JPH04504201A - Nucleic acid detection method by dual amplification - Google Patents
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- JPH04504201A JPH04504201A JP2505279A JP50527990A JPH04504201A JP H04504201 A JPH04504201 A JP H04504201A JP 2505279 A JP2505279 A JP 2505279A JP 50527990 A JP50527990 A JP 50527990A JP H04504201 A JPH04504201 A JP H04504201A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.
Description
【発明の詳細な説明】 二元的増幅による核酸の検出方法 発明の技術分野 本発明は核酸配列の検出、そしてより詳細には標的核酸配列の二つの部分の増幅 により得られる生成物を組み合わせる方法に関する。[Detailed description of the invention] Nucleic acid detection method by dual amplification Technical field of invention The invention relates to the detection of nucleic acid sequences, and more particularly to the amplification of two parts of a target nucleic acid sequence. relates to a method of combining the products obtained by.
発明の背景 関心ある核酸配列の検出に使用できる実用的な核酸ハイブリダイゼーション法の 開発はいくつかの要因から制限されてきた。これらには感度不足、手順の複雑さ 、および検出方法を放射線測定によるものからよらないものに転換したいという 要望が含まれる。非放射線測定法の感度を上げるために様々な方法が研究されて きた。一般的アプローチの一つとしてトータル・アッセイ（ｔｏｔａｌａｓｓａ ｙ）法の改良が、それに伴う複雑さおよび非放射線測定式検出という問題に対す る効果と共に検討されてきた。Background of the invention Practical nucleic acid hybridization methods that can be used to detect nucleic acid sequences of interest Development has been limited by several factors. These lack sensitivity and the complexity of the procedure. , and would like to change the detection method from one that relies on radiation measurement to one that does not. Includes requests. Various methods have been investigated to increase the sensitivity of non-radiometry methods. came. One common approach is the total assay. y) Improvements in the method address the associated complexity and problems of non-radiometric detection. It has been studied together with the effects of
もう一つのアプローチとして、かかるアッセイにより検出されるべき核酸量を高 める方法も追求されている。Another approach is to increase the amount of nucleic acids to be detected by such assays. Methods are also being pursued.
Ｆａｌｋｏｗに交付された米国特許第４．３５８．５３５号は細胞培養してそれ らの数、従って存在すると思われる生物の核酸の量を増大させ、そのサンプルを 固定支持体に沈着させた後そのサンプルを標識プローブと接触させ、次いでその 支持体を洗浄しそしてその標識を検出するという方法を記載している。この方法 の一つの欠点は、まず生物を培養しないとアッセイの感度が十分でない点である 。U.S. Patent No. 4,358,535 issued to Falkow increase the number of organisms, and therefore the amount of nucleic acids of organisms likely to be present, and After being deposited on a fixed support, the sample is contacted with a labeled probe; A method is described in which the support is washed and the label detected. this method One drawback is that the assay is not sensitive enough without first culturing the organism. .
しかしながら培養工程を加えることは時間がかかるということであり、また常に うまくいくとは限らない。However, adding a culture step is time consuming and always There's no guarantee it'll go well.
Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ、、 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｔｎｇ Ｈａｒ ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 ｐｐ、３９０−４０１（１９８２）は目的の 核酸をそれを適当な宿主系にクローン化することにより増幅する方法を記載して いる。その場合、宿主生物が培養中に複製すれば目的の核酸も複製される。Maniatis et al, Mo1ecular Cloning: A Laboratory Manual, Co1d Sprtng Har bor Laboratory, pp, 390-401 (1982) Describes a method for amplifying a nucleic acid by cloning it into a suitable host system There is. In that case, if the host organism replicates during culture, the target nucleic acid will also replicate.
この方法もまた培養工程を用いなければならないという煩しさがあり、従って時 間のかかる複雑な手順となる。This method also has the disadvantage of having to use a culture step and is therefore time consuming. This is a time-consuming and complicated procedure.
