JPH04297488A - Ｖｅｒｏ毒素遺伝子の検出方法およびそれに用いるプライマ− - Google Patents
Ｖｅｒｏ毒素遺伝子の検出方法およびそれに用いるプライマ−Info
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- JPH04297488A JPH04297488A JP3087610A JP8761091A JPH04297488A JP H04297488 A JPH04297488 A JP H04297488A JP 3087610 A JP3087610 A JP 3087610A JP 8761091 A JP8761091 A JP 8761091A JP H04297488 A JPH04297488 A JP H04297488A
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- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ＰＣＲ（ＤＮＡ増幅）
法によるＶｅｒｏ毒素遺伝子の検出方法およびそれに用
いるプライマ−に関する。
法によるＶｅｒｏ毒素遺伝子の検出方法およびそれに用
いるプライマ−に関する。
【０００２】
【従来の技術】Ｖｅｒｏ毒素産生性大腸菌（Ｖｅｒｏｔ
ｏｘｉｎ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ， ＶＴＥＣ）による出血性大腸炎や溶血
性尿毒症症侯群の報告例は、我が国においても年々増加
の傾向にある。下痢と腹痛を伴う症状から短期間で溶血
性尿毒症症侯群を続発し、死亡する例も報告されており
、ＶＴＥＣの迅速な検出・同定法の確立が急務とされて
いる。
ｏｘｉｎ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ， ＶＴＥＣ）による出血性大腸炎や溶血
性尿毒症症侯群の報告例は、我が国においても年々増加
の傾向にある。下痢と腹痛を伴う症状から短期間で溶血
性尿毒症症侯群を続発し、死亡する例も報告されており
、ＶＴＥＣの迅速な検出・同定法の確立が急務とされて
いる。
【０００３】本菌感染において重要な病原的役割を果た
すと考えられているＶｅｒｏ毒素（ＶＴ）は、現在まで
に少なくとも５種類が報告されている。すなわち、志賀
赤痢菌の産生する志賀毒素と分子構造が全く同一のＶＴ
１、生物学的性状はＶＴ１と類似しているが免疫学的物
理化学的性状が全く異なるＶＴ２、ＶＴ２と一部共通抗
原性を有する豚浮腫病由来の大腸菌が産生するＶＴ２ｖ
ｐ、ＶＴ２と一部共通抗原性を有し溶血性尿毒症症侯群
患者由来の大腸菌の産生するＶＴ２ｖｈａ、ＶＴ２ｖｈ
ｂの５種類である。
すと考えられているＶｅｒｏ毒素（ＶＴ）は、現在まで
に少なくとも５種類が報告されている。すなわち、志賀
赤痢菌の産生する志賀毒素と分子構造が全く同一のＶＴ
１、生物学的性状はＶＴ１と類似しているが免疫学的物
理化学的性状が全く異なるＶＴ２、ＶＴ２と一部共通抗
原性を有する豚浮腫病由来の大腸菌が産生するＶＴ２ｖ
ｐ、ＶＴ２と一部共通抗原性を有し溶血性尿毒症症侯群
患者由来の大腸菌の産生するＶＴ２ｖｈａ、ＶＴ２ｖｈ
ｂの５種類である。
【０００４】この５種類のＶＴのＤＮＡ配列は、以下の
通り、既に報告されている。 ＶＴ１： Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓ
ｉｓ １９８７， ２： １４７−１５３Ｊ． Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ．， Ｓｅｐｔ． １９８７， ｐ． ４
３１３−４３１９， Ｖｏｌ． １６９， Ｎｏ． ９ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳ
Ａ， Ｖｏｌ． ８４，ｐｐ． ４３６４−４３６８，
Ｊｕｌｙ １９８７ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ １９
８８， ５： ３５７−３６９ＶＴ２： ＦＥＭＳ Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４４ （１
９８７） １０９−１１４（配列番号：１） ＶＴ２ｖｐ： Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎ
ｅｓｉｓ １９８８，５： ４１９−４２６Ｊ． Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ．， Ｓｅｐｔ． １９８８， ｐ．
４２２３−４２３０， Ｖｏｌ． １７０， Ｎｏ．
