JPH04501356A - 精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 精製方法 本発明は、共有結合ＤＮＡ／蛋白質複合体を精製および定量するための方法、並 びにその方法で製造される材料に関する。

ＤＮＡ／ｌ−ポイソメラーゼおよび他の共有結合ＤＮＡ／蛋白質複合体の形成を 定量するため現在用いられている方法は、時間を要しそして他の欠点を有してい る。蛋白質を会合させたＤＮＡの分解を検出するためのＺｗｅｌｌｉｎｇ、　Ｌ 、　Ａ、他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２０：６５５３−６５６３　（１９ ｇ　、）のアルカリ性溶離技術は、非常に時間を要しそして標準化するのが困難 である。

この技術をＤＮＡ／蛋白質複合体の回収に適合させるのも困難である。

Ｔｒａｓｋ、　Ｄ、　Ｋ、他、ＥＭＢＯＪ、、３：６７１−６７６　（１９８４ ）の沈澱方法もまた多段階から成る操作であり、そしてこれは複合体の回収に使 用することができるが、しかしこれは、インサイチュ−法における、数多くの蛋 白質分子を有するＤＮＡの切片のためには最も高能率でありそして単一部位のた めには非常に非能率であるところの公知の欠点を有している。このことは、恐ら く、複製フォークＤＮＡには有利である、何故ならば、トポイソメラーゼＩＩが ここでは非常に活性であるためである。Ｔｒａｓｋの方法は、新しく複製された ＤＮＡを主に沈澱させる。部位に特異なトポイソメラーゼの開裂は、束もしくは 単一部位のどちらかで生じ、従ってこの方法における代表とはなり得ない。

ポリマー類および／または塩類の混ざり合わない水溶液の相系は、この２つの成 分相に関するそれらの差別的な親和力を基として、細胞と巨大分子との分離手段 を与えるものである［Ｗａｌｔｅｒ　Ｈ，Ｂｒｏｏｋｓ　ＤＥ、　＆　Ｆｔｓｈ ｅｒ　Ｄ、　（ｉｉｉ集）「バイオテクノロジーにおける水系の二相系の分配、 理論、方法、使用および応用Ｊ　（Ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ　ｉｎ　ａｑｕｅ ｏｕｓ　ｔｗｏ−ｐｈａｓｅ　ｓｙｓｔｍｓ、　ｔｈｅｏｒｙ、　ｍｅｔｈｏｄ ｓＳｕｓｅｓ　ａｎｄ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ ｌｏｇｙ）、＾ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　０ｒｌａｎｄｏ　１９８５）　 ］。

驚くべきことに、ＰＥＧ溶液の上の相および底のホスフェート溶液相から成る適 切な水系の二相系を用ることで、ＤＮＡ／蛋白質複合体の蛋白質成分に対してポ リエチレングリコール（ＰＥＧ）を連成させることによって共有結合的に結合し たＤＮＡ／蛋白質複合体が、非共有結合的結合のＤＮＡ／蛋白質複合体および非 結合のＤＮＡから分離され得ることをここに見い出した。

従って、本発明は、 （ｉ）ＰＥＧの活性誘導体を用いてＤＮＡ／蛋白質複合体を処理し、そして （ｉ　ｉ）段階（ｉ）の生成物に、ＰＥＧ水溶液相とホスフェート水溶液相との 間の相分配を受けさせる、 段階を含む、非共有結合ＤＮＡ／蛋白質複合体および非結合ＤＮＡから、共有結 合ＤＮＡ／蛋白質複合体を分離するための方法を提供する。

好適に、共有結合的に結合したＤＮＡ／蛋白質複合体は、水系ＰＥＧ相から回収 される。

理論によって範囲が限定されることを望むものではないが、ＰＥＧ連成条件およ び／または相分配条件が、結果として、非共有結合的に結合したＤＮＡ／蛋白質 複合体の解離を生じさせ、そしてホスフェート溶液に対するＤＮＡの高い親和力 を考慮すると［＾１ｂｅｒｔｓｏｎ　Ｐ−＾、［細胞粒子および巨大分子の分配 Ｊ　（Ｐａｒｔｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｅｌｌ、　ｐａｒｔｉｃ］ｅｓ　ａｎｄ　 ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）第３版、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏ ｎ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８６］　、Ｐ　ＥＧ相に引っ張られるのはＰＥ Ｇと結合した共有結合ＤＮＡ／蛋白質複合体のみであると考えられる。

ＤＮＡ／蛋白質複合体へのＰＥＧの達成は、好適には、該複合体と、ＰＥＧの活 性を示す２．　２．　２−トリフルオロエタンスルホニル（トレシル）誘導体、 好適には英国特許出願番号８８２４５９１．５に記載されているトレシルモノエ トキシＰＥＧ　（ＴＭＰＥＧ）とを反応させることによって行われる。

本発明は更に、次の付随する図面から成る図を参照にして説明されるであろう： 図１は、ＤＮＡ／蛋白質複合体へのＰＥＧの達成を図式的に示す。

図２は、サケの精子のＤＮＡの分子量に対する音波処理の効果を示すグラフであ る（ピークからピークへの振幅１２μ、２０ｋＨｚ１５０Ｗ）。

図３は、蛋白質を含んでいないＤＮＡの分配化に対する音波処理の効果を示すグ ラフである。

図４は、ＰＥＧ相からのＤＮＡの回収に対するホスフェート抽出の過剰の繰り返 しの効果を図式的に示す。

図５および図６は、ＶＰ−１６−２１３（図５）　およびＵＶ　（図６）ｉ、： よる細胞の処理の後の、ＰＥＧ相のＤＮＡ中の、線量に関係した増分を示す。

図７．８．９．１６および２１は、走査濃度計のプロットを示す。

図１０は、Ｔｒａｓｋ製造のＰＥＧ相分離からの収率に関するグラフである。

図１１は、レチン酸誘発および未誘発細胞からの差別的ＤＮＡ回収を示す。

図１２および１３は、差別的雑種形成実験の結果を示す。

図１４および１５は、差別的雑種形成実験の結果を示す。

図１７および１８は、Ｔｒａｓｋ方法（図１７）および本方法（図１８）で製造 されたＤＮＡの収率に対するレチン酸およびノボビオシンの効果を示す。

図１９および図２０は、種々の誘発されたもしくは未誘発の細胞からの分画され たＤＮＡへのチューブリン雑種形成を示す。

図２２および図２３は、本発明の方法によって製造されたクローン化したＤＮＡ からの雑種形成シグナルを示す。

図２４は、ＶＰ１６に暴露させた誘発もしくは未誘発の細胞からのＰＥＧ相のＤ ＮＡ中の増分を示す。

図２５は、本発明に従って分配したときのＤＮＡの収率に対するｍ−ＡＭＳＡの 効果を示す。

図２６は、レチン酸で前処理した細胞からのＰＥＧ相収率に対するＶＰ１６の効 果を示す。

図２７は、レチン酸で誘発されたＤＮＡ蛋白質の会合を示すためのＵＶ架橋の使 用を示す。

本発明の方法は２つの現象を利用している（図１に図式的に示されている）。最 初に、トレシルクロライドを用いたＰＥＧの活性化によって（図１のパネル１） 、このＰＥＧが共有結合的に蛋白質に付着するのを可能にする（パネル２）。こ れが、ＰＥＧの豊富な上相に対する非常に高い親和力をＤＮＡ／蛋白質複合体に 与え、これによって、この付着したＤＮＡの回収を可能にし、一方、付着してい ないＤＮＡはホスフェートの豊富な底の相に残存している（パネル５）。これは 、該蛋白質結合ＤＮＡの回収もしくは定量に用いられ得る。上部の（ＰＥＧ）相 中のＤＮＡの割合は、サンプル中のＤＮＡ／蛋白質複合体の割合に依存し、蛋白 質に付着しているＤＮＡの平均サイズに依存している（後者は、用途に対して、 サンプルの音波処理、ＤＮアーゼ処理、或は制限エンドヌクレアーゼ消化で制御 される）。

次に、ここに記述する反応混合物および／または相分配条件は、結果として、非 共有結合的に結合した蛋白質（これと、真核生物のＤＮＡの大部分とが会合して いる）をＤＮＡから解離させる。従って、この方法は、結果として、結合してい ないかもしくは蛋白質と非共有結合的に結合している蛋白質であるＤＮＡをホス フェート相中に残す。ＰＥＧは、ＤＮＡの立体配置をコンパクトにしそして変化 させることが知られている。この変化の正確な性質は未だ論議されている段階で あるが、非共有結合的に結合しているＤＮＡの解離は、ＤＮＡの主要なそして微 小な溝の大きさが変化するため生じると我々は仮定する（何故ならば、これらは 、ＤＮＡに対する蛋白質の非共有結合的結合にとって、決定的であるからである ）。

この新規な分配方法を用いることで、単一のトポイソメラーゼ分子の存在でさえ も理論的に分画を可能にする。単−ＰＥＧで修飾されたトポイソメラーゼ分子、 或は同様な蛋白質に関して、それらが付着したＤＮＡをＰ　Ｅ　Ｇ相に運ぶ能力 は、付着したＤＮＡの長さに依存している、何故ならば、それは対抗する力（Ｄ ＮＡおよびＰＥＧ−蛋白質は、該複合体を各々ホスフェート相およびＰＥＧ相に もっていくために競争する）の結果を反映しているからである。従って、単一ト ポイソメラーゼ分子に付着しているＤＮＡの有効な分画は、この付着したＤＮＡ が充分に短い場合のみ達成される。これは音波処理によって達成されるが、我々 はまた、トポイソメラーゼＩＩを未だＤＮＡに付着させたままで、ＤＮアーゼ消 化の制限酵素を用いる可能性も達成した。しかしながら、より短いＤＮＡセグメ ントはより低い分配係数を有する（Ｗａｉｔｅｒ　ＨｌＢｒｏｏｋｓ　ＤＥ、　 ＆　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｄ、　（編集）「バイオテクノロジーにおける水系の二相系 の分配、理論、方法、使用および応用」Ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ　ｉｎ　ａｑ ｕｅｏｕｓ　ｔｗｏ−ｐｈａｓｅ　ｓｙｓｔｍｓｌｔｈｅｏｒｙ、　ｍｅｔｈｏ ｄｓ、　ｕｓｅｓ　ａｎｄ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｂｉｏｔｅｃｈ ｎｏｌｏｇｙ”　、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　０ｒｌａｎｄｏ　１９８ ５　：中の２２７〜２６６頁の、「核酸のＭｕｌｌｅｒ　Ｍ分配」Ｍｕｌｌｅｒ 　Ｍ　Ｐａｒｔｊ、ｔｉｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ”　、 即ちこの２つの相の間により均等な分配を示し、それによって、これを補うため 追加的回数のホスフェート相（或は、向流相の分配）の抽出が必要とされること になるであろう。我々は、これが容易に達成されることを示した。

本発明は、例えば次のことに関して開発されたものである：１）誘発可能な遺伝 子（転写活性のダウンレギュレーション（ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）の 誘発がＤＮＡトポイソメラーゼＩおよび／またはＩｌの作用、或はＤＮＡと共有 結合中間体を生成する他の酵素の作用に伴うもの）の種類に隣接しているＤＮＡ の精製。これは、誘発可能な遺伝子のＤＮＡクローン化のための新規な方策を提 供するものである。

２）蛋白質結合部位でのＤＮＡの精製（それらが作用するとき自然理法に従って ＤＮＡと共有的に結合していない蛋白質に関しては、結合後膣蛋白質にＤＮＡを 結合させるための追加的段階が必要である）。

３）ＤＮＡトポイソメラーゼ活性の定量。

４）ＤＮＡ）ポイソメラーゼ開裂部位特異性の定量。

５）ｒＤＮアーゼ保護」法則を用いたＤＮＡ蛋白質結合部位の調製。

６）ＤＮＡ蛋白質架橋剤のための定量。

７）ＤＮＡ）ボイソメラーゼおよび他の切れ口開閉酵素のインヒビターのための 評価。

本発明は更に、蛋白質に結合している少なくとも１種のＰＥ０部分を有する蛋白 質に共有結合的に結合しているＤＮＡフラグメントを含む生成物を提供する。好 適には、このＰＥ０部分はモノエトキシＰＥＧ基である。

トレシルクロライドの加水分解を避けるため、全ての試薬は使用前に乾燥する必 要がある。モノメトキシポリ（エチレン）グリコール（ＭＰＥ　Ｇ）　（Ｍｒ　 ５０００、Ｕｎｉｏｎ　ＣａｒｂｉｄｅＳＵＳＡ）をベンゼン（沸点７９〜８０ ℃）に溶解した後、水−有機共沸混合物（沸点６５°Ｃ）を蒸留して除去した。

減圧下溶媒を除去し２てＭＰＥＧを回収した後、これを真空上室温に一晩放置す ることによって最終的乾燥を行った。ジクロロメタン（ＡｎａｌａＲグレードＢ Ｄ）Ｉ、　Ｕ、　Ｋ、　）を、溶媒１リツトル当たり１００ｇのモレキュラーシ ーブＡ３（結晶性のケイ酸カリウムアルミナ、ＢＤｆｌ、　Ｕ、に、）を用いて 室温で一晩乾燥しまた。

乾燥したＭＰＥＧ　（１８ｇ、３．５ミリモル）を、室温で、乾燥ジクロロメタ ン（４５ｍＬ）中に溶解した。この混合物を０℃に冷却し、マグネティックスク ーラーを用いて撹拌し、そして１．１２５ｍＬ　（１４ミリモル）のピリジン（ ＾ｎａｌａＲグレードＢＤＩ（、Ｕ、　Ｋ、　）および１ｍＬ（９ミリモル）の トレシルクロライド（Ｆｌｕｋａ　ＡＧ、スイス）を０℃で滴下した。１．５時 間一定した撹拌で、この反応を室温で継続させた後、減圧下の蒸留でジクロロメ タンを除去した。白色の固体を、室温で一晩真空下乾燥した。

このトレシル−ＰＥＧ調製物（ＴＭＰＥＧ）を使用前に洗浄して、ピリジンを除 去した。このＴＭＰＥＧをメタノール−ＨＣｌ混合物（２５０：１）に溶解した 後、−２０℃で８時間沈澱させた。得られる白色の固体を０°Ｃで集めた後、こ の濾液のピリジン含有量を分光（λ、、、２５５ｎｍ）光度測定で検査した。ピ リジンが検出されなくなるまで、洗浄用混合物としてメタノール−ＨＣｌ　（１ ０００：１）を用いてこの操作を繰り返した。最後に、このピリジンを含んでい ないＴＭＰＥＧ（１０〜１２ｇ１収率５５〜６６％）を、室温で数時間真空上乾 燥した。硫黄含有量は０．５％であった（ＭＰＥＧ−５０００の１分子当たり１ 個のトレシル基に関する理論値含有量は０．６２％である）。このＴＭＰＥＧを 使用に先立って、４℃で乾燥保存した。

ｂ）ＤＮＡ／蛋白質複合体のＰＥＧ修飾０．０５Ｍのナトリウムホスフェート０ ．１２５ＮａＣＩ緩衝液ｐＨ７，５中のＴＭＰＥＧ４００ｍｇ／ｍＬと、細胞溶 解物もしくはＤＮＡ／蛋白質複合体とを、ｌ、：ｌ（ｖ：ｖ）の比率で、回転ミ キサー上、室温で２時間混合した。トポイソメラーゼＩＩの１分子当たりのリジ ン分子の数が分からないため、そして他の蛋白質が存在しているため、我々は、 過剰のＴＭＰＥＧを加えることを選択した。アルブミンを用いた実験は、ＴＭＰ ＥＧ：リジンのモル比が８＝１でＰＥＧ相への最大分配を示し、そしてより低い 値で、著しく向上した分配が達成された。従って、これらの実験で用いたＴＭＰ ＥＧに対するＤＮＡ／蛋白質複合体の比率は、ＴＭＰＥＧの全部の過剰量を表し ているが、しかしこれは、ＤＮＡ立体配置に対するＰＥＧの濃度効果のため、追 加的に優位な効果を有している（４．５）。分離操作に関するこれらの２つの面 を個々に評価するためは、更に一層の実験が必要である（共有結合修飾段階中、 ＴＭＰＥＧおよびＰＥＧの混合物の使用）。