生物の核酸量を高めるためのもう一つのアプローチは米国特許第４．６８３．２ ０２号および同第４．６８３．１９５号に記載されている。これらの特許は“核 酸またはその混合物に含まれる標的核酸配列の増幅および検出方法”を開示して いる。この方法は各サイクル完了後に増幅対象核酸配列を倍化する試験管内サイ クリング機構を用いている。これは増幅すべき核酸配列の相補鎖を分離し、これ らポリヌクレオチド鎖を過１１１のオリゴヌクレオチド・プライマーと接触させ そしてそれらプライマーを酵素処理により延長させて各プライマーと共にアニー ルされた核酸に対し相補的なプライマー延長生成物を形成させることにより行わ れる。この工程はさらに必要な回数だけ繰り返す。Another approach to increasing the amount of nucleic acids in living organisms is described in U.S. Patent No. 4.683.2. No. 02 and No. 4.683.195. These patents are “nuclear” Discloses a method for amplifying and detecting target nucleic acid sequences contained in acids or mixtures thereof. There is. This method is an in vitro method that doubles the nucleic acid sequence to be amplified after each cycle. It uses a Kling mechanism. This separates the complementary strand of the nucleic acid sequence to be amplified; contact the polynucleotide strand with over 111 oligonucleotide primers. Then, these primers are extended by enzyme treatment and annealed together with each primer. This is done by forming a primer extension product that is complementary to the sampled nucleic acid. It will be done. This process is repeated as many times as necessary.
この方法の長所の一つは、目的とする生物の核酸配列の小部分を多量に速やかに 生産できることである。この方法の欠点の一つは、直接アッセイ法を用いる生成 核酸の検出が複雑なことである。というのはその増幅法ではコピーされるべきも のと核酸の忠実でないコピーである核酸配列を生成し得るからである。これら誤 った核酸配列はバックグランド・ノイズを高め従って方法全体の感度を低める誤 った陽性例をアッセイにもちこむことになり得る。One of the advantages of this method is that a small portion of the nucleic acid sequence of the target organism can be quickly extracted in large quantities. It is something that can be produced. One of the drawbacks of this method is the production using direct assay methods. Detection of nucleic acids is complicated. This is because the amplification method also requires copying. This is because it can produce nucleic acid sequences that are not faithful copies of the nucleic acid. These mistakes Nucleic acid sequences that are positive cases may be brought into the assay.
過去多くのＤＮＡプローブ・アッセイが目的とする核酸の検出のために報告され ている。（前述の） Ｆａｌｋｏｗ法はまず標的核酸を一本鎖化した後それを固 体支持体に固定している。次にその固体支持体に標的核酸に対し相補的な標識プ ローブを接触させる。過剰のプローブを洗い流しそして生成ハイブリッド中の標 識の存在を測定する。In the past, many DNA probe assays have been reported for the detection of target nucleic acids. ing. The Falkow method (described above) first converts the target nucleic acid into a single strand and then solidifies it. It is fixed to a body support. Next, the solid support is coated with a labeled compound that is complementary to the target nucleic acid. Bring the lobes into contact. Wash away excess probe and remove target in the resulting hybrid. Measuring the presence of knowledge.
この方法の欠点の一つは時間がかかりかつ煩瑣なことである。このアッセイの段 階、すなわち、ハイブリダイゼーションおよび洗浄段階は膜（固体支持体）およ び緩衝溶液を含むシールされた小袋（パウチ）内で行われる。One of the disadvantages of this method is that it is time consuming and cumbersome. This assay stage The steps, i.e., hybridization and washing steps, involve the membrane (solid support) and The test is carried out in a sealed pouch containing the water and buffer solution.