９ ＶＴ２ｖｈａ、ＶＴ２ｖｈｂ： Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ
Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ １９９０， ８： ４７−
６０
通り、既に報告されている。 ＶＴ１： Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓ
ｉｓ １９８７， ２： １４７−１５３Ｊ． Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ．， Ｓｅｐｔ． １９８７， ｐ． ４
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９８７） １０９−１１４（配列番号：１） ＶＴ２ｖｐ： Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎ
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ｃｔｅｒｉｏｌ．， Ｓｅｐｔ． １９８８， ｐ．
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９ ＶＴ２ｖｈａ、ＶＴ２ｖｈｂ： Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ
Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ １９９０， ８： ４７−
６０
【０００５】また、ＶＴ１遺伝子およびＶＴ２遺伝子の
それぞれをＰＣＲ法により増幅したという報告が既にな
されている。 ＶＴ１： Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃ
ｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ １９９０；１６２：１
１９５−１１９８ ＶＴ２： Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｏｃｔ． １９９０，
ｐ． ２３５１−２３５３， Ｖｏｌ． ２８， Ｎｏ． １０
それぞれをＰＣＲ法により増幅したという報告が既にな
されている。 ＶＴ１： Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃ
ｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ １９９０；１６２：１
１９５−１１９８ ＶＴ２： Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｏｃｔ． １９９０，
ｐ． ２３５１−２３５３， Ｖｏｌ． ２８， Ｎｏ． １０
【０００６】このように、ＶＴ１遺伝子およびＶＴ２遺
伝子のＰＣＲ法による増幅の報告はあるものの、それ以
外のＶＴ２ｖｐ、ＶＴ２ｖｈａ、ＶＴ２ｖｈｂ遺伝子の
増幅に関する報告は無く、さらに、これら５つの遺伝子
全てを増幅させうるプライマ−の報告も無い。
伝子のＰＣＲ法による増幅の報告はあるものの、それ以
外のＶＴ２ｖｐ、ＶＴ２ｖｈａ、ＶＴ２ｖｈｂ遺伝子の
増幅に関する報告は無く、さらに、これら５つの遺伝子
全てを増幅させうるプライマ−の報告も無い。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】上記の通り、ＶＴ１、
ＶＴ２、ＶＴ２ｖｐ、ＶＴ２ｖｈａ、およびＶＴ２ｖｈ
ｂ遺伝子全てに共通なプライマ−は未だ報告されておら
ず、現在のところＶＴＥＣの検出のためには、各遺伝子
それぞれを別個に検出せざるをえない。これらはＶＴＥ
Ｃの迅速な検出法とは言い難く、ＶＴ１、ＶＴ２、ＶＴ
２ｖｐ、ＶＴ２ｖｈａ、およびＶＴ２ｖｈｂ遺伝子全て
をＰＣＲ法で増幅し得るプライマ−が待望されていた。
ＶＴ２、ＶＴ２ｖｐ、ＶＴ２ｖｈａ、およびＶＴ２ｖｈ
ｂ遺伝子全てに共通なプライマ−は未だ報告されておら
ず、現在のところＶＴＥＣの検出のためには、各遺伝子
それぞれを別個に検出せざるをえない。これらはＶＴＥ
Ｃの迅速な検出法とは言い難く、ＶＴ１、ＶＴ２、ＶＴ
２ｖｐ、ＶＴ２ｖｈａ、およびＶＴ２ｖｈｂ遺伝子全て
をＰＣＲ法で増幅し得るプライマ−が待望されていた。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は、ＰＣＲ法によ
って、ＶＴ１、ＶＴ２、ＶＴ２ｖｐ、ＶＴ２ｖｈａ、お
よびＶＴ２ｖｈｂ遺伝子全てを増幅し得るプライマ−を
提供する。
って、ＶＴ１、ＶＴ２、ＶＴ２ｖｐ、ＶＴ２ｖｈａ、お
