example 2 A reaction was carried out in the same manner as in Example 1, using Escherichia coli MT-10350 (Feikoken Bacteria No. 7438) instead of the microorganism used. Formalin was continuously supplied to the reaction solution for 57 hours, and the total amount of formalin supplied to the reaction solution was 25 ml. In the reaction solution
28g of L-serine was accumulated, the accumulated concentration of L-serine was 53g/, the yield of L-serine produced relative to the glycine added to the reaction solution was 80% in molar ratio, and the yield relative to formaldehyde added to the reaction solution. was 80% in molar ratio. The ability of the microorganisms used in the present invention to produce L-serine from glycine was compared in the presence and absence of formaldehyde, and the results are shown in the following experimental example. Experimental example Escherichia coli MT-10350 and MT-
10351 each with 10 g of meat extract and 10 peptone
liquid medium (PH7.0) containing 5 g/, NaCl 5 g/
It was inoculated into 100 ml and cultured with shaking at 30°C for 24 hours. The cultured cells were centrifuged and washed twice with physiological saline to obtain about 0.4 g of wet cells. This wet bacterial body 0.2
g glycine 5000 μmole formaldehyde
The suspension was suspended in 10 ml of 50 mM phosphate buffer (PH7.0) containing 150 μmole of tetrahydrofolic acid, 10 μmole of tetrahydrofolic acid, and 0.1 μmole of pyridoxal phosphate, and reacted with shaking at 37° C. for 2 hours. As shown in Table 3, accumulation of L-serine was observed. On the other hand, Table 3 also shows the results of an experiment conducted in exactly the same manner as above but without the addition of formaldehyde.
【表】
すなわち、本発明で用いられる微生物は、グリ
シンとホルムアルデヒドよりＬ−セリンを生成す
る活性を有し、かつ、グリシン単独では実質的に
はＬ−セリンを生成する活性を認め得ない程度の
ものであることが明らかである。[Table] In other words, the microorganism used in the present invention has an activity of producing L-serine from glycine and formaldehyde, and has an activity of producing L-serine from glycine alone to a level where it is virtually impossible to recognize the activity of producing L-serine from glycine alone. It is clear that it is a thing.