JPH04507234A - 筋萎縮性側索硬化症の治療用組成物の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 筋萎縮性側索硬化症の治療用組成物の製造方法発明の分野 発明の分野は筋萎縮性側索硬化症の治療用の神経向性因子の製造方法である。

従来技術 神経系の最も一般的で、最も破壊的な疾患の幾つかの病因はまだ不明である。こ のような疾患リストで顕著な疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、振せん麻 痺、及びアルツハイマー病である。これらの各症状は発生源不明の破壊的な障害 であると現在考えられている。各疾患に対して、ウィルス病因または免疫学的病 因が示唆されているが、感染病原体または細胞仲介もしくは体液性免疫因子の存 在を支持する説得力のある再現可能なデータは存在しない。これらの３疾患の全 ては末梢神経系または中枢神経系または両神経系の比較的限られた組織内の病的 変化を表す。

筋萎縮性側索硬化症 筋萎縮性側索硬化症とは、上位及び下位運動ニューロンを傷つける複合障害に与 えられた名称である。患者は進行性を髄筋肉萎縮、進行性球萎縮、原発性側索硬 化またはこれらの症状の組合せを有すると考えられる。・大部分の患者は３タイ プ全ての要素を有するが、各形態は運動系が関与した独特の臨床発現を表すと考 えられる〔１〕。

（参考文献番号は「従来技術」の結論にリストした参考に対するものである）。

現在米国においてこの複合疾患の発生率は１００．０００人に約１．８人であり 〔２〕、その罹患率は１００，０００人につき５〜７人である。男性の方が女性 よりも罹患しやすく、男性対女性の比は１．６：１である。症例の約１０％は家 族性である〔３〕。発病は如何なる年令においても生ずるが、中年以降が最も一 般的であり、発生率は年令と共に増大するように思われる。

発病の平均年令は６６オである〔６〕。

末梢衰弱（ｄｉｓｔα１ｗ−αｋｎａｓｓ）　と萎縮がこの障害の顕著な特徴で あり、上位と下位の運動ニューロンが犯される。感覚徴候は通常無いが、エレク トロミオグラフィーによる量的な感覚評価が異常を示唆することがある〔４〕。

外眼筋肉と膀胱が関与することは稀である。通常、１２〜３０か月にわたって進 行し、呼吸機能の重度な損傷の結果として死亡する。

主な病的異常は運動及質、脳幹及びを髄の大きな運動ニューロンの損失である。

残りの運動ニューロン中には、染色質溶解が認められ、リボ核酸に富み、ｋ−グ イ小体様または好酸性〔ブニナ体（Ｂｓｎ１ｎａ　ｂａｄν〕〕である封入体が 存在する〔５〕。全ニューロンが関与するように思われ、末梢軸索の［ダイイン グバック（ｄｙｉ％σｂｃｅ＆）Ｊの徴候がごく僅かに存在する〔６〕。さらに 、ＡＬＳ患者からの運動ニューロン中に大きな近位軸索膨潤（スフエロイド）が 存在することが報告されており〔７〕、Ｂ−Ｂ’−イミノジブロブリオニトリル の注入後の動物にも同様な異常が誘発されて、緩慢な軸索輸送の欠陥が生ずる〔 ８〕。これらのス７エロイド（５ｐｈａｒｏｉｄ）はノイロフィラメントの異常 を表し、細胞質中ならびに軸索中に検出される。

幼少期に発現する家族性症状には運動系の関与が報告されている〔３〕。例えば 、子宮中または乳児期中に迅速な進行性常染色体退縮症状として存在するグエル ドニツヒホフマン病（Ｉｌ’ｇｒｄｎｉ　ｇ　−Ｈｏ　ｆｆｍａｎｎ　ｄ　ｉ　 ａ　ａ　ａｓ　ａ　）は重度な衰弱を特徴とする。クーゲルベルグーヴエランデ ル病（λｕｇｅ１ｗｇｒｇ−Ｗｅｌａｎｄｇｌ　ｄｉｓｅａｓｅ）は最初幼少期 に腰部の衰弱を伴って発現し、次に肩の筋肉が関与する。これは常染色体の退縮 異常としても遺伝するが、常染色体の優性のＸ結合退縮伝播が述べられている。

これらの臨床症状の両方は前月細胞異常から生じ、中年以降に生ずる進行性筋委 縮を伴う臨床特徴を共に示す。

次の参考文献が本発明に関係する： １　ムンサットテイエル（Ｍｕｎｓａｔ　ＴＬ）、ブラッドレイダブルジー（Ｂ １−αｄｉｇνＷＧ）：　［筋萎縮性軸索硬化症ＣＡｍｙｏｔｒｏｐｈｉ’ｃ　 １ａｔｅｒａｌ　ｓｃｔｇｒｏｓｉｓ　）　Ｊ、□タイラーエッチアール（Ｔｙ ｒｅデＨＲ）、ダラソンディーエム（Ｄａｗｎ　ｏ　ｎ　ＤＭ　）　ｍ　集カレ ントノイロロシー（Ｃｕｒｒａｎｔ　Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ）　２巻、ボストン（ Ｂｏａ−ｔｏｎ）ホートンミツリン（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ　Ｍｉｆｆｌｉｎ　）、 ２、　ジュエルテンスエスエム（’Ｊｕａ’ｒｇｇｎａ　ＳＭ　）、クーラ特表 千４−５０７２３４　（３） ンドエルテイ（ｆｕｒｌαｎｄＬＴ）、オカザキエソチ（ＯｋαｚａｋイＨ）、 ムルダーデイダブリュ−（Ｍ鱈ｄｅｒＤＷ’）：ＡＬＳ、　ロチェスターミネソ タ、１９２５〜１９７７；ノイロロジーＣＮａｓｙｏｌｏｇｙ　）　（Ａ’）’ ）３０巻、４６３〜４７０頁、１９８０ ３　エンゲルダブリューケイ（Ｅｓ（ＨＥ　ＩＦＫ）　：　［運動ニューロン異 常（Ｍｏｔｏｒ　Ｎｅｕｒｏｓ’　Ｄｉｓｏｒｄｅｒ　）　Ｊ、ゴールデンンー ンイーエス（Ｇｏｌｄａｓｓｏｈｎ　ＥＳ）、アペルエスエツヂ（’Ａｐｐｅｌ 　ＳＥ　）　（編集〕：サイエンティフィック　アブローチェス　ツークリニカ ル　ノイロロジ−（５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ　ｔｏ　Ｃ２ ｉ　−％１ｃａｌ　Ｎｅｗｒｏ−１ｏｇｙ　）ｏ　フイラデルフイア、リーアン ドフエビガー（Ｌ４ａ　４　Ｆａｈｉｇａｒ　）、１９７７．１３２２〜１３４ ６頁 ４、ディックピーシエイ（ＤｉｅｋＰＪ）、スティーブンズジエイシー（Ｓｔ− ９−ｎｓＪｃ）、ムルダーディーダブリュー（Ｍｕｌｄａｒ　ＤＭ’）等：「筋 萎縮性側索硬化症における末梢運動ニューロンと感覚ニューロンの神経線維変性 の発生率：深部及び表布腓骨神経の測定（ＦｒｅｑｕｅｎＣｙ　ｏｆ　ｎｅｒｖ ｅ　ｆｉｂｅｒ　ｃｌａｇｍｎ電ｒａｔｉｏｎｏｆ　ｐａｒｉｐｈａｒａｌ　ｍ ｏｔｏｒ　ａｎｄ　５ｅｎｓｏｒｙ　ｓｌげＯ％ａｉｎ　ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉ ｃ　１ａｔｅｒａｌ　ｓｃｌｇｒｏｓｉｓ　：ゝｍｏｒｐ五−αｐ）２５巻、７ ８１〜７８５頁（’１９７５）５　チョーエスエム（Ｃｈｏ％ＳＭＶ「ＡＬＳに おけるニューロン内封入体の診断（Ｐａｔｈｏｇｎｏｍｙ　ｏｆ　ｉｎｔ　−ｒ ａｎｇｕｒｏｎａＬ　１ｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｉｎ　ＡＬＳ　）　Ｊ、ソバキテイ （Ｔａｕｂａｋｉ　Ｔ　）、トヨクラワイ（Ｔｏｙｏｋｗｒａｌａｔｅｒａｌ　 ａｅｌａｒｏｍｉｓ　）東京大学出版部（東京）１９７９．１３５〜１７６頁 ６、　プラトレイ　ダブリュージー（ＢｒｃＬｄ　ｌ　ａ　ｙ　ＩＦＧ　）、ケ レメンジエイ（ＫεｌａｍｇｎＪ　）、アデルマン　エルニス（Ａｄ　ｇ　ｌ’ ｍａｎ　Ｌ　Ｓ　）等：「筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の横隔膜神経における ダイイングバックの不存在（Ｔｈｅ　ａｂｓｅｎｃｅ　ｏｆ　ｄｙｉｎｇ　ｂａ ｃｋ　ｉｎ　ｔｈｅｐｌｒａ＊ｉｃ　ｎｇｒｖａ　ｏ’ｆ　ａｍｙｏｔｒｏｐｈ ｉｃ　ｌαｇａｒαにｃ−４０９頁、′１９８・０ ７　カーペンタ−ニス（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ　Ｓ　）　：「運動ニューロン疾患 における近位軸索拡大（Ｐｒｏｚｔｍａｌ　ａｔｏｍαＪ　’　ａｎｌαデσｅ ｔｎａｎｔ　ｉｎ　ｍｏｔｏｒｎｅｕｒｏｎ　ｄｉｓｅａｓｅ　）　Ｊ　ノイロ ロジ−（Ｍｉｎ＊ａａｐ）１８巻、８４１〜８５１頁（１９６８）８　グリフイ ン　ジエイダブリュＣＧｒｉｆｆｉｔｓ　ＪＷ）、ホフマ／ビーエヌＣ１１ｂｆ ｆｎａｎｎ　ＰＮ　）、クラークエイダブリュー（Ｃ１ａｒｋ　ＡＩＶ）、　キ ャロルピーテイ（Ｃａｒｒｏ　ｌ　ｌ　Ｐ’Ｔ　）、プライスディーエル（Ｐｒ ｔｃｅＤＬ）：　［ノイロフィラメント蛋白質の緩慢な軸索輸送９β、β−イミ ノジプロピオニトリル投与による障害（Ｓｌｏｗ　ａｚｏｎａｔ　ｔｒａｎｓｐ Ｏｒｔ　ｏｆ　ｎｇｕｒａｆｉ　−１ａｒｎａｎｔ　ｐｒｏｔｇｉｎｓ　：　ｔ ｍｐａｉｒｍｅｎｔ　ｏｆ　ｂｅｔａ、ｂｅｔａ−ｉｍｉｎｏｐｒｏｐｉｏｎｉ ｔｒｉｌａ　ａｄｔｎｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）Ｊ、サイエンスＣ３ｃｉｅｎｃ ｅ　）　２０２巻、６３３〜６３５頁（１９７８）。