よびＶＴ２ｖｈｂ遺伝子全てを増幅し得るプライマ−を
提供する。
【０００９】本発明のプライマ−は、ＶＴ１、ＶＴ２、
ＶＴ２ｖｐ、ＶＴ２ｖｈａ、およびＶＴ２ｖｈｂ遺伝子
全てに対して高い相同性を有するものであ。すなわち、
本発明のプライマ−は、連続した１５〜２５塩基長を有
し、５つの遺伝子それぞれに対して、同一か、または、
１〜２塩基しか異ならないことを特徴とする。
ＶＴ２ｖｐ、ＶＴ２ｖｈａ、およびＶＴ２ｖｈｂ遺伝子
全てに対して高い相同性を有するものであ。すなわち、
本発明のプライマ−は、連続した１５〜２５塩基長を有
し、５つの遺伝子それぞれに対して、同一か、または、
１〜２塩基しか異ならないことを特徴とする。
【００１０】具体的には、５つの遺伝子の配列を比較し
て（図１および図２参照）、これらの遺伝子配列の相同
性が高い、以下の部分から本発明のプライマ−がデザイ
ンされる（「−」は同一塩基）。
て（図１および図２参照）、これらの遺伝子配列の相同
性が高い、以下の部分から本発明のプライマ−がデザイ
ンされる（「−」は同一塩基）。
【００１１】
ＶＴ１ ：・・・−−Ａ−Ｇ−−−−−−−−−−
−−−−−−・・・ＶＴ２ ：・・・ＧＡＧＣＡＡ
ＡＡＴＡＡＴＴＴＡＴＡＴＧＴＧ・・・ＶＴ２ｖｐ ：
・・・−−Ａ−Ｇ−−−−−−−−−−−−−−−−・
・・ＶＴ２ｖｈａ：・・・−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−−・・・ＶＴ２ｖｈｂ：・・・−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−−−・・・（図１参照
）
−−−−−−・・・ＶＴ２ ：・・・ＧＡＧＣＡＡ
ＡＡＴＡＡＴＴＴＡＴＡＴＧＴＧ・・・ＶＴ２ｖｐ ：
・・・−−Ａ−Ｇ−−−−−−−−−−−−−−−−・
・・ＶＴ２ｖｈａ：・・・−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−−・・・ＶＴ２ｖｈｂ：・・・−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−−−・・・（図１参照
）
【００１２】
ＶＴ１ ：・・・−−−−−−−−−−−Ｔ−−−
−−−−−・・・ＶＴ２ ：・・・ＡＴＡＣＴＧＡ
ＡＴＴＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡ・・・ＶＴ２ｖｐ ：・・
・−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−・・・Ｖ
Ｔ２ｖｈａ：・・・−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−−・・・ＶＴ２ｖｈｂ：・・・−−−−−−−−
−−−−−−−−−−−−・・・（図２参照）
−−−−−・・・ＶＴ２ ：・・・ＡＴＡＣＴＧＡ
ＡＴＴＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡ・・・ＶＴ２ｖｐ ：・・
・−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−・・・Ｖ
Ｔ２ｖｈａ：・・・−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−−・・・ＶＴ２ｖｈｂ：・・・−−−−−−−−
−−−−−−−−−−−−・・・（図２参照）
【００１３】この部分を選択すれば、１５〜２５塩基に
わたり、各遺伝子に対して、同一または１〜２塩基だけ
異なるプライマ−をデザインすることができる。例えば
、 センスプライマ−：５’ＧＡＲＣＲＡＡＡＴＡＡＴＴＴ
ＡＴＡＴＧＴＧ ３’ （配列番号：２） アンチセンスプライマ−：５’ＴＧＡＴＧＡＴＧＲＣＡ
ＡＴＴＣＡＧＴＡＴ ３’ （配列番号：３） （但し、ＲはＡまたはＧを表わす。）なるプライマ−を
デザインできる。
わたり、各遺伝子に対して、同一または１〜２塩基だけ
異なるプライマ−をデザインすることができる。例えば
、 センスプライマ−：５’ＧＡＲＣＲＡＡＡＴＡＡＴＴＴ
ＡＴＡＴＧＴＧ ３’ （配列番号：２） アンチセンスプライマ−：５’ＴＧＡＴＧＡＴＧＲＣＡ
ＡＴＴＣＡＧＴＡＴ ３’ （配列番号：３） （但し、ＲはＡまたはＧを表わす。）なるプライマ−を
デザインできる。
【００１４】さらに詳細には、本発明に用いられたプラ
イマ−は、 センスプライマ−：５’ＧＡＧＣＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴ
ＡＴＡＴＧＴＧ ３’ （配列番号：２） アンチセンスプライマ−：５’ＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＡ
ＡＴＴＣＡＧＴＡＴ ３’ （配列番号：３） である。これらは、各遺伝子に対して、同一または１塩
基しか異ならない。
イマ−は、 センスプライマ−：５’ＧＡＧＣＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴ
ＡＴＡＴＧＴＧ ３’ （配列番号：２） アンチセンスプライマ−：５’ＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＡ
ＡＴＴＣＡＧＴＡＴ ３’ （配列番号：３） である。これらは、各遺伝子に対して、同一または１塩
基しか異ならない。
【００１５】これらのプライマ−に対する相補鎖も、も
ちろん本発明のプライマ−として用いることができる。 また、これらのプライマ−を数塩基短縮または延長して
も、１５〜２５塩基にわたり、各遺伝子に対して、同一
または１〜２塩基だけ異なるものとなることは図１およ
び図２から明らかであり、そのようなものも本発明の範
囲に含まれる。
ちろん本発明のプライマ−として用いることができる。 また、これらのプライマ−を数塩基短縮または延長して
も、１５〜２５塩基にわたり、各遺伝子に対して、同一
または１〜２塩基だけ異なるものとなることは図１およ
び図２から明らかであり、そのようなものも本発明の範
囲に含まれる。
【００１６】通常、ＰＣＲ法に用いるプライマ−は、１
５塩基以上であると、所望の特異性が得られる。従って
、本発明のプライマ−も１５塩基以上であることが望ま
しく、上記の配列のうち、少なくとも連続した１５塩基
またはその相補鎖を有するプライマ−も本発明に包含さ
れる。
５塩基以上であると、所望の特異性が得られる。従って
、本発明のプライマ−も１５塩基以上であることが望ま
しく、上記の配列のうち、少なくとも連続した１５塩基
またはその相補鎖を有するプライマ−も本発明に包含さ
れる。
【００１７】本発明のプライマ−は、ＰＣＲ法によるＶ
Ｔ遺伝子の検出用プライマ−として用いられるだけでな
く、ＶＴ遺伝子の検出用プロ−ブとして用いることもで
きる。 従って、本発明のプライマ−と同一の塩基配列を有する
オリゴヌクレオチドは、その用途に限定されず、すべて
本発明に包含される。
Ｔ遺伝子の検出用プライマ−として用いられるだけでな
く、ＶＴ遺伝子の検出用プロ−ブとして用いることもで
きる。 従って、本発明のプライマ−と同一の塩基配列を有する
オリゴヌクレオチドは、その用途に限定されず、すべて
本発明に包含される。
【００１８】本発明のプライマ−を用いるＰＣＲ法によ
るＶＴ遺伝子の検出は、通常の方法で行なえばよい。例
えば、被検菌を溶菌させたのち、Ｔａｑ ＤＮＡポリメ
ラ−ゼを加え、変性（９４℃、１分）→アニ−リング（
５８℃、１．５分）→合成（７２℃、１．５分）の反応
を約３０回繰り返し、増幅したＤＮＡ断片をポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法により検出すればよい。
るＶＴ遺伝子の検出は、通常の方法で行なえばよい。例
えば、被検菌を溶菌させたのち、Ｔａｑ ＤＮＡポリメ
ラ−ゼを加え、変性（９４℃、１分）→アニ−リング（
５８℃、１．５分）→合成（７２℃、１．５分）の反応
を約３０回繰り返し、増幅したＤＮＡ断片をポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法により検出すればよい。
【００１９】
【実施例】プライマ−：それぞれのＶＴをコ−ドする遺
伝子の塩基配列を比較して（図１および図２参照）、相
同性が高い領域を検索し、以下の配列を有するオリゴヌ
クレオチドを合成した。 センスプライマ−：５’ＧＡＧＣＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴ
ＡＴＡＴＧＴＧ ３’ （配列番号：２） アンチセンスプライマ−：５’ＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＡ
ＡＴＴＣＡＧＴＡＴ ３’ （配列番号：３）
伝子の塩基配列を比較して（図１および図２参照）、相
同性が高い領域を検索し、以下の配列を有するオリゴヌ
クレオチドを合成した。 センスプライマ−：５’ＧＡＧＣＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴ
ＡＴＡＴＧＴＧ ３’ （配列番号：２） アンチセンスプライマ−：５’ＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＡ
ＡＴＴＣＡＧＴＡＴ ３’ （配列番号：３）
【００２０】使用菌株：各ＶＴの陽性コントロ−ルとし