ＴＭＰＥＧで処理した材料の一定分量を直接、該相系に加えた。より一層の酵素 処理（例えば、制限酵素を用いた）を計画している場合、これらの蛋白質が修飾 されるのを防止するために、未反応のＴＭＰＥＧを中和することが推奨される。

我々は、免疫親和性の相の分配化に関する研究において、達成化段階後のＴＭＰ ＥＧの更に一層の望ましくない反応を防止するため、リジンもしくはアルブミン が使用できることを確立した。実際、我々は、プロテアーゼには強健でありそし て、３７℃で一晩保温した場合、ＴＭＰＥＧで処理した材料を添加してもほとん ど影響を受けないことを見い出した。しかしながら、２番目の酵素的操作を用い た他の全ての方法に関しては、達成用緩衝液（１容積）中に溶解したＩＭの遊離 塩基リジン（Ｓｉｇｍａ）を該反応混合物（６容積）に加えた後、更に１時間室 温でこの混合物を保温した。

Ｃ）相分配 選択した相系は、１０％（Ｗ／Ｗ）のポリ（エチレングリコール）６０００　（ ＢＤＨ）　、１４％のホスフェート（１６，８６ｇのＫＨ２ＰＯ４および４０． ２０ｇのＫ　ｔ　ＨＰ　Ｏ４（３Ｈ２０）の割合）および７６％の蒸留した脱イ オン無菌水を含有している。この系を混合した後、放置して、上部のＰＥＧが豊 富な相と下部のホスフェートが豊富な相に分離させた。これらを分離した後、一 定分量の０．２２ｕｍフィルター（Ｇｅｌｉ＋ａｎ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｉｎｃ、 　Ｍｉｃｈｉｇａｎ）を通して別々に濾過し、そして−２０℃で保存した。これ を行ったのは、混合した相系から２つの相の割合を変化させないで、一定分量を 採取するのが困難であるため、そしてそれがこの方法の再現性を減少させ得るた めである。各々の分画に関して、この相系は、トレシル−ＰＥＧ処理ＤＮＡ／蛋 白質抽出液から成る相系の全容積の１５％を越えない量で、ＰＥＧ：ホスフェー ト相の既定容量比を用いて、通常、再び組み立てられる。小さいＤＮＡフラグメ ントを分画するための実験に関しては、通常、ＰＯ４：ＰＥＧ相の比率を、７５ ０：　２５０ｕ　Ｉに上昇させ、そして複数回のホスフェート抽出を用いた。

この相を、渦を巻くように混合した後、２５℃で１０分間静置した。その後、数 回に渡るホスフェート抽出（上を参照）で、該ＰＥＧ豊富相が新鮮なホスフェー ト相に移り、そしてこの操作が繰り返される（抽出の純粋なサケの精子のＤＮＡ 　（実施例１の実験で用いた）をＴＥ（１０ｍＭトリスＣＬ　１ｍＭ　ＥＤＴＡ 、ｐＨ７，４）中１０ｕｇ／ｍＬに希釈した後、５００ｕ　１分量を、泡立ちを 避けるように注意しながら、氷上のＭＳＥ卓上音波処理装置中、ピークからピー クが１２ｕ、２０ＫＨｚ、１５０ワツトで、音波処理した。他の全ての実験に関 しては、５００ｕ　１分量の、トレシル−ＰＥＧ処理したＨＬ６０細胞ＤＮＡ／ 蛋白質溶解物（プロテアーゼインヒビターを含有する一層を参照）を、上述した のと同じ装置を用いて５〜６０秒間音波処理した。

Ｎアーゼ処理 実施例６の実験に関して、２．５ｕｇのＤＮＡと等量のＤＮＡ／蛋白質複合体（ Ｔｔａｓｋ方法で製造された）とを、５００ｕ　ｌの反応混合物中１０ｕｇのＤ Ｎアーゼ■（ウシのすい臓のＤＮアーゼ、Ｓｉｇｍａ　Ｌｔｄ、　）に暴露した 。後者は、５０ＭのトリスＨＣＩ；２５ｍＭのＭ　ｇ　Ｃｌ　２　；　２０ｍＭ のＣ１；１ｍＭのＣａＣｌ２；　１０％ｗ／ｖのグリセロール；５０ｕｇ／ｍＬ のウシの血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ　−Ｓｉｇｍａ　Ｌｔｄ、　）を含有して いた。指示された暴露時間後、最終濃度が１％のＳＤＳおよび１５ｍＭのＥＤＴ Ａを用いてこの反応を停止させた。

２回の分配化の繰り返しの間の過剰な段階としてＤＮアーゼを用いた場合、１６ ０ｕｌのＰＥＧ相中の回収されたＤＮＡ／蛋白質複合体を、６５ｕ１のトリスＥ ＤＴＡ　ｐＨ８，０，１２，５ｕｌの５０　ｍＭ　Ｍ　ｇＣＩおよび１２．５ｕ ｌの５０ｍＭＣａＣＩｚおよび１０ｕ１の１０％ＢＳＡの存在下２．５ｕｇのウ シのすい臓のＤＮＮアーゼに暴露した。

２分間の暴露時間を用いた。

ｆ）相からのＤＮＡの回収および定量 相中のＤＮＡを定量するための種々の手段を評価した。数多くの通常に用いられ ている方法は、相それ自身にＤＮＡが存在している間のＤＮＡには応用できない 。化学発光によって、［Ｈ４Ｆ　ＤＮＡおよびシンチレーション計算の使用が妨 げられた。ＰＥＧの蛍光によって、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８　（、蛍光によっ てＤＮＡを定量するために用いられる挿入色素）の使用が妨げられた。ＰＥＧは クロロホルム抽出で除去でき、ホスフェートと他の塩類は、適切な脱塩カラムを 用いて除去できる。

ＰＥＧ相中のＤＮＡの割合は、トポイソメラーゼに対して錯体を形成しているＤ ＮＡの測定単位として働くが、しかしこれは、消光のため、蛋白質の存在下では 蛍光定量法的には容易に測定できない。ＤＮＡから蛋白質を分離するためフェノ ール／クロロホルム抽出が用いられるが、しかしこれは直接使用することができ ない、何故ならば、ＤＮＡに対して共有結合的に結合している蛋白質が、付着し たＤＮＡ　（通常型まれるＤＮＡ）の損失を生じさせるからである。従って、該 トポイソメラーゼは消化される必要がある。プロテアーゼＫ　（Ｓｉｇｍａ　Ｃ ｈｅｍｉｃａｌｓ　Ｐｏｏｌｅ）の２０ｍｇ／ｍＬ水溶液を加えた後（１００ｕ ｌ／ｍＬのＰＥＧもしくはホスフェート相）、３７°Ｃで一晩保温する。その後 、この段階に続いて、ＤＮＡを回収するための抽出操作（例えば、１：１の比率 （ｖ　／　ｖ　）を用いた３回のフェノール／クロロホルム抽出、フェノール／ クロロホルムは０．１％の８−ヒドロキシキノロンを含有していた一ＢＤＨＣｈ ｍｉｃａｉｓ　Ｐｏｏｌｅ）を行い、そして残存するいかなるフェノールも除去 するため、クロロホルム／イソアミルアルコール（２４：ｌｖ：ｖ）を用いて１ 回抽出した。この操作でＰＥＧが効果的に除去されるが、ホスフェートは除去さ れない。後者を除去するため（塩濃度が高すぎる場合、ＤＮＡのエタノール沈澱 化が有効でないため）、ＰＥＧが豊富な相とホスフェートが豊富な相の両方から の抽出物１１．　Ｏｕ　ｌを、１ｍＬのシリンジ中に充填した５ｅｐｈａｄｅｘ 　Ｇ５０　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の１．２ｍＬのカラム上に載せた。この５ｅ ｐｈａｄｅｘは、予め１０ｍＭのトリスＨＣＩ、１００ｍＭＮａＣ１１ｍＭ　Ｅ ＤＴＡ　ｐＨ８，０（ＳＴＥ）を用いて平衡にしておいた。カラムは４００ｇで ４分間回転させた。−７０℃で１時間２倍容積の無水アルコール中で沈澱させた 後、超遠心分離機（ＭＳＥ装置）中１０分間１１．０００ｇで遠心分離すること によって、溶出液からＤＮＡを回収した後、このペレット状のＤＮＡを、２０ｕ 　Ｉ（Ｄト’ＪスＥＤＴＡ：１０ｍＭのトリス：ＨＣＩ、１ｍＭのＥＤＴＡ　ｐ Ｈ７，４（ＴＥ）中に再び懸濁させた。その後、このＤＮＡは通常の手段で定量 できる。

上述した実施例に関して、紫外線吸収分光光度測定を用いるか、或は、負荷を受 けさせそして回収したＤＮＡの大きさの分布を測定しようとする場合（分配の挙 動はＤＮＡフラグメントの大きさで変化するため）、我々はアガロースゲル電気 泳動を用いて定量した。各々のサンプルの６ｕ４分量を、トリス流緩衝液ニホウ 酸トリス０．０８９Ｍ、ホウ酸０゜０８９Ｍ、０．００２ＭのＥＤＴＡ　（ＴＢ Ｅ）中のエチジウムブロマイドｌｕｇ／ｍＬを用いた１％（ｗ／ｗ）のアガロー スゲル（１００ｘ７５ｍｍ）中を、２４ポルト（２，４Ｖ／ｃｍ）で１時間流し た。このゲルの写真を、ポラロイド６６７フイルムを用いた２４５ｎｍのＵＶト ランスイルミネータ上で撮った。このＤＮＡを、公知量のＤＮＡと比較すること によッテ、ネガ（Ｊｏｙｃｅ　Ｌａｂｅｌ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｇａｔｅ ｓｈｅａｄ）の走査濃度計プロットの積分から定量し、た。この操作を用いて、 ＰＥＧ相およびホスフェート相に関して、個々に公知な量のＤＮＡを加える実験 を行った結果、この２相の回収率が異なることが示された。迅速定量に関しては 、サンプルをアガローススラブ上に斑点を付けるように置き、上述したトランス イルミネータ上で写真に撮った後、１セツトのＤＮＡ標準と比較した。

ＰＥＧ相に関する損失は、ＰＯ４相に比べて著しく低かった（実施例１参照）。

従って、サンプルの「真の」分配挙動を見積もるため、結果をこの差別的損失に 対して補正し、そしてこの目的のため、回収の標準を特定の実験に含めた。

この操作において損失したＤＮＡを定量するため、負荷を受けさせたＤＮＡに関 する回収を計算する場合、次の段階（ＰＫ消化、フェノール／クロロホルム抽出 、エタノール沈澱など）の損失を排除する目的で、負荷を受けさせたＤＮＡと同 じ分量を、回収したサンプルとして処理し、そして回収した負荷を受けさせたＤ ＮＡのパーセントを計算するための参照として用いた。

ＨＬ　６０細胞の蛋白質が会合したＤＮＡの調製対数期成長中のＨＬ６０細胞が 、４００ｇで６分間遠心分離することによって得られ、それを、血清を含んでい ない媒体（ＲＰＭＩ　Ｇｉｂｃｏ　Ｌｔｄ、　）中に再び懸濁して＜　５ｘｌＯ ’個細胞／ｍＬにした。１０％の水系ＳＤＳを添加することによるプロテアーゼ インヒビターの存在下、メタノール中の１００ｍＭのストック溶液からの１％ｖ 　／　ｖのＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ）　ｓ　１５ｍＭのＥＤＴＡ および１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオライド（Ｓｉｇｏ＋ａ）を用い て、細胞を溶解し１％の最終濃度とした。

この細胞溶解物を、渦巻き状に撹拌しながら一定分量を採取した後、−２０℃で 保存した。

いくつかの実験において、細胞を７０分間、全てトランス型のレチン酸（Ｓｉｇ ｍａ）　１０−’Ｍで予め処理するか、或は１０−５ＭのＶＰ１６−２１３　（ ＶｅｐｅｓｉｄＳＢｒｉｓｔｏｌ　Ｍｅｙｅｒｓ　Ｕ、に、　）で上述した期間 予め処理した。

レチン酸処理の時間は選択にした、何故ならば、前の試験の結果、この時間間隔 をおいた後、分化によって誘発された蛋白質会合ＤＮＡの分解物が存在している ことが示されたからである。対照区は、同じ時間関係する希釈剤で模擬試験した 。対照区の適切な模擬処理は、細胞の取り扱いがＤＮＡ／蛋白質の会合に対して 明らかな影響を与えそしてそのため収率に影響を与えるところのある種の実験（ 例えば、ＵＶ蛋白質架橋）においては特に重要である。このような実験に関して は、個々の結果は、単一の「未処理」または時間がＯの対照区に対してよりはむ しろ、適合させた模擬処理対照区に対して表される必要がある。

ＤＮＡ／蛋白質複合体のＳＤＳ／ＫＣＩ沈澱（Ｔｒａｓｋ操作）この方法は、子 ウシの胸腺のＤＮＡを結合反応用緩衝液から除去しそして激しい撹拌を用いない （従って、長いＤＮＡフラグメントがせん断を受けない）ことを除いて、本質的 に、文献中（上記引用文中）に示さ１０％のウシの胎児の血清（Ｇｉｂｃｏ−Ｐ ａｉｓｌｅｙ　５ｃｏｔｌａｎｄの両方）を補ったＲＰＭＩ　１６４０中で成長 させた対数期のＨＩ、６０細胞を得た後、再び懸濁して６．　５　ｘ　１０’／ ｍＬとした。次に、この細胞を３７℃の保温蓋中で再び平衡にした。エトボサイ ド（Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）　（ｆＰ　１６−２１３　Ｂｒ１ｓｔｏｌ　Ｍｅｙｅ ｒｓ、　ＮＹ州ＵＳＡ）を、適切な希釈対照を用いて、血清を含んでいないＲ１ ）ＭＩ中に連続して希釈し、最終濃度が１０−５Ｍから１０−９Ｍに、変化重要 を用いて等しい希釈濃度とした。次に、これを３７℃で１５分間該細胞と反応さ せた。この反応は、最終的に、ドデシル硫酸ナトリウムおよびＴｒｉｔｏｎ　Ｘ −１００（両方共Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ−Ｐｏｏｌｅ　Ｅｎｇｌａｎ ｄ）を添加することで停止させ、最終濃度の１％（Ｖ／Ｖ）とした。フェニルメ チルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）およびエチレンジアミノテトラ酢酸二 ナトリウム（ＥＤＴＡ、両方共Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ−Ｐｏｏｌｅ　 Ｅｎｇｌａｎｄ）もまた、それぞれ１ｍＭおよび１５ｍＭの最終濃度になるよう に加えた。

トレシルモノメトキシポリ（エチレン）グリコール（ＴＭＰＥＧ）を連成用緩衝 液（０，５ＭのＮａＰＯ４，０，０８ＭのＮａＣ１、ｐＨ７，５）中に溶解して ４００ｍｇ／ｍＬの濃度とした後、同じ比率（２００ｕ　１　：　２００ｕ１） を、各々の細胞溶解物と、室温で２時間、回転しているターンテーブル上で反応 させた。

６つの１．０００ｕｌ相を、ＰＥＧおよびホスフェートから組み立てた後（５０ ０：　５００ｕ　ｌ）　、該ＴＭＰＨＧ　：細胞溶解物の混合物１００ｕ　１を 各々の相に加えた。次に、これらを渦巻き状に撹拌した後、２５℃で１０分間静 置した。その後、これらの相を分離し、そして最終濃度が１１００ｕ／ｍＬのプ ロテアーゼＫ　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ−Ｐｏｏｌｅ　Ｅｎｇｌａｎ ｄ）と−緒に３７℃で一晩保温した。その後、０．５％の８−ヒドロキシキノリ ンを含有しているフェノール／クロロホルム（全てＢＤＨＣｈｅｍｉｃａｌｓ− Ｐｏｏｌｅ　Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いて２回抽出することによって、これらの相 から蛋白質を取り除いた。