次の追加の参考文献も本発明に関係する：ボツテンシュタイン　ジエイイ−（Ｂ ｏｔｔ’ｅｓｔｇｉｎ　ｊＥ）、サトージーエツチＣ３ａｔｏ　ＧＥ　）　：　 ｌ”血清を含まない補充培地におけるラット神経芽腫細胞ラインの増殖（Ｇｒｏ ｗｔｈ　ｏｆ　ａ　ｒａｔ　ｎｇｕｒｏｂｌｔｓｒｒｔｏｍａ　ｃｅｌｌ　ｊｊ ｓｓブラドシャウアールエイ（Ｂデａｄａｈｏｗ　ＲＡ）　：　ｒ：神経増殖因 子（ＮＣＣ１０Ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｅｔｏデ）」アニス　レブ　バイオケム（Ａ ｎｎｓ　Ｒｇｖ　ＥｉｏｃｈａｔＫ）４７　：　１９１　２１６頁、１９７８ ブラウンエムシー（Ｅｒｏｓｂ％ＭＣ）、ホラノドアールエル（Ｅｏｌｌａｓｄ 　ＲＬ）、ホプキンスダブリュージーＣＥｏｐ−ｋｉｎａ　ＷＧ　）　：　「運 動神経新芽（Ｍｏｔｏｒ　ｎａｒｖｇ　ａｐｒｏ　−％ｔ＝ｎａ）Ｊアニス　レ ブ　フィロサイ（Ａ％ｎｕ　Ｒａｖ　Ｎｅ−ｕｒａａｅｉ　）　４巻：１７〜４ ２頁、１９＠１　・コーヘンジエイ（Ｃａ＆１％Ｊ）、レグイーモンタルシニア ール（Ｌｅｖｉ−Ｍｏｎｔａｌｅｉｎｉ　Ｒ）　：　［蛇毒から単離した神経増 殖刺激因子（Ａ　ｎｅｒｖｅ　ｇｒｏｗｔｈ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔ ｏｒ　１ｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　５ｎａｋｅ　ｖｅｎａｍ）Ｊ、プロフナト ル　アカドサイ　ＵＳＡ　４２巻、５７１〜５７４頁、デヴイスピー（Ｄａｖｉ ｅｓ　Ｐ　）　：　［正常老化と老年痴呆におけるコリンアセチルトランスフェ ラーゼ活性の損失（Ｌｏｓｓ　ｏｆ　ｅｈｏｌｉｎｅ　ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓ ｆａｒａｓｇ　ａｃｔｉｖｉｔ１１１３巻、２５１〜２５７頁（１９７８）フィ ンチシーイ−（Ｆｔｎｃｈ　ＣＥ　）　：　［老化雄マウスの脳におげろカテコ ールアミン代謝（ｃａｔａｃｈｏｌａｔｎｉｎａｍａｔａｂｏｌｉａｍ　ｉｎ　 ｔｈａ　ｂｒａｉｎｓ　ｏｆ　ａｇｉｎｇ　ｍａｌｅ　ｍ１ｃａ）Ｊプレイン　 レス（Ｂｒａｉｎ　Ｌａｇ　）　５２巻、２６１〜２７６頁（１９７３） ホヌムエ７　ＣＦｏｎ％％ｆｆ＆Ｆ）：（”コリンアセチルトランスフェラーゼ 活性とアセチルコリンエステラーゼ活性の測定のためのラジオケミカルマイクロ アッセイ（Ｒαｄｉｏ−Ｃル１ｍイｃａｌ　ｖｎｉｃｒｏ　ａｓｓａｙｓ　ｆｏ デ　を五ｅ　ｄａｔｇｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆ　ｃｈｏｌＳｎａ　ａｔｓｍｔｙ ｌｔｒａｎｓｆｍｒａａａ　ａｎｄ　ａｃｇｔｙｌｃル〇−ギラー　イーエルＣ Ｇ１１ｌａｒ　ＥＬ）、二一ルジエイエッチＣＮａａｌａ　ＪＥ）、　ブロック ピーエヌ（ＢｕｌＬｏｃｋ　ＰＮ）、シュリールビーケイ（Ｓｃｈｒｉａｒ　Ｂ Ｋ）、ネルンンピージ特表千４−５０７２３４　（４） Ｌ−（Ｎｅｌｓｏｎ　ＰＧ）　：　ｒ筋肉との共培養によって及び筋肉条件付き 培地によって強化した、を髄細胞培養物のコリンアセチルトランスフェラーゼ活 性（Ｃｈｏ　ｌ　ｉｎｎ　ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆａｒａｓｇ　ａｃｔｉｖｉ ｔｙ　ｏｆ　５ｐｉｎａｌ　ｃｏｒｄ　ｃａｌｌｃｒｂｌｔｂｒａｓ　１ｎｃｒ ｅａｓｅｄ　ｂｙ　ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ　ｗｉｔｈ　ｍｒｂｓ　−ｃＬｅ　ａ ｎｄ　ｂｙ　ｙｘｓａｃ！ｇ　−ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ　ｍａｄｉｕｒｎ）Ｊ 、　ジエイ　セル　パイオル（／　Ｃａ１ｌ　Ｂｉｏ！　）７４巻、１６〜２９ 頁、１９７７ ヘメンジンガーエルエム（Ｅｇｍｍａｘｄｉｎｇａｒ　ＬＭ　）、ガーバーピー ビー（ＧαデｂａデＢＢ）、ホフマンピーシ−ＣＨｏｆｆｍａ＊　ＰＣ）、ヘラ −エイ（ＩｈｌＬｅｒ　Ａ）　：「インビトロでの胎胚の中脳ドパミンニューロ ンによる標的ニューロン特異性の突起形成（Ｔａｒｇｊｔ　ｎｇｕｒｏｎ−ａｐ ｅｃｉｆｉｃ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｆｏｒｍａｔｉｏ％ｂｙ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｖｎｍａａｎｃｍｐｈａｌｉｃ　ｄｏｐａｗ＞ｉｎｎ　ｎｇｓｒｏｎｓ　ｉｎ　 ｖｉｔｒｏ）Ｊ、〜１２６８頁（１９８１） ホリテイエム（ＨｏＪ　１ｙｄａｙ　Ｍ　）、ハンバーガーヴイ（Ｈｗｍｂｕｒ ｇａｒ　Ｖ　）汀末梢拡大による自然発生運動二ニー０７損失の減少（Ｒａｄｕ ｃｔｉｏ＊　ｏｆ　ｔｈａ　ｎａｔＳｒａｌｌｙｏｅｃｓｒｒｉｎｇ　ｍｏｔｏ ｒ　ｎｅｕｒｏｎ　１ｏｓｓ　ｂｙ　ｅｎｔａｒ（Ｈｍａｎｔｏｆ　ｔｈａ　ｐ ａｒｉｐｈａｒｙ　）　Ｊ、ジエイ　コンブ　ノイロル（／　Ｃｏｒｎｐ　Ｎｅ ５ｒｏ　Ｊ　）　１７０巻、３１１〜３２０頁ハドソン　エイジエイ（Ｈｕｄｓ ｏｎ　ＡＪ　）　：　「筋萎縮性側索硬化症及びこれと痴呆、振せん麻痺、「そ の他の神経学的障害との関係：展望（Ａｔｈｙｏｔｒｏｐｈｉｃ　Ｌａｔｅｒａ ｌ　ｓｃｌ　−ａｒｏｓｉｓ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ａｓｓｏｃｓαｔｉｏｓ　ｗｉ ｔｈ　ｄｇｍｇｎｔｉａ＋ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｕｒｎ　ａｎｄ　ａｔｈｍｒ　 ｓｅｓｒｏｌｏｇｉｃａｌ　ｄｉｓｏｒ　−ｄａｒａ　：　Ｒｓｖｉｅｗ　）　 Ｊプレイ７　（Ｂｒａｉｎ　）　１０４巻、２１７〜２４７頁（１９８０） ジョンソンディエイＣＪｏｈｎｓｏｎ　ＤＡ）、ピラージー（Ｐｉｌａｒ　Ｇ） 　二ｒ脱分極化に応じた、神経節後細胞体からのアセチルコリン放出（Ｔｈｅ　 ｒａｌａａｓｅ　ｏｆ　ａｃｍｔｙｌｅｈｏｌｉｎａ　ｆｒｏｍ＞　ｐｏｓｔ− ｇａｘｇｌｉｏｎｉｃ　ｅａＨｂｏｄｉｅｓ６０５〜６１９．１９８０ モブレイ　ダブリューシーＣＭｏｂＬａｙ　ＷＣ）、サーバーエイシー（５ｅｒ ｖｅｒ　ＡＣ）、イシイ　ディーエヌ（ＩａｈｉｉＤＮ）、リオペール　アール ジエイ（Ｒゼｏｐｍｌｌｅ　ＲＪ）、ショーターイーエム（Ｓ五ｏｏＬａｒ　Ｅ Ｍ）二［神経増殖因子ペストロンク　エイ（Ｐｅｓｔｒｏｎｋ　Ａ）、ドラツチ マンディービ−（Ｄｒａｅｈｍａ＊　ＤＥ　）、グリフイン　ジエイダブリュー （Ｇｔｉｆｆ’％ＪＩＦ）：「神経発芽と再生に対する老化の影響（Ｅｆｆａｃ ｔｔｔ　ｏｆ　ａｇｉｎｇ　ｏ％％ｇｒｔ＃　ＭｐｒＯＳ　−Ｎｎｇ　ａｎｄ　 ｒａｇｅｎｅｒａｔｉｏ％）　Ｊ、イクスプ　ノイロルピノトマ７　アールダブ リュー（Ｐｉ　ｔ　ｔｔｎａｎ　ＲＩＰ’　）、オツヘンハイムアールダブリュ ＣＯｐｐｅｓｈａｉｍ　ＲＷ）　：［神経筋肉阻害はニワトリ胎胚における正常 細胞死中の運動ニューロン出現を増加させる（Ｎｇｕｒｏｒｎｕｓｃｕｌａｒｂ ｌｏｃｋａｇｅ　１ｎｃｒｅａｓｅｓ　ｍｏｔｏｎｍｕｒｏｎａ　ａｒｒｉｖａ ｌ　ｄｕｒ−ｉｎｇ　ｎｏｒｔｎａｌ　ｃｍ’ｌＬ　ｄｅａｔｈ　ｓｓ　ｔｈｅ 　ｃｈｉｃｋ　ｅｍｂｒｙｏ）」、プロチアンツ　エイ（Ｐｒｏｃｈｉαｎｅｔ 　Ａ）、ジボルジオユ−（ＤｉＰｏｒｚｉｏ　Ａ　）、カド−エイ（ＫａｔｏＡ ）、パーシャーピー（Ｂａｒｇａｒ　Ｂ　）、グローインスキージエイ（Ｇｌｏ ｗｉｎｓｋｉ　／　）　：ｒマウス胎胚からの中脳ドパミン作用性ニューロンの インビトロ成熟はそれらの線条体標的細胞の存在下で強化される（　Ｉｎ　ｖｉ ｔｒｏ　ｍαｔｓデα百０％ｏｆ　ｍａａａｘｃａｐｈａＬｉｃ　ｄｏｐａｍｉ ｓａｒｇｉｅ　算ｍｘｒｏｓｓ　ｆｒｏｍｍｏｓｓｓ　ａｍｂｒｙｏａ　ｉｓ　 ａｎルａｎｃｇｄ　ｉｎ　ｐｒｅｓｅｎｃｅ　６／リードデイエム（Ｒｅａｄ　 ＤＭ）　、）レスジエイエム（Ｔｏｒｒｅｍ　ＪＭ）、プロディジエイエイＣＢ ｒｏｄｙ　ＪＡ）　：「グエムでの１９４５〜１９７２年の筋萎縮性側索硬化症 と振せん麻痺−痴呆（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ　Ｌａｔｅｒａｌ　ｍＣ１−ｇｒ ｏａｉｓ　ａｓｄ　Ｐａｒｋｉｎｓｏｓｉａｎ−ｄａｍｍｓｔｉａ　ｏｎ　Ｇｎ ａｗｎ。

