JPH04275299A - New physiologically active peptide - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】0001
【産業上の利用分野】本発明は、Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｐｒｏ−
Ｐｈｅのアミノ酸配列を有する新規ペプチド（但しＸは
ジペプチドまたは中性アミノ酸、Ｙは芳香族アミノ酸、
Ｚは中性アミノ酸をそれぞれ示す）に関する。本発明の
ペプチドは動脈弛緩活性を有し、医薬品、生化学試薬な
どに利用可能である。[Industrial Field of Application] The present invention relates to X-Y-Z-Pro-
A novel peptide having the amino acid sequence of Phe (where X is a dipeptide or a neutral amino acid, Y is an aromatic amino acid,
Z represents a neutral amino acid). The peptide of the present invention has arterial relaxing activity and can be used in pharmaceuticals, biochemical reagents, and the like.
【０００２】0002
【従来の技術】従来から、ペプチド化合物が動脈弛緩活
性を有することは広く知られている。例えばブラジキニ
ン、サブスタンスＰ、ニューロテンシンはその代表的な
ものである。近年食品由来のペプチドに種々の生理活性
が存在することが知られてきており、多くの生理活性ペ
プチドが発表されている。これらのペプチドは食品とし
て摂取された後、栄養効果以外に種々の生体機能を調節
していることが推定されている。本発明者らは、人乳カ
ゼインのアミノ酸配列を研究する過程において、強い動
脈弛緩活性や血圧降下作用を有する新規ペプチドを見出
し、カソキシンＤと命名した。このカソキシンＤは血圧
降下剤としても有用であり、特願平３−１４７６９号と
して特許出願した。このペプチドは、Ｔｙｒ−Ｖａｌ−
Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅの配列を有す
るヘプタペプチドである。本発明者らは、このペプチド
のアミノ酸配列と生理活性との関係の研究を行う過程に
おいて、動脈弛緩活性に必須の構造を見出し、本発明を
完成するに到った。BACKGROUND OF THE INVENTION It has been widely known that peptide compounds have arterial relaxing activity. For example, bradykinin, substance P, and neurotensin are representative examples. In recent years, it has become known that food-derived peptides have various physiological activities, and many bioactive peptides have been published. It is estimated that these peptides, after being ingested as food, regulate various biological functions in addition to their nutritional effects. In the course of researching the amino acid sequence of human milk casein, the present inventors discovered a novel peptide that has strong arterial relaxing activity and blood pressure lowering activity, and named it casoxin D. This casoxin D is also useful as a hypotensive agent, and a patent application was filed as Japanese Patent Application No. 3-14769. This peptide is Tyr-Val-
It is a heptapeptide having the sequence Pro-Phe-Pro-Pro-Phe. In the process of researching the relationship between the amino acid sequence and physiological activity of this peptide, the present inventors discovered a structure essential for arterial relaxing activity and completed the present invention.
【０００３】0003
【発明が解決しようとする課題】本発明により提供され
るペプチドはＸ−Ｙ−Ｚ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅのアミノ酸配
列を有する新規ペプチド（但しＸはジペプチドまたは中
性アミノ酸、Ｙは芳香族アミノ酸、Ｚは中性アミノ酸を
それぞれ示す）であり、いずれもカソキシンＤと同様に
動脈弛緩作用を有する。本発明は、このような新規配列
を有し、動脈弛緩活性を有するペプチドの提供を課題と
する。[Problems to be Solved by the Invention] The peptide provided by the present invention is a novel peptide having the amino acid sequence X-Y-Z-Pro-Phe (where X is a dipeptide or a neutral amino acid, Y is an aromatic amino acid, and Z are neutral amino acids), and like casoxin D, both have an arterial relaxing effect. An object of the present invention is to provide a peptide having such a novel sequence and having arterial relaxing activity.