て、ＶＴ１、ＶＴ２、ＶＴ２ｖｈａ、ＶＴ２ｖｈｂにつ
いては、クロ−ニング株を、ＶＴ２ｖｐについては、オ
リゴプロ−ブでＶＴ２ｖｐ以外のＶＴは保持していない
ことを確認した菌株を用いた。
て、ＶＴ１、ＶＴ２、ＶＴ２ｖｈａ、ＶＴ２ｖｈｂにつ
いては、クロ−ニング株を、ＶＴ２ｖｐについては、オ
リゴプロ−ブでＶＴ２ｖｐ以外のＶＴは保持していない
ことを確認した菌株を用いた。
【００２１】ＰＣＲ：ＤＮＡの増幅反応は、１０ ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．５）、５０ ｍＭ Ｋ
Ｃｌ、１．５ ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０１％（Ｗ／Ｖ
） ゼラチン、２００ μＭ各ｄＮＴＰ、および１ μ
Ｍ各 プライマ−を含む溶液に、被検菌の培養液１μｌ
を加えた反応溶液１００μｌを９４℃、５分間で溶菌さ
せた後、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラ−ゼ２．５単位を加え
、変性（９４℃、１分）→アニ−リング（５８℃、１．
５分）→合成（７２℃、１．５分）の反応を３０回繰り
返した。増幅したＤＮＡ断片は、６％ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法により検出した。
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．５）、５０ ｍＭ Ｋ
Ｃｌ、１．５ ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０１％（Ｗ／Ｖ
） ゼラチン、２００ μＭ各ｄＮＴＰ、および１ μ
Ｍ各 プライマ−を含む溶液に、被検菌の培養液１μｌ
を加えた反応溶液１００μｌを９４℃、５分間で溶菌さ
せた後、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラ−ゼ２．５単位を加え
、変性（９４℃、１分）→アニ−リング（５８℃、１．
５分）→合成（７２℃、１．５分）の反応を３０回繰り
返した。増幅したＤＮＡ断片は、６％ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法により検出した。
【００２２】結果：増幅したＤＮＡ断片を、６％ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法により検出した結果を、図
３に示す。図３から明らかな様に、本発明のプライマ−
を用いてＰＣＲを行なえば、ＶＴ１、ＶＴ２、ＶＴ２ｖ
ｐ、ＶＴ２ｖｈａ、ＶＴ２ｖｈｂ遺伝子のいずれか１つ
を保持する菌株について、所望の位置にバンドが検出さ
れ、いずれをも保持しない菌株では、バンドが検出され
なかった。
クリルアミドゲル電気泳動法により検出した結果を、図
３に示す。図３から明らかな様に、本発明のプライマ−
を用いてＰＣＲを行なえば、ＶＴ１、ＶＴ２、ＶＴ２ｖ
ｐ、ＶＴ２ｖｈａ、ＶＴ２ｖｈｂ遺伝子のいずれか１つ
を保持する菌株について、所望の位置にバンドが検出さ
れ、いずれをも保持しない菌株では、バンドが検出され
なかった。
【００２３】
【発明の効果】本発明のプライマ−を用いるＶＴ遺伝子
の検出方法によると、ＶＴ１、ＶＴ２、ＶＴ２ｖｐ、Ｖ
Ｔ２ｖｈａ、ＶＴ２ｖｈｂ遺伝子のいずれでも検出する
ことが可能であり、ＶＴＥＣの迅速な検出が可能になる
。
の検出方法によると、ＶＴ１、ＶＴ２、ＶＴ２ｖｐ、Ｖ
Ｔ２ｖｈａ、ＶＴ２ｖｈｂ遺伝子のいずれでも検出する
ことが可能であり、ＶＴＥＣの迅速な検出が可能になる
。
【００２４】配列番号：１
配列の長さ：１２４１
配列の型：核酸
配列
ＡＴＧＡＡＧＴＧＴＡ ＴＡＴＴＡＴＴＴＡＡ ＡＴＧ
ＧＧＴＡＣＴＧ ＴＧＣＣＴＧＴＴＡＣ ＴＧＧＧＴＴ
ＴＴＴＣ ＴＴＣＧＧＴＡＴＣＣ ６０ＴＡＴ
ＴＣＣＣＧＧＧ ＡＧＴＴＴＡＣＧＡＴ ＡＧＡＣＴＴ
ＴＴＣＧ ＡＣＣＣＡＡＣＡＡＡ ＧＴＴＡＴＧＴＣＴ
Ｃ ＴＴＣＧＴＴＡＡＡＴ １２０ＡＧＴＡＴＡ
ＣＧＧＡ ＣＡＧＡＧＡＴＡＴＣ ＧＡＣＣＣＣＴＣＴ
Ｔ ＧＡＡＣＡＴＡＴＡＴ ＣＴＣＡＧＧＧＧＡＣ Ｃ
ＡＣＡＴＣＧＧＴＧ １８０ＴＣＴＧＴＴＡＴＴ
Ａ ＡＣＣＡＣＡＣＣＣＣ ＡＣＣＧＧＧＣＡＧＴ Ｔ
ＡＴＴＴＴＧＣＴＧ ＴＧＧＡＴＡＴＡＣＧ ＡＧＧＧ
ＣＴＴＧＡＴ ２４０ＧＴＣＴＡＴＣＡＧＧ Ｃ
ＧＣＧＴＴＴＴＧＡ ＣＣＡＴＣＴＴＣＧＴ ＣＴＧＡ
ＴＴＡＴＴＧ ＡＧＣＡＡＡＡＴＡＡ ＴＴＴＡＴＡＴ
ＧＴＧ ３００ＧＣＣＧＧＧＴＴＣＧ ＴＴＡＡ
ＴＡＣＧＧＣ ＡＡＣＡＡＡＴＡＣＴ ＴＴＣＴＡＣＣ
ＧＴＴ ＴＴＴＣＡＧＡＴＴＴ ＴＡＣＡＣＡＴＡＴＡ