１９４５−１９７２）ｊ、エム　ジエイ　エピデミオール（Ａｍ　Ｊ　Ｅｐｉｄ ｅｔｎｉｏｌ　）　１０１巻、３０２〜３１０頁、Ｂス　アールシー　（Ｓｍｉ ｔｈ　ＲＧ　）、アペル　ニスエッチ＜Ａｐｐａｊ、ｓＨ）　：「ニューロン生 残、神経突起伸長及びアセチルコリン（ＡＣｈ）合成を促進する骨格蛋白質の立 証（ＥｖｉｄｅｎＣｅ　１０ｙ　ａ　５ｋａＬｅｔａｌ　ｍｕｓｃｌｅ　ｐｒｏ ｔａｉｎｔｈａｔ　ｅｎｈａ？５Ｃｅｓ　ｎｅｕｒｏｎ　ｓｕｒｖｗａｌ、　ｎ ｇｓｙｉｔｍ　ａｚｔｅｎ−ｓｉｏｎ　ａｎｄ　ａｃｓｔｙＬｇ五ａｇｉｎｇ　 （ＡＣん）ｓｙｎｔｈａａｉｓ　）Ｊ、米国特許第４，２９４，８１８号はリン パ球に会合した抗原性物質と反応する抗体製剤から成る、多発硬化症の診断方法 を開示している。

米国特許第３，８６４，４８１号は多発硬化症の抑制と診断のための合成アミノ 酸を開示している。

米国特許第３．９６１，８９４号・、第４，０４６，８７０号及び第４，２２５ ．５７６号は体内のホルモンを検出するための分析方法を開示している。

発明の開示 本発明は、筋萎縮性側索硬化症が犯されたニューロンのシナプス標的中で合成さ れるまたは貯えられて、逆行的に作用することによって特異的効果を及ぼすニュ ーロン組織または系に特異的な神経栄養ホルモンの欠乏から生ずるという発見に 基づく。ＡＬＳの診断と治療は、骨格筋組織から抽出され、運動ニューロン生残 率の強化と、特表平４−５０７２３４　（５） 運動ニューロン培養物中のコリン作用性及び形態学的差異とに関して検査された 運動神経栄養因子（ｍｏｔｏｒｎａｕｔｒｏｐｈイ６　ｆａｃｔβｒ）に基づく 。この抽出し検査した神経栄養因子を次に精製する。欠乏している場合には、特 定の運動ニューロン組織と系に特異的な神経栄養因子をＡＬＳに罹患した個体に 投与する。

従って、ＡＬＳの治療に有効な組成物を提供することが本発明の目的である。

運動ニューロン系に特異的な神経栄養因子を投与することによってＡＬＳを治療 することが、本発明の他の目的である。

本発明のさらに他の目的は、５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって測定した見かけの分 子量２０〜２２ＫＤと、ＰＩ４．８とを有し、運動ニューロン系に特異的な因子 である神経栄養因子の抽出と＆＃！である。

本発明のさらに他の態様は、５ＤＳ−ＰＡＧＥによって測定した見かけの分子量 〜１６−１８ＫＤとＰＩ９とを有し、運動ニューロン系に特異的な因子である神 経栄養因子の抽出と精製である。

本発明のこの他の目的、特徴及び利点は明細書と請求の範囲を通して述べる。

本発明の好ましい実施態様の説明 上記説明から、ＡＬＥが特定のニューロン組織すなわち運動ニューロン系の障害 であることが理解されよう。

この障害はシナプス前ニューロン入力の変化と次の標的組織の表化とを表す。Ａ ＬＳはベンツ細胞、頭蓋運動ニューロン及び前月細胞の病的変化を表す。

本発明の神経栄養因子の役割は特定ニューロンの本質的な老化という概念を変え ることである、すなわち特定の外因子の存在がニューロンの維持と生存率に影響 を与える。各疾患において、この系の変性はシナプス前末端によって吸収され、 シナプス前軸索を軸幹（ｓｏｒｎａ）と核に逆行的に輸送することによってその 影響力を及ぼすシナプス後細胞によって通常放出される特定の神経栄養因子の有 効性低下によるものである。

従って、運動ニューロン系には、ニューロン生存率を強化し、神経突起の伸長を 促進し、神経支配細胞中の神経伝達物質合成酵素の活性を高める神経栄養蛋白質 がインビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ　）に存在する。インビトロ（ｉｎ　５ｔｔ−ｔｏ ）のニューロン生存率に責任のある同じ因子がインビボのニューロン生存率にも 責任がある。同様な因子または同じ因子さえもインビボでのライフサイクルを通 してニューロンの維持に責任があり、老化の正常な関数として減少する。

従って、ＡＬＥ病の最初の発現は標的組織が必要な神経栄養因子を供給できない ことである。組織の明白な病的変化の存在は不必要である。関連因子の合成また は放出（またはこれらの両方）の障害は疾患の必須条件を表す。例えば、ＡＬＳ の下位運動ニューロン症候群では筋肉細胞が適当な運動神経栄養因子を放出でき ないことが前月細胞の機能不全を生ずる。

病的症状は染色質溶解による前月細胞機能の徐々の停止と、「ダイイングバソク 」の最小の徴候を示す植機能の変化である。同様に、ベンツ細胞損傷が標的ニュ ーロ／からの神経栄養因子の放出低下から生ずる。ヒトにおげろ下行ベンツ細胞 軸索のシナプス標的は確実には知られていないので、上位運動ニュー０７症候群 をこれ以上正確に述べることは不可能である。

従って、この系においてシナプス後細胞から放出される適当な因子が欠損すると 、シナプス前細胞の生育力が損われ、前月細胞とベンツ細胞が徐々に劣化する。

組織培養物が入手可能であるならば、ＡＬＥ病における特定の神経栄養因子の存 在、不足または不存在を容易に評価することができる。

本発明は次の工程： （ｃｃｌ　正常哺乳動物の骨格筋から蛋白質を抽出する；（６１蛋白質単離物を 運動ニューロンに対する栄養効果に関して検定する；及び （ａｌ　前記栄養効果を有する蛋白質分画から、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって測定して約２０．０００〜約２２，０ ００ダルトンの範囲内の見かけの分子量を有するか、または５ＤＳ−ＰＡＧＥ分 析によって測定して約１６，０００〜約１８，０００ダルトンの見かけの分子量 を有する、神経栄養因子を単離する から成る、筋萎縮性側索硬化症の治療に有効な蛋白質組成物の製造方法を開示す る。