【０００４】0004
【課題を解決するための手段】カソキシンＤは[Means for solving the problem] Casoxin D is
【配列表
１】に示す配列を有するヘプタペプチドであり、強い血
圧降下作用と動脈弛緩活性を有する。またオピオイドア
ンタゴニスト活性や、モルモット回腸収縮作用などの活
性も有している。カソキシンＤの配列Ｔｙｒ−Ｖａｌ−
Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅの配列のうち
、Ｎ末端Ｔｙｒを除去することによりオピオイドアンタ
ゴニスト作用および回腸収縮作用は消失するが、動脈弛
緩作用は消失しない。またＮ末端２残基以上またはＣ末
端のＰｈｅの欠失により全ての生理活性が消失すること
を見出した。これらの研究を介し、カソキシンＤの生理
活性は、異なったレセプターに対し結合することにより
もたらされることが推定される。本発明においては、動
脈弛緩活性を発現するのに必須なアミノ酸配列を検討し
た結果、Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅのアミノ酸配列を
有するペプチド（但しＸはジペプチドまたは中性アミノ
酸、Ｙは芳香族アミノ酸、Ｚは中性アミノ酸をそれぞれ
示す）が必要単位であることが判明した。It is a heptapeptide having the sequence shown in [Sequence Listing 1], and has a strong blood pressure lowering effect and arterial relaxing activity. It also has opioid antagonist activity and guinea pig ileal constriction activity. Sequence of casoxin D Tyr-Val-
By removing the N-terminal Tyr in the Pro-Phe-Pro-Pro-Phe sequence, the opioid antagonist action and ileal contracting action are abolished, but the arterial relaxing action is not abolished. It was also found that deletion of two or more residues at the N-terminus or Phe at the C-terminus abolishes all physiological activities. Through these studies, it is presumed that the physiological activity of casoxin D is brought about by binding to different receptors. In the present invention, as a result of examining the amino acid sequence essential for expressing arterial relaxing activity, we found a peptide having the amino acid sequence X-Y-Z-Pro-Phe (where X is a dipeptide or a neutral amino acid, and Y is an aromatic amino acid). It was found that the amino acids of the group Z (Z indicates a neutral amino acid, respectively) are the necessary units.
【０００５】このようなペプチドは、市販のペプチドシ
ンセサイザーを用いることにより容易に合成可能である
。例えば、合成装置として、バイオサーチ社製のＳａｍ
２ペプチド合成装置を用いてペプチドの合成を行う。
すなわち、樹脂に活性基を保護したアミノ酸を吸着させ
、これにデブロッキング液を注入して保護基を除去し、
活性基を保護したアミノ酸を注入し、両者を反応させ、
ジペプチドを合成する。この操作を繰り返すことによっ
て目的とする配列を有するペプチドを合成する。ペプチ
ドの担体としての樹脂からの脱離と保護基の除去は、１
０％アニソールを含む無水フッ化水素中で０℃の温度条
件下に一時間攪拌することにより行う。[0005] Such peptides can be easily synthesized using a commercially available peptide synthesizer. For example, as a synthesis device, the Sam
2. Peptides are synthesized using a peptide synthesizer. That is, an amino acid with a protected active group is adsorbed onto a resin, and a deblocking solution is injected into the resin to remove the protecting group.
Inject amino acids with protected active groups and react with each other,
Synthesize dipeptides. By repeating this operation, a peptide having the desired sequence is synthesized. The removal of the peptide from the resin as a carrier and the removal of the protecting group are performed in 1
This is carried out by stirring in anhydrous hydrogen fluoride containing 0% anisole at a temperature of 0° C. for one hour.
【０００６】上記フッ化水素を留去した後、樹脂をエー
テルで洗浄し、３０％酢酸によりペプチドを抽出する。
抽出により得られたペプチドは、３０％酢酸で平衡化し
たバイオゲルＰ−２カラムを用いてゲル濾過した後、オ
クタデシリル（ＯＤＳ）カラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ
５Ｃ１８）により精製する。目的とするペプチドは０．
１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの直線的濃
度勾配により、それぞれのペプチド特有の溶出位置を示
す。After distilling off the hydrogen fluoride, the resin is washed with ether and the peptides are extracted with 30% acetic acid. The peptides obtained by extraction were subjected to gel filtration using a Biogel P-2 column equilibrated with 30% acetic acid, followed by octadecyl (ODS) column (Cosmosil).