３６０ＴＣＡＧＴＧＣＣＣＧ ＧＴＧＴＧＡＣ
ＡＡＣ ＧＧＴＴＴＣＣＡＴＧ ＡＣＡＡＣＧＧＡＣＡ
ＧＣＡＧＴＴＡＴＡＣ ＣＡＣＴＣＴＧＣＡＡ
４２０ＣＧＴＧＴＣＧＣＡＧ ＣＧＣＴＧＧＡＡＣＧ
ＴＴＣＣＧＧＡＡＴＧ ＣＡＡＡＴＣＡＧＴＣ ＧＴ
ＣＡＣＴＣＡＣＴ ＧＧＴＴＴＣＡＴＣＡ ４８
０ＴＡＴＣＴＧＧＣＧＴ ＴＡＡＴＧＧＡＧＴＴ ＣＡ
ＧＴＧＧＴＡＡＴ ＡＣＡＡＴＧＡＣＣＡ ＧＡＧＡＴ
ＧＣＡＴＣ ＣＡＧＡＧＣＡＧＴＴ ５４０ＣＴ
ＧＣＧＴＴＴＴＧ ＴＣＡＣＴＧＴＣＡＣ ＡＧＣＡＧ
ＡＡＧＣＣ ＴＴＡＣＧＣＴＴＣＡ ＧＧＣＡＧＡＴＡ
ＣＡ ＧＡＧＡＧＡＡＴＴＴ ６００ＣＧＴＣＡ
ＧＧＣＡＣ ＴＧＴＣＴＧＡＡＡＣ ＴＧＣＴＣＣＴＧ
ＴＧ ＴＡＴＡＣＧＡＴＧＡ ＣＧＣＣＧＧＧＡＧＡ
ＣＧＴＧＧＡＣＣＴＣ ６６０ＡＣＴＣＴＧＡＡ
ＣＴ ＧＧＧＧＧＣＧＡＡＴ ＣＡＧＣＡＡＴＧＴＧ
ＣＴＴＣＣＧＧＡＧＴ ＡＴＣＧＧＧＧＡＧＡ ＧＧＡ
ＴＧＧＴＧＴＣ ７２０ＡＧＡＧＴＧＧＧＧＡ
ＧＡＡＴＡＴＣＣＴＴ ＴＡＡＴＡＡＴＡＴＡ ＴＣＡ
ＧＣＧＡＴＡＣ ＴＧＧＧＧＡＣＴＧＴ ＧＧＣＣＧＴ
ＴＡＴＡ ７８０ＣＴＧＡＡＴＴＧＣＣ ＡＴＣ
ＡＴＣＡＧＧＧ ＧＧＣＧＣＧＴＴＣＴ ＧＴＴＣＧＣ
ＧＣＣＧ ＴＧＡＡＴＧＡＡＧＡ ＧＡＧＴＣＡＡＣＣ
Ａ ８４０ＧＡＡＴＧＴＣＡＧＡ ＴＡＡＣＴＧ
ＧＣＧＡ ＣＡＧＧＣＣＴＧＴＴ ＡＴＡＡＡＡＡＴＡ
Ａ ＡＣＡＡＴＡＣＡＴＴ ＡＴＧＧＧＡＡＡＧＴ
９００ＡＡＴＡＣＡＧＣＴＧ ＣＡＧＣＧＴＴＴＣ
Ｔ ＧＡＡＣＡＧＡＡＡＧ ＴＣＡＣＡＧＴＴＴＴ Ｔ
ＡＴＡＴＡＣＡＡＣ ＧＧＧＴＡＡＡＴＡＡ ９
６０ＡＧＧＡＧＴＴＡＡＧ ＣＡＴＧＡＡＧＡＡＧ Ａ
ＴＧＴＴＴＡＴＧＧ ＣＧＧＴＴＴＴＡＴＴ ＴＧＣＡ
ＴＴＡＧＣＴ ＴＣＴＧＴＴＡＡＴＧ １０２０Ｃ
ＡＡＴＧＧＣＧＧＣ ＧＧＡＴＴＧＴＧＣＴ ＡＡＡＧ
ＧＴＡＡＡＡ ＴＴＧＡＧＴＴＴＴＣ ＣＡＡＧＴＡＴ
ＡＡＴ ＧＡＧＧＡＴＧＡＣＡ １０８０ＣＡＴＴ
ＴＡＣＡＧＴ ＧＡＡＧＧＴＴＧＡＣ ＧＧＧＡＡＡＧ
ＡＡＴ ＡＣＴＧＧＡＣＣＡＧ ＴＣＧＣＴＧＧＡＡＴ
ＣＴＧＣＡＡＣＣＧＴ １１４０ＴＡＣＴＧＣＡ
ＡＡＧ ＴＧＣＴＣＡＧＴＴＧ ＡＣＡＧＧＡＡＴＧＡ
ＣＴＧＴＣＡＣＡＡＴ ＣＡＡＡＴＣＣＡＧＴ ＡＣ
ＣＴＧＴＧＡＡＴ １２００ＣＡＧＧＣＴＣＣＧＧ
ＡＴＴＴＧＣＴＧＡＡ ＧＴＧＣＡＧＴＴＴＡ ＡＴ
ＡＡＴＧＡＣＴＧ Ａ
１２４１
ＧＧＴＡＣＴＧ ＴＧＣＣＴＧＴＴＡＣ ＴＧＧＧＴＴ
ＴＴＴＣ ＴＴＣＧＧＴＡＴＣＣ ６０ＴＡＴ
ＴＣＣＣＧＧＧ ＡＧＴＴＴＡＣＧＡＴ ＡＧＡＣＴＴ
ＴＴＣＧ ＡＣＣＣＡＡＣＡＡＡ ＧＴＴＡＴＧＴＣＴ
Ｃ ＴＴＣＧＴＴＡＡＡＴ １２０ＡＧＴＡＴＡ
ＣＧＧＡ ＣＡＧＡＧＡＴＡＴＣ ＧＡＣＣＣＣＴＣＴ
Ｔ ＧＡＡＣＡＴＡＴＡＴ ＣＴＣＡＧＧＧＧＡＣ Ｃ
ＡＣＡＴＣＧＧＴＧ １８０ＴＣＴＧＴＴＡＴＴ
Ａ ＡＣＣＡＣＡＣＣＣＣ ＡＣＣＧＧＧＣＡＧＴ Ｔ
ＡＴＴＴＴＧＣＴＧ ＴＧＧＡＴＡＴＡＣＧ ＡＧＧＧ
ＣＴＴＧＡＴ ２４０ＧＴＣＴＡＴＣＡＧＧ Ｃ
ＧＣＧＴＴＴＴＧＡ ＣＣＡＴＣＴＴＣＧＴ ＣＴＧＡ
ＴＴＡＴＴＧ ＡＧＣＡＡＡＡＴＡＡ ＴＴＴＡＴＡＴ
ＧＴＧ ３００ＧＣＣＧＧＧＴＴＣＧ ＴＴＡＡ
ＴＡＣＧＧＣ ＡＡＣＡＡＡＴＡＣＴ ＴＴＣＴＡＣＣ
ＧＴＴ ＴＴＴＣＡＧＡＴＴＴ ＴＡＣＡＣＡＴＡＴＡ
３６０ＴＣＡＧＴＧＣＣＣＧ ＧＴＧＴＧＡＣ
ＡＡＣ ＧＧＴＴＴＣＣＡＴＧ ＡＣＡＡＣＧＧＡＣＡ
ＧＣＡＧＴＴＡＴＡＣ ＣＡＣＴＣＴＧＣＡＡ
４２０ＣＧＴＧＴＣＧＣＡＧ ＣＧＣＴＧＧＡＡＣＧ
ＴＴＣＣＧＧＡＡＴＧ ＣＡＡＡＴＣＡＧＴＣ ＧＴ
ＣＡＣＴＣＡＣＴ ＧＧＴＴＴＣＡＴＣＡ ４８
０ＴＡＴＣＴＧＧＣＧＴ ＴＡＡＴＧＧＡＧＴＴ ＣＡ
ＧＴＧＧＴＡＡＴ ＡＣＡＡＴＧＡＣＣＡ ＧＡＧＡＴ
ＧＣＡＴＣ ＣＡＧＡＧＣＡＧＴＴ ５４０ＣＴ
ＧＣＧＴＴＴＴＧ ＴＣＡＣＴＧＴＣＡＣ ＡＧＣＡＧ
ＡＡＧＣＣ ＴＴＡＣＧＣＴＴＣＡ ＧＧＣＡＧＡＴＡ
ＣＡ ＧＡＧＡＧＡＡＴＴＴ ６００ＣＧＴＣＡ
ＧＧＣＡＣ ＴＧＴＣＴＧＡＡＡＣ ＴＧＣＴＣＣＴＧ
ＴＧ ＴＡＴＡＣＧＡＴＧＡ ＣＧＣＣＧＧＧＡＧＡ
ＣＧＴＧＧＡＣＣＴＣ ６６０ＡＣＴＣＴＧＡＡ
ＣＴ ＧＧＧＧＧＣＧＡＡＴ ＣＡＧＣＡＡＴＧＴＧ
ＣＴＴＣＣＧＧＡＧＴ ＡＴＣＧＧＧＧＡＧＡ ＧＧＡ
ＴＧＧＴＧＴＣ ７２０ＡＧＡＧＴＧＧＧＧＡ
ＧＡＡＴＡＴＣＣＴＴ ＴＡＡＴＡＡＴＡＴＡ ＴＣＡ
ＧＣＧＡＴＡＣ ＴＧＧＧＧＡＣＴＧＴ ＧＧＣＣＧＴ
ＴＡＴＡ ７８０ＣＴＧＡＡＴＴＧＣＣ ＡＴＣ
ＡＴＣＡＧＧＧ ＧＧＣＧＣＧＴＴＣＴ ＧＴＴＣＧＣ
ＧＣＣＧ ＴＧＡＡＴＧＡＡＧＡ ＧＡＧＴＣＡＡＣＣ
Ａ ８４０ＧＡＡＴＧＴＣＡＧＡ ＴＡＡＣＴＧ
ＧＣＧＡ ＣＡＧＧＣＣＴＧＴＴ ＡＴＡＡＡＡＡＴＡ