ここに述べる因子の分子量範囲は溶液中においてゲル濾過クロマトグラフィーに よってまたは５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって測定したものである。技術上一般に 認められているように、誇求の範囲の神経栄養因子の比分子量は、蛋白質の単離 に用いた方法によって変化する。ここで用いるかぎり、ゲル濾過クロマトグラフ ィーによって単離した一２８ＫＤ因子は５ＤＳ−ＰＡＧＥによって単離した−２ ０〜２２ＫＤ因子に一致する。ゲル濾過クロマトグラフィーな用いて単離した一 Ｌ２ＫＤ神経栄養因子は分取ＳＤＳゲル電気泳動によって測定して、約１６．０ ００〜約ｉ　ｓ、ｏ　ｏ　ｏダルトンの分子量範囲を有する蛋白質組成物に一致 する。

「栄養効果」とは、抽出した神経栄養因子が神経組織内に存在するニューロンの 生存、成熟及び再生に寄与する特定の神経要素に選択的な効果を及ぼすことを意 味する。

コリン作動性活性の生物学的検定法は、本発明の神経栄養因子が有すも栄養効果 を実証する１手段として用いられる。

コリン作動性活性は通常、アセチルコリンの合成を刺激する能力として、または この代りに酵素のコリンアセチルトランスフェラーゼのレベルを高める能力とし て定義される。

特表平４−５０７２３４　（６） 運動ニューロンに栄養効果を及ぼす単離運動神経栄養因子は、多様な正常哺乳動 物から採取した骨格筋から単離される。例えば、ヒト、ラット、ウシからの骨格 筋は全て、同定可能な神経栄養因子を含む蛋白質分画を生じた。ラット骨格筋か ら単離した神経栄養因子がゲル濾過クロマトグラフィーによって溶液中で測定し て、−２８ＫＤの範囲の分子量と、分取りロマトフオーカノングクロマトグラフ イーによって測定して約５１の等電点とを有することが判明している。この特定 の因子はさらに５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製されてお り、見かけの分子量は一２０〜２２ＫＤである。

５ＤＳ−ＰＡＧＥ精製物質を用いた等電点電気泳動は約４．７の等電点を与える 。従って、測定した等電点は両方とも実験誤差の範囲内にあるので、−２０〜２ ２ＫＤ神経栄養因子の等電点はｐＨ５±０．５に与えられる。

ヒト骨格筋から単離した神経栄養因子がゲル濾過クロマトグラフィーによって溶 液中で測定して約１２ＫＤの分子量、５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析法で測定して約１６ −１８ＫＤの分子量及び分取りロマト７オー力シングクロマトグラフイーによっ て測定して約９±１０の等電点を有することも判明している。

ここに開示した方法を用いて当業者が筋肉内に存在する他の神経栄養因子を抽出 し、分析し、精製することも本発明の範囲内であり、さらにラット骨格筋からの 一２０〜２２ＫＤ因子がヒトを含めた他の哨乳動物様の筋肉からも単離されるこ とも本発明に含まれろ。

ここに述べた神経栄養因子は種々な演習的で周知の抽出・精製方法を用いて単離 される。抽出方法には、ブレンダーまたは実験室用ホモゲナイザーを用いた水溶 液中での骨格筋組織の音波処理がある。水溶液は通常、生理的塩類と、Ｈになる よ５１Ｃ緩衝化され、１種類以上のキレート化剤を含めて１種類以上のプロテア ーゼ阻害剤を含む。抽出工程で用いる特定の緩衝剤、キレート化剤及びプロテア ーゼ阻害剤は本発明の実施に重要ではない；従って、下記の試薬は使用可能な試 薬を単に説明するにすぎなし・。例えば、水溶液はリン酸塩緩衝化生理的食塩水 （ＰＢＳ）、クエン酸塩−リン酸塩緩衝液を含むことができ、キレート化剤はＥ ＤＴＡ、ＥＧＴＡ等を含むことができ、プロテアーゼ阻害剤はフェニルメチルス ルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、ペプスタチンＡ１バシトラシン、ロイペプチ ン、Ｎα−ｐ−トシル−Ｌ−アルギニンメチルエステル（ＴＡＭＥ））ｌｔＪＪ Ｎα−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエステル（ＢＡＥＥ）を含むことがで きる。

これらの例に挙げた因子は中程度の酸性ｐＨと塩基性ｐＨにおいて安定である。

それ故、例えば酢酸またはエタノールアミン溶液のような、酸性または塩基性水 溶液中で抽出が行われる。本発明の好ましい実施態様はＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、Ｐ ＭＳＦ及びペプスタチンＡを補充したＰＢＳ　（ｐＨ７，４）　を用いて、−２ ０〜２２ＫＤ筋肉神経栄養因子を抽出する。この代りに、−１７ＫＤ神経栄養因 子の抽出に用℃・た好ましい実施態様はＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ１酢酸及（ＪＰＭＳ Ｆを補充したＰＢＳ（、Ｅ７４）を含む。この組織ホモジナイゼーションによっ て調製した筋肉抽出物を次に遠心分離によって明澄化する。

有用な精製方法の幾つかの種類は、モレキュラーシーブクロマトグラフィー、適 当な条件下でのイオン交換クロマトグラフィーを用いたサイズ分画化；例えば神 経栄養因子の生物学的活性形に対する抗体を用いたアフイニテイクロマトグラフ イー；例えばヒドロキシアパタイト、ンリカ、アルミナ等のような非特異的支持 体を用いた吸収クロマトグラフィー；及びゲル支持電気泳動である。

本発明の神経栄養因子の精製に用いる方法の詳細な説明は下記の実施例に述べる 。

一２０〜２２ＫＤ神経栄養因子は上溝を酢酸によって、Ｅ　５に調節し、生成し た沈殿を遠心分離によって回収することによって精製される。

酢酸沈殿から得られた蛋白質ペレットは、例えばゲル濾過クロマトグラフィー、 ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換クロマ トグラフィー、ヘパリンアフイニテイクロマトグラフイー及び５ＤＳ−ポリアク リルアミドゲル電気泳動を含めた多（のクロマトグラフィ一方法のいずれかによ ってさらに精製することができる。これらの方法を個別にまたは連続的に用いて 、望ましい神経栄養因子を精製することができるが、−２０〜２２ＫＤ因子の精 製法の好ましい実施態様は下記に述べる。

酢酸沈殿からの蛋白質ペレットを緩衝液中に再懸濁し、適当なマトリックスを用 いるゲル濾過クロマトグラフィーによるサイズ分画化を実施して、２５〜３ｌ− ＫＤ範囲内の蛋白質を分離する。カラムを平衡化し１例えば１０？３Ｍエタノー ルアミン、１５０　ｍＭ　ＮａＣ１，０，０１％ポリエチレングリコール（ＰＥ Ｇ）のような適当な緩衝剤を用いてｐＨ９，２，４°Ｃにおいて処理する。０． ０１％〜約０１％の範囲内のポリエチレングリコールは最初の抽出と沈殿工程の 次に用いられる全ての緩衝溶液に含まれる；ＰＥＧは〜２Ｏ−２２ＫＤコリン作 動性神経栄養因子活性の回収を精製中に高めることが判明しているからである。

ゲル濾過クロマトグラフィーがらの神経栄養因子の見かけの分子量は２８−３０ ＫＤであると推定される。

溶離物をプールし、同じ緩衝液中で平衡化したヒドロキシルアパタイト上に直接 負荷することによって濃縮する。コリン作動性栄養活性を平衡緩衝液中の２０　 ｍＭ　！Ｊン酸ナトリウムによって、ヒドロキシルアパタイトから段階的に溶離 する。

次に、溶離した因子を陰イオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製する 。先行のヒドロキシルアパタイト段階からの溶離剤を低塩緩衝液中で１．５に希 釈し、ｐＨ７，５に調節する。通常、例えば２５　ｒｎ−’ｄ　ＨＥＰＥＳのよ ５な低塩緩衝液が用いられる。この溶液をｐＨ７，５特表平４−５０７２３４　 （７） に調節し、３０常ＫＮαＣ１と００１％ＰＥＧを含む同様な緩衝液（ｐＨ７，５ ）で平衡化したＤＥＡＥセルロースのような陰イオン交換カラムに吸着させる。

このカラムを同じ緩衝液中０．０３　Ｍ〜０．３ＭのＮａＣ１の直線勾配によっ て溶離する。神経栄養活性は約０．１５ＭＮａＣ１〜０、２　Ｍ　ＮａＣ１の範 囲内で溶離する。

活性な〜２Ｏ−２２ＫＤコリン作動性神経栄誉因子を濃縮し、付加的なヒドロキ シルアパタイトクロマトグラフイ一工程によってさらに精製する。活性なりＥＡ Ｅ溶離剤を酢酸によってｐＨ７に調節し、２５　惧＆ＨＥＰＥＳ緩衝液、００１ ％ＰＥＧによって平衡化したヒドロキシルアパタイトカラムＣｐＨ７）に塗布す る。活性の全てはヒドロキシルアパタイトに結合して残留する。カラムを同じ緩 衝液で洗浄１．、続いて２０ｍＭリン酸ナトリウム及び２５ｍ＆エタノールアミ ンと０．０１％ＰＥＧ（ＰＨ９，２）中の３Ｑｍ＆と４０ｍＭのリン酸ナトリウ ムを用いて連続的に段階溶離した。神経栄養因子は限外濾過によって濃縮する。

非還元性条件下での分取５ＤＳ−ＰＡＧＥによって、最終精製を実施する。活性 の大部分は見かけの分子量２０〜２２ＫＤを有して移動するが、幾つかの製造で は、少量の活性が〜２４−２６ＫＤのやや大きい分子量を有して移動する。

神経栄養因子の純度を分析５ＤＳ−ＰＡＧＡによってさらに特徴づける。神経栄 養因子の分子量は酸処理及び例えばＤＴＴのような還元剤への暴露によって変化 せず、５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の〜２０帯の電気泳動可動性を有意に変化させな い。

５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析による神経栄養因子の見かけの分子量は〜２Ｏ−２２ＫＤ であるが、ゲル濾過クロマトグラフィーによって算出した見かけの分子量はこれ よりも大キい（〜２８ＫＤ）。これらの結果は本発明の神経栄養因子に与えられ た分子量範囲２０〜３０ＫＤを支持する。