5C18). The target peptide is 0.
A linear gradient of acetonitrile with 1% trifluoroacetic acid indicates the unique elution position of each peptide.
【０００７】このようにして得られたペプチドのアミノ
酸配列をプロテインシーケンサーにより配列分析、アミ
ノ酸分析計によるアミノ酸分析により特定できる。得ら
れたペプチドは以下に示す動脈弛緩活性により活性を検
定する。イヌ腸管膜動脈を摘出し、そのらせん状切片の
一端を糸を介し、等長製トランスジューサに接続し、他
端を内容積２ｍｌのマグナス管の底に固定する。マグナ
ス管にはクレプス─カンゼライト液を満たし、３７℃の
温度に保ち、Ｏ２ ／ＣＯ２ 混合ガス（９５：５）を
通気する。０．５μＭのプロスタグランジンＦ２ αに
よって収縮させた腸管膜動脈に対し、５０％弛緩させる
ペプチド濃度をＥＣ５０として標記する。The amino acid sequence of the peptide thus obtained can be identified by sequence analysis using a protein sequencer and amino acid analysis using an amino acid analyzer. The activity of the obtained peptide is assayed by the arterial relaxing activity shown below. The canine mesenteric artery is excised, one end of its spiral section is connected to an equal-length transducer via a thread, and the other end is fixed to the bottom of a Magnus tube with an internal volume of 2 ml. The Magnus tube is filled with Krebs-Canzerite solution, maintained at a temperature of 37°C, and bubbled with an O2/CO2 mixed gas (95:5). The peptide concentration that causes 50% relaxation of mesenteric arteries contracted by 0.5 μM prostaglandin F2α is designated as EC50.
【０００８】下記表１に本発明の合成ペプチドのアミノ
酸配列と腸管動脈の弛緩活性を示す。Table 1 below shows the amino acid sequence and intestinal artery relaxing activity of the synthetic peptide of the present invention.
【表１】[Table 1]
【０００９】カソキシンＤの持つ動脈弛緩活性を発揮す
るためには、 Ｘ− Ｙ − Ｚ −Ｐｒｏ−Ｐｈｅの
配列が必要である。
式中のＸはジペプチドまたは中性アミノ酸であり、とく
に好ましくはＭｅｔ，Ｖａｌ，Ｐｒｏのいずれかのアミ
ノ酸であり、Ｙは好ましくは芳香族アミノ酸、特に好ま
しくはＴｙｒまたはＰｈｅであり、Ｚは中性アミノ酸、
特に好ましくは、ＰｒｏまたはＧｌｎである。このよう
な配列を有するペプチドおよびペプチドの塩は本発明に
包含されるものである。このようなペプチドの塩として
は、ナトリウム塩、カリウム塩、酢酸塩等を例示するこ
とができる。また、本発明により提供されるペプチドを
、配列中に含むカゼインは遺伝子操作により容易に生産
が可能であり、生体内での消化によりこのようなペプチ
ドの遊離を目的とする蛋白質やペプチドも包含する。[0009] In order to exert the arterial relaxing activity of casoxin D, the sequence X-Y-Z-Pro-Phe is required. In the formula, X is a dipeptide or a neutral amino acid, particularly preferably Met, Val, or Pro, Y is preferably an aromatic amino acid, particularly preferably Tyr or Phe, and Z is a neutral amino acid. amino acid,
Particularly preferred is Pro or Gln. Peptides and peptide salts having such sequences are included in the present invention. Examples of such peptide salts include sodium salts, potassium salts, acetate salts, and the like. Furthermore, casein containing the peptide provided by the present invention in its sequence can be easily produced by genetic manipulation, and also includes proteins and peptides whose purpose is to release such peptides by digestion in vivo. .
【００１０】以下に実施例を示し、本発明をさらに詳細
に説明する。[0010] The present invention will be explained in more detail with reference to Examples below.