同分量（１０ｕｌ）の各々のサンプルを、ホウ酸トリスの流緩衝液（０，０８９ Ｍのホウ酸トリス、０．０８９Ｍのホウ酸、０．００２ＭのＥＤＴＡ　（ｐＨ８ ，０）　、全てＢＤＨＣｈｅｍｉｃａｌｓ−Ｐｏｏｌｅ　Ｅｎｇｌａｎｄ）を用 いた１％のアガロースゲルを通して、２５ｖ／ｃｍで１時間流した。次に、この ゲルの写真を、ポラロイド６６フインスタントフイルムを用いて波長が２５４ｎ ｍの紫外線光下撮った。このネガを、Ｊｏｙｃｅ　Ｌａｂｅｌ密度計を用いて精 密検査し、そして得られた積分値を、未処理の対照区に対して、回収されたＤＮ Ａを計算するために用いた。

ｈ）ＤＮＡに対して非共有結合的に結合している蛋白質のＵＶ架橋参照は、Ｇｉ ｌｍｏｕｒおよびＬｉｓのＰＮＡＳ　８１　ｐ４２７５−４２７９　：　１９８ ４である。

１０％のウシの胎児の血清を補ったＩ？ＰＭＩ　１６４０培地（両方ともＧｉｂ ｃｏ）中で成長している対数期のＨＬ６０細胞を取り出し、４００ｇで４分間回 転させた。次に、これらの細胞を再び懸濁させて所望の濃度とした。その後、１ ｍＬ分量を小型のベトリ皿（Ｎｕｎｃの製品）中に置き、１２．５ｃｍで、波長 が２５４ｎｍ、強さが５Ｗ／ｃｍ２のＵＶ光に暴露した。その後、Ｅｐｐｅｎｄ ｏｒｆ管中、６５００ｇで５分間遠心分離することによって細胞を集めた。この 細胞を再び、２００マイクロリツトルの１０ｍＭトリスＨＣＩ　ｐＨ７，４１ｍ ＭＥＤＴＡ（Ｔ、Ｅ、）　ドデシル硫酸ナトリウム、ＳＤＳ　（Ｓｉｇａ＋ａ） およびＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００（ＢＤＨ）に懸濁させて、最終濃度を１％とし た後、ＥＤＴＡ二ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を最終濃度が１５ｍＭになるように 加えた。このサンプルを次に４℃に冷却した後、氷上のＭＳＥ卓上音波処理装置 を用いて３０秒間、ピークからピークの振幅が１２マイクロメートル、１５０ワ ツトおよび２０ＫＨｚで音波処理した。これによって、該ＤＮＡの形態上の大き さを約８００個の塩基対に減少させた。負の対照サンプルを、プロテイナーゼＫ 　（Ｓｉｇｍａ）を用いて５６℃で１゜５時間保温して、最終濃度を５マイクロ グラム／マイクロリツトルとした。その後、このサンプルを他と同様にして処理 した。

トレシルメトキシポリ（エチレングリコール）　ＴＭＰＥＧを、０．０５ナトリ ウムホスフェート０．１２５塩化ナトリウムｐＨ７，５中の緩衝液１ミリリツト ル当たり４００ミリグラムとなるように調製した後、室温で２時間、Ｕ／Ｖ照射 および未照射サンプルと１　：　１　＜Ｖ／Ｖ＞の比率に混合した。

ＴＭＰＥＧと一緒に保温した後、全ての材料を、７５０マイクロリツトルのホス フェート豊富相および２５０マイクロリツトルのＰＥＧ豊富相から成る相系に加 えた。この系は、１４．７％Ｗ／Ｗのポリ（エチレングリコール’）　６０００ 　（ＢＤＩＩ）　ｌ　ｌ、２％ｗ／ｗのホスフェート（１６，８６クラム（７） ＫＦＩ２ＰＯ４オ、Ｊ：　ヒ４０　、　２０　ｇ　（’）Ｋ２１１ＰＯ４（３Ｈ ｚＯ）　、両方共ＢＤＨ）および７４．１％の蒸留した脱イオン無菌水を用いて 組み立てた。この相を渦巻き状に撹拌した後、２５℃で１０分静置して、上層の ＰＥＧ豊富相を、新鮮な７５０マイクロリツトルの、ホスフェートが豊富な底の 相に移させた。次に、これを繰り返して、１条件当たり１つの上部相と４つの底 部相を残した。

その後、各々の条件を、プロティナーゼＫを用いて３７゛　ｃのＯ／Ｎで保温し て、最終濃度をマイクロリットル当たり５マイクログラムとした。次に、この相 を同容積のフェノール−クロロホルム（領　１％のヒドロキシキノリンを含有し ているフェノール：クロロホルム１：１ｖ／　Ｖ　％全てＢＤＨ）を用いて２回 抽出した後、いかなる残存フェノールをも除去するためクロロホルム−イソアミ ルアルコール２４　＋　１−　（両方共ＢＤＨ）で最終抽出を行った。これによ って、存在するいかなるＰＥＧも除去されるが、いかなるホスフェートも除去さ れない。ＤＮＡのエタノールによる沈澱は高塩濃度において有効でないため、ホ スフェートを除去する必要がある。ＳＴＥ　ｐＨ８（１０ｍＭのトリス’ＣＩ　 ｐＨ８；　１ｍＭのＥＤＴＡ；１００ｍＭのＮａＣ１）を用いて平衡にしである ５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０（Ｐｈａｒａ＋ａｃｉａ）を充填した１ｍＬのシリ ンジを通してサンプルを降下させるように回転させて、該ホスフェートを除去す る。この溶出液を次に、２倍容積の一７０゛　Ｃの冷無水アルコールを用いて一 晩沈澱させた。

ソノ後、ＭＳＥ超遠心分離器中、１１．００Ｏｒ、ｐ、ｍ、ｒｌｏ分間回転させ た後、１０マイクロリツトルのＴ、Ｅ、ｐＨ７，４中に再び懸濁させた。これを その後、センナメートル当たり２．５ボルトで２時間、１％のアガロースゲル上 を流した。このゲルの写真を、ポラロイド６６５フイルムを用いてＵＶトランス イルミネータ上、撮影した。このネガを、密度計（Ｊｏｙｃｅ　Ｌｏｂｅｌ）で 精密検査し、そしてこの積分値を、公知のサケの精子標準を用いて、存在するＤ ＮＡの量を計算するために用い゛た。

この結果を、上部相中に存在するＤＮＡが該上部相から回収されるにつれて、出 発量のパーセントおよびまたマイクロダラムで表した量としＨＬ　６０細胞を、 標準培養条件下（上を参照）、３７℃で６０分間、１０−’Ｍのノボビオシン（ Ｓｉｇｍａ　Ｌｔｄ、　）を用いて予め培養した後、レチン酸（１０−’Ｍ、７ ０分間）に暴露するか、或は希釈剤と一緒に模擬処理した。毒性試験の結果、ニ グロシンで評価して、この投薬量のノボビオシンで５％未満の細胞が死滅するこ とを示していた。ノボビオシンは、エピポドフィロトキシンおよびインター力レ ーク（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）とは異なる様式、即ち、後者とは異なり、こ れは、酵素とＤＮＡとの開裂可能な複合体を安定化しないが、ＤＮＡに対する酵 素の結合を抑制する傾向にある点で異なる様式で作用するところの、ＤＮＡ　ｌ −ポイソメラーゼ１１の確立されたインヒビターである。しかしながら、最近、 薬：酵素の比率を変更することでインヒビター的および刺激剤的効果が観察され 得る点で（Ｃｏｌｌｉｎｓ　ａｎｄ　Ｊｏｈｎｓｏｎ　Ｎｕｃｌ　Ａｃ１ｄｓ　 Ｒｅｓ　７：１３３１；１９７９）　、該薬剤は該酵素と複雑な相互作用を有す ることが示された。

適合させた分化誘発および未誘発細胞からの、ＰＥＧおよびホスフェート相のＤ ＮＡを用いた雑種形成方策は実施例７に説明されている。

該フィルターを、ＦＣＫａｆａｔｏｓ、　ＣＷ　ＪｏｎｅｓおよびＡ、　Ｅｆｓ ｔｒａｔｉａｄｉｓ、のドツトプロット（ｄｏｔ　ｂｌｏｔ）方法（Ｎｕｃｌｅ ｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　７：１５４１；１９７９）で調製した。Ｓ、 　ｌ、　ＢｅｒｇｅｒおよびＡ、　Ｒ，Ｋｉｍｍｅｌ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒ ｅｓｓ　１９８７編集の「分子クローン化技術への手引書からの提案」“Ｌｉｆ ｔｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｔｈｅ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎ ｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ″。

１）全てトランス型のレチン酸またはホルボル（ｐｈｏｒｂｏｌ、）−１２−ミ リスチン酸エステル１３−酢酸エステル（ＰＭＡ）　Ｃ両方共Ｓｉｇｍａ　Ｃｈ ｅｍｉｃａｉｓ−Ｐｏｏｌｅ　Ｅｎｇｌａｎｄ）で誘発された細胞から回収され たＤＮＡ／蛋白質複合体からのＤＮＡを用いた、ニトロセルロースまたはナイロ ンＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ　Ｐ１１１Ｓ７　イルターの調製（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａ ｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ−Ｂｏｓｔｏｎ　 ＵＳＡ）。

通常、ＤＮＡの４倍希釈液を、最大希釈としてＱ、０５ｕｇ用いて該フィルター に加え、そして次の３つのドツトは２倍希釈を用いた。単独の負荷変性などで２ 〜３個の複製フィルターを製造した。サンプルをＴ。

Ｅ、ｐＨ８，０（１０ｍＭのトリスＣＬ１ｍＭのエチレンジアミンテトラ酢酸、 ＥＤＴＡ）を用いて希釈して、Ｏ，ｌｕｇのＤＮＡとした。その後、各々のサン プルにＴＥｐＨ８を加えて、標準の５０ｕ１容積にした。

全てのサンプルを、０．１容積の３Ｍ水酸化ナトリウム（ＢＤＨＣｈｅｍｉｃａ ｌｓ−Ｐｏｏｌｅ　Ｅｎｇｌａｎｄ）と−緒に４５分間７０℃に加熱した。これ によって、該ＤＮＡを変性させ、そしてもし存在していればいかなるＲＮＡも分 解させた。次に、このサンプルを室温に冷却した後、５５ｕ１の２Ｍ酢酸アンモ ニウム（ＢＤＩＩ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ−Ｐｏｏｌｅ　Ｅｎｇｌａｎｄ）を加え た。次に、連続希釈を１Ｍ酢酸アンモニウム中で行った。このＤＮＡを、「ホー ムメート」のドツト−プロット装置を用いてナイロン（またはニトロセルロース ）上に載せ、少なくとも３０分間室温に放置した後、減圧を用いて吸い上げた。

その後、フィルターを３ＭＭ紙（Ｗｈａｔｍａｎ　Ｐａｐｅｒ−１１ａｉｄｓｔ ｏｎｅＥｎｇｌａｎｄ）の間で乾燥した後、減圧下８０℃で２時間ベータした（ ナイロ製のフィルターに関しては任意）。このフィルターを次に、６ＸＳＳＣ（ ０，９Ｍの食塩水、０．９Ｍのクエン酸ナトリウムｐＨ７，０、両方共ＢＤＨＣ ｈｅｍｉｃａｌｓ−Ｐｏｏｌｅ　Ｅｎｇｌａｎｄ）　、０．　５％のＳＤＳ　（ ドデシル硫酸ナトリウム、Ｓｊ、ｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ−Ｐｏｏｌｅ　Ｅ ｎｇｌａｎｄ）　５　ｘＤｅｎｈａｒｔｓ溶液（０５ｇのＦｉｃｏｌ、０．５ｇ のポリビニルピロリドンおよび０．５ｇのウシの血清アルブミンＰｅｎｔａｘ　 Ｆｒａｃｔｉｏｎ　Ｖ−全てＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｐ。

ｏｌｅ　Ｅｎｇｌａｎｄ）および１００ｍｃｇ／ｍｌ、の蒸留した脱イオン水２ ００ｍＬ中の、高度に音波処理したサケの精子のＤＮＡ　（Ｓｉｇａ＋ａ　Ｃｈ ｅｍｉｃａｌｓ−Ｐｏｏｌｅ　Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いて予備雑種形成した。こ のフィルターは、振とう水浴中撹拌しながら６８℃で３．５時間予備雑種形成し た。予備雑種形成後、この流体を注ぎ出し、そして１００ｍＬ容積中、６ｘＳＳ Ｃ。

０．５％の５ＤＳＳＤｅｎｈａｒｔｓ、１００ｍｃｇ／ｍＬの変性したサケの精 子のＤＮＡおよび０．１ＭＥＤＴ＾を含有している雑種形成流体を加えた。

これに、ランダムプライマ一方法のキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｌｃ−Ａｍｅ ｒｓｈａｍ　Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いて、ｄＣＴ３２ｐで標識を付けたプローブ 放射を加え、そして組み込まれる量は、遊離ヌレクオチドを除去するため洗浄し た引用文献中のＷｈａｔｍａｎ　ＤＥ−８１フイルタ一紙Ｍａｎｎｉａｔｉｓに 吸着させることによって定量した。約１７時間撹拌しながら６８℃で再び雑種形 成を進行させた。後雑種形成の洗浄は４５分間で２回行い、そして、６８℃に予 め温めて置いた１００ｍＬの蒸留した脱イオン水中の１ｘＳＳＣ，１ｘＤｅｎｈ ａｒｔｓおよび０．　１％のＳＤＳを用いて３０分間、２回行った。該雑種形成 流体を除去した後のフィルターに、この溶液を加えた。後雑種形成の洗浄はまた 、水浴中で撹拌しながら実施した。この洗浄の後（２回、６８℃に予め温めた０ 、１ｘＳＳＣ１００ｍＬを用いて、水浴中撹拌しながら最終的２０分間のすすぎ を行った。その後、このフィルターをｌｆｈａｔｍａｎ３ＭＭ紙のシートの間で 吸い取った後、空気中で完全に乾燥させた。

このフィルターは、背景の上に２２−５ｃｐを越えないカウント数を有しており 、そして、得られる結果に応じて２４〜４８時間−７０℃で、２種の希土類の増 感紙（Ｄｕ　Ｐｏｎｔ　Ｃｒｏｎｅｘ　Ｑｕａｎｔａ　ＩＩＩ、Ｄｕ　Ｐｏｎｔ 　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ　Ｕ、　Ｋ、　）の備わっているＦｕｊｉ　ＲＸ　１０ ０メデイカルＸ線フイルム（ＦｕｊｉＦｈｏｔｏ　Ｆｉｌｓ　Ｃｏ、　Ｌｔｄ、 −Ｊａｐａｎ）に暴露した。

使用したプローブには、ｃ−ｍｙｃ、即ちゲノム状のＤＮＡの８ＫｂｐＥｅｏ　 Ｒ１／Ｈｉｎｄ　ＩＩＩフラグメント（Ｄａｌｌａ−Ｆａｕｒａ他、ＰＡＮＳ、 　７９：６４９７；　１９８２）、並びに１．５Ｋｂｐ　ｃ　−ｆ　ｏ　ｓのｃ ＤＮＡフラグメント（最初ノエキソンが不足している、５°末端に関して切断さ れた）　（ＭｕｒｐｈｙおよびＮｏｒｔｏｎの個人的情報）、並びに以下のよう にして製造されたレチン酸プラス（Ｒつプローブを含んでいた。レチン酸で誘発 された細胞を、Ｔｔａｓｋ他の方法で製造された蛋白質会合ＤＮＡを製造するた めに用いた。その後、この材料（５，Ｏｕｇ）を、２５０ｕ　Ｉ容積中、５０ｍ ＭのトリスＣ１ｐＨ８，０，１００％ｖ　／　ｖのグリセロール、０．１％のウ シの血清アルブミン、２５０ｍＭのＭｇ”、１０ｍＭのＣａ”および２００ｍＭ のＫ”（全てＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　Ｐｏｏｌｅ−Ｅｎｇｌａｎｄ） の存在下、５分間、０゜０５ｕｇのウシのすい臓のＤＮアーゼ１　（Ｓｊｇｍａ 　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ−Ｐｏｏｌｅ　Ｅｎｇｌａｎｄ）に暴露した。同様のプロ ーブ（Ｒ“）を、同様の未分化ＨＬ６０細胞から調製した。