Ｈｉｌｌら（Ｗｏ ８６１０５８１５）は前記アッセイ方式の一変形を記載して いるがこれはニトロセルロース被覆磁性粒子を用いてこれに標的ＤＮＡを付着さ せ、次いでビオチニル化プローブで直接ハイブリダイズしそしてストレプトアビ ジン接合レポーターを用いて検出するというものでありグイゼーション方式を記 載しているが、これは固体支持体に付着した第一のまたは捕捉プローブを含有す る溶液と標的核酸を混合するというポリヌクレオチド・プローブを用いた二段階 式サンドイッチ・アッセイを用いている。ある時間の経過後、支持体を洗浄しそ してやはり標的核酸に対して相補的ではあるが捕捉プローブに対しては相補的で はない第二のまたはレポーター（標識）プローブを添加しそして捕捉プローブ− 標的核酸複合体とハイブリダイズさせる。ハイブリダイズされなかったレポータ ープローブを洗浄除去後、標的核酸にハイブリダイズされたレポーター・プロー ブの存在を検出するというものである。Hill et al. (Wo 86105815) describe a variation of the assay format. However, this method uses nitrocellulose-coated magnetic particles to which target DNA is attached. and then directly hybridized with biotinylated probe and streptavium. The method is to detect using a zymogen-conjugated reporter, and the zygination method is described. This includes a first or capture probe attached to a solid support. A two-step process using a polynucleotide probe in which a solution containing a target nucleic acid is mixed with a target nucleic acid. A formula sandwich assay is used. After a certain period of time, the support should be cleaned. is still complementary to the target nucleic acid, but not to the capture probe. Add no second or reporter (labeled) probe and capture probe - hybridize with the target nucleic acid complex. Reporter that was not hybridized - After washing and removing the probe, remove the reporter probe hybridized to the target nucleic acid. The purpose is to detect the presence of blocks.
Ｒａｎｋｉら（米国特許第４．５６３．４１９号）はＥＰＡ０１５４５０５、Ｗ Ｏ８６１０３７８２およびＥＰＡ Ｏ２００１１３を開示している。認識される べきは、これらすべてが第一のまたは捕捉プローブを固体支持体に固定してから ハイブリダイゼーションを行うアッセイ手順を用いていることである。Ranki et al. O86103782 and EPA O200113. be recognized All of this should be done after immobilizing the first or capture probe on a solid support. It uses an assay procedure that involves hybridization.
もう一つの変形が独出願公開第３．５４６．３１２Ａ１号に記載されている。こ の方法はＲａｎｋｉらの記載したものと同じく標的核酸の区別された部分にハイ ブリダイズする捕捉プローブおよびレポータープローブを用いている。標的核酸 は溶液中でそれら二つのプローブによる接触を受ける。第一プローブまたは捕捉 プローブは固体支持体に付着させたレセプター成分、例えばストレプトアビジン と結合できる結合成分、例えばビオチンを含有する。捕捉ブローブー標的核酸− レポータープローブ複合体の形成後、ストレプトアビジン変性固体支持体を添加 する。ハイブリダイズしなかったレポータープローブを洗い流した後、固体支持 体に結合した複合体に取り込まれた標識を検出する。Ｒａｎｋｉらの開示した方 法に比してこの方法が有利なのは、溶液中で行われるハイブリダイゼーションの 方が反応速度論的に有利である。標的核酸長が標的核酸長が大きい程小さくなる 全体としての反応効率に影響するという短所もいくつかある。さらに、サンドイ ッチ核酸プローブアッセイはへテロジニアス型一段階または二段階方式の如何に かかわらずあるいは溶液ハイブリダイゼーションを用いようと直接アッセイ法は どの感度はない。Another variant is described in German Published Application No. 3.546.312A1. child The method described by Ranki et al. is similar to that described by Ranki et al. A hybridizing capture probe and reporter probe are used. target nucleic acid is contacted by these two probes in solution. First probe or capture The probe is a receptor component attached to a solid support, e.g. streptavidin. Contains a binding moiety, such as biotin, that can bind to. Capture blow-boo target nucleic acid- After formation of the reporter probe complex, add streptavidin-modified solid support do. After washing away unhybridized reporter probes, the solid support was The label incorporated into the complex bound to the body is detected. Those disclosed by Ranki et al. The advantage of this method over other methods is that hybridization is carried out in solution. is more advantageous in terms of reaction kinetics. The target nucleic acid length becomes smaller as the target nucleic acid length increases. There are also some disadvantages that affect the overall reaction efficiency. In addition, sandwiches Nucleic acid probe assays can be performed in a heterogeneous one-step or two-step format. The direct assay method, regardless of whether it uses solution hybridization or There is no sensitivity.