〜２Ｏ−２２ＫＤコリン作動性神経栄養因子の等を点はここに参考文献として関 係するファーマシア（Ｐｈａｒ−ｍａｃｉａ）が述べた方法に従う分取りロマト フオー力シングクロマトグラフイーによって測定される。活性分画はＰＲ９〜４ のポリバッファー（ＰｏＬｙ　ｂｓ／／ｓｙ）　（ファーマシア）によって溶離 する。活性分画はｐＨ４，７〜５分画中に存在する。

ｐＨ４〜７アンホリン（ａｍｐｈｏＬｉｎｍ　）　［：セルバ（Ｓｅｒｖａ　） 　：）を用いたアガロースゲル中での分取等電点電気泳動を用し・ても活性因子 の等電点を算出することができる。この方法を用いて、活性をｐＨ４，ｓ〜ｐＨ ｓ、ｔで回収された。ｐＨ４〜６．５バグプレート（Ｐａｇｐｌａｔａ　）（Ｌ ＫＢ）を用いた分析等電点電気泳動によって測定した５ＤＳ−ＰＡＧＥ精製物質 の等電点はｐＨ４，８であった。

上記全ての工程は４°Ｃで実施し、分画は一８０°Ｃで保存する。

各精製後に、生物学的検定法を実施して、活性を検出し、単離蛋白質成分の収量 を算出する。さらに、生化学的検定法によって筋肉抽出物の熱及びプロテアーゼ に対する感受性も測定する。

１５０°Ｇの６　＃　ＥＣ６中での２４時間後に５ＤＳ−ＰＡＣ；Ｅ＠製ラット 骨格筋神経栄養因子のアミノ酸組成を測定して、下記の第１表に示す。各アミノ 酸の残基数１モルは２０ＫＤの分子量に基づくものである。この因子はその酸性 ＰＩ値と一致して、アスパラギン酸残基とグルタミン酸残基を多（含有する。し かし、顕著な数のりシ／残基とアルギニ／残基も存在する。システィン、トリプ トファン及びメチオニンの残基は検出されなかった。

第１表 残基１モル アスパラギン酸　１９±１゜０ スレオニン　８士Ｏ セリン　１４±０．５ グルタミン酸　２８±１．５ プロリン　８±０．５ グリシン　２６±１．０ インロイ７ン　７士Ｏ ロイノン　１４±０．５ チロシン　６士０５ フエニルアラニン　８±０．５ ヒスチジン　１０±０．５ アルギニ７　８±０．５ 畳　測定されず アミノ酸組成の測定の他に、精製神経栄養因子はリシルＣペプチダーゼ（リシン 残基後に特異的に開裂するンによって開裂され、次の内部ペプチドが同定され、 配列が定められた： （ｆ）　−Ｆ−Ｖ−Ｙ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｎ−Ｆ−Ｔ−Ｌ−Ｌ−Ｅ−Ｌ−Ｎ−Ｎ−Ａ カッコに入れられたりシン残基は実際には配列されながったが、リシルＣペプチ ダーゼを開裂剤として用いたのでその存在が推定される。

哺乳動物と鳥類から得られた運動ニューロンの培養物において−２０−２２ＫＤ 神経栄養因子を分析する。

Ｅ１４〜Ｅ１５ラット胎仔（ｅｍｂｒｙｏ　）から得られた解離を髄の培養物を 用いることが好ましい。この分子の生物学的活性はこれらの培養物の生存、コリ ン作動性及び形態学的分化の刺激に基づくものである。好ましい検定方法は神経 栄養因子と共にラット運動ニューロンの培養物を４８時間インキュベートして、 各培養孔におけるコリ特表千４−５０７２３４　（８） ンアセチルトランスフエラーゼレベルの刺激をθ１］定することである。この種 類及び他の種類の運動ニューロン培養物中の生存率、細胞増殖または他のプリン 作動性特性の強化な用いた検定法をも用いて、この因子を検出することができる 。

〜１７ＫＤ神経栄養因子に関しては、本発明の好ましい方法は、〜２Ｏ−２２Ｋ Ｄコリン作動性栄養因子に関して上述したように、筋肉組織を緩衝液中でホモジ ナイズすることによるヒト骨格筋がら蛋白質を抽出することを含む。ＰＢＳに２ 　ｒｎＭ　ＥＤＴＡ、２　ｎｓＭ　ＥＧＴＡ、０．２惰Ｍ　ＰＭＳＦを補充し、 酢酸中０．５Ｍにした。ホモジナイゼーション後に、抽出物を遠心分離によって 澄明化する。次に〜１７ＫＤコリン作動性神経栄養因子を硫酸アンモニウムによ って沈殿させる。実際には、１００％飽和になるように硫酸アンモニウムを加え ることによって形成された沈殿を遠心分離によって回収する。〜１７ＫＤ因子活 性は高い硫酸アンモニウム濃度（飽和の６０％以上）で沈澱することが判明する 。従って、後での精製工程の代替方法は６０％硫酸アンモニウム飽和で沈殿する 物質を除去した後に１００％飽和時に生ずる沈殿を回収することである。

次に、ヒト神経栄養因子を陽イオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製 する。硫酸アンモニウムペレットを緩衝液（例えばｚ　Ｎ　ＨＣｌｔでｐＨ３− ５に調節した４０ｍＭリン酸す）　ＩＪウム）中に再習濁させ、冷所で攪拌し、 遠心分離によって澄明化する。生成した溶液を同じ緩衝液で平衡化したホスホセ ルロースカラム（例エバ、セレツクス（Ｃｇｌｅｚ）Ｐ）に塗布し、完全に洗浄 した後に、神経栄養因子を１ＭＮαＣ１’５ｒ：含む同じ緩衝液で段階的に溶離 する。

ヒト神経栄養因子をゲル濾過クロマトグラフィーによってさらＶこ積層する。溶 離した因子を例えばアミコンＣＡｒｎ１ｃｏｎ　）　ＹＭ５膜を用いる限外テ過 によって濃縮し、１５００〜３０．０００ダルトン範囲内の蛋白質を分画化しう るゲル濾過カラムに塗布する。例えば、ＰＥＳと００２％アジ化ナトリウムによ って平衡化したセファデックス（Ｓａｐｈａｄｍｚ　）Ｇ　５０カラムを用いる ことができる。

生物学的活性は１２−１８ＫＤに相当する広範囲な分画にわたって溶離する。

最後に、ヘパリン　アフイニテイ　クロマトグラフィによってコリン作動性神経 栄養因子を精製する。活性なセファデックス分画を、Ｈ〜７の緩衝液（例えば０ １５ＭＨＥＰＥＳ）によって平衡化したヘパリン　アフィゲル（Ｈ４，αｙｉｎ 　Ａｆｆｊσ−ｌ）に塗布する。０．２５Ｍ、０．５Ｍ。

０．７５Ｍ、１．０Ｍ、１．２５Ｍ及び１．５ＭＮαＣＡ’を補充した同じ緩衝 液を用いて段階的溶離を実施する。因子活性の大部分は１．５　Ｍ　ＮａＣ１段 階で溶離する。しかし、貫流分画中に顕著な活性が観察され、これも回収される 。これらの分画は一８０°Ｃに保存することができる。

精製組換え塩基性繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）に対して生じた抗血清を用いて 、ヒト神経栄養因子をさらに評価し、特性化した。ヘパリンカラムからのヘパリ フ結合物質と貫流物質との両方の全神経栄養活性を抗体の１％希釈において完全 に中和した。これらの結果はヒト筋肉因子から単離した神経栄養活性は塩基性Ｆ ＧＦかまたは抗原的に関連した化合物であることを示唆する。

〜１７ＫＤコリン作動性神経栄養因子の等電点をファーマシアが述べた方法に従 って分取りロマトフオー力シングクロマトグラフイーによって測定した。活性分 画をホリバツ７７−９６（ファーマンア）によって溶離すると、活性がｐＨ９分 画に存在することが判明する。

各精製工程後に生物学的検定法を実施して、活性を検出し、〜２Ｏ−２２ＫＤ神 経栄養因子の単離に関して前述したように、蛋白質収量を算出する。ヒト神経栄 養因子に実施した特定の検定法は、ラット筋肉に用いた検定法とは若干異なるの で、以下で説明する。

鳥類または哺乳動物種から得られた運動ニューロンの培養物で〜１７ＫＤ神経栄 養因子を検定する。バカＣＶａｃａ）等がデブ　プレイン　レス（Ｊ）ｍｖ、　 Ｂｒａｉｎ　Ｈａｓ、）（１９ｓｓン１９巻、３７〜４６頁に述べているように 、Ｅ８〜Ｅ９ニワトリ胚から得た、解離チキン繊毛神経節ニューロンの培養物を 用いることが好ましい。この因子の生物学的活性は培養した繊毛神経節ニューロ ンの成長、生存及びプリン作動性分化の刺激に基づ（ものである。

好ましい検定方法は、この因子を解離ニワトリ稙毛神経節培養物と共に７２時間 インキュベートし、コリンアセチルトランスフェラーゼ活性のレベルの刺激を測 定することである。この培養物ならびに運動ニューロン培養物の生存率、細胞増 殖または他のコリン作動性特性の強化を用いた検定法もこの因子の検定法として 用いられる。