【実施例１】 Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐ
ｈｅ 、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐ
ｈｅ の合成
Ｓａｍ ｔｗｏペプチド（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ社製）
により、同装置の標準プロトコールに従って合成した。
１ｇ当たり０．５ｍｍｏｌのｔ−Ｂｏｃ−Ｐｈｅを結合
したアシルオキシメチル樹脂２ｇをペプチド合成装置の
反応容器にセットし、４５％（Ｖ／Ｖ）トリフルオロ酢
酸、２．５％（Ｖ／Ｖ）アニソール、５２．５％（Ｖ／
Ｖ）ジクロロメタンによる洗浄の後、１０％（Ｖ／Ｖ）
ジイソプロピルエチルアミンを含むジクロロメタンにて
樹脂中和し、ジクロロメタンにより洗浄した。その後６
．７ｍｍｏｌのｔ−Ｂｏｃ−Ｐｒｏ 及び６．７ｍｍｏ
ｌのジイソプロピルカルボジイミド（それぞれ理論当量
の６．７倍）を含む３４ｍｌのジクロロメタン、ジメチ
ルフォルムアミド混合液中で２時間室温にて反応せしめ
た。ジメチルフォルムアミド及びジクロロメタンにて順
次洗浄した後、０．４Ｍ Ｎ−アセチルイミダゾール
を含むジメチルフォルムアミド中で未反応のαアミノ基
をアセチル化した。この樹脂をジクロロメタンで洗浄し
た後、上記と同様にデブロッキングを行い、以下同様に
Ｃ末端側からｔ−Ｂｏｃ−Ｐｒｏ，ｔ−Ｂｏｃ−Ｐｈｅ
，ｔ−Ｂｏｃ−Ｐｒｏ を結合せしめｔ−Ｂｏｃ−Ｐｒ
ｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ 樹脂を得た。[Example 1] Pro-Phe-Pro-Pro-P
he, Val-Pro-Phe-Pro-Pro-P
Synthetic Sam two peptide of he (Biosearch)
was synthesized according to the standard protocol of the same instrument. 2 g of acyloxymethyl resin bound with 0.5 mmol of t-Boc-Phe per 1 g was set in a reaction vessel of a peptide synthesizer, and 45% (V/V) trifluoroacetic acid and 2.5% (V/V) anisole were added. , 52.5% (V/
V) 10% (V/V) after washing with dichloromethane
The resin was neutralized with dichloromethane containing diisopropylethylamine and washed with dichloromethane. then 6
．． 7 mmol of t-Boc-Pro and 6.7 mmol
The mixture was reacted for 2 hours at room temperature in 34 ml of a mixture of dichloromethane and dimethylformamide containing 1 liter of diisopropylcarbodiimide (each 6.7 times the theoretical equivalent). After sequentially washing with dimethylformamide and dichloromethane, unreacted α-amino groups were acetylated in dimethylformamide containing 0.4M N-acetylimidazole. After washing this resin with dichloromethane, deblocking was performed in the same manner as above, and t-Boc-Pro, t-Boc-Phe
, t-Boc-Pro and t-Boc-Pr
o-Phe-Pro-Pro-Phe resin was obtained.
【００１１】この樹脂を１０％アニソールを含む無水フ
ッ化水素中で１時間０℃にて反応させた後、フッ化水素
の留去及びエーテルによる洗浄を行った。得られたペプ
チド及び樹脂の混合物から３０％酢酸にてペプチドを抽
出し凍結乾燥によって約６００ｍｇの粗ペプチドを得た
。This resin was reacted for 1 hour at 0° C. in anhydrous hydrogen fluoride containing 10% anisole, and then the hydrogen fluoride was distilled off and washed with ether. The peptide was extracted from the resulting mixture of peptide and resin with 30% acetic acid and freeze-dried to obtain about 600 mg of crude peptide.