この反応混合物を１％のＳＤＳおよび１５ｍＭのＥＤＴＡにまでもっていくこと によって反応を停止させた。同容積の４００ｍｇ／ｍＬのＴＭＰＥＧ（トレシル モノエトキシポリエチレングリコール）を、存在している蛋白質に対して、室温 で２時間反応させた後、ＰＯ４を用いて５回、２５０／２７０ｕｌのＰＥＧ　： 　ＰＯ４相系に関して分配させた。次に、プロテイナーゼＫ　（Ｓｉｇｍａ　Ｃ ｈｅｍｉｃａｌｓ−Ｐｏｏｌｅ　Ｅｎｇｌａｎｄ）を３７℃で、−晩、２０ｍｇ ／ｍＬになるまで添加することによって該蛋白質から該ＤＮＡを遊離させた。そ の後、このサンプルをフェノール／クロロホルムを用いて２回抽出し、続いてイ ソアミルアルコール／クロロホルムを用いて１回抽出した。

２つの異なるクローン化技術を評価したが、しかし原則としていかなる標準の技 術も使用され得る。

ａ）ホモポリマーテーリング技術を、該調製ＤＮＡフラグメントをｄＣＴＰ末端 につないだプラスミド（ｐｕｃ８）中に導入するために用いた。この方法を選択 したのは、トポイソメラーゼ開裂部位、せん断された末端または制限部位に関す るいかなる特徴ある取り扱い方も含まれていないからである（我々は、交互に配 列したトポイソメラーゼ開裂部位の有無に拘らず、フラグメントの加工効率の差 異を避けたかった）。形質転換に続＜Ｄ８５大腸菌中でのプラスミドの成育およ びそこからの回収の結果、組み換え型プラスミドが生産されることが示された。

しかしながら、この方法の効率は比較的低かった。

ｂ）トポイソメラーゼ会合ＤＮＡのクローン化のための２番目の方策は下記の通 りである：トポイソメラーゼ開裂部位で生産された突き出し物をＫｌｅｎｏｗ　 （Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｕ、　Ｋ、　）で末端充填した後、Ｓａｌ　ｉリンカ−（ Ｐｈａｒｍａｃｊａ）で平滑な末端を結合させた。その後、このＤＮＡをＥｃ。

Ｒ１およびＳａｌ　Ｉを用いて消化させる（Ｅｃｏ　Ｒ１は最も大きいＤＮＡフ ラグメントを適当な大きさに消化し、そしてＳａｌ　Ｉは粘着性のある末端を作 り出す）。次に、このＤＮＡを、Ｅｃｏ　ＲＩおよびＳａｌ　１で予め消化した ｐＵｃ１８に結合させ、そして大腸菌ＤＨ５細胞（Ｂ　ＲＬ）に形質転換させる 。この操作で、ランダムに開裂したＤＮＡ、並びに該トポイソメラーゼ会合ＤＮ Ａの両末端をクローン化させるべきであるが、トポイソメラーゼＩＩ開裂部位か ら遠く離れたＤＮＡの部分からのＳａｌ　Ｉ／Ｓａｌ　Ｉフラグメントの切断を 排除する傾向を有する。

Ｘｇａ　Ｉプレートを用いると、ある種の未知の理由により、この材料は数多く の青色のコロニーを与え、これは形質転換したとき追加的白色のコロニー中に生 じる。これは、結合したベクター単独を有し、そしてクローン体の生産に非常に 有効でないこと（予測されたように）がわかっているにも拘らず存在していた。

白色のコロニーを生じさせる効率は、結合させたベクター／挿入断片のバッチ間 で変化していた。これらの青色のコロニーが非常に小さい挿入断片を有している 可能性があり、従ってこれらを廃棄する前にサンプルを検査すべきである。

この新しい方法で分画されたＤＮＡは、最初は、制限酵素による消化に対する抵 抗を示したが、しかしこれは、ＤＮＡを最初にＱＩＡＧＥＮ　（商標）チップに 通すことで克服された。この操作によるクローン化のためのＤＮＡは、クローン 化に利用され得るランダムに開裂する末端の数を減少させるため、できるだけ大 きいままにしてお（べきである。

クローン化は、Ｓａｌ　Ｉ単独によるベクターの切断を用いて改良され、そして 末端のホスフェート基を除去するため、子ウシの腸のホスファターゼで処理され 得る。従って、Ｓａｌ　Ｉリンカ−の付着によりトポイソメラーゼ開裂部位に人 口的に作られたＳａｌ　ｌと、最も近いＥｃｏＲ１部位との間にＳａｌ　１部位 が存在している場合、これらはクローン化される（他の５ａｉｌ−８ａｌｔフラ グメントと同様）。

−ＤＮＡのりＯ−＞４Ｂ　（Ｍａｎｉａｔｉｓ他、「分子クローン化Ｊ　”　Ｍ ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ”　：＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｎｕ ａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ、　１９８２）１）クローン化 のためのＤＮＡの調製 分画したＤＮＡのＱＩＡＧＥＮチップ精製サンプルを水で希釈して１３０ｕ　Ｉ にする。

７０ｕ１の、１．５Ｍ　ＮａＣｌ／２５０ｍＭＭＰＳ　ｐＨ７，０を加える。

３００ｕ　Ｉの緩衝液Ａを用いてＱＩＡＧＥＮチップ５を平衡にする。

チップを通してピペットで４回採取することでＤＮＡをチップ上に吸着させる。

５Ｘ７５０ｕ　１の緩衝液Ｃを用いてリンカ−を洗い流す。

３Ｘ２００ｕ　］の緩衝液Ｆ中にＤＮＡを溶出させる。

０．４８ｍＬ　（０，８容積）のイソプロパツールを加えた後、氷上に１５分間 置く。

３０分間超遠心分離する。

ペレットを７０％エタノールで洗う。

３０分間超遠心分離する。

真空下でペレットを乾燥する。

ＴＥｐＨ７，５中に溶解する。

ＤＮＡの平滑末端化 ２ｕｌ　１０ｘ修復用緩衝液 ５ｕｌ　１ｍＭのｄＮＴＰｓ　（各々ｉｍＭ）（３ｕｌ　ＴＥ　ｐＨ７，５ ５ｕ　ｌ　ＤＮＡ　（２，Ｏｕｇ） １　ｕ　Ｉ　Ｋｌｅｎｏｗ　（５Ｕ／ｕ　Ｉ）室温で１時間培養する。

６５℃で５分間加熱する（加熱して酵素を不活性にする）。

リンカ−の燐酸化 ］、ｕｌ　１０ｘキナーゼ緩衝液 ｌｕｌ　リンカ−（ｌｕｇ） ｌｕｌ　Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ７ｕｌ　ｄｄｗ（２倍蒸留水） ３７℃で１時間培養する。

リンカ−へのＤＮＡの連結反応 ２０ｕ１　平滑末端化ＤＮＡ ５ｕｌ　５ｘリガーゼ緩衝液（ＢＲＬ）５ｕｌ　キナーゼリンカ− １０ｕｌ　ｄｄｗ ５ｕｌ　Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＩＵ／ｕｌ）４〜１５℃で一晩培養する。

５０ｕ１のフェノール／クロロホルムを加えそして混合する。

短時間超遠心分離しそしてフェノール／クロロホルムで再抽出する。

クロロホルムで抽出する。

５０ｕｌのＴＥ　ｐＨ７，５と一緒に抽出物を戻す。

４ｕｌの５ＭＮａＣ１を、１００ｕｌのＤＮＡと４００ｕ１の１００％冷エタノ ールに加える。

一７０℃で冷凍した後１５分間超遠心分離する。

ペレットを真空乾燥する。

制限エンドヌクレアーゼ消化 ４０ｕ　Ｉ　ｄｄｗ　（ＤＮＡへ溶解）５ｕｌ　ｉｏｘ緩衝液（ＥｃｏＲＩおよ びＳａｌ　Ｉ用ＢＲＬ　Ｈ緩衝液） ｌｕｌ　Ｅｃｏ　Ｒ１（９０Ｕ／ｕｌ）３７℃で１時間培養する。

６８℃で５分間加熱して不活性化する。

４ｕｌのＳａ　Ｉ　Ｉ　（１０Ｕ／ｕ　Ｉ）を加える。

３７℃で４時間培養する。

リンカ−のＱＩＡＧＥＮチップ除去 ５０ｕ　ＩのＤＮＡに、 １００ｕＩのｄｄｗ ２５ｕ１の５ＭＮａＣｌ ７．５ｕｌのＬＭ　ＭＯＰＳ　Ｐｈ７．０を加える。

３００ｕ　Ｉの緩衝液Ａを用いてＱＩＡＧＥＮチップ５を平衡にする。

チップを通してピペットで４回採取することでＤＮＡをチップ上に吸着させる。

５ｘ７５０ｕｌの緩衝液Ｃを用いてリンカ−を洗い流す。

３ｘ２００ｕｌの緩衝液Ｆ中にＤＮＡを溶出させる。

０．４８ｍＬ　（０，８容積）のイソプロパツールを加えた後、氷上に１５分間 置く。

３０分間超遠心分離する。

ペレットを７０％エタノールで洗う。

３０分間超遠心分離する。

真空下でペレットを乾燥する。

４０ｕ１のｄｄｗ中に溶解する。

平均サイズを測定するため０．　８％のアガロースゲル中、２ｕｌを流す。

１６ｕｌ　ｐＵｃ１８　（０，２５ｕｇ／ｕｌ、即ち４ｕｇ）２ｕｌ　１０ｘｌ ｉｌｉ液（ＥｃｏＲＩおよびＳａｌ　Ｉ用ＢＲＬ　Ｈ緩衝液） ｌｕｌ　Ｅｃｏ　Ｒ１（９０Ｕ／ｕｌ）３７℃で数時間培養する。

切断の完了を確実にするために１％ミニゲル上に流す。

ｌｕｌのＳａｔ　Ｉ　（ＩＯＵ／ｕｌ）を加える。

３７℃で数時間消化する。

１１０ｕｌのｄｄｗ、７０ｕｌの１．５Ｍ　ＮａＣ１，１２０ｍＭＭ０ＰＳ　ｐ Ｈ７，０を加える。

上述したように、ＱＩ＾ＧＥＮチップを用いて小さい挿入物を除去する。

ｄｄｗに溶解して０．１ｕｇ／ｕｌの濃度とする。

ベクターの脱燐酸化 ５ｕｌ　１０ｘＣＩＰ緩衝液 ４５ｕ　１　ベクター（２ｕｇ） ｌｕｌ　子ウシの腸のホスファターゼ ３７℃で３０分間培養する。

ｉｕｌのＣＩＰを加えそして更に３０分間培養する。

４０ｕｌ　ｄｄｗ １０ｕｌ　５ＴＥ（トリスＥＤＴＡ食塩水）５ｕｌ　１０％ＳＤＳを加える。

６５℃で１５分間加熱する。

一２０℃で４ｕｌの５ＭＮａ、ＣＩ、２００ｕ　１の冷エタノールおよび沈澱Ｄ ＮＡを加える。

１５分間超遠心分離し、上澄み液を除去しそして真空下乾燥する。

ｄｄｗに溶解してＯ，ｌｕｇ／ｍＬの濃度とする。

３）ＤＮＡ挿入断片へのベクターの連結反応Ｑ、１ｕｇのｐＵｃ］、８　（Ｅｃ ｏ　Ｒ１／Ｓａｌ　Ｉで切断）ＤＮＡ挿入断片（５：１（モル、モル）などの比 率で）２０ｕ　］ ６８℃で５分間加熱する。

氷上で冷却する。

４ｕｌの５ｘ連結反応用緩衝液 ｌｕｌのＴ４　ＤＮＡリガーゼ １５℃で一晩培養する。

４）Ｅ、ｃｏｌｉの形質転換（ＤＨ５受容細胞）ＢＲＬプロトコルにより、 氷上で細胞を解かす。

２０ｕ　Ｉの分量に分ける。

ｌｕｌのベクター／ＤＮＡ挿入断片を加える（ＴＥ中１：５に希釈）氷上で３０ 分間培養する。

４２℃で４０秒間培養した後氷上に置く。

８Ｑｕ　１のＳＯＣを加えた後、３７℃で６０分間振とうしながら培養する（２ ２５ｒｐｍ） Ｘ−ガルプレート上に置きそして一晩培養する。

１００ｕｌのＬブイヨン＋アンピシリン中にコロニーを採取しそして一晩成育さ せる。

１００ｕｌの３０％グリセロールを加えそして一７０℃で保存する。

５）溶液および緩衝液 Ｅ １ｍＭのＥＤＴＡ ＩＱｍＭのトリス １０ｘ修復用緩衝液 ０．５ＭのトリスｐＨ７，４ ７０ｍＭのＭｇＣｌ２ １０ｍＭのジチオトレイトール １０ｘキナーゼ緩衝液 ０．６６ＭのトリスｐＨ７，６ １０ｍＭのＡＴＰ １０ｍＭのスペルミジン １０ｍＭのＭｇＣ＋２ １５０ｍＭのジチオトレイトール ２ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ　（分子生物学グレード）１０ｘＣＩＰ緩衝液 ０．５ＭのトリスｐＨ９，０ １０ｍＭのＭｇＣ＋２ ］、ｍＭのＺｎＣｌ２ １０ｍＭのスペルミジン ＣｈｕｒｃｈＳＧ、Ｍ、およびＧ１１ｂｅｒｔＳＷ、　（１９８４）　ｒゲノム の配列Ｊ　”　Ｇｅｎｏｍｉｃ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ”、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８１．１９９１−１９９５２５７．０ｇ 　ＮａｚＨＰ０４”　１２Ｈ２０５６，８ｇ　ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２０ｄｄｗ で１０１００Ｏにする。

（溶解させるため加熱してもよい） または １．３４ｇ　ＮａＮａＨ２ＰＯ４７Ｈ ２Ｏ４燐酸 ｄｄｗで１０００１００Ｏする。

（溶解させるため加熱してもよい） Ｃｈｕｒｃｈ予備雑種形成緩衝液 ０．５ＭのＮａＰｉ　ｐＨ７，２ ７％ＳＤＳ １ｍ〜１のＥＤＴＡ １ＭのＮａＰｉ　ｐＨ７，２１００ｍ１　２５０ｍ１　５０ｈ１２０％Ｓ　Ｄ　 ３　７０ｍ１　１７５ｍ１　３５０ｍ１０．５ＭのＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ　０．４ｍｌ 　１．０ｍｌ　２．０ｍ１ｄ　ｄ　ｗ　２９．６ｍｌ　７４ｍ１　１４８ｍ１Ｃ ｈｕｒｃｈ洗浄溶液 ４０ｍＭのＮａＰｉ　ｐＨ７，２ １％のＳＤＳ １ＭのＮａＰｉ　ｐＨ７，２４０＋ｓｌ　８０ｍ１　２００ｏ＋１２０％のＳ　 Ｄ　Ｓ　５０ａ＋１　１００ｍ１　２５Ｏｎ＋１ｄ　ｄ　ｗ　９１０ｍ１　１８ ２ｈｌ　４４５ｈｌ操作 プラスチック製のバッグ中、６５Ｃで２〜６時間、５０〜１００１／ｃｍｚ中、 フィルターを予め雑種形成する。

プローブを加えた後、６５Ｃで一晩（１６〜２４時間）雑種形成する。

室温のＣｈｕｒｃｈ洗浄液中２ｘ５分洗浄する。

６５　Ｃ０）Ｃｈｕｒｃｈ洗浄液中２Ｘ３０分洗浄する。

増感紙を用いて一晩放射能写真を撮る。

７）媒体、プレートおよび試薬 ＯＣ ２ｇ　バクトドリプトン ０．５ｇ　酵母菌抽出液 ｉｍＬＩＭのＮａＣ１ ０，２５ｍＬ　ＬＭのＫＣＩ ９７ｍＬのｄｄｗ中でオートクレーブにかける。