ＡＬＳに罹患した個体に運動神経栄養因子が欠乏する場合には、下記実施例に述 べる単離神経栄養因子のいずれかを投与することによって治療が行われる。

本発明を次の実施例によって、さらに説明する。これらの実施例は本発明の如何 なる限定をも意図しないものである。

実施例 生後２週間のスプラーグーダウレイ（Ｓｐｒａｇｕａ　−Ｄａｗ−Ｌａｙ）ラッ トからの肢骨格筋（１００ｆ）を、１鴨ＭＥ　ＤＴ　Ａ、　０．５　ｍＭ　ＥＧ ＴＡ、　１　ｔｎＭ　ＰＭＳＦ、　０．１　μｙ／ｄペプスタチン（アｅｐｓｔ ａｔｉ％）Ａ及び１μｙ／ｍｌのバシトラシン、ロイペプチン、Ｔ　Ａ　ＭＥ及 びＢＡＥＥを補充した、３倍ｆ（重量／容量）の氷冷ＥＢＳ中でホモジナイズし 、３０．０００　Ｘ４において１時間４℃で遠心分離させ、細胞破片を除去した 。実施例で実施する遠心分離は全て、他に指示しないかぎり、４℃で１時間ラン するものとする。生底した上溝（Ｓｌ）を１３０，０００　Ｘｆにおいてさらに １時間遠心分離し、得られた上清（粗抽出物）特表千４−５０７２３４　（９） を１Ｍ酢酸によってｐＨ５に調節し、氷上で３０分間攪拌した。沈殿した蛋白質 を３０．０００）ｌにおける１時間の遠心分離によって回収した。回収した沈殿 をＥＢＳ（１０ｍ＆エタノールアミン、１５０　惰＃　ＮａＣ１，０，０１％Ｐ ＥＧ、　、Ｈ９，２）中に再抽出し、３０．０ＯＯｘｆにおいて１時間遠心分離 した。ＣＡＴ発生活性（ＣＤＩ）を含む透明な上清（、Ｈ５−７’）に対して次 にゲル透過クロマトグラフィーを実施した。

ｐＨ５−Ｐを２５浴Ｍエタノールアミン、０．０１％ＰＥＧ、ｐＨ９，２中に再 懸濁し、４℃のＥＢＳで平衡化したセファデックスＧ−１００（ファーマシア） に塗布した。ＣＡＴ発生活性は１５〜４５ＫＤの範囲内で溶離した。これらの分 画をプールし、ＥＢＳで平衡化したヒドロキシルアパタイト〔バイオ−ラド（Ｂ ｉｏ　−Ｒａｄ　）　、カリフォルニア州すッチモンド〕のｌＸ６ＣＩＩＬカラ ムに直接塗布した。〉５０Ｋｌ）の高分子量で溶離した、空隙中の小活性ピーク を、さらに精製することなく、−８０℃にお（・て凍結保存した。ＣＡＴ発生活 性の全ては保留され、平衡緩衝液（ＨＡＰ−９）中の２０毒Ｍ　Ｎａ１ｌ　２Ｐ Ｏ４の段階的勾配（口＃Ｗ−ｇｒαｄｉｇ％ｔ）によってヒドロキシルアパタイ トから定量的に溶離した。この方法はＣＡＴ発生活性を迅速に濃縮する。

ＤＥＡＥクロマトグラフィーとヒドロキシルアパタイトＭＡＰ−９溶離剤からの ＣＡＴ発生活性を２５ｍ＃ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７，５によって１：５に希釈し、２ ５ｍＭＢ　Ｅ　Ｐ　Ｅ　Ｓ　、　０．０３　Ｍ　ＮａＣ１及び０．０１％ｐＥｃ ；、ｐＨ７５で平衡化させたＤＥＡＥセルロースの１．５ｘ２０ｃＩｒＬカラム に塗布した。ＣＡＴ発生活性の全てはｐＨ７，５においてＤＥＡＥセルロースに 結合し、０．０３Ｍ−０，３ＭＡ’ａ　Ｃｌの直線勾配によってＤＥＡＥセルロ ースかう溶離した。ＣＡＴ発生活性はＣｌ　１５　Ｍ　〜０．２　Ｍ　Ｎａｃｌ の範囲で溶離する。これらの活性ＤＥＡＥ分画をプールし、ＬＯＭＨＣＩＩによ ってｐＨ７に調節し、２５　ｔｎＭ　Ｅ　ＥＰＥＳ緩衝液、０．０１％ＰＥＧ％ 　ｐＨ７，０で平衡化したヒドロキシルアパタイトのＱ、９膜３ｃｍカラムに塗 布した。２０ｍＭＮａＨ１ＰＯ４を補充した平衡緩衝液でカラムを洗浄した後に 、ＣＡＴ発生活性を２０　惰Ｍ　Ｎａ１ｌ＊Ｐ　に’４３０　ｍｔ、次に２５悟 Ｍエタノールアミンと０．０１％ＰＥＧ　（、Ｈ９，２）中の３０　ｍ、Ｍ　Ｎ ａＨ２ＰＯ，及び４０　ｍＭ　ＮＪ、ＰＯ，各３Ｑｍｌとによって連続的に段階 溶離した。３０　ｍＭ　ＮＪ、ＰＯ，溶離剤（ＨＡＰ−７）をアミコンＹＭ−５ 膜次にセントリコン（Ｃａｎｔｒｉｃｏｎ）　−１０膜を用いた限外濾過によっ て、２段階でＱ、　ｌ　ｍｉに濃縮した。この濃縮物質を分取ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動に用いた。〜２Ｏ−２２ＫＤコリン作動性因子の精製結果の要約 を第２表に示す。

例　４゜ ＲＡＰ−７分画に対して非還元性条件下での０．１％ＳＤＳ中の分取ゲル電気泳 動を実施した。電気泳動は１４％アクリルアミド−２，５％ビスアクリルアミド 分離ゲル（１４０Ｘ１２０Ｘ１ｍ１１）と、４．５％アクリルアミド堆積ゲルと を用いて、レムリ（Ｌａｍｒｎｎｓｌｉ）　（１９７１）のネイチャ〒（ロンド ン）２７７：６８０に従って実施した。電気泳動後に、ゲルを２５ｍｍＭ　ＨＥ ＰＥＳ（ｐＨ７，５）によって１回すすぎ洗いし、２ｆｌ切片にスライスした。

各切片を切りきざみ、２５ｍＭＨＥＰＥＳ、０．０１％Ｐ　Ｅ　Ｇ　（ｐＨ７， ５）　１．０ｍ７！中で４℃において１晩抽出した。ゲルスライスからの上溝を 取出し、−８０’Ｃで保存した。活性の大部分は２０〜２２ＫＤの見かけの分子 量を有して移動したが、ある調製では、少量の活性がやや高い分子量（〜２５Ｋ Ｄ）で移動するのが観察された。

この方法による５ＤＳ−ＰＡＧＥからの蛋白質の回収は（ＩｕＩ：３大豆トリプ シン阻害剤と（１２！７）標＠ＨＡＰ−７蛋白質帯との回収に基づいて、８０〜 ８５％であると算出された。

分析用ゲル（０，５ｍｍ厚さ）を調製用ゲルに関して述べたように、バイオ−ラ ドミニゲル装置を用いて調製した。

このゲルを２００Ｖにおいて４５分間ランした。電気泳動の前にサンプルを真空 遠心分離によって乾燥させ、電気泳動緩衝液１０μｌ中に再懸濁した。沸とうさ せ、還元したサンプルをＤＴＴ２ｍｍ含有電気泳動緩衝液中に再特表千４−５０ ７２３４　（１０） 懸濁し、電気泳動の前に１００℃に５分間加熱した。電気泳動後に、ゲルを１０ ％酢酸、５０％メタノール中に固定し、オークレイ（０σｋｌ−ν）等（１９８ ０）のアナル。

頁の銀染色方法に従って染色した。ヨウ素化蛋白質含有ゲルを固定し、ホヮット マン（Ｗｈ　ａ　ｔ　ｍａ％）慮３戸紙上で乾燥させ、コダックＸ−オマット（ Ｋｏｄａｋ　Ｘ−ＯＭＡＴ　）ＲＰ−５フイルムに一７０℃において暴露させた 。

分取５ＤＳ−ＰＡＧＥにかける前のＤＴＴ含有ＨＡＰ−７分画の予熱は神経栄養 因子の生物学的活性の移動位置を有意に変えず、さらに低分子量で移動する付加 的な活性も出現させなかった。骨格筋１００Ｆから平均１１００単位の活性が５ ＤＳ−ＰＡＧＥからの２０〜２２ＫＤ帯に回収された。これは粗抽出物からの１ ．６％回収率と、ＲＡＰ−７段階がらの活性の１０％回収率をラット骨格筋から の神経栄養因子の活性を１４日胎芽ラットのを髄ニューロンの解離培養物で検定 した。を髄ニューロンはマクナマン（Ｍｃｎａｍａ％）　等カフ７−　、　Ｊ： イオｘ（Ｄａｖ、ＥｉｏＬ＞＜１９８５）　１１２巻、２４８〜２５２頁に述べ ているよ５に、トリプシン解離を髄から入手した。解離ニューロンを１０％熱不 活化ウマ血清補充ＤＭＥＭ中に懸濁させ、１０００００細胞／孔の密度でポリリ シン被覆９６孔マイクロタイタープレートに接種した。培養物を空気９０％、Ｃ ｏ、１０％の湿った雰囲気中で３７℃において１時間ブレインキュベートして、 ニューロンを支持体（ａｓｂｓｔデαｔｓｒｎ）に付着させた。ブレインキュベ ーション期間後に、神経栄養因子を加えた。

典型的には、１時間のブレインキュベーション期間後に、この因子１〜３０μｌ ／７．、を加えた。細胞を既述したように３７℃においてさらに４８時間インキ ュベートしてから、イシダ（Ｉｓ五ｉｄａ　）とデグチ（Ｄｅｇｓｃｋｉ）がジ エイ。

１８１８〜１８２３頁に述べ【いるように、コリンアセチルトランスフェラーゼ 活性に関して検定した。この因子の生物学的活性はＰＢＳで処理した対照培養物 を凌駕するＣＡＴ活性の強化に基づくものである。この検定が細胞数と反応時間 に直線的に比例し、培養物中のアセチルトランスフェラーゼ活性の９５％より多 い割合が１０μＭ　ＮＶＰ　（コリントランスフェラーゼの特異的阻害剤）によ って、またはコリンの代りにカルニチンを用いることによって、またはＡＣｈＥ 　４単位を検定溶液に加えることによって阻害されることは既に示した（マクナ マン等（１９８ｇ）、ダブ。パイオル１２５巻、３１１〜３２０頁）。この因子 の飽和量によって得られる典型的な刺激は対照培養物の２〜３倍である。活性の １単位は、等量のサンプルＭｋ衝液で処理した対照培養物に比べたＣＡＴ活性の ５０％刺激として機能的に定義される。この検定法を用いて、生後１４日間のラ ット骨格筋１００９がら平均５Ｘ１０’単位が得られた。