Ａ ＡＣＡＡＴＡＣＡＴＴ ＡＴＧＧＧＡＡＡＧＴ
９００ＡＡＴＡＣＡＧＣＴＧ ＣＡＧＣＧＴＴＴＣ
Ｔ ＧＡＡＣＡＧＡＡＡＧ ＴＣＡＣＡＧＴＴＴＴ Ｔ
ＡＴＡＴＡＣＡＡＣ ＧＧＧＴＡＡＡＴＡＡ ９
６０ＡＧＧＡＧＴＴＡＡＧ ＣＡＴＧＡＡＧＡＡＧ Ａ
ＴＧＴＴＴＡＴＧＧ ＣＧＧＴＴＴＴＡＴＴ ＴＧＣＡ
ＴＴＡＧＣＴ ＴＣＴＧＴＴＡＡＴＧ １０２０Ｃ
ＡＡＴＧＧＣＧＧＣ ＧＧＡＴＴＧＴＧＣＴ ＡＡＡＧ
ＧＴＡＡＡＡ ＴＴＧＡＧＴＴＴＴＣ ＣＡＡＧＴＡＴ
ＡＡＴ ＧＡＧＧＡＴＧＡＣＡ １０８０ＣＡＴＴ
ＴＡＣＡＧＴ ＧＡＡＧＧＴＴＧＡＣ ＧＧＧＡＡＡＧ
ＡＡＴ ＡＣＴＧＧＡＣＣＡＧ ＴＣＧＣＴＧＧＡＡＴ
ＣＴＧＣＡＡＣＣＧＴ １１４０ＴＡＣＴＧＣＡ
ＡＡＧ ＴＧＣＴＣＡＧＴＴＧ ＡＣＡＧＧＡＡＴＧＡ
ＣＴＧＴＣＡＣＡＡＴ ＣＡＡＡＴＣＣＡＧＴ ＡＣ
ＣＴＧＴＧＡＡＴ １２００ＣＡＧＧＣＴＣＣＧＧ
ＡＴＴＴＧＣＴＧＡＡ ＧＴＧＣＡＧＴＴＴＡ ＡＴ
ＡＡＴＧＡＣＴＧ Ａ
１２４１
【００２５】配列番号：２配列の長さ：２１配列の型：
核酸 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 配列 ＧＡＲＣＲＡＡＡＴＡ ＡＴＴＴＡＴＡＴＧＴ Ｇ
２１
核酸 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 配列 ＧＡＲＣＲＡＡＡＴＡ ＡＴＴＴＡＴＡＴＧＴ Ｇ
２１
【００２６】配列番号：３
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
アンチセンス：Ｙｅｓ
配列
ＴＧＡＴＧＡＴＧＲＣ ＡＡＴＴＣＡＧＴＡＴ
２０
２０
【図１】ＶＴ１、ＶＴ２、ＶＴ２ｖｐ、ＶＴ２ｖｈａ、
およびＶＴ２ｖｈｂ遺伝子の配列を比較した図である。 「−」はＶＴ２遺伝子の配列と同一であることを示し、
「＋」は欠失を示す。四角で囲った部分は、プライマ−
の設計に選択された部分である。
およびＶＴ２ｖｈｂ遺伝子の配列を比較した図である。 「−」はＶＴ２遺伝子の配列と同一であることを示し、
「＋」は欠失を示す。四角で囲った部分は、プライマ−
の設計に選択された部分である。
【図２】ＶＴ１、ＶＴ２、ＶＴ２ｖｐ、ＶＴ２ｖｈａ、
およびＶＴ２ｖｈｂ遺伝子の配列を比較した図であり、
図１の続きである。「−」はＶＴ２遺伝子の配列と同一
であることを示し、「＋」は欠失を示す。四角で囲った
部分は、プライマ−の設計に選択された部分である。
およびＶＴ２ｖｈｂ遺伝子の配列を比較した図であり、
図１の続きである。「−」はＶＴ２遺伝子の配列と同一
であることを示し、「＋」は欠失を示す。四角で囲った
部分は、プライマ−の設計に選択された部分である。
【図３】本発明の方法により増幅したＤＮＡ断片を、６
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により検出した結
果を示す図である。
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により検出した結
果を示す図である。
Claims (6)
- 【請求項１】ＶＴ１、ＶＴ２、ＶＴ２ｖｐ、ＶＴ２ｖｈ
ａ、およびＶＴ２ｖｈｂ遺伝子全てに対して高い相同性
を有するプライマ−。 - 【請求項２】該遺伝子全てに対して、同一、または、１
〜２塩基しか異ならないことを特徴とする請求項１記載
のプライマ−。 - 【請求項３】１５〜２５塩基長を有する請求項１記載の
プライマ−。 - 【請求項４】塩基配列：５’ＧＡＲＣＲＡＡＡＴＡＡＴ
ＴＴＡＴＡＴＧＴＧ ３’または５’ＴＧＡＴＧＡＴＧ
ＲＣＡＡＴＴＣＡＧＴＡＴ ３’（但し、ＲはＡまたは
Ｇを表わす。）のうち、少なくとも連続した１５塩基ま
たはその相補鎖を有する請求項１記載のプライマ−。 - 【請求項５】塩基配列：５’ＧＡＧＣＧＡＡＡＴＡＡＴ
ＴＴＡＴＡＴＧＴＧ ３’または５’ＴＧＡＴＧＡＴＧ
ＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＡＴ ３’のうち、少なくとも連
続した１５塩基またはその相補鎖を有する請求項１記載
のプライマ−。 - 【請求項６】請求項１〜５のいずれかに記載のプライマ
−を用いることを特徴とする、ＰＣＲ法によるＶｅｒｏ