室温に冷却する。

１ｍＬの２Ｍ　Ｍｇ”および１ｍＬの２Ｍグルコースを加える。

１００ｍＬとする。

フィルター滅菌する。

Ｌブイヨン Ｌｏｇ　バクトドリプトン ５ｇ　バクト酵母菌抽出液 １０ｇ　ＮａＣ］ ｄｄｗで１０１００Ｏとする。

オートクレーブで滅菌する。

冷却した後１ｍＬの２５ｍｇ／ｍＬアンピシリンを加える。

Ｌ寒天 １００ｍＬのしブイヨン中１．５ｇのバクト寒天オートクレーブで滅菌する。

冷却した後１ｍＬの２５ｍｇ／ｍＬアンピシリンを加えそしてプレートに注ぐ。

ジメチルホルムアミド中２０ｍｇ／ｍＬ５ｍＬのジメチルホルムアミド中１００ ｍｇのＸ−ガルＸ−ガル＝５−ブロモー４−クロロ−３インドリルー−Ｄ−ガラ クトピラノシド ４Ｃで保存する。

０．１ＭのＩ　ＰＴＧ ５ｍＬの無菌ｄｄｗ中１１９ｍｇのＩＰＴＧフィルター滅菌した後、超遠心分離 管中に分量する。

−２００で保存する。

Ｉ　ＰＴＧ　ニイソプロピル−チオガラクトピラノシド２５ｍｇ／ｍＬのアンピ シリン ２５０ｍｇのアンピシリンを１．０　ｍ　Ｌのｄｄｗに溶解する。

フィルター滅菌した後、超遠心分離管中に分量する。

−２０Ｃで保存する。

Ｘ−ガルプレート １００ｍＬのＬ寒天をく５０に冷却する。

２５ｍｇ／ｍＬで４００ｕ　ｌのアンピシリンと３００　ｕ　Ｉ　２０ｍｇ／ｍ Ｌで３００ｕ　ＩのＸ−ガルと０．１Ｍで１００ｕｌを加える。

プレートに注ぎ、粘着フィルムで包み４Ｃで保存する。

実施例Ｉ ＰＥＧ−蛋白質達成操作はＰＥＧ相に対する蛋白質結合ＤＮＡの親和力を向上さ せそしてそのＤＮＡの回収および定量を可能にするＰＥＧ相の回収が、ＤＮＡに 付着している蛋白質に対するＰＥＧの達成によるものである度合を示す試みを行 う前に、遊離したＤＮＡのＰＥＧ相の回収がＤＮＡフラグメントの長さに大きく 影響されることを正確に評価することが重要である。従って、親和力による分配 を示すための比較を行う場合、そしてまた、ＰＥＧ−蛋白質−ＤＮＡ複合体にと ってより特異な系にするための分配条件（ＰＥＧ：ホスフェート相の容積比率お よびホスフェート抽出に必要な繰り返し回数）を選択する場合、上記のことを考 慮する必要がある。

図２および３は、ＰＥＧ相の収率に関する音波処理の影響を示している。ＤＮＡ の分子量が低下するにつれて、ＰＥＧ相の収率が上昇する。

図３は、１：１のＰＥＧ：ホスフェート相の容積比および新鮮なホスフェート相 を用いた１２回の分配（丸）または７回の分配（四角）を用いたときのＰＥＧ相 の収率に対する音波処理の影響を示している。

これらの結果は理論的基礎において予想される結果に一致している、何故ならば 、小さい分子を用いると、分配係数が１と見なされるｉｔ（即ち、この２つの相 の間での等しい分配）（引用文献中のＭｕｌ、１ｅｒ）に近づき、そして分配の 特異性はなくなる。無限（即ち、ＰＥＧ相中に１００％）に近いＰＥＧ−蛋白質 に関する公知の分配係数（引用文献中のＷａｉｔｅｒ）が得られれば、我々は、 単に、ホスフェート相を用いてＰＥＧ相を追加的回数繰り返して抽出することに よって（図２の四角）　、ＤＮＡが高度にフラグメント化されている場合でさえ （そして、これはしばしば理論的基礎を基にすると望ましい一以下を参照）、所 望される親和力分配が達成され得ることを予測した。必要な繰り返し回数を制限 する目的で、ＰＥＧ相よりも多いＰＯ４相を用いた相系を組み立てることもでき る。

追加的にホスフェート抽出を数回行うことで、成功裏に、蛋白質を含んでいない ＤＮＡの小さいフラグメントを除去し、そして蛋白質が会合しているＤＮＡのみ を本質的に残すことを確かめるため、全体のゲノム状もしくはＤＮＡ−蛋白質複 合体が豊富なりＮＡを、ホスフェート抽出を追加的に数回行うことで分配させた （典型的な例は図３に示されており、ここでは、３回のＰＯ４抽出の後では、非 常に少ない量（０，２％）の一層のＤＮＡがＰＯ４相中に回収された）。

図４は、ＰＥＧ相およびホスフェート相中のＤＮＡの回収に対する、ホスフェー ト相を用いた追加的繰り返し回数の抽出の効果を示している。

結果は、４回に渡る個々の実験の平均値±ＳＥＭである。

この回収されたＰＥＧ相のＤＮＡのどの部分が結合した蛋白質であるかを測定す るため、同様に分画したサンプルに関してプロテイナーゼに処理した一定分量を 、同じ（処理した（表■）。

表■ 音波処理　収　率 Ｒ＋ＨＬｗｃ　ＰＫ−３０４４００ニア００　０．４６％ＰＫ＋　０．００％ Ｒ＋ＨＩ、ｖｃ　ＰＫ−３０４４００＋７００　０．７０％ＰＫ＋　０．００％ Ｒ＋ＨＬＷＧ　ＰＫ−３０４４００ニア００　１．２１％ＰＫ＋　０．００％ Ｒ＋ＨＬＷＧ　ＰＫ−３０４２５０ニア００　０．５６％ＰＫ＋　０．００％ Ｒ＋ＨＬＷＧ　ＰＫ−３０４２５０ニア００　０．３６％ＰＫ＋　０．０１％ １？＋ＴＲＡｓＫ　ＰＫ−０５５００ニア５０　７．８９％（ＤＮアーゼ） ＰＫ＋　０．００％ Ｒ＋ＴＲＡＳＫ　ＰＫ−６０５５００ニア５０　１１．４２％ＰＫ＋　Ｑ、　Ｑ Ｑ％ Ｒ−ＴＲＡＳＫ　ＰＫ−６０５５００＋７５０　１６．３８％ＰＫ＋　０．６０ ％ ＰＥＧ相の収率が、該蛋白質上に付着したＰＥＧまたは蛋白質それ自身に依存し ている度合を確かめるため、ＰＥＧで改質したＤＮＡ−蛋白質複合体と模擬処理 したＤＮＡ−蛋白質複合体とを比較し、そしてまたプロテイナーゼにで処理した サンプルと、同じ複合体の一定分量から派生する蛋白質を含んでいないＤＮＡと を比較した。蛋白質−ＤＮＡ共有結合複合体（ＳＤＳ／ＫＣＩ沈澱方法によって 調製された主にトポイソメラーゼ結合したＤＮＡ　（引用文献中のＴｔａｓｋ） 　）を、以下に示す活性化したトレシル−ＭＰＥＧ方法でＭＰＥＧに連成させる か、或は達成用緩衝液および未トレシル化ＭＰＥＧで模擬処理した。

この模擬処理の結果、ＰＥＧ相における顕著に低い回収率をもたらした（９６． ３±４．３％の減少した収率、即ち、３回の個々の実験の平均±ＳＥＭ　（ＰＯ ４抽出を１回用いたときの８８．８％から、５回抽出を行ったときの１００％の 範囲）。ＰＥＧ相の分配化に先立って、同じ＜ＰＥＧ修飾したＤＮＡ−蛋白質複 合体の一定分量にプロテイナーゼに処理を受けさせた場合、収率は９９．７±０ ．４％まで減少し、そして全ての蛋白質を除去するためのプロテイナーゼに処理 に続いてフェノールクロロホルム抽出を行った場合、３つの実験全てにおいて、 いかなるＤＮＡもＰＥＧ相中で検出されなかった。

これらの２つの相からのＤＮＡの回収率は変化し、そして方法に関して概略を示 した標準操作を用いた場合、ＰＥＧ相に関して負荷を受けさせたものに関しては 約３８．０±８．１％であり、モしてＰＯ４相に関しては４９．７±８．４％で ある（脱塩カラムおよびエタノール沈澱を用いた）。結果は６個の独立した実験 に対する平均±ＳＥＭであり、そしてこの差異は統計的に有意である（ｐ＜領　 ０１；対になったｔ−試験）。これは、回収されたＤＮＡの量が、負荷を受けた ＤＮＡに関して表されておりそして、同様に取り扱われた対照区（即ち、対照区 を、関係する相（類）に溶解した後、そこから抽出した）に対して表されていな いところのいくつかの用途に関しては、重要である。

この方法を評価するために用いるための、異なる２種類のＤＮＡ−蛋白質複合体 のレベルを上昇させた細胞を調製する目的で、我々は細胞を、ａ）ＶＰ−１６− ２１３（エトポシド）に、モしてｂ）ＤＮＡに対して通常非結合的に結合してい る蛋白質に共有結合的付着を生じさせるＵＶ照射に、暴露した。図５および６は 、ＰＥＧ相のＤＮＡ中の、用量に関係した増分を示す。

全体細胞から成るＶＰ’−１６（１５分間の暴露）を、ＤＮＡに対して複合化し たトポイソメラーゼＩＩの割合を上昇させるため用いた。結果は、未処理の対照 区に対して表した８個の個々の実験に関するＰＥＧ相の収率の平均値±ＳＥＭで ある（図５）。

分画すべき調製中のトポイソメラーゼＴＩに対して複合したＤＮＡの量は、濃度 を徐々に上昇させなからＶＰ１６−２１３に、ＨＬ　６０細胞を暴露することで 変化させた。この薬剤は、それがＤＮＡ　（１１）に対して共有結合的に結合す る段階の酵素を安定化させ、そしてこの反応（結合および解離段階）の終結を防 止する。図１ａは、最大値１０−’ＭのＶＰ１６−２１３で、ＰＥＧ相からのＤ ＮＡ回収に関する用量に関係した増加を示している。相分配化を、以下に示すよ うにして行った（これらの実験では多数回のホスフェート抽出を使用しなかった ）。結果は、８個の独立した実験の平均±ＳＥＭであり、ＶＰ１６−２１３に細 胞を暴露しなかったときに回収されたＤＮＡ量のパーセントとして表す。２／８ 実験において、分画に先立ってサンプルを音波処理した。音波処理したものおよ び６個の音波処理していないサンプルの中の３つの両方において、１０−’Ｍの ＶＰ１６−２１３で増分が検出されたが、それ以外の応答は同様であった。

この方法の非常な鋭敏性は、これが応答に関して不均一であるため、以下に詳し く考察する（用量に対する応答曲線上の肩としてここでは現れ、そして追加的実 験で確かめられた）。

ＤＮＡに対して共有結合的に結合した蛋白質の割合を上昇させるためＵＶ架橋を 用いた。結果は、未処理の対照区に対して示した−３つの独立した実験の平均値 ±ＳＥＭである（図６）。

ＵＶ照射は、蛋白質とＤＮＡとの間の共有結合架橋を誘発することはよく知られ ている。この実施例は、この方法によりＤＮＡに対して非結合的に結合させた蛋 白質の検査のための本方法の適合性に関するものである（更にまた以下の実施例 中で考察する）。

連続して用いたときの、ＤＮＡの改良された回収および分化する細胞と未分化細 胞との間の改良された差別的回収分化する細胞および未分化細胞に関するこの２ つの技術の性能を評価した（表ＩＩ）。この新規な操作を用いたときの収率がＤ ＮＡフラグメントの平均的長さに大きく依存しているため、この方法に関する最 終的な収率は計算できない。５秒間の音波処理を用いたとき、この新規な操作で は、Ｔｔａｓｋ操作よりも高い収率が得られる。より小さいフラグメントの大き さく約２０〜４０倍）にも拘らずこれが生じるところの５秒間音波処理したサン プルは、この新規な方法では、より多（のＤＮＡフラグメントが回収されること を示した。この大きさによる差は、図５中の５秒間音波処理したＤＮＡサンプル （実施例２）と、図９中のＴｔａｓｋ材料のＤＮＡ分子量（実施例６）とを比較 することによって示される。各々のフラグメントは１つ以上のＤＮＡｌ−ポイソ メラーゼＩＩ開裂部位を表すため、この方法はそれらの部位に関してより有効で ある。

表Ｉ　Ｉ　：　ＳＤＳ／ＫＣＬ沈澱方法とこの新規な方法との比較細胞予備処理 　本操作＊　Ｔｔａｓｋ方法（ＨＬ６０細胞）　（ｎ）　（ｎ） 収率、負荷を受けさせたＤＮＡに対する％５秒間の音波処理 レチン酸　６．０±３．０　２．６１±０．５２なし　６．４±１．６　２．３ ７±０．４８＊５秒間の音波処理および繰り返しが４回のホスフェート抽出（音 波処理によって誘発されたより小さいＤＮＡフラグメントの大きさを補うため一 方法を参照）。

分化の誘発中のＤＮＡ／）ボイソメラーゼＩＩ会合に関する独立した実験的証拠 が存在しているが、単独で用いた技術のどれも、誘発された細胞および未誘発の 細胞から回収されたＤＮＡの量に関して重要な差異を示さなかった（表ＩＩ）。

これは驚（べきことではない、何故ならば、誘発された分化において生じる細胞 当たりのＤＮＡ分解（または分解集合体）の数の定量値は低く、即ち、おそらく は細胞当たり５ｏのみであるため、そして５秒間の音波処理を用いたときの形態 的フラグメントの長さが小さいことによるためであり、これはゲノムの小さい比 率を表している。

Ｔｒａｓｋ他が別のところで指摘したところの、ＤＮＡ／トポイソメラーゼＩｌ 複合体の製造のためのＳＤＳ／ＫＣＩ沈澱方法に関して、我々は、理論的保留を 記述した。彼の方法は、数多くのトポイソメラーゼ分子がＤＮＡの単一ストラン ドに付着している部位に対してのみ有効である。

このことは、部分的に、ここで観察された差異を説明し得る。

複製フォークにおけるトポイソメラーゼ開裂部位および分化に関連した分解部位 の分布に関して可能な差異が得られれば、この新規な方法は、これが、単一トポ イソメラーゼ分子が何着しているＤＮＡを分配できるため、分化部位ＤＮＡの製 造のために有利であり得ることを特記する。

このことは、勿論、分化に関連したトポイソメラーゼ開裂部位のための２段階の 分画操作を生じさせるために、連続して、この新規な技術とＴｒａｓｋ操作とを 一緒に使用することができないことを意味するものではない、何故ならば、沈澱 の効率は低いが、１個もしくは数個のトポイソメラーゼ分子を有する分化部位は 上澄み液中よりはむしろ沈澱物中により少なく表れる傾向にないためである。

上に概略を示したように、この新規な方法を用いたときの向上した収率（これは 、単一トポイソメラーゼ分子と会合したＤＮＡのより有効な回収を反映している ）は、蛋白質の非常に少ない分子がＤＮＡに付着している用途においてこの方法 が使用できることを暗示している（例えば、単離されたＤＮＡの調節配列が単一 トポイソメラーゼＩＩ開裂部位もしくは２−５個の部位から成る小さい集合体を 含むことは知られている）。

以下に示す２つの実施例は、この新規な方法により上記部位の検出が改良される とするこの考えを立証するものである。

１）ＤＮＡの非常に小さい分子に関して親和力分配化が達成された実験（約１． ２Ｏ−４００ｂｐ）。以前に出版されたＤＮアーゼ保護分析は、消化が酵素の存 在下で行われる場合、１４０ｂｐのフラグメントが各々の独立したトポイソメラ ーゼＩＩ開裂部位で保護されることを示しているため、この大きさの範囲のフラ グメントは、単一酵素分子に付着しているいくつかを含んでいる必要がある（以 下を参照）。