これらすべての方法の不利な点は、所要の特異性を得る、すなわち目的とする標 的核酸を適正に確認するには特定のハイブリダイゼーション工程を用いることが 必要なことである。The disadvantage of all these methods is to obtain the required specificity, i.e. to achieve the desired target Specific hybridization steps can be used to properly identify target nucleic acids. It's necessary.
本発明の開示 所定の核酸配列を含む核酸を含むと思われる検体中の前記所定の核酸配列を検出 および／または測定するための本発明の核酸アッセイは、以下の工程、すなわち 、（＾）標的核酸を一本鎖化する； （Ｂ）いずれかの配列が増幅条件下に増幅されたときにいずれかの配列の延長生 成物が他方の配列の合成のための鋳型として働くことができないような位置関係 にある、所定の核酸配列内に含まれる二つの特定の核酸配列を下記工程（１）〜 （４）により増幅する：（１）前記−重鎖を、増幅される各々異なる特定配列に ついて、−セットずつ、合計二セットのオリゴヌクレオチドブライマーを用いて 、増幅される各々異なる配列について各核酸鎖に対して相補的な各プライマーの 延長生成物が合成されるような条件下に処理し、その際前記セットのプライマー は各々特定配列を有する異なる核酸鎖に対しそれらとハイブリダイズするのに十 分相補的であるように選択して、二セットのプライマーの各セットの一方のプラ イマーから合成される延長生成物が、それぞれの相補体から分離されたときに二 セットのプライマーの各セットの他方のプライマーの延長生成物の合成のための 鋳型として役立ち得るようにし、また各セットのプライマーの一方のプライマー がその５′−末端にＬｏｘＰ配列を含有するようにす名；（２）プライマー延長 生成物をそれらの合成の基礎とされた鋳型から分離して一本鎖化された分子を生 成させる； （３）工程（２）で生成させた一本鎖化された分子を、工程（１）の二セットの プライマーを用いて、プライマー延長生成物が工程（２）で生成させた一本鎖の 各々を鋳型として用いて合成される条件下に処理する：そして （４）工程（２）および（３）を繰り返して検出および／または測定に十分なプ ライマー延長生成物を生成させる： （Ｃ）二つの別個の増幅反応の生成物をリコンビナーゼ酵素Ｃｒｅにより処理す る；および （Ｄ）二つの別個の増幅反応から得られる工程（Ｃ）の生成物を検出および／ま たは測定する より成る。Disclosure of the invention Detecting the predetermined nucleic acid sequence in a sample that is thought to contain a nucleic acid containing the predetermined nucleic acid sequence. and/or the nucleic acid assay of the present invention for measuring the following steps: , (^) Make the target nucleic acid single-stranded; (B) Extension of either sequence when either sequence is amplified under amplification conditions a positional relationship such that one product cannot serve as a template for the synthesis of the other sequence Two specific nucleic acid sequences contained within a predetermined nucleic acid sequence located in the following steps (1) to (4): (1) The above-mentioned heavy chain is amplified by each different specific sequence to be amplified. Using a total of two sets of oligonucleotide primers, one set each , each primer complementary to each nucleic acid strand for each different sequence to be amplified. under conditions such that an extension product is synthesized, in which the primers of the set are are sufficient to hybridize with different nucleic acid strands, each having a specific sequence. One primer of each of the two sets of primers is selected to be partially complementary. When the extension products synthesized from the imers are separated from their respective complements, for the synthesis of extension products of the other primer of each set of primers in the set. One primer of each set of primers can also serve as a template. (2) Primer extension Products are separated from the template on which their synthesis was based to produce single-stranded molecules. make it happen; (3) The single-stranded molecules produced in step (2) are divided into two sets of step (1) Using a primer, the primer extension product is the single-stranded product generated in step (2). Each is used as a template and treated under conditions under which it is synthesized: and (4) Repeat steps (2) and (3) to obtain sufficient plasma for detection and/or measurement. Generate the limer extension product: (C) Treating the products of two separate amplification reactions with the recombinase enzyme Cre. and (D) detecting and/or detecting the products of step (C) resulting from two separate amplification reactions; or measure Consists of.
