JPH04297488A - Vero毒素遺伝子の検出方法およびそれに用いるプライマ− - Google Patents

Vero毒素遺伝子の検出方法およびそれに用いるプライマ−

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JPH04297488A
JPH04297488A JP3087610A JP8761091A JPH04297488A JP H04297488 A JPH04297488 A JP H04297488A JP 3087610 A JP3087610 A JP 3087610A JP 8761091 A JP8761091 A JP 8761091A JP H04297488 A JPH04297488 A JP H04297488A
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竹田 美文
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、PCR(DNA増幅)
法によるVero毒素遺伝子の検出方法およびそれに用
いるプライマ−に関する。
【0002】
【従来の技術】Vero毒素産生性大腸菌(Verot
oxin−producing Escherichi
a coli, VTEC)による出血性大腸炎や溶血
性尿毒症症侯群の報告例は、我が国においても年々増加
の傾向にある。下痢と腹痛を伴う症状から短期間で溶血
性尿毒症症侯群を続発し、死亡する例も報告されており
、VTECの迅速な検出・同定法の確立が急務とされて
いる。
【0003】本菌感染において重要な病原的役割を果た
すと考えられているVero毒素(VT)は、現在まで
に少なくとも5種類が報告されている。すなわち、志賀
赤痢菌の産生する志賀毒素と分子構造が全く同一のVT
1、生物学的性状はVT1と類似しているが免疫学的物
理化学的性状が全く異なるVT2、VT2と一部共通抗
原性を有する豚浮腫病由来の大腸菌が産生するVT2v
p、VT2と一部共通抗原性を有し溶血性尿毒症症侯群
患者由来の大腸菌の産生するVT2vha、VT2vh
bの5種類である。
【0004】この5種類のVTのDNA配列は、以下の
通り、既に報告されている。 VT1: Microbial Pathogenes
is 1987, 2: 147−153J. Bac
teriol., Sept. 1987, p. 4
313−4319, Vol. 169, No. 9 Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, Vol. 84,pp. 4364−4368,
 July 1987 Microbial Pathogenesis 19
88, 5: 357−369VT2: FEMS M
icrobiology Letters 44 (1
987) 109−114(配列番号:1) VT2vp: Microbial Pathogen
esis 1988,5: 419−426J. Ba
cteriol., Sept. 1988, p. 
4223−4230, Vol. 170, No. 
9 VT2vha、VT2vhb: Microbial 
Pathogenesis 1990, 8: 47−
60
【0005】また、VT1遺伝子およびVT2遺伝子の
それぞれをPCR法により増幅したという報告が既にな
されている。 VT1: The Journal of Infec
tious Diseases 1990;162:1
195−1198 VT2: Journal of Clinical 
Microbiology, Oct. 1990, 
p. 2351−2353, Vol. 28, No. 10
【0006】このように、VT1遺伝子およびVT2遺
伝子のPCR法による増幅の報告はあるものの、それ以
外のVT2vp、VT2vha、VT2vhb遺伝子の
増幅に関する報告は無く、さらに、これら5つの遺伝子
全てを増幅させうるプライマ−の報告も無い。
【0007】
【発明が解決しようとする課題】上記の通り、VT1、
VT2、VT2vp、VT2vha、およびVT2vh
b遺伝子全てに共通なプライマ−は未だ報告されておら
ず、現在のところVTECの検出のためには、各遺伝子
それぞれを別個に検出せざるをえない。これらはVTE
Cの迅速な検出法とは言い難く、VT1、VT2、VT
2vp、VT2vha、およびVT2vhb遺伝子全て
をPCR法で増幅し得るプライマ−が待望されていた。
【0008】
【課題を解決するための手段】本発明は、PCR法によ
って、VT1、VT2、VT2vp、VT2vha、お
よびVT2vhb遺伝子全てを増幅し得るプライマ−を
提供する。
【0009】本発明のプライマ−は、VT1、VT2、
VT2vp、VT2vha、およびVT2vhb遺伝子
全てに対して高い相同性を有するものであ。すなわち、
本発明のプライマ−は、連続した15〜25塩基長を有
し、5つの遺伝子それぞれに対して、同一か、または、
1〜2塩基しか異ならないことを特徴とする。
【0010】具体的には、5つの遺伝子の配列を比較し
て(図1および図2参照)、これらの遺伝子配列の相同
性が高い、以下の部分から本発明のプライマ−がデザイ
ンされる(「−」は同一塩基)。
【0011】 VT1   :・・・−−A−G−−−−−−−−−−
−−−−−−・・・VT2   :・・・GAGCAA
AATAATTTATATGTG・・・VT2vp :
・・・−−A−G−−−−−−−−−−−−−−−−・
・・VT2vha:・・・−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−−・・・VT2vhb:・・・−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−−−・・・(図1参照
【0012】 VT1   :・・・−−−−−−−−−−−T−−−
−−−−−・・・VT2   :・・・ATACTGA
ATTGCCATCATCA・・・VT2vp :・・
・−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−・・・V
T2vha:・・・−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−−・・・VT2vhb:・・・−−−−−−−−
−−−−−−−−−−−−・・・(図2参照)
【0013】この部分を選択すれば、15〜25塩基に
わたり、各遺伝子に対して、同一または1〜2塩基だけ
異なるプライマ−をデザインすることができる。例えば
、 センスプライマ−:5’GARCRAAATAATTT
ATATGTG 3’ (配列番号:2) アンチセンスプライマ−:5’TGATGATGRCA
ATTCAGTAT 3’ (配列番号:3) (但し、RはAまたはGを表わす。)なるプライマ−を
デザインできる。
【0014】さらに詳細には、本発明に用いられたプラ
イマ−は、 センスプライマ−:5’GAGCGAAATAATTT
ATATGTG 3’ (配列番号:2) アンチセンスプライマ−:5’TGATGATGGCA
ATTCAGTAT 3’ (配列番号:3) である。これらは、各遺伝子に対して、同一または1塩
基しか異ならない。
【0015】これらのプライマ−に対する相補鎖も、も
ちろん本発明のプライマ−として用いることができる。 また、これらのプライマ−を数塩基短縮または延長して