粗抽出物中の神経栄養因子活性のレベルは動物の年令に依存する。生後１２〜１ ５日間の動物からの骨格筋の抽出物中で最高の比活性が検出された。高年令の動 物の筋肉からはより多量の筋肉が得られるが、この因子の精製のための出発物質 としては生後１２〜１５日間の動物が好ましい、このような組織内の特異的活性 が大きいか神経栄養因子をグリコジル化する可能性を、特異的レクチンアフイニ テイ・カラムを用いて研究した。第３表に示すように、Ａ２．。物質のごく小さ い割合のみがコンカナバリンＡ、小麦胚芽またはカブトガニ（ＬｉｍｕＬｓａ） レクチンのいずれからか成るテフィニティカラムに結合し、ＲＡＰ−９段階から の活性分画中の神経栄養因子活性は全く結合しなかったが、これらの各カラムは 対照の糖蛋白質孔とは結合した。

ヘパリンーセ７アロースアフイニテイカラムを用いて、ｐＨ５−Ｐ分画中の神経 栄養活性のヘパリンとの結合可能性を分析した。第３表に示すように、この段階 の精製では、蛋白質の８％のみがヘパリン−セファロースに結合し、栄養活性は 全く結合しなかった。生物学的活性含有ＤＥＡＥ分画をヘパリン−セファロース クロマトグラフィーによって分析した場合にも、同様なデータが認められた。

ラット骨格筋因子の約２．０００〜３，０００単位を第３表の各カラムに個別に 塗布した。第３表に示した値は、貫流液プラス洗浄液中または糖もしくは塩溶離 剤中に回収された、塗布した活性と蛋白質との割合である。

上記例に示したデータは、アミノ酸配列情報、等電点及び塩基性ＦＧＦに対する 抗体との交差反応の無いことを含めて、この因子がＦＧＦに関係しない新規なコ リン作動性因子であることを実証する。

特表平４−５０７２３４　（１１） 例　７゜ イリオプンアス（ｌ１ｉｏｐｓｏａｓ）、胸筋または両方の筋肉源を通常急性外 傷被害者から死後２０時間未満以内に取出した。１回の調製用に約０４〜０．５ 館の筋肉を処理した。腿と脂肪を除去した後に、残りの組織を小片に切断し、各 ２ｍＭのＥＤＴＡとＥ　Ｇ　Ｔ　Ａ　％０．２　ｍＭ　ＦＭＳ　Ｆ及びｏ、５ｙ 酢駿を補充した、１ＩＰＢｓ溶液（ｐＨ７，４）中でワーリングブレンダー（ｊ ｌ’ａｒｉｎｇ　ｂｌｕｎｄｅｒ）を用いてホモジナイズした。このホモジネー トを２７，０００　ｆで１時間遠心分離し、上溝を数層のチーズ布に通してデカ ントした。硫酸アンモニウムを１００％飽和になるまで加えて活性蛋白質分１Ｍ １ｉを沈殿させ、２７．０００５’での１時間の遠心分離によって回収した。

Ｉ　Ｎ　ＨＣｌによって、Ｈ３，５に調節した、４０ｍ＃ＮａＨ，Ｐ０．２５０ ｍｌ中にペレットを再懸濁させ、冷所で３０分間攪拌した。この溶液を１００， ０００　Ｆにおいて１時間遠心分離し、ペレットを廃棄した。上溝を蒸留水によ って導電率２５　ｍｓ／ｃａになるように希釈した。

セレツクス（Ｃｅｌｌａｒ）Ｐ　（パイオーラド）スラ替−約２００ｍ／を再懸 濁緩衝液の希釈上清に加え、混合物を冷所で１晩攪拌することによって、イオン 交換クロマトグラフィーを実施した。セレツクスＰと結合蛋白質をブ７ナーフィ ルターを用いて戸紙上に回収し、再懸濁緩衝液ですすぎ洗いし、Ｉ　Ｍ　ＮａＣ １を補充した再懸濁緩衝液２５０ｍＪを含むビーカー中に再懸濁させた。この溶 液を冷所で３〜４時間攪拌した後に、溶離物をブフナーロートによって回収した 。戸液をアミコンＹＭ５フィルター上で約５ｍｌに濃縮した。

濃縮物をセファデックス６５０カラム（０，０２％ＮａＮ。

を含むＰＢＳで予め平衡化した１、５　Ｘ　１８０ｃｍ）でクロマトグラフィー 精製した。１００滴または〜３ｍｌの約８０分画を回収した。殆んどの活性は〜 １７ＫＤに相当する分画５５〜６０で溶離した。これらの分画をさらに精製する ためにプールした。

て、プールした分画をヘパリン　アフイーゲル　カラム（パイオーラド）に徐々 に塗布した。結合蛋白質は０．２５Ｍ、０．５Ｍ、０．７５Ｍ、１．ＯＭ、１． ２５Ｍ及び最後にり、５ＭＮαＣ７ｌを補充した、０．５　Ｍ　ＨＥＰＥＳ　（ ｐＨ７）緩衝液を用いた、連続数段階で溶離した。プリン作動性活性の大部分は 約１．５　Ｍ　ＮａＣ１で溶離した。しかし、有意な量の活性が貫流分画中に検 出され、これは今後の分析のために保存した。〜１７ＫＤ神経栄養因子の精製結 果の要約は第４表に示す。

第４表 ヒト筋肉因子の精製結果の要約 ２６．０ＯＯＸＰ上清　５．６−１２．４１Ｆ　Ｎ、Ｄ。

１００．０ＯＯＸｒ上清　４３０　７５０”ｌｉ’　３＆０ＯＯ（１ａａｔｉｍ ａｔａ）Ｃａｌｌｕｓ　Ｐ溶離物　２８−８０ｍ９　２５−６４，０００６５０ 　３．５−８．２＃　８−２２．０００ヘパ１）ン　１．５＆　５−３０μｙ　 １，２００＝３，０００出発物質　０．４〜０．５　＃筋肉（８ＭＸ６６〜７０ 　Ｋ基づく）ヒト骨格筋因子を８〜９日間チキン胚の繊毛神経節培養物の解離培 養物で検定した。培養物をバカ等（１９８５）が上記文献に述べたように調製し た。簡単に説明すると、神経節をトリプシン化によって解離し、これを標準塩溶 液の代りにＤＭＥＭを用い、０．４％熱不活化ウつ胎仔崩清を加えることによっ て改良したサトウの培地（Ｓａｔｏ’ｘｍｅｄｉｕｍ）中に懸濁した。典型的な 検定法では、細胞をポリリシン被覆９６孔プレートに１孔につき神経節へ〜スの 密度で接種し、湿った室内の９０％空気、１０％Ｃ０２中、３７℃において１時 間ブレインキュベートした。

このブレインキュベーション期間後に、神経栄養因子（培養物量の０．２８％） を加えた。次に細胞を上記条件下で３日間増殖させ、３日目にこれらをホヌム（ Ｆｏｎｕｍ）等がジエイ、ノイロケム（１９７５）２４巻、４０７〜４０９頁に 述べているように、コリンアセチルトランスフェラーゼ活性に関して分析した。

神経栄養活性の検定法としてＣＡＴの刺激を用いて、１単位を対照培養物に比べ て５０％刺激として定義した。典型的には、剖検したヒト骨格筋０．５＃から栄 養因子５〜６μ２が得られた。

従って、本発明は本発明の対象及び目的を達成するために充分に適切かつ適合す るものであり、上記その他の固有の利点及び特徴を有している。

本発明の現在好ましい実施態様を説明のために述べてきたが、請求の範囲によっ て定義される本発明の本質に含まれるよ５な変更を行うことも可能である。

補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成　元年１１月　２日 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８８１０１３９３ ２、発明の名称 筋萎縮性側索硬化症の治療用組成物の製造方法３、特許出願人 住　所　アメリカ合衆国テキサス用７７０３０．　ヒユーストン。

ワン・ベイラー・プラザ　（番地ない 名　称　ベイラー・カレッジφオブ・メディスン５、補正書の提出日 平成　元年　９月　５日 ６、添付書類の目録 （１）　補正書の翻訳文　１通は正なものは追突）浄＠（内容に変更なし） 請求の範囲 １、次の工程： （α）正常哺乳動物の骨格筋から蛋白質を抽出する工程；（ｂ）　蛋白質抽出物 の運動ニューロンに対する栄養効果を検定する工程；及び ｔｃｌ　前記栄養効果を有する蛋白質抽出物から、５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析によっ て測定して約２０，０００ダルトンから約２２，０００ダルトンまでの範囲内の 分子量を有する神経栄養因子を単離する工程 かう成る、筋萎縮性側索硬化症の治療に有効な蛋白質組成物の調製方法。

２、前記正常哺乳動物がラットである請求項１記載の方法。

３、前記蛋白質分画がｐＨ５±０．５において等電性である請求項２記載の方法 。

４、前記神経栄養因子が内部ペプチド配列：Ｆ−Ｖ−Ｙ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｎ−Ｆ− Ｔ−Ｌ−Ｌ−Ｅ−Ｌ−Ｎ−Ｎ−Ａを有する請求項２記載の方法。

５、前記抽出が１種類以上のプロテアーゼ阻害剤とキレート化剤を含む、緩衝化 水溶液中での骨格筋のホモジナイジングを含む請求項１記載の方法。

６、前記単離が、 ｔｃＬ＋　抽出物をｐＥ　５に調節し、沈殿を回収することによる蛋白質抽出物 の精製； （ｂ）ｐＥ　５−Ｐ沈殿のヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーによる分 画化： ｔｃ）　結合蛋白質の溶離によるコリン作動性因子活性の回収： （圏　陰イオン交換クロマトグラフィーによるｐＨ５−Ｐ沈殿の分離；及び （６）　コリン作動性因子活性を回収するための活性分画のプール、 を含む請求項１記載の方法。