本発明の詳細な説明 本発明の核酸アッセイは所定の配列を有する標的核酸を検出するための以下の全 体プロセスから成る。Detailed description of the invention The nucleic acid assay of the present invention includes all of the following for detecting a target nucleic acid having a predetermined sequence. Consists of body processes.
ａ）米国特許第４．６８３．２０２号（その開示を引用により本発明の開示の一 部に含める）に記載されたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）核酸増幅法を用いて 、特定の配列内の二つの特定の核酸配列をまず検体中に存在する変性標的核酸を 前記特定の核酸配列に対し相補的な二セットのオリゴヌクレオチドプライマーと 共にアニーリングして増幅する。これらのプライマーは各セットのプライマーの 一方のプライマーが５′−末端に結合するＬｏｘＰ配列を含有するように設計さ れる。ＬｏｘＰ配列は３４−ヌクレオチド配列５’、、、＾Ｔ＾＾ＣＴＴＣＧＴ ＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ、 、 、 ３’、（Ｓｔ ｅｒｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ、、Ｊ９Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、、Ｖｏｌｕｍｅ １ ９７．１９７−２１２（１９８６）参照〕により規定される。特定の核酸配列は 各配列が増幅条件下に増幅されるときいずれかの配列の延長生成物が他方の配列 の合成の鋳型として働き得ないような位置関係にある。増幅中に各セットのプラ イマーから形成される各延長生成物は所定の核酸配列内の二つの特定の核酸配列 の一方に対して相補的であって更なるプライマー延長のための鋳型となる。検出 および／または測定のために所望される量のプライマー延長生成物を生成させる には、このプロセスを次いで必要なだけ繰り返す。a) U.S. Pat. No. 4,683,202, the disclosure of which is incorporated herein by reference. using the polymerase chain reaction (PCR) nucleic acid amplification method described in , two specific nucleic acid sequences within a specific sequence are first extracted from the denatured target nucleic acid present in the sample. two sets of oligonucleotide primers complementary to the specific nucleic acid sequence; Anneal together and amplify. These primers are the same as each set of primers. One primer was designed to contain a LoxP sequence attached to the 5'-end. It will be done. The LoxP sequence is a 34-nucleotide sequence 5'...^T^^CTTCGT ATAGCATACATTATACGAAGTTAT, , , 3', (St ernberg et al., J9Mo1. Biol, Volume 1 97.197-212 (1986)]. A specific nucleic acid sequence is When each sequence is amplified under amplification conditions the extension products of either sequence are It is in such a position that it cannot serve as a template for the synthesis of Plasma of each set during amplification. Each extension product formed from an imer has two specific nucleic acid sequences within a given nucleic acid sequence. is complementary to one of the primers and serves as a template for further primer extension. detection and/or generate the desired amount of primer extension product for measurement. This process is then repeated as many times as necessary.
ｂ）二つの別個の増幅反応の生成物にリコンビナーゼ酵素Ｃｒｅを添加し、該酵 素により第一増幅からの増幅生成物を第二増幅からの増幅生成物と結合させる。b) Adding the recombinase enzyme Cre to the products of two separate amplification reactions and The amplification product from the first amplification is combined with the amplification product from the second amplification by an element.
得られる生成物は二つの特定の核酸配列を結合したものに３４個の付加的ヌクレ オチドを加えた長さである。The resulting product combines two specific nucleic acid sequences with 34 additional nuclei. This is the length including the punch line.