【００１２】得られた粗ペプチドを０．１％トリフルオ
ロ酢酸に溶解した後、オクタデシルシラン（ＯＤＳ）カ
ラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８ ２５０×２０
ｍｍ、ナカライテスク社製）により、０．１％のトリフ
ルオロ酢酸を含むアセトニトリルの直線的濃度勾配（０
〜４０％／４０分、１０ｍｌ／分）にて展開した。目的
とするペプチドはアセトニトリル濃度約３４．５％で溶
出された。このようにして得られたペプチドのアミノ酸
配列は、Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ で
あることは、アミノ酸分析およびプロテインシーケンサ
ー（アプライドバイオシステムズ製４７７Ａ）により確
認された。さらに、このペプチドをシリカゲル薄層クロ
マトグラフィ（ＴＬＣ）を行った。展開溶媒としてブタ
ノール：酢酸：ピリジン：水＝１５：３：１０：１２を
使用し展開させたところＲｆ値は０．５８であった。After dissolving the obtained crude peptide in 0.1% trifluoroacetic acid, it was applied to an octadecylsilane (ODS) column (Cosmosil 5C18 250×20
mm, manufactured by Nacalai Tesque), a linear concentration gradient of acetonitrile containing 0.1% trifluoroacetic acid (0
~40%/40 min, 10 ml/min). The target peptide was eluted at an acetonitrile concentration of about 34.5%. It was confirmed by amino acid analysis and a protein sequencer (477A manufactured by Applied Biosystems) that the amino acid sequence of the peptide thus obtained was Pro-Phe-Pro-Pro-Phe. Furthermore, this peptide was subjected to silica gel thin layer chromatography (TLC). When developed using butanol:acetic acid:pyridine:water=15:3:10:12 as a developing solvent, the Rf value was 0.58.
【００１３】なおペプチドの純品はＯＤＳカラム（Ｃｏ
ｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８，１５０×４６ｍｍ、ナカラ
イテスク社製）から０．１％トリフルオロ酢酸を含むア
セトニトリルの直線的濃度勾配（０〜４０％／４０分、
１ｍｌ／分）では、アセトニトリル濃度３４．５％濃度
においてシャープな単一ピークを示した。[0013] Pure peptide products can be obtained using an ODS column (Co
A linear concentration gradient of acetonitrile containing 0.1% trifluoroacetic acid (0 to 40%/40 minutes,
1 ml/min), a sharp single peak was observed at an acetonitrile concentration of 34.5%.
【００１４】上記Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐ
ｈｅ の合成工程において、ｔ−Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−Ｐｈ
ｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ樹脂にさらにｔ−Ｂｏｃ−
Ｖａｌ を結合せしめ、ｔ−Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−
Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ 樹脂を得た。この樹
脂を上記と同様に操作し、粗ペプチドを得た。この粗ペ
プチドを同様に０．１％トリフルオロ酢酸に溶解した後
、オクタデシルシラン（ＯＤＳ）カラム（Ｃｏｓｍｏｓ
ｉｌ ５Ｃ１８ ２５０×２０ｍｍ、ナカライテス
ク社製）により、０．１％のトリフルオロ酢酸を含むア
セトニトリルの直線的濃度勾配（０〜４０％／４０分、
１０ｍｌ／分）にて展開した。目的とするペプチドはア
セトニトリル濃度約３７％に溶出された。このようにし
て得られたペプチドのアミノ酸配列は、Ｖａｌ−Ｐｒｏ
−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ であることは、ア
ミノ酸分析およびプロテインシーケンサー（アプライド
バイオシステムズ製４７７Ａ）により確認された。又上
記と同様な条件でＴＬＣを行ったところＲｆ値は０．６
２であった。[0014] The above Pro-Phe-Pro-Pro-P
In the synthesis step of he, t-Boc-Pro-Ph
In addition to the e-Pro-Pro-Phe resin, t-Boc-
Val and t-Boc-Val-Pro-
A Phe-Pro-Pro-Phe resin was obtained. This resin was operated in the same manner as above to obtain a crude peptide. After dissolving this crude peptide in 0.1% trifluoroacetic acid in the same manner, it was added to an octadecylsilane (ODS) column (Cosmos).