毒素遺伝子の検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3087610A JP2905944B2 (ja) | 1991-03-26 | 1991-03-26 | Ｖｅｒｏ毒素遺伝子の検出方法およびそれに用いるプライマ− |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3087610A JP2905944B2 (ja) | 1991-03-26 | 1991-03-26 | Ｖｅｒｏ毒素遺伝子の検出方法およびそれに用いるプライマ− |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04297488A true JPH04297488A (ja) | 1992-10-21 |
| JP2905944B2 JP2905944B2 (ja) | 1999-06-14 |
Family
ID=13919740
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3087610A Expired - Fee Related JP2905944B2 (ja) | 1991-03-26 | 1991-03-26 | Ｖｅｒｏ毒素遺伝子の検出方法およびそれに用いるプライマ− |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2905944B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0669399A2 (en) * | 1994-02-28 | 1995-08-30 | Shimadzu Corporation | Oligonucleotides and method for detecting bacteria |
| EP0864657A1 (fr) * | 1997-03-14 | 1998-09-16 | Centre National d'Etudes Vétérinaires et Alimentaires CNEVA | Oligonucléotides dérivés des gènes vts de bactéries E. coli productrices de vérotoxines et leurs utilisations |
-
1991
- 1991-03-26 JP JP3087610A patent/JP2905944B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0669399A2 (en) * | 1994-02-28 | 1995-08-30 | Shimadzu Corporation | Oligonucleotides and method for detecting bacteria |
| EP0669399A3 (en) * | 1994-02-28 | 1996-05-22 | Shimadzu Corp | Oligonucleotides and methods for the detection of bacteria. |
| US5795717A (en) * | 1994-02-28 | 1998-08-18 | Shimadzu Corporation | Oligonucleotides for detecting bacteria and detection process |
| US6218110B1 (en) | 1994-02-28 | 2001-04-17 | Shimadzu Corporation | Oligonucleotides for detecting verotoxin-producing E. coli and detection process |
| EP0864657A1 (fr) * | 1997-03-14 | 1998-09-16 | Centre National d'Etudes Vétérinaires et Alimentaires CNEVA | Oligonucléotides dérivés des gènes vts de bactéries E. coli productrices de vérotoxines et leurs utilisations |
| FR2760749A1 (fr) * | 1997-03-14 | 1998-09-18 | Veterinaires Et Alimentaires C | Oligonucleotides derives des genes vts de bacteries e. coli productrices de verotoxines, et leurs utilisations |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2905944B2 (ja) | 1999-06-14 |
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