も、15〜25塩基にわたり、各遺伝子に対して、同一
または1〜2塩基だけ異なるものとなることは図1およ
び図2から明らかであり、そのようなものも本発明の範
囲に含まれる。
【0016】通常、PCR法に用いるプライマ−は、1
5塩基以上であると、所望の特異性が得られる。従って
、本発明のプライマ−も15塩基以上であることが望ま
しく、上記の配列のうち、少なくとも連続した15塩基
またはその相補鎖を有するプライマ−も本発明に包含さ
れる。
【0017】本発明のプライマ−は、PCR法によるV
T遺伝子の検出用プライマ−として用いられるだけでな
く、VT遺伝子の検出用プロ−ブとして用いることもで
きる。 従って、本発明のプライマ−と同一の塩基配列を有する
オリゴヌクレオチドは、その用途に限定されず、すべて
本発明に包含される。
【0018】本発明のプライマ−を用いるPCR法によ
るVT遺伝子の検出は、通常の方法で行なえばよい。例
えば、被検菌を溶菌させたのち、Taq DNAポリメ
ラ−ゼを加え、変性(94℃、1分)→アニ−リング(
58℃、1.5分)→合成(72℃、1.5分)の反応
を約30回繰り返し、増幅したDNA断片をポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法により検出すればよい。
【0019】
【実施例】プライマ−:それぞれのVTをコ−ドする遺
伝子の塩基配列を比較して(図1および図2参照)、相
同性が高い領域を検索し、以下の配列を有するオリゴヌ
クレオチドを合成した。 センスプライマ−:5’GAGCGAAATAATTT
ATATGTG 3’ (配列番号:2) アンチセンスプライマ−:5’TGATGATGGCA
ATTCAGTAT 3’ (配列番号:3)
【0020】使用菌株:各VTの陽性コントロ−ルとし
て、VT1、VT2、VT2vha、VT2vhbにつ
いては、クロ−ニング株を、VT2vpについては、オ
リゴプロ−ブでVT2vp以外のVTは保持していない
ことを確認した菌株を用いた。
【0021】PCR:DNAの増幅反応は、10 mM
 Tris−HCl (pH8.5)、50 mM K
Cl、1.5 mM MgCl2、0.01%(W/V
) ゼラチン、200 μM各dNTP、および1 μ
M各 プライマ−を含む溶液に、被検菌の培養液1μl
を加えた反応溶液100μlを94℃、5分間で溶菌さ
せた後、Taq DNAポリメラ−ゼ2.5単位を加え
、変性(94℃、1分)→アニ−リング(58℃、1.
5分)→合成(72℃、1.5分)の反応を30回繰り
返した。増幅したDNA断片は、6%ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法により検出した。
【0022】結果:増幅したDNA断片を、6%ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法により検出した結果を、図
3に示す。図3から明らかな様に、本発明のプライマ−
を用いてPCRを行なえば、VT1、VT2、VT2v
p、VT2vha、VT2vhb遺伝子のいずれか1つ
を保持する菌株について、所望の位置にバンドが検出さ
れ、いずれをも保持しない菌株では、バンドが検出され
なかった。
【0023】
【発明の効果】本発明のプライマ−を用いるVT遺伝子
の検出方法によると、VT1、VT2、VT2vp、V
T2vha、VT2vhb遺伝子のいずれでも検出する
ことが可能であり、VTECの迅速な検出が可能になる
【配列表】
【0024】配列番号:1 配列の長さ:1241 配列の型:核酸 配列 ATGAAGTGTA TATTATTTAA ATG
GGTACTG TGCCTGTTAC TGGGTT
TTTC TTCGGTATCC     60TAT
TCCCGGG AGTTTACGAT AGACTT
TTCG ACCCAACAAA GTTATGTCT
C TTCGTTAAAT    120AGTATA
CGGA CAGAGATATC GACCCCTCT
T GAACATATAT CTCAGGGGAC C
ACATCGGTG    180TCTGTTATT
A ACCACACCCC ACCGGGCAGT T
ATTTTGCTG TGGATATACG AGGG
CTTGAT    240GTCTATCAGG C
GCGTTTTGA CCATCTTCGT CTGA
TTATTG AGCAAAATAA TTTATAT
GTG    300GCCGGGTTCG TTAA
TACGGC AACAAATACT TTCTACC
GTT TTTCAGATTT TACACATATA
    360TCAGTGCCCG GTGTGAC
AAC GGTTTCCATG ACAACGGACA
 GCAGTTATAC CACTCTGCAA   
 420CGTGTCGCAG CGCTGGAACG
 TTCCGGAATG CAAATCAGTC GT
CACTCACT GGTTTCATCA    48
0TATCTGGCGT TAATGGAGTT CA
GTGGTAAT ACAATGACCA GAGAT
GCATC CAGAGCAGTT    540CT
GCGTTTTG TCACTGTCAC AGCAG
AAGCC TTACGCTTCA GGCAGATA
CA GAGAGAATTT    600CGTCA
GGCAC TGTCTGAAAC TGCTCCTG
TG TATACGATGA CGCCGGGAGA 
CGTGGACCTC    660ACTCTGAA
CT GGGGGCGAAT CAGCAATGTG 
CTTCCGGAGT ATCGGGGAGA GGA
TGGTGTC    720AGAGTGGGGA 
GAATATCCTT TAATAATATA TCA
GCGATAC TGGGGACTGT GGCCGT
TATA    780CTGAATTGCC ATC
ATCAGGG GGCGCGTTCT GTTCGC
GCCG TGAATGAAGA GAGTCAACC
A    840GAATGTCAGA TAACTG
GCGA CAGGCCTGTT ATAAAAATA
A ACAATACATT ATGGGAAAGT  
  900AATACAGCTG CAGCGTTTC
T GAACAGAAAG TCACAGTTTT T
ATATACAAC GGGTAAATAA    9
60AGGAGTTAAG CATGAAGAAG A
TGTTTATGG CGGTTTTATT TGCA
TTAGCT TCTGTTAATG   1020C
AATGGCGGC GGATTGTGCT AAAG
GTAAAA TTGAGTTTTC CAAGTAT
AAT GAGGATGACA   1080CATT
TACAGT GAAGGTTGAC GGGAAAG
AAT ACTGGACCAG TCGCTGGAAT
 CTGCAACCGT   1140TACTGCA
AAG TGCTCAGTTG ACAGGAATGA
 CTGTCACAAT CAAATCCAGT AC
CTGTGAAT   1200CAGGCTCCGG
 ATTTGCTGAA GTGCAGTTTA AT
AATGACTG A               
        1241
【0025】配列番号:2配列の長さ:21配列の型:
核酸 配列の種類:他の核酸  合成DNA アンチセンス:No 配列 GARCRAAATA ATTTATATGT G  
                         