２）分化に特異な蛋白質ＤＮＡ複合体を豊富にするこの方法の能力（以下を参照 ）。

我々はまた、連続した２つの方法を用いて試験を行った（表ＩＩＩ）。

ここでは、逆に、９つの実験（６０秒の音波処理、或は追加的ＤＮアーゼ処理を 用いた６０秒の音波処理を使用）において、出発材料がＳＤＳ／ＤＣＩ沈澱させ た（”Ｔｒａｓｋ”）ＤＮＡである場合、レチン酸で処理した細胞から回収され るＰＥＧ相のＤＮＡの比率が著しく上昇する。分化する細胞からのＴｒａｓｋ材 料から得られるこの上昇したＤＮＡの回収は、相分間に関して選択されたフラグ メントの大きさに依存している、何故ならば、これは、小さいフラグメントに関 して観察されたが（例えば、追加的ＤＮアーゼ消化の有無に拘らず、６０秒間の 音波処理で）、シかし２０秒間の音波処理を用いた場合観察されなかった。音波 処理なしの場合、実際上全てのＴｒａｓｋ材料（これは、せん断を避けながら製 造した場合、主に、２０Ｋｂｐ以上のフラグメントを有している）は、ＰＥＧ相 に送り、そして差別的回収を不可能にする。

表ＩＩＩ 細胞予備処理 （ＲＬ６０細胞） 収率、全ゲノム状ＤＮＡに対する％　収率ＴｒａｓｋのＤＮＡに対する％レチン 酸ＡＣＩＤ　Ｏ，０２７±０．０１５　０．４０＋０．１４　１．．４６±０． ３３　１１．７９±２，３４なし　０．０２０±０．００８　０．５８＋０．２ ８　０．５２±０．１７　１６．０９±６．２０ｐ（対のｔ−試験）　０．０２ ９ Ｎ、　Ｓ、　Ｎ、　Ｓ、　有意　Ｎ、　Ｓ。

＊３つの実験において追加的ＤＮアーゼ消化を用いた。

差別的回収は、次のようない（つかの可能性を示唆している：未分化細胞に対す る、分化からのＳＤＳ／ＫＣＬ沈澱物中に遊離させる蛋白質結合ＤＮＡの比率の 上昇（分化におけるＤＮＡ　ｌ−ボイソメラーゼＩｌの公知の作用を基にして予 測された）、シかしながら、我々は次のことを排除できない：ＰＥＧ修飾のため にそれらが近づき得るリシル残基に対して結合している蛋白質の種類の定性的変 化；或はＳＤＳ／ＫＣＬ沈澱物のＤＮＡフラグメントの平均的大きさの減少（よ り長いフラグメントを用いた場合、ホスフェート相への親和力に打ち勝つことが より困難になるため）。この後者の仮定はありそうにない、何故ならば、ＳＯ８ ，／ＫＣＬ沈澱物の高分解能電気泳動を行った訳ではないが、２０Ｋｂｐ未満の これらのフラグメントの際だった減少は、分化させた細胞中に生じそうにないた めである。

この出発（全体がゲノム状の）材料に対して結果が表される場合、回収が著しく 上昇することなしにＳＤＳ／ＫＣＬ沈澱物からの回収が上昇することに関して、 必ずしも、他の（非分化に関係した）蛋白質／ＤＮＡ共有結合相互作用が誘発中 に失われ得ることを示すものではない。この２回目の回収は、非常に小さい分画 のみの中間的回収であり、そしてＳ　ＯＳ　／　Ｋ　ＣＬ回収を全体のゲノム状 ＤＮＡに関係させることに関する誤差は、いかなる増分も容易に覆ってしまうで あろう。

実施例４ ＤＮＡの長さを減少させるための音波処理の使用および蛋白質に対して最も密に 会合しているＤＮＡの改良された富裕化および単一蛋白質結合部位を有する複合 体の回収 ＤＮＡをフラグメント化するための音波処理および他の方法は、この方法に対し て２つの影響を有している。対抗する力が、ＤＮＡ−蛋白質複合体上に働く。単 一分子に付着しているＤＮＡが充分に長い場合、それは、ホスフェート相への親 和力を通して、その相の中に該複合体を保持させ得る。ＤＮＡを短くすると、こ れが生じる可能性を小さくする。

このＤＮＡを短くするための２番目の動機は、望まれるとき、ＤＮＡに隣接した 蛋白質結合部位で、はとんど汚染なしにＤＮＡを回収することにある。

１）ＤＮＡを含んでいない蛋白質の分配係数に対する音波処理の効果上に概略を 示した理由のため、音波処理は時々、蛋白質に付着したＤＮＡの平均的長さを短 くするために用いられる。しかしながら、ＤＮＡの長さを短くすると分配係数を 変化させ、そのためＤＮＡがホスフェート相に残存する傾向を減じそしてこの２ つの相の間でより等しい分配をもたらすことは知られている。音波処理によって 達成されるところの、ＰＥＧ相中の蛋白質結合ＤＮＡの改良された富裕化（ＤＮ Ａ−蛋白質結合部位に関する富裕化）は、従って、ある程度この変化によって妨 げられる、何故ならば、音波処理を増大させると、追加的な、蛋白質を含んでい ないＤＮＡがＰＥＧ相に分配されるからである（図２および３）。

ＰＥＧ相に対して非常に高い親和力を有するＰＥＧ／蛋白質／ＤＮＡ複合体とは 異なり、ＰＥＧ相の蛋白質を含んでいないＤＮＡは、新鮮なホスフェート相を用 いた追加的繰り返し回数の分配化、或は対向流分配（即ち、複数の相分配装直中 のクロマトグラフィー分離）によって抽出され得る。実施例１に記述されている 実験および図４は、音波処理後のＰＥＧ相のＤＮＡの除去における、ホスフェー ト相を用いた追加的繰り返し回数の抽出の効果を明らかに示している。

２）ＤＮＡ蛋白質複合体のＤＮＡの長さを短くするとＰＥＧ相からのＤＮＡの回 収率が低下する 音波処理は、ＤＮＡ／蛋白質調合物中のＤＮＡの平均長を減少させ、そしてそれ に伴って、ＰＥＧ相へのＤＮＡの分配を減少させる。方法に関するプロトコルお よび５秒間の音波処理を用いると、未音波処理の、蛋白質が結合したＤＮＡに関 する平行した実験（４つの異なる種類のサンプル、即ち薬剤処理および対照区を 用いた）における値の３２±１７％にまで、ＰＥＧ相のＤＮＡが減少した。

この方法のこのような修正は、ＤＮＡの一部と結合している単一の単離された蛋 白質分子のみが存在している複合体の検出を達成するためは重要であり得る。こ れはまた、潜在的に、蛋白質結合部位でのＤＮＡのクローン化のための方法への 適用に有益である、何故ならば、音波処理によって隣接するＤＮＡが除去される からである。

図７は、小さいＰＥＧ／蛋白質／ＤＮＡ複合体の親和力分配に関する実施例を示 している。ＤＮＡをフラグメント化するため、ＤＮＡ／蛋白質複合体を６０秒間 音波処理した。ＤＮアーゼ保護の定量において、トポイソメラーゼＴＩが、約１ ４０個の塩基対から成るＤＮＡフラグメントを保護することは知られている。従 って、この大きさのフラグメントは、該ＤＮＡに付着した酵素の単一分子以上を 有していそうもない。

この実験は、分配後のＰＥＧ相から小さいフラグメント（主に５６４と１２５ｂ ｐの分子量マーカーの間）が回収されることを示している。

これらのフラグメントは、単に、ホスフェート相中に残存している小さいＤＮＡ 分子が減少する傾向（この問題は上述した）にあるためではないことが、達成段 階（ＰＥＧを蛋白質／ＤＮＡ複合体に連成させる）前にプロテイナーゼＫを用い て処理した対照区のサンプルによって明らかに示されている。

この予測された非常に小さいＤＮＡフラグメントの大きさのため、追加的繰り返 し回数のホスフェート抽出を行うばかりでなく、この２つの相の容積比を、ＰＥ Ｇ：　ＰＯ４が２５０　：　７５０ｕｌになるように変更した（７５０ｍＬのＰ Ｏ，から成る３回の変化を用いた）。

この実験は、分化に特異なトポイソメラーゼｌｌＤＮＡ複合体（これらのいくつ かが、相対的に、ゲノム中で単離されることは知られている）の検出がこの新規 な方法で改良されるべきであるとの主張に関係している（以下の実施例７を参照 ）。

実施例６ ＤＮＡの長さを減少させるためのヌクレアーゼ類の使用および蛋白質に対して最 も密に会合しているＤＮＡの改良された富裕化および単一蛋白質結合部位を有す る複合体の回収 我々はまた、ＤＮＡ／蛋白質複合体のＤＮＡの大きさを小さくするためにヌクレ アーゼ類（例えば、ＤＮアーゼおよび制限エンドヌクレアーゼ）が使用できるこ とを確かめた。方法に関して記述されているプロトコルを用いたＴｒａｓｋ方法 で製造されたＤＮＡ蛋白質複合体のＤＮアーゼ消化によって、１０〜２０分後、 ６０秒間の音波処理に匹敵するフラグメントが得られる（図８）。同様な製造に おいて、この蛋白質は、消化（図８中の挿入図）から、ＤＮＡの低分子量の帯を 「保護している」：レーン１および２＝ＤＮアーゼなし：レーン４〜６＝プロテ イナーゼに後の１．５．１０分間のＤＮアーゼ消化（このＤＮＡは保護されてお らず、そして大部分消化されている）；レー：／　７−　ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｅｃ ｏＲＩ　Ｄ　Ｎ　Ａ：レーン８〜１０＝蛋白！／ＤＮＡ複合体の１．５．１０　 分間（Ｄ　Ｄ　Ｎ　７−ゼ消化（約１３０ｂｐの低分子量帯のＤＮＡは保護され ている）。従って、この方法はまた、トレシル化段階（図９）の前か、或は次の 分配またはＤＮＡクローン化の前の最初の分配化（図１０）後の分配化に対して 、ＤＮＡの大きさを減少させるために用いられ得る。図９中の蛋白質にで消化さ せた対照区は、この回収された低分子量のＤＮＡが親和力による分配化の結果で あることを、明らかに示している、何故ならば、プロテイナーゼＫによる消化に よって、ＤＮＡからＰＥＧ蛋白質を最初に除去した場合、なにも回収されないか らである。

この付着した蛋白質が、ＤＮアーゼによる消化から、この付着ＤＮＡを「保護し ている」ため、この方法は、上記フラグメントが豊富なサンプルを製造するため に用いられ得る。これは、ＤＮアーゼ保護法則を用いたＤＮＡ蛋白質結合部位の 分析における用途を有している。

ＤＮＡ／蛋白質複合体の６０秒間の音波処理で製造される小さいフラグメントの 大きさを基にして予測され得るように、ＤＮアーゼＩ後の追加的分配化段階では 、ＰＥＧ相からのＤＮＡの収率の適度な減少を生じさせたのみであった。結果は 、レチン酸で誘発されたＨＬ６０細胞および未誘発からのＴｒａｓｋ製造から得 られる収率を示しており、そしてこれは、音波処理のみを用いた５つの実験に関 する平均値±ＳＥＭに対する、ＤＮアーゼと６０秒間の音波処理との両方を用い た３つの実験に関する平均値±ＳＥＭである。

音波処理のみを用いた４つの実験に対して、ＤＮアーゼと６０秒間の音波処理と の両方を用いた３つの実験を比較したときの、Ｔｔａｓｋ製造からのＰＥＧ相の 収率を図１０に示す。レチン酸で誘発させたＨＬ６０細胞および未誘発の両方か らの材料を用いたとき、適度な収率の減少が見られる。

実施例７ 分化に特異なりＮＡ蛋白質複合体を豊富にするための本方法の使用ａ）分化細胞 からのＳＤＳ／ＫＣＬ沈澱物から得られる定量的に異なる量のＤＮＡ回収に関す る実証 我々は、以前の研究から、分化の誘発直後、ＤＮＡトボイソメラーゼ１１がＤＮ Ａの切断−再結合反応を行うのをレチ：／酸が誘発することを知っている。これ は、いくつかの方法（例えば、ヌクレオイド沈降、アルカリ性フィルター溶離技 術および蛍光アルカリ性ＤＮＡ巻戻し−ＦＡＤＵ−技術）で実証でき、そしてＤ ＮＡトポイソメラーゼＩｌインヒビター（１３）によって抑制される。しかしな がら、これらの方法のいずれも、これらの複合体の精製には不適切である。上述 したようなＴｔａｓｋ操作は、理論的基礎において、単離されたＤＮＡ付着蛋白 質分子には不充分であると考えられる。これはまた、実際上、レチン酸で処理し た細胞からのＤＮＡ／蛋白質複合体の回収量は、対照区からの量よりも多（はな い（上の実施例３を参照）。従って、Ｔｔａｓｋ技術が、他の複合体に対してこ の種類のＤＮＡ／蛋白質複合体を有意に富裕化するとは考えられない（この技術 は、ＤＮＡ複製フォークからのＤＮＡ／）ボイソメラーゼＩｌ複合体を高度に富 裕化することは知られている）。

この新規な技術が、充分な量のレチン酸誘発複合体を、検出されるべきそれらの 存在に対して富裕化および／または回収できるか否かを検査するため、我々は上 述した２つの「短いフラグメント」の修飾（ＤＮアーゼ処理後、６０秒間の音波 処理か、或は音波処理プラス追加的回数の分配）を用いた。各々の場合の出発材 料は、Ｔｔａｓｋ方法で沈澱させたＤＮＡ／蛋白質複合体製造物であった。

図８に示されるように、７／９実験において、より高い割合の出発材料がレチン 酸処理材料から回収された。この差は、統計的に有意である（ｐ＝０゜０２９； 対のｔ−試験）。

分化するＨ　１．６０細胞および未分化ＨＬ　６０細胞から製造されたときのＴ ｒａｓｋ材料からの差別的収量は図１１に示されている。

ｂ）分化に関連した蛋白質への付着を有する特定のＤＮＡ配列がこの操作によっ て富裕化されることの実証 分化が、特定なりＮＡ配列を必要とするか否かを試験するため、我々は、ＲＡ誘 発で分化する細胞からの高度に精製されたＴｏｐｏＩＴ会合ＤＮＡを生じさせ、 標識し、そしてこのＤＮＡを雑種形成させて、未分化ＨＬ６０細胞、およびＲＡ またはホルボールエステルで誘発させて分化させた細胞の両方からの、Ｔｏｐｏ ｌＩが結合したＤＮＡが豊富なりＮＡ、或はそれが少ないＤＮＡを生じさせた。

差別的雑種形成は、単離されたＤＮＡが特定の配列に対して富裕化されることを 明らかに示した。差別的雑種形成はまた、ミックおよびフォスプローブを用いて も見られ、これは、ＴｏｐｏＩＩ開裂がこれらの遺伝子の近くで生じることを示 唆している。

即ち、これは、我々が知る限りでは、分化の誘発中、ゲノム中の特定の（或は制 限された）部位でＴｏｐｏｌｌが相互作用を行うことを示した最初の実証である 。トポイソメラーゼＩＩをＶＰ−１６（エトポシド）により共有結合複合体段階 で停止させたとき、増大した回収が見られるが、この薬剤は、開裂部位の特異性 に影響を与えることが知られているため、次の実験には用いないことを書き加え るは重要である。

対抗する力が相分配糸中で働べため（より長いＤＮＡフラグメントは、親和力に よる分配に対抗する）、開裂部位ＤＮＡの回収に関する理論的な最大効率が、可 能な最短フラグメントを用いたとき生じる。この末端に対して、我々は、はみ出 ているＤＮＡを除去するためＤＮアーゼ消化を用いた（トポイソメラーゼは、そ れらが働くとき約１４０ｂｐのＤＮＡを保護することが知られている）。この詳 細な実験は、分化に特異な分解部位の回収のために特に重要である、何故ならば 、これは、汚染する反復配列の存在を減少させるからである。

１．２および５分間、Ｔｒａｓｋ方法で製造したＤＮＡ／Ｔｏｐｏｌ　Ｉ複合体 のＤＮアーゼ消化によって、明らかに、ＤＮＡの明らかな保護帯が示され、この 材料が親和力分配され得ることが示された（上の実施例を参照）。