７、前記単離工程が、 （α）抽出物をｐＨ５に調節し、沈殿を回収することＫよる蛋白質抽出物の精製 ； （６）　ゲル濾過クロマトグラフィーによるｐｎ５−ｐ沈殿の精製； （ｃ）　〜２８ＫＤ蛋白質成分の回収；（ｄ）　ヒドロキシルアパタイトクロマ トグラフィーにょる〜２８ＫＤ蛋白質成分の回収化； （−）　結合蛋白質の溶離： （１）ＩＩ！イオン交換クロマトグラフィーにょる溶離蛋白質の分離； （ｙ）　活性分画のプール； （匍　ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーによる、プールした活性の分 画化； （ｊ）　コリン作動性因子活性の回収；＜ｊ）　限外濾過によるプリン作動性因 子活性の濃縮；及び（＆）　濃縮コリン作動性因子活性に対する５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅｌみ長平４−５０７２３４　（１３） 分析の実施と、〜２Ｏ−２２ＫＤ神経栄養因子の回収、を含む請求項１記載の方 法。

８、各クロマトグラフィ一段階に約０．０１％〜約０，１％のポリエチレングリ コールが存在する請求項６または７記載の方法。

９　次の工程： （（Ｌ）　正常哺乳動物の骨格筋から蛋白質を抽出する工程；（ｂ）　蛋白質抽 出物の運動ニューロンに対する栄養効果を検定する工程；及び （Ｃ）　前記栄養効果を有する蛋白質抽出物から約１ａＯＯＯ〜約１８．０００ ダルトンの範囲内の分子量を有する神経栄養因子を単離する工程、 から成る、筋萎縮性側索硬化症の治療に有効な蛋白質組成物の調製方法。

１０、前記正常哨乳動物がヒトである請求項９記載の方法。

１１、前記単離工程が、 （α）ｐＨの３．５への調節と硫酸アンモニウムの１００％飽和までの添加； （ｂ）生ずる沈殿の回収； （Ｃ１ホスホセルロース上でのイオン交換クロマトグラフィーによる生成沈殿の 分画化； （祷　コリン作動性活性を有する結合蛋白質の回収；（−）　回収蛋白質のゲル が過クロマトグラフィーによる分画化； げ）　〜１７ＫＩ）因子に相当する活性分画のプール；＜ｙ）　プールした分画 に対するヘパリンーアフィニティクロマトグラフイーの実施；及び ｃｈｒ）〜１７ＫＤ蛋白質組成物の回収、を含む請求項９記載の方法。

１２、請求項２記載の方法によって調製した蛋白質。

１３、　（補正後）　５ＤＳ−ＰＡＧＥによって測定するとき〜２０，０００ダ ルトンの分子量と、５±０．５の等電点を有し、内部ペプチド配列：Ｆ−Ｖ−Ｙ −Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｎ−Ｆ−Ｔ−Ｌ−Ｌ−Ｅ−Ｌ−Ｎ−Ｎ−Ａ　を含む、実質的に純 粋な神経栄養因子。

１４、Ｋ残基が最初に挙げられたＦ残基に先行する請求項１３記載の神経栄養因 子。

１５、（削除） 工６．（追加）　ＳＤＳ、ＰＡＧＥによって測定するとき〜２０．０００〜２２ ，０００ダルトンの分子量と、５　＋　０．５の等電点な有する実質的に純粋な 神経栄養因子であって、該神経栄養因子が実質的にヘパリンに結合せず、かつ塩 基性ＦＧＦに対する抗体と実質的な交叉反応性を有さない上記神経栄養因子。

手続補正書（方式） ％式％ 特許庁長官　麻　生　渡　殿　Ｄゾ １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８８１０１３９３ 昭和６３年特許願第５０４１５’９号 ２、発明の名称 筋萎縮性側索硬化症の治療用組成物の製造方法３、補正をする者 名　称　ベイラー・カレッジ・オブ・メディスン４゜代理人 住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区 電話３２７０−６６４１〜６６４６ ５、補正命令の日付　平成４年７月１４日　（発送田６、補正の対象 （１）出願人の代表貴名を記載した国内書面（２）委任状及び翻訳文 （８）タイプ印書により浄書した明細書及び請求の範囲の翻訳文手続補正書（方 式） 平成　４年　８月ｆ日 特許庁長官　麻　生　渡　殿　１１ １、事件の表示 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所 名　称　ベイラー・カレッジ・オブ・メディスン４、代理人 住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区 ５、補正命令の日付　平成４年７月１４日　（発送日）６、補正の対象 （１）タイプ印書により浄書した平成元年１１月２日付提出の補正書の翻訳文 ７、補正の内容 別紙０通り（尚、（１）の書面の内容には変更ない国際調査報告 一一−＾−ｍｍｓ＠、　ＰＣＴ／υｓ　８８１０１３９３国際調査報告 ＵＳ　８８０１３９３ Ｓ＾　２２２１７

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．次の工程： （ａ）正常哺乳動物の骨格筋から蛋白質を抽出する工程；（ｂ）蛋白質抽出物の 運動ニユーロンに対する栄養効果を検定する工程；及び （ｃ）前記栄養効果を有する蛋白質抽出物から、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によつて 測定して約２０，０００ダルトンから約２２，０００ダルトンまでの範囲内の分 子量を有する神経栄養因子を単離する工程 から成る、筋萎縮性側索硬化症の治療に有効な蛋白質組成物の調製方法。
2. ２．前記正常哺乳動物がラットである請求項１記載の方法。
3. ３．前記蛋白質分画がｐＨ５±０．５において等電性である請求項２記載の方法 。
4. ４．前記神経栄養因子が内部ペプチド配列：Ｆ−Ｖ−Ｙ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｎ−Ｆ− Ｔ−Ｌ−Ｌ−Ｅ−Ｌ−Ｎ−Ｎ−Ａを有する請求項２記載の方法。
5. ５．前記抽出が１種類以上のプロテアーゼ阻害剤とキレート化剤を含む、緩衝化 水溶液中での骨格筋のホモジナイジングを含む請求項１記載の方法。
6. ６．前記単離が、 （ａ）抽出物をｐＨ５に調節し、沈殿を回収することによる蛋白質抽出物の精製 ； （ｂ）ｐＨ５−Ｐ沈殿のヒドロキシルアバタイトクロマトグラフィーによる分画 化； （ｃ）結合蛋白質の溶離によるコリン作動性因子活性の回収； （ｄ）陰イオン交換クロマトグラフィーによるｐＨ５−Ｐ沈殿の分離；及び （ｅ）コリン作動性因子活性を回収するための活性分画のプール、 を含む請求項１記載の方法。
7. ７．前記単離工程が、 （ａ）抽出物をｐＨ５に調節し、沈殿を回収することによる蛋白質抽出物の精製 ； （ｂ）ゲルろ過クロマトグラフィーによるｐＨ５−Ｐ沈殿の精製； （ｃ）〜２８ＫＤ蛋白質成分の回収； （ｄ）ヒドロキシルアバタイトクロマトグラフィーによる〜２８ＫＤ蛋白質成分 の分画化； （ｃ）結合蛋白質の溶離； （ｆ）陰イオン交換クロマトグラフィーによる溶離蛋白質の分離； （ｇ）活性分画のプール； （ｈ）ヒドロキシルアバタイトクロマトグラフィーによる、プールした活性の分 画化； （ｉ）コリン作動性因子活性の回収； （ｊ）限外ろ過によるコリン作動性因子活性の濃縮；及び（ｋ）濃縮コリン作動 性因子活性に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の実施と、〜２０−２２ＫＤ神経栄養 因子の回収、を含む請求項１記載の方法。
8. ８．各クロマトグラフィー段階に約０．０１〜約０．１％のポリエチレングリコ ールが存在する請求項６または７記載の方法。
9. ９．次の工程： （ａ）正常哺乳動物の骨格筋から蛋白質を抽出する工程；（ｂ）蛋白質抽出物の 運動ニユーロンに対する栄養効果を検定する工程；及び （ｃ）前記栄養効果を有する蛋白質抽出物から約１６，０００〜約１８，０００ ダルトンの範囲内の分子量を有する神経栄養因子を単離する工程、 から成る、筋萎縮性側索硬化症の治療に有効な蛋白質組成物の調製方法。
10. １０．前記正常哺乳動物がヒトである請求項９記載の方法。
11. １１．前記単離工程が、 （ａ）ｐＨの３．５への調節と硫酸アンモニウムの１００％飽和までの添加； （ｂ）生ずる沈殿の回収； （ｃ）ホスホセルロース上でのイオン交換クロマトグラフィーによる生成沈殿の 分画化； （ｄ）コリン作動性活性を有する結合蛋白質の回収；（ｅ）回収蛋白質のゲルろ かクロマトグラフィーによる分画化； （ｆ）〜１７ＫＤ因子に相当する活性分画のプール；（ｇ）プールした分画に対 するヘバリン−アフイニテイクロマトグラフイーの実施；及び （ｈ）〜１７ＫＤ蛋白質組成物の回収、を含む請求項９記載の方法。
12. １２．請求項２記載の方法によつて調製した蛋白質。
13. １３．〜２０，０００ダルトンの分子量と５±０．５の等電点を有し、内部ペプ チド配列：Ｆ−Ｖ−Ｙ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｎ−Ｆ−Ｔ−Ｌ−Ｌ−Ｅ−Ｌ−Ｎ−Ｎ−Ａ を含む、実質的に純粋な神経栄養因子。
14. １４．Ｋ残基が最初に挙げられたＦ残基に先行する請求項１３記載の神経栄養因 子。
15. １５．免疫学的に塩基性ＦＧＦに関係し、請求項１０記載の方法によつて製造さ れる実質的に純粋な神経栄養因子。