A linear concentration gradient of acetonitrile containing 0.1% trifluoroacetic acid (0 to 40%/40 min,
10 ml/min). The target peptide was eluted at an acetonitrile concentration of about 37%. The amino acid sequence of the peptide thus obtained is Val-Pro
-Phe-Pro-Pro-Phe was confirmed by amino acid analysis and protein sequencer (477A manufactured by Applied Biosystems). When TLC was performed under the same conditions as above, the Rf value was 0.6.
It was 2.
【００１５】なおペプチドの純品はＯＤＳカラム（Ｃｏ
ｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８，１５０×４６ｍｍ、ナカラ
イテスク社製）から０．１％トリフルオロ酢酸を含むア
セトニトリルの直線的濃度勾配（０〜４０％／４０分、
１ｍｌ／分）では、アセトニトリル濃度３７％濃度にお
いてシャープな単一ピークを示した。[0015] Pure peptide products can be obtained using an ODS column (Co
A linear concentration gradient of acetonitrile containing 0.1% trifluoroacetic acid (0 to 40%/40 minutes,
1 ml/min), a sharp single peak was observed at an acetonitrile concentration of 37%.
【００１６】[0016]
【実施例２】 Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐ
ｒｏ−Ｐｈｅ 、Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐ
ｈｅ 、Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐ
ｈｅ 、Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ 、
Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ の
合成実施例１と同様にＳａｍ ｔｗｏ ペプチドシ
ンセサイザーを用いて合成を行った。まずｔ−Ｂｏｃ−
Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ 樹脂を調製し、この
樹脂にＶａｌ−Ｖａｌ，Ｖａｌ，Ｍｅｔ，Ｔｙｒ（Ｃｌ
２−Ｂｚｌ）−Ｐｒｏを結合させた樹脂を調製し、以下
は実施例１と同様に操作し目的とする各ペプチドを得た
。得られた精製ペプチドは、アミノ酸組成の分析、プロ
テインシーケンサーによる配列分析により、目的のペプ
チドであることを確認した。[Example 2] Val-Val-Phe-Pro-P
ro-Phe, Val-Phe-Pro-Pro-P
he, Val-Met-Phe-Pro-Pro-P
he, Met-Phe-Pro-Pro-Phe,
Synthesis of Tyr-Pro-Phe-Pro-Pro-Phe Synthesis was carried out in the same manner as in Example 1 using a Sam two peptide synthesizer. First, t-Boc-
Phe-Pro-Pro-Phe resin was prepared, and Val-Val, Val, Met, Tyr (Cl
A resin bound with 2-Bzl)-Pro was prepared, and the following operations were performed in the same manner as in Example 1 to obtain each desired peptide. The obtained purified peptide was confirmed to be the desired peptide through amino acid composition analysis and sequence analysis using a protein sequencer.
【００１７】また、実施例１と同様に、ペプチドの純品
はＯＤＳカラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ５Ｃ１８，１５０×
４６ｍｍ、ナカライテスク社製）から０．１％トリフル
オロ酢酸を含むアセトニトリルの直線的濃度勾配（０〜
４０％／４０分、１ｍｌ／分）溶出を行った。Ｖａｌ−
Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ はアセトニ
トリル３８．５％、Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−
Ｐｈｅ はアセトニトリル３５．５％、Ｖａｌ−Ｍｅｔ
−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ はアセトニトリル
３８％、Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ は
アセトニトリル３５％、Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒ
ｏ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ はアセトニトリル３６．５％の濃
度で溶出された。又、実施例１と同様の条件でＴＣＬを
行ったところ、それぞれのＲｆ値は０．７４、０．７１
、０．７４、０．７３、０．７０であった。[0017] Similarly to Example 1, pure peptides were prepared using an ODS column (Cosmosil 5C18, 150×
46 mm, manufactured by Nacalai Tesque) to a linear concentration gradient of acetonitrile containing 0.1% trifluoroacetic acid (0 to
40%/40 min, 1 ml/min) elution was performed. Val-
Val-Phe-Pro-Pro-Phe is acetonitrile 38.5%, Val-Phe-Pro-Pro-
Phe is acetonitrile 35.5%, Val-Met
-Phe-Pro-Pro-Phe is 38% acetonitrile, Met-Phe-Pro-Pro-Phe is 35% acetonitrile, Tyr-Pro-Phe-Pr
o-Pro-Phe was eluted at a concentration of 36.5% acetonitrile. Furthermore, when TCL was performed under the same conditions as in Example 1, the respective Rf values were 0.74 and 0.71.