                    21
【0026】配列番号:3 配列の長さ:20 配列の型:核酸 配列の種類:他の核酸  合成DNA アンチセンス:Yes 配列 TGATGATGRC AATTCAGTAT    
                         
                    20
【図面の簡単な説明】
【図1】VT1、VT2、VT2vp、VT2vha、
およびVT2vhb遺伝子の配列を比較した図である。 「−」はVT2遺伝子の配列と同一であることを示し、
「+」は欠失を示す。四角で囲った部分は、プライマ−
の設計に選択された部分である。
【図2】VT1、VT2、VT2vp、VT2vha、
およびVT2vhb遺伝子の配列を比較した図であり、
図1の続きである。「−」はVT2遺伝子の配列と同一
であることを示し、「+」は欠失を示す。四角で囲った
部分は、プライマ−の設計に選択された部分である。
【図3】本発明の方法により増幅したDNA断片を、6
%ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により検出した結
果を示す図である。

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】VT1、VT2、VT2vp、VT2vh
    a、およびVT2vhb遺伝子全てに対して高い相同性
    を有するプライマ−。
  2. 【請求項2】該遺伝子全てに対して、同一、または、1
    〜2塩基しか異ならないことを特徴とする請求項1記載
    のプライマ−。
  3. 【請求項3】15〜25塩基長を有する請求項1記載の
    プライマ−。
  4. 【請求項4】塩基配列:5’GARCRAAATAAT
    TTATATGTG 3’または5’TGATGATG
    RCAATTCAGTAT 3’(但し、RはAまたは
    Gを表わす。)のうち、少なくとも連続した15塩基ま
    たはその相補鎖を有する請求項1記載のプライマ−。
  5. 【請求項5】塩基配列:5’GAGCGAAATAAT
    TTATATGTG 3’または5’TGATGATG
    GCAATTCAGTAT 3’のうち、少なくとも連
    続した15塩基またはその相補鎖を有する請求項1記載
    のプライマ−。
  6. 【請求項6】請求項1〜5のいずれかに記載のプライマ
    −を用いることを特徴とする、PCR法によるVero
    毒素遺伝子の検出方法。
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