Ｃ）前記段階より得られる生成物を例えばゲル電気泳動により検出する。かかる 検出は、一方における目的結合生成物と各増幅生成物同士の組み合わせによる結 合生成物を区別することができる。C) Detecting the product obtained from said step, for example by gel electrophoresis. It takes Detection involves the combination of the desired binding product on one side and each amplification product. Synthetic products can be distinguished.
プライマー・オリゴヌクレオチドを用い標的核酸配列を増幅して酵素的手段によ り、標的核酸の小部分の大幅に増大した数のコピーを生成させる方法に言及する 上で本明細書に用いられる用語“ＰＣＲ”は米国特許第４、６８３．２０２号に 記載されている。The target nucleic acid sequence is amplified using primer oligonucleotides and enzymatically refers to a method of producing a significantly increased number of copies of a small portion of a target nucleic acid. The term "PCR" as used herein above is derived from U.S. Pat. No. 4,683.202. Are listed.
以後のハイブリダイゼーションに対し十分な量の増幅標的核酸を生成させるには 、ＰＣＲ標的増幅反応は約２０〜３０リピート・サイクルを必要とする。増幅核 酸の変性はアルカリ、酸、カオトロピック剤、または熱による処理によって行う ことができるが、好ましい方法は増幅標的核酸を少（とも１０分間沸騰水浴に入 れた後生くとも２分間冷水浴（４℃）に入れる方法である。To generate a sufficient amount of amplified target nucleic acid for subsequent hybridization , a PCR target amplification reaction requires approximately 20-30 repeat cycles. amplified nucleus Acid denaturation is carried out by treatment with alkalis, acids, chaotropic agents, or heat. However, a preferred method is to place the amplified target nucleic acid in a boiling water bath for at least 10 minutes. This method involves placing the animal in a cold water bath (4°C) for at least 2 minutes.
以下の実施例は本発明を例示するものである。The following examples illustrate the invention.
以下の特定の条件および試薬を用いて米国特許第４、６８３．２０２号およびＧ ｅｎｅＡｍｐ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＲｅａｇｅｎｔＫｉｔ（ ＃ Ｎ ８０１−００４３）の製品解説書に記載の手順に従った。U.S. Pat. No. 4,683.202 and G. eneAmp DNA Amplification Reagent Kit ( #N 801-0043) The procedure described in the product manual was followed.
ＦＩＩＶ Ｉゲノムの二つの配列を増幅対象に選ぶことができる。第一の配列は プラスミド中に取り込まれた■ＩｖＩの６＾Ｇ ｐ１７領域内に位置する１０３ −ヌクレオチド塩基配列（大部分の）ＩＩＶ Ｉゲノムを取り込んだプラスミド はｐＢＨｌｏ−Ｒ３と称する）であり、そして下記のようなプライマーＡおよび Ｂを用いて増幅され得る。Two sequences of the FIIV I genome can be selected for amplification. The first array is ■103 located within the 6^G p17 region of IvI incorporated into the plasmid - A plasmid incorporating the nucleotide base sequence (most of) the IIV I genome is designated pBHlo-R3) and primers A and can be amplified using B.