我々は、親和力分配（Ｔｔａｓｋ方法とは異なり）によって、単一トポイソメラ ーゼ分子に付着したＤＮＡを回収できることを実証したことにより、この新規な 方法は、分化開裂部位からの高度に富裕化したＤＮＡの製造に関して理論的な利 点を有する（一方、Ｔｒａｓｋ技術は、複製フォークＤＮＡに対して最も有効で ある）。

該ＴｏｐｏＩＩ開裂部位がゲノム中の特定部位に存在しているか否かを試験する ため、我々は、次の４つの異なるＤＮＡサンプルを製造した。

１）　分化細胞からのＴｏｐｏ会合ＤＮＡ２）　未分化細胞からのＴｏｐｏ会合 ＤＮＡ３）　分化細胞からの、Ｔｏｐｏ開裂部位の少ないＤＮＡ４）　未分化細 胞からの、Ｔｏｐｏ開裂部位の少ないＤＮＡ０分化させた細胞からの、ＤＮアー ゼ保護されたＴｏｐｏ会合ＤＮＡに対するドツトプロット雑種形成を用いたとき の、雑種形成の予測されるパターン（分化中、特定ＤＮＡ配列が、トポイソメラ ーゼまたは他の蛋白質と会合し始め、従って、この方法で回収される場合）は以 下の通りである： １）　＋＋＋（未分化の対照区に対して豊富）２）　＋＋ ３）　十（未分化の対照区に対して少ない）４）　＋＋。

差別的雑種形成は、特定の配列が、レチン酸誘発顆粒球分化中に蛋白質結合して くることを示している（図１２）。

フィルターＤＮＡが、ホルボールエステルで誘発された細胞から製造されるとき もまた、差別的雑種形成が観察される（図１３）。従って、少な（ともある部位 が、単球分化と顆粒球分化との間で共有される。この結果は、この方法で回収さ れたＤＮＡ配列が、分化の発生を１つの特定細胞血統および誘発因子系中に限定 するよりも幅広い適用性を有していることを示している。

Ｃ）差別的雑種形成が再現可能であることの実証図１４は、個々に調製されたフ ィルターおよびプローブサンプル（２つのプローブおよび６つのフィルターサン プル）を用いて、同様の差別的雑種形成が達成されることを示している。ＰＭＡ 雑種形成もまた、再現性のある差別的雑種形成を示した。１０／１０雑種形成に おいて、図１４に示したように、Ｒ−のＤＮＡよりもＲ＋のＤＮＡからのシグナ ルがより強いことが示された。

ｄ）造血細胞の分化中の発現における公知の変化を有する遺伝子がこの方法で分 画されることの実証（そして、これが、トポイソメラーゼ会合を受ける遺伝子中 もしくはその回りの配列によることの実証）ミックおよびフォスプローブでフィ ルターを試験するとき、この差別的雑種形成がまた観察される。造血細胞の分化 （Ｃ−・ミックおよびＣ−フォス）中、発現が調節されることが知られている２ つの遺伝子を富裕化させることに成功したことにより、この新規な技術が、本質 的に未知の分化遺伝子を研究するための方策を与えることが示唆された。分解部 位のＤＮＡが、現在、「分化遺伝子」および推定上の調節部位を同定する目的で クローン化されている。

これらの発見は、誘発された顆粒球分化中、分化に関連したＴｏｐｏＩＩ開裂反 応（および／または他のＤＮＡ蛋白質結合の発生）が、ミックおよびフォス遺伝 子中もしくはその近くで生じることを示唆している。ノボビオシンを加えたとき のミックに関しては差別的雑種形成が失われるため（図１６参照）、他のＤＮＡ 蛋白質結合の発生は有りそうにない。

図１６の走査濃度計追跡は、Ｒ子細胞をノボビオシン（ＴｏｐｏＩ　Ｉのインヒ ビター）で再び処理したときＲ＋およびＲ−のＤＮＡによるミックプローブに対 する差別的雑種形成が失われることを示している：各々線Ａ、ＢおよびＣ０ 分化細胞からのＤＮＡと未分化細胞との間で観察される差別的雑種形成は、ノボ ビオシン、即ちＴｏｐｏｌｌの公知のインヒビターによって阻止された。このこ とは、この酵素への共有結合付着が、必ずしも全ての回収されたＤＮＡの原因で あるとは限らないが、差別的雑種形成に影響を与えるＤＮＡの回収の原因となっ ていたことを示唆している。

分化細胞および未分化細胞から回収されたＤＮＡ量の定量分析は、差別的雑種形 成の原因となっているＤＮＡが特にノボビオシンの抑制作用に対して敏感である ことを示唆している（図１７および１８）。

ノボビオシンは”　Ｔｒａｓｋ″ＤＮＡの回収の穏当な減少を誘発させるが、図 １．７に示されるように、分化細胞に関してのみである。

ノボビオシンは、−緒にしたＴｒａｓｋ／新規操作によって回収されたＤＮＡの 量の有意な減少を生じさせなかった、即ちレチン酸で誘発された細胞中でも生じ な（、そして図１８に示されるように未分化細胞中にも生じなかった。

ｅ）ＤＮＡに隣接する安定発現した（分化未調節）遺伝子がこの方法では富裕化 されないことの実証 チューブリン遺伝子プローブ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ） を用いて、ミックおよびフォスに関するものに対する同様な雑種形成実験を行っ た。

図１９および２０は、レチン酸でも、そしてフォルボールエステルでも誘発され ていない細胞を用いると、ＰＥＧ相で回収された蛋白質会合ＤＮＡを有するチュ ーブリンプローブに対する分化雑種形成が存在することを示している。

この遺伝子プローブがチューブリンであるときの、Ｒ十およびＲ−のＤＮＡを用 いての差別的雑種形成の不足（ミックおよびフォスに対して用いたのと同様な条 件下）が、図１９に示されている。

この遺伝子プローブがチューブリンであるときの、ＲＭＡ十およびＲＭＡ−のＤ ＮＡを用いての差別的雑種形成の不足（ミックおよびフォスに対して用いたのと 同様な条件下）が、図２０に示されている。

実施例８ クローン化のためのＤＮＡ製造のための本方法の使用、並びにある種のクローン が分化に関連したトポイソメラーゼ開裂部位ＤＮＡに対して差この方法の１つの 使用が、クローン化のための特定ＤＮＡ配列を製造することにあるため、我々は 、クローン操作のために適切なりＮＡを本方法が生じさせることを示すため、レ チン酸誘発ＤＮＡ／蛋白質複合体（音波処理またはＤＮアーゼ消化のどちらかを 用いて上述したように製造）からのＤＮＡをクローン化させた。

２つの異なるクローン化技術を評価したが、本質的にいかなる標準技術も使用さ れ得る。

Ａ）ホモポリマーテーリング技術を、該調製ＤＮＡフラグメントをｄＣＴＰ末端 につないだプラスミド（ｐＵＣ８）中に導入するために用いた。この方法を選択 したのは、トポイソメラーゼ開裂部位、せん断された末端または制限部位に関す るいかなる特徴ある取り扱い方も含まれていないからである（我々は、交互に配 列したトポイソメラーゼ開裂部位の有無に拘らず、フラグメントの加工効率の差 異を避けたかった）。形質転換に続いてＤ　Ｈ５大腸菌中でのプラスミドの成育 およびそこからの回収の結果、組み換え型プラスミドが生産されることが示され た。しか〜しながら、この方法の効率は比較的低かった。

ＤＮＡ挿入物がＥｃｏＲ１／Ｈｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ消化によって切断されたプラ スミドのアガロースゲル電気泳動の走査光学密度計測を図２１に示す。

Ｂ）２番目の方策は、フレノウポリイソメラーゼを用いたトポイソメラーゼ開裂 反応により、生じた突き出し物を取り除くこと、そしてＳａＩ　Ｉリンカ−を付 着させることである。ＥｃｏＲｌおよびＳａｌ　Ｉを用いた消化後、ＤＮＡをｐ Ｕｃ、１８に結合させ、同様に消化させた後、大腸菌ＤＨ５細胞に形質転換させ た。

分化の誘発中トポイソメラーゼと優先的に会合するＤＮＡ配列を表すＤＮＡ挿入 物を測定するため、Ｒ＋Ｒ−および全体のゲノム状プローブに対する差別的雑種 形成（即ち、上で用いたのと同様な方策を用いて）のために、クローンをふるい 分けした。図２２および２３中に示される最初の２９８個のクローンに関する２ ３のサンプルが得られた。

クローンからの測定された量のＤＮＡに対する３回の雑種形成に関する、組み合 わせた雑種形成シグナル（ｍｍ２当たりの吸光度）は、図２２に示されており、 Ｒ十およびＲ−のプローブは上の差別的雑種形成実験に関するものであり、ＷＧ は標識された全体のゲノム状（未分画）ＨＴ、６０細胞ＤＮＡであった。

図２２に与えられている３回の雑種形成に関する雑種形成シグナル（ｍｍ２当た りの吸光度）は、図２３中の組み合せた雑種形成シグナルの比率として表されて いる。

これらの結果は明らかに、この材料をクローン化できるばかりでなく、ある割合 の得られるクローンが、誘発分化の結果として、会合した蛋白質になるところの 特定のＤＮＡ配列を有していることも示している。影響を受けた遺伝子の近くで それが作用することを要求しているメカニズムによって、トポイソメラーゼが遺 伝子の発現を調節しているため、これらのＤＮＡフラグメントは、トポイソメラ ーゼＩＩによって調節された分化遺伝子中もしくはその近くに存在している。

実施例２中の上の用量応答曲線によって示されるように、この方法は、誘発され るか、或は異なる種類のトポイソメラーゼＩＩインヒビターによって抑制された ＤＮＡに対するトポイソメラーゼの複合化を定量するため用いることができる。

この方法はＶＰ−１６の検出に対して非常に敏感であり、これは、ＩＱ−９Ｍの ＶＰ１６で、ＰＥＧ相のＤＮＡに関する３２６±１００．２５％の増加を検出す る（未分化もしくは分化誘発されたＨＬ６０のどちらかを用いた１０回の実験の 平均値±ＳＥＭ）。増分（最大９５０％）が７／１０実験で検出された。１０− ”ＶＰ１６−２１．３での大部分のサンプル中のＰＥＧ相ＤＮＡの増分を図２４ に示す。未誘発の細胞を１５分間ＶＰ１６に暴露した。誘発された細胞を７０分 間レチン酸（１０−’Ｍ）に暴露すると同時に、ＶＰ１６にも暴露した。上の実 施例２で述べたように、音波処理は、増分を示すサンプルの比率に対して影響を 与え、従って本方法のこのおよび他の面は、いかなる個々の系に対しても、最も 鋭敏な定量方法を与えるために有効に活用される必要があり得る。

この結果は、通常１０−７〜１０−’Ｍの範囲でのみＶＰ１６を検出する他の定 量方法よりも、この新規な方法は、インヒビターの作用に対して更に一層敏感で あり得ることを示している。

この鋭敏性は、エピポドフィロトキシン（ｅｐｉｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉ ｎ）型のトポイソメラーゼＩＩインヒビターに限定されるものではなく、そして 同様な結果が挿入物を用いても得られる。

ＰＥＧ相の収率に対するｍ−ＡＭＳＡ、即ち挿入物の効果は図２５に示されてい る。不活性な類似物のｏ−ＡＭＳＡ（これは、トポイソメラーゼＩＩを有意には 抑制しない）が相分配化の結果に影響を与えるため、収率は、ｏ−ＡＭＳＡ対照 区に対して修正を行う必要があった。

７０分間のレチン酸による細胞の誘発、そして付随するｖｐ１６への暴露（示さ れた投薬量での後者）を行った後、ＰＥＧ相の収率の増大は明らかに二相性であ る。図２４および２５の結果は２つの独立した実験を示している。予備的データ のみであるが、同様な「肩」効果が刺激されていない細胞中に見られる。この観 察は、ＶＰ−１６がＬＯ−９Ｍで分化を抑制するが、一方これは１０−７Ｍまた はそれ以上のみで増殖を抑制するところの、細胞系中の観察に関連づけることが でき、これは、この２つの方法に必要な酵素の機能的な均質性を示している。

従って、この方法は、インヒビターに対して固有のもしくは与えられた異なる感 受性を有するトポイソメラーゼを区別するための方法を提供する。

レチン酸処理後のＰＥＧ相の収率に対するＶＰ−１６の効果を図２６架橋段階を 用いる場合、理論的に、それ自身がＤＮＡに対して通常共有結合的に結合してい ない蛋白質の会合／解離における変化は、この方法によって評価され得る。我々 は、以前に、造血細胞分化に関するレチン酸誘発中、ＤＮＡと会合した蛋白質の 量が上昇することを確立した。

この新規な技術がこれを検出できるか否かを示すため、細胞を、示した期間レチ ン酸に暴露した後、蛋白質をＤＮＡに架橋させるためＵＶ照射を受けさせた。架 橋は確立的な工程であるが、ＤＮＡに対する蛋白質の架橋の増加中に、蛋白質の 正味の会合が増加することが示されるべきである。ＨＬ６０は、周知のごとく、 応力に対して、そして衝撃で誘発された分化に対して敏感であるため、模擬処理 （取り扱い）された対照区を用い、そして各々の時点に関する結果は、これらの 対照区との関係で表した。

図２７に示されるように、レチノイド類に対して７０分間暴露したとき、ＰＥＧ 相の蛋白質会合ＤＮＡのピークの有意な増大が存在している。

同様な増分がＵＶ架橋段階なしでは観察されなかったため（７０分間のレチン酸 処理後のＰＥＧ相ＤＮＡの有意な差異が存在していないところの、上記表ＩＩを 参照）、この増大は、非共有結合的に結合している蛋白質の架橋によるものと結 論づけ、これは、標準条件下でのＰＥＧ相の収率に対して有意には貢献しない。

出典 １　）　ｆａｌｔｅｒ　Ｈ，Ｂｒｏｏｋｓ　ＤＥ、　＆　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｄ、　 （編集）「バイオテクノロジーにおける水系の二相系の分配、理論、方法、使用 および応用」”Ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ　ｉｎ　ａｑｕｅｏｕｓ　ｔｗｏ−ｐ ｈａｓｅ　ｓｙｓｔｅｍｓ、　ｔｈｅｏｒｙ、　ｍｅｔｈｏｄｓ、　ｕｓｅｓ　 ａｎｄ　■ ｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＋＾ｃａｄｅｍｉ ｃ　Ｐｒｅｓｓ、　０ｒｌａｎｄｏ　１９８５゜２）＾１ｂｅｒｔｓｏｎ　Ｐ− ＾、「細胞粒子および巨大分子の分配Ｊ　”　Ｐａｒｔｉｔｉｏｎ　。

ｆ　ｃｅｌｌ　ｐａｒｔｉｃｌｅｓ　ａｎｄ　ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ” 第３版、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　ｓｏｎ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８６゜ ３）「細胞生物学およびバイオ技術における水相使用分離の進展」”＾ｄｖａｎ ｃｅｓ　ｉｎ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎｓ　ｕｓｉｎｇ　ａｑｕｅｏｕｓ　ｐｈａ ｓｅｓ　ｉｎ　ｃｅｌｌ　ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　■ ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｄ、および５ｕｔｈｅｒｌａｎｄ 　Ｉ＾９編集、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ　１９８８印刷（「相分配に関する第 ５回国際会議の会報」”Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆｔｈｅ　５ｔｈ　Ｉｎｔ ｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｐｈａｓｅ　Ｐａｒｔｉ ｔｉｏｎｉｎｇ−，０ｘｆｏｒｄ、　１９８７年８月）中のＤｅｌｇａｒｄｏ　 Ｃ１Ｆｒａｎｃｉｓ　ＧＥＳＦｉｓｈｅｒ　Ｄ、著「トレシルクロライドを用い た活性化による蛋白質へのＰＥＧの達成。免疫親和力細胞分配における用途Ｊ　 ”　Ｃｏｕｐｌｉｎｇ　ｏｆ　ＰＥＧ　ｔｏ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｂｙ　ａｃｔ ｉｖａｔｉ。