, 0.74, 0.73, 0.70.
【００１８】[0018]
【実施例３】 Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐ
ｒｏ−Ｐｈｅ の合成実施例１と同様にＳａｍ ｔｗ
ｏペプチド（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ社製）により、同装置
の標準プロトコールに従って合成した。１ｇ当たり０．
５ｍｍｏｌのｔ−Ｂｏｃ−Ｐｈｅ を結合したアシルオ
キシメチル樹脂２ｇをペプチド合成装置の反応容器にセ
ットし、４５％（Ｖ／Ｖ）トリフルオロ酢酸、２．５％
（Ｖ／Ｖ）アニソール、５２．５％（Ｖ／Ｖ）ジクロロ
メタンによる洗浄の後、１０％（Ｖ／Ｖ）ジイソプロピ
ルエチルアミンを含むジクロロメタンにて樹脂中和し、
ジクロロメタンにより洗浄した。その後６．７ｍｍｏｌ
のｔ−Ｂｏｃ−Ｐｒｏ及び６．７ｍｍｏｌのジイソプロ
ピルカルボジイミド（それぞれ理論当量の６．７倍）を
含む３４ｍｌのジクロロメタン、ジメチルフォルムアミ
ド混合液中で２時間室温にて反応せしめた。ジメチルフ
ォルムアミド及びジクロロメタンにて順次洗浄した後、
０．４Ｍ Ｎ−アセチルイミダゾールを含むジメチル
フォルムアミド中で未反応のαアミノ基をアセチル化し
た。この樹脂をジクロロメタンにて洗浄した後、上記と
同様にデブロッキングを行い、以下同様にＣ末端側から
ｔ−Ｂｏｃ−Ｐｒｏ，ｔ−Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（Ｃｌ２ Ｂ
ｚｌ），ｔ−Ｂｏｃ−Ｐｒｏ，ｔ−Ｂｏｃ−Ｖａｌを結
合せしめｔ−Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ
−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ 樹脂を得た。[Example 3] Val-Pro-Tyr-Pro-P
Same as Synthesis Example 1 of ro-Phe, Sam tw
o peptide (manufactured by Biosearch) according to the standard protocol of the same device. 0.0% per 1g.
2 g of acyloxymethyl resin bound with 5 mmol of t-Boc-Phe was set in a reaction vessel of a peptide synthesizer, and 45% (V/V) trifluoroacetic acid, 2.5%
After washing with (V/V) anisole and 52.5% (V/V) dichloromethane, the resin was neutralized with dichloromethane containing 10% (V/V) diisopropylethylamine,
Washed with dichloromethane. Then 6.7 mmol
t-Boc-Pro and 6.7 mmol of diisopropylcarbodiimide (each 6.7 times the theoretical equivalent) in a 34 ml dichloromethane/dimethylformamide mixture for 2 hours at room temperature. After sequentially washing with dimethylformamide and dichloromethane,
Unreacted α-amino groups were acetylated in dimethylformamide containing 0.4M N-acetylimidazole. After washing this resin with dichloromethane, deblocking was performed in the same manner as above, and t-Boc-Pro, t-Boc-Tyr (Cl2 B
zl), t-Boc-Pro, t-Boc-Val are combined and t-Boc-Val-Pro-Tyr-Pro
-Pro-Phe resin was obtained.
【００１９】この樹脂を１０％アニソールを含む無水フ
ッ化水素中で１時間０℃にて反応させた後、フッ化水素
の留去及びエーテルによる洗