５′１．＾ＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧ＾＾ＧＴＴ ＡＴＴＧＧＧＣＡＡＧＣ＾ＧＧＧＡＧＣＴＡＧＧ、 、 ３’ プライマーＡ５ ′１．＾ＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴ＾ＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡ ＴＴＣＴＧ＾＾ＧＧＧ＾ＴＧＧＴＴＧＴＡＣＧ、 、 ３’ プライマーＢ第二 の配列はプラスミド中に取り込まれた同じく旧Ｖ■ゲノムのＧＡＧ ｐ１７領域 内に位置する１６０塩基領域（大部分のＲＩＶ Ｉゲノムを取り込んだプラスミ ドはｐＢＨ１Ｏ−Ｒ３と称する）であり、そして下記のようなプライマーＣおよ びＤを用いて増幅され得る： ５′０．＾ＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧ＾＾ＧＴＴ ＡＴＴＴＣＣＣＴＣＡＧＡＣＣＣＴＴＴＴＡＧＴＣ，、３’ プライマーＣ５′ １．＾ＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴ＾ＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ ＴＧＧＣＧＴＡＣＴＣ＾ＣＣＡＧＴＣＧＣＣＴ、 、 ３’ プライマーＤプラ スミドｐＢｎ １Ｏ−Ｒ３の連続希釈液アリコート（ＬＸｌＯす、Ｉ Ｘ １０ ”、ｌＸｌ０弓、ｌＸｌ０’″４、Ｉ Ｘ １０４３、Ｉ×１０４２、ｌＸｌ０ ”、および０コピー）をＰｃＲヲ用いて増幅テきる。各アリコートをｄＡＴＰＳ ｄＴＴＰ、 ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰの各々について２００ｇＭ、プライマーＡ 、ＥＳＣおよびＤの各々について１．ｈＭであって、ｌｌｕｇヒト胎盤ＤＮ＾／ 反応および２．５単位のＤＮＡポリメラーゼを含む緩衝液と総反応容量を１０ｈ Ａ’として混合できる。5'1. ^TAACTTCGTATAGCATACATTATACG^^GTT ATTGGGCAAGC^GGGAGCTAGG, 3' Primer A5 '1. ＾TAACTTCGTAT＾GCATACATTATACGAAGTTA TTCTG^^GGG^TGGTTGTACG, , 3’ Primer B second The sequence is the GAG p17 region of the old V■ genome that was also incorporated into the plasmid. A 160 base region located within the plasmid that incorporates most of the RIV I genome. pBH1O-R3) and primer C and primers as below. and D can be amplified using: 5'0. ^TAACTTCGTATAGCATACATTATACG^^GTT ATTTCCCTCAGACCCTTTTAGTC, 3' Primer C5' 1. ＾TAACTTCGTAT＾GCATACATTATACGAAGTTAT TGGCGTACTC^CCAGTCGCCT, 3' Primer D plastic Serial dilution aliquots of SUMIDO pBn 1O-R3 (LXIO, IX 10 ”, lXl0 bow, lXl0’″4, IX 1043, I×1042, lXl0 ”, and 0 copies) are amplified using PcR. Each aliquot is amplified using dATPS. 200 gM each of dTTP, dCTP and dGTP, Primer A , ESC and D 1. hM, llug human placenta DN^/ Reaction and buffer containing 2.5 units of DNA polymerase and total reaction volume for 10 h. Can be mixed as A'.
各反応混合物を次いで前記製品解説書に記載のように３０回温度循環できる。Each reaction mixture can then be temperature cycled 30 times as described in the product literature.
この方法により標的分子数の増加見積りはＩ Ｘ １０”〜Ｉ Ｘ １０”にな ると予測される。With this method, the estimated increase in the number of target molecules is between IX10'' and IX10''. It is predicted that
増幅反応の生成物は標準条件下に６％アクリルアミドゲル操作にかけることがで きる。電気泳動の後、そのゲルを１０ｍ１ｌ Ｔｒｉｓ、 ｐＨ７，０中のエチ ジウムブロマイドの１０ｕｑ／ｍｌ溶液に１５分間浸漬することができる。次に そのゲルをｉＱ＋ｓＭ Ｔｒｉｓ、 ｐｌ＋７．０ですすぐことができ、そして 得られる生成物バンドはそのゲルを３０２ｎｍにて照射しそして生じた蛍光バン ドを目視することにより検出および／または測定することができる。The products of the amplification reaction can be run on a 6% acrylamide gel under standard conditions. Wear. After electrophoresis, the gel was incubated in 10 ml of Tris, pH 7.0. It can be immersed in a 10 uq/ml solution of dium bromide for 15 minutes. next The gel can be rinsed with iQ+sM Tris, pl+7.0, and The resulting product band was determined by irradiation of the gel at 302 nm and the resulting fluorescent band. It can be detected and/or measured by visually observing the code.
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