ｎ　ｗｉｔｈ　ｔｒｅｓｙｌ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ、　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ 　ｊ、ｎ　ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ　ｃｅｌｌ　ｐａ窒■ ｊｔｉｎｎｉｎｇ″ ４　）　Ｊｏｒｄａｎ　ＣＦ、　Ｌｅｒｍａｎ　ＬＳ、　Ｖｅｎａｂｌｅ　ＪＴ Ｉ著「濃縮ポリマー溶液中のＤＮＡの構造および循環ジクロイズムＪ　”　５ｔ ｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｃｉｒｃｕｌａｒ　Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ　ｏｆ　ＤＮ Ａ　ｉｎ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ　ｐｏｌｙｍｅｒ　５ｏｌｕｔｉｏｎｓ” 　Ｎａｔｕｒｅ　Ｎｅｗ　ｂｉｏｌｏ■ ｙ　２３６：６７−７０＋　１９７２゜５）　Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ、Ｖｅｎａ ｂｌｅ　ＪＨＳＬｅｒｏ＋ａｎ　ＬＳ著「ｐｓｉ−ＤＮＡの構造ｊ”　Ｔｈｅ　 ５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｐｓｉ−ＤＮＡ−Ｊ、　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ、　８４ ：３７−６４；１９７４゜（３）　Ｚｖｅｌｌｉｎｇ　ＬＡ、　Ｍｉｃｈａｅｌ ｓ　Ｓ、Ｅｒ１ｃｋｓｏｎ　ＬＣ，Ｕｎｇｅｒｌｅｉｄｅｒ　Ｒ３，Ｎ１ｃｈｏ ｌｓ　Ｍ、　Ｋｏｈｎ　ＫＭ著［デオキシリポ核酸挿入剤類４’　−（９−アク リジニルアミノ）メタンスルホン−ｍ−アニシドおよびアドリミシンで処理した Ｌ１２１０細胞中の蛋白質会合デオキシリポ核酸ストランド分解」”Ｐｒｏｔｅ ｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　 ５ｔｒａｎｄ　ｂｒｅａｋｓ　ｉｎ　Ｌ１２１０ｃｅｌｌｓ　ｔｒｅａｔｅｄ　 ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｄｅｏｘｙｒｊｂｏｎｕｃｌｅｉ　ａｃｉｄ　ｊｎｔｅｒｃ ａｌａｔｉｎｇ　ａｇｅｎｔ■ ４’　（９−ａｃｒｉｄｉｎｙｌａｍｉｎｏ）ｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｐｈｏｎ− ｍ−ａｎｉｓｉｄｅ　ａｎｄ　ａｄｒｉｍｙｃｉｎ″Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 　２０：６５５３−６５６３．１９８゜７　）　ＴｒＢｓｋＤＮＳ［１ｉＤＯｎ ａｔｏ　ＪＡ、、Ｍｕｌｌｅｒ　ＭＴ著「共有結合ＤＮＡ／蛋白質複合体の迅速 検出および単離：トポイソメラーゼＩおよびＩＩへの適用」”　Ｒａｐｉｄ　ｄ ｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　１ｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏｖａｌｅｎｔ　Ｄ ＮＡ／ｐｒｏｔｅｊｎ　ｃｏｍｐｌｅｘ■ ｓ：　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ　Ｉ　ａｎ ｄ　ＩＩ″ＭＥＢＯＪ　３：６７１−６７６．１９８４゜８）「癌の化学療法お よび生物学的応答修飾剤、年報９」“Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ 　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅ５ｐｏｎｓｅ　Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ　ａ ｎｎｕａ＋　９＋Ｈ，Ｍ、　ＰｆｎｅｄｏＳＢ、Ａ、　Ｃｈａｂｎｅｒおよびり 、Ｌ、　Ｌｏｎｇｏ著、ＥＩｓｅｖｉｅｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅ ｒｓ　Ｂ。

Ｖ、　１９８７（同封されている再版物）中のＦｒａｎｃｉｓ　Ｇ、Ｅ、　＆　 Ｐｉｎｓｋｙ　Ｃ，Ｇｒｏｗｔｈ著［成長および分化制御Ｊ　”　Ｇｒｏｗｔｈ 　ａｎｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｃｏｎｔｒｏｌ”９）　Ｄａｒｂ ｙ　ＭＷ、　Ｈｅｒｒｅｒａ　ＲＥ、　Ｖｏｓｂｅｒｇ　Ｈ−Ｐ、　Ｎｏｒｄｈ ｅｉｍ　Ａ著［インビトロでの、Ｃ−フォスフオド−腫瘍遺伝子の５′隣接領域 中の特定部位におけるＤＮＡ）−ポイソメラーゼ開裂Ｊ　”　ＤＮＡ　ｔｏｐｏ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ　ｃｌｅａｖｅｓ　ａｔ　５ｐｅｃｉｆｉｅ　５ｉｔｅｓ　 ｉｎ　ｔｈｅ　５’　ｆｌａｎｋｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ　ｏｆ　ｃ−ｆｏｓ　ｐ ｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ■ ｉｎ　ｖｉｔｒｏ″ＥＭＢＯＪ、　９：２２５７−２２６５．１９８６゜１０） 　Ｗａｉｔｅｒ　Ｈ，Ｂｒｏｏｋｓ　ＤＥ、　＆　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｄ、　（編集 ）「バイオテクノロジーにおける水系の二相系の分配、理論、方法、使用および 応用」“Ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ　ｉｎ　ａｑｕｅｏｕｓ　ｔｗｏ−ｐｈａｓ ｅ　ｓｙｓｔｅｍｓ、　ｔｈｅｏｒｙ、　ｍｅｔｈｏｄｓ、　ｕｓｅｓ　ａｎ■ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”　Ａｃａｄｅ ｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　ＮｅＷＹｏｒｋ　１９８５中の［核酸のムラ−間分配Ｊ 　”　Ｍｕｌｌｅｒ　Ｍ　Ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅｉｃ　 ａｃｉｄｓ”ｐｐ　２２７−２６６ １１　）　Ｃｈｅｎ　ＧＬ、　Ｙａｎｇ　Ｌ、　Ｒｏｗｅ　ＴＣ，、Ｈａｌｌｉ ｇａｎ　ＢＤＳＴｅｗｅｙ　ＫＭ、　Ｌｉｕ　ＬＦ著「非挿入抗腫瘍剤は哺乳類 のＤＮＡｌ−ポイソメラーゼＩｌの切断再結合反応を阻害するＪ　”　Ｎｏｎ１ ｎｔｅｒｃａｌａｔｆｖｅ　ａｎｔｉｔｕａ＋ｏｒ　ｄｒｕｇｓ　１ｎｔｅｒｆ ｅｒｅ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｂｒｅａｋａｇｅ−ｒｅｕｎｉｏｎ　ｒｅａｃｔｉ ｏｎ　ｏｆ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ＤＮＡ　ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ　h Ｉ″Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２５９：１３５６０−１３５６６．１９８４゜１ ２）　Ｌｉｕ　ＬＦ、　ｆａｎｇ　ＪＣＣＦＤＮＡ−ギラーゼ複合体：酵素の外 側のＤＮＡ二重体のラッピングＪ　＋ＤＮＡ−ｇｙｒａｓｅ　ｃｏｍｐｌｅｘ： 　ｔｈｅ　ｗｒａｐｐｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＤＮＡ　ｄｕｐｌｅｘ　ｏｕｔｓ ｉｄｅ　ｔｈｅ　ｅｎｚｙｍｅ”　Ｃｅ１ｌ　１５：９７９−９８４；　１９７ ８゜１３　）　Ｆｒａｎｃｉｓ　Ｇ、　Ｅ、、Ｂｅｒｎｅｙ　ＪＪ、　Ｎｏｒｔ ｈ　ＰＳ、　Ｋｈａｎ　Ｚ、、Ｗｉｌｓｏｎ　ＥＬ、　Ｊａｃ。

ｂｓ　Ｐ、＾ｌｉ　Ｍ、著「好中球顆粒球分化におけるＤＮＡトポイソメラーゼ １１の必要性に関する証拠Ｊ　”　Ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｉｎｖ ｏｌｖｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ＤＮＡｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ　Ｈｉｎ　ｎｅｕ ｔｒｏｐｈｉｌ　ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ” 　Ｌｅｕｋａｅｍｉａ　１：６５３−６５９．１９８７゜１４　）　Ｆｒａｎｃ ｉｓ　ＧＥ、、Ｋｈａｎ　Ｚ、　Ｇｒａｙ　ＤＡ、　Ｗｉｎｇ　Ｍ＾、Ｂｅｒｎ ｅｙ　ＪＪ、　ＧｕｉｍａｒａｅｓＪＥＴＥＳＨｏｆｆｂｒａｎｄ　ＡＹ著「顆 粒球−ｖ　りｏ　７７−　’）　−ｙ　ｏニー刺ｉｔ活性１：よるヒトの骨髄細 胞の刺激作用中のＤＮＡ連結反応を仲介するＤＮＡストランド切断およびＡＤＰ リボシル転移酵素Ｊ　”　ＤＮＡ　５ｔｒａｎｄ　ｂｒｅａｋａｇｅａｎｄ　Ａ ＤＰ　ｒｉｂｏｓｙｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ＤＮＡ　 ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｄｕｒｉｎｇ　ｓｔｉｍｕｌ■ ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　ｇ ｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｉａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｃｏｌｏｎ■ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ａｃｔｉｖｉｔｙ″Ｌｅｕｋ　Ｒｅｓ　８：４０７− ４１５．１９８４゜１５）　Ｋｈａｎ　Ｚ、、Ｆｒａｎｃｉｓ　Ｇ、　Ｅ、著　 「顆粒球および単球分化中のＤＮＡ連結反応に依存しているＤＮＡストランド切 断およびＡＤＰ−リボシル化の対比パターンＪ　”　Ｃｏｎｔｒａｓｔｉｎｇ　 ｐａｔｔｅｒｎｓ　ｏｆ　ＤＮＡ　５ｔｒａｎｄ　ｂｒｅａｋａｇｅａｎｄ　Ａ ＤＰ−ｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｏｎ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ＤＮＡ　ｌｉｇａｔｉ ｏｎ　ｄｕｒｉｎｇ　ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ　■ ｎｄ　ｍｏｎｏｃｙｔｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ″Ｂｌｏｏｄ　６９ ：１１１４−１１１９：　１９８７゜１６）　Ｗｅｎｉｇｅｒ　Ｐ著「真核性細 胞のＤＮＡ中の少量の放射能損傷を検出するための改良された方法Ｊ　−Ａｎ　 ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｓｍａｌｌ　ａｍｏｕ ｎｔｓ　ｏｆ　ｒａｄｉａｔｉｏｎ　ｄａｍａｇｅ　ｉｎ　ＤＮＡ　ｏｆ　ｅｕ ｋａｒｙｏｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ−Ｉｎｔ　Ｊ　Ｒａｄｉａｔ　Ｂｔｏｌ　３６＋ １９７−１９９．１９７９゜１７）　Ｚｖｅｌｌｉｎｇ　ＬＡ、　Ｍｉｃｈａｅ ｌｓ　Ｓ、　Ｅｒ１ｃｋｓｏｎ　ＬＣＳＵｎｇｅｒｌｅｉｄｅｒ　Ｒ３，Ｎ１ｃ ｈｏ１ｓ　Ｍ、　Ｋｏｈｎ　ＫＭ著「デオキシリポ核酸挿入剤類４’−（９−ア クリジニルアミノ）メタンスルホン−ｍ−アニシドおよびアドリミシンで処理し たＬ１２１０細胞中の蛋白質会合デオキシリポ核酸ストランド分解」”　Ｐｒｏ ｔｅｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉ ｄ　５ｔｒａｎｄ　ｂｒｅａｋｓ　ｉｎ　Ｌ１２P ０　ｃｅｌｌｓ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕ ｃｌｅｉ　ａｃｉｄ　ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ　ａｇｅ■ ｔｓ　４’　−（９−ａｃｒｉｄｉｎｙｌａｍｉｎｏ）ｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｐ ｈｏｎ−ｍ−ａｎｉｓｉｄｅ　ａｎｄ　ａｄｒｉｍｙｃｉｎh Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２０：６５５３−６５６３．１９８１゜ｌ　８）　 Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ他著、［分子クローン化：実験室マニュアルＪ”）ｌ。

１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ：＾１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ”　 Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　１９ｇ２゜ＶＰ−１６つ濃度　（Ｍ ） 稜尤度　□　； ｒ）　○　ｌ〉 ＤＮＡの濃、７１　（ｎ９） ａｉｔｎＫ　Ｉ　Ｔ’Ｌ’１−１１　７ｍｍ２１　ＳＯｎｇＤＮＡ−一−−Ａ　 ・・・・・・Ｂ　−Ｃ （５２月１−子イｌタグ（理 −肥＋澤処理 ＯＮへの５東Ｊ艷　（ｎ９） −−Ｎ箇々１ぐトロか０−〜ｎ々φリトロか０−〜ｎ−一、−Ｆ＋−一一一一〜 〜ｃ＋Ｊヘ ク０−ン敷 組冷わ（ｔ；刺しげり泳シググノνっ封１１圏■溺■ 国際調査報告

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．（ｉ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の反応性を示す誘導体を用いてＤ ＮＡ／蛋白質複合体を処理し、そして（ｉｉ）段階（ｉ）の生成物に、ＰＥＧ水 溶液相とホスフェート水溶液相との間の相分配を受けさせること、から成る段階 を含む、非共有結合ＤＮＡ／蛋白質複合体および未結合ＤＮＡから共有結合ＤＮ Ａ／蛋白質複合体を分離するための方法。
2. ２．更に、 （ｉｉｉ）該水系ＰＥＧ相から共有結合的に結合したＤＮＡ／蛋白質複合体を回 収すること、 の段階を含む請求の範囲１に従う方法。
3. ３．該ＰＥＧの反応性を示す誘導体が２，２，２−トリフルオロエタンスルホニ ルモノメトキシポリエチレングリコール（ＴＭＰＥＧ）である請求の範囲１また は請求の範囲２に従う方法。
4. ４．該共有結合的に結合したＤＮＡ／蛋白質複合体がＤＮＡ／トポイソメラーゼ 複合体である請求の範囲１〜３のいずれか１項に従う方法。
5. ５．該ＤＮＡトポイソメラーゼがＤＮＡトポイソメラーゼＩおよび／またはＩＩ である請求の範囲４に従う方法。
6. ６．請求の範囲１〜５のいずれか１項に従う方法によって、共有結合ＤＮＡ／酵 素複合体を分離することを含む、ＤＮＡを有する共有結合中間体を生じさせる１ つ以上の酵素の作用が転写活性の誘発を伴う、誘発可能な遺伝子を含むか、或は それと会合しているＤＮＡを精製するための方法。
7. ７．必要ならば、蛋白質結合部位でＤＮＡに蛋白質を共有結合させた後、請求の 範囲１〜５のいずれか１項に従う方法で共有結合ＤＮＡ蛋白質複合体を分離する ことを含む、蛋白質結合部位を有するＤＮＡを精製するための方法。
8. ８．請求の範囲４または請求の範囲５に従う方法による、ＤＮＡ／トポイソメラ ーゼ複合体の分離を含む、ＤＮＡトポイソメラーゼ活性定量のための方法。
9. ９．請求の範囲４または請求の範囲５に従う方法によって、共有結合ＤＮＡ／ト ポイソメラーゼ複合体を分離することを含む、ＤＮＡトポイソメラーゼ開裂部位 の特異性を定量するための方法。
10. １０．ＤＮアーゼ酵素を用いた消化による、ＤＮＡフラグメントの長さを減じる ことが必要であり、そして請求の範囲１〜５のいずれか１項に従う方法により、 この得られるＤＮＡ蛋白質複合体を分離するところの、蛋白質結合部位およびこ の部位に結合している蛋白質を有するＤＮＡフラグメントの共有結合榎合体を生 じさせることを含む、蛋白質結合部位を有するＤＮＡを生産するための方法。
11. １１．請求の範囲１〜５のいずれか１項に従う方法によって、共有結合ＤＮＡ／ 蛋白質複合体を分離することを含む、ＤＮＡ−蛋白質架橋剤の定量方法。
12. １２．請求の範囲１〜５のいずれか１項に従う方法によって、共有結合ＤＮＡ／ 酵素複合体を分離することを含む、切れ目開閉酵素のインヒビターを定量するた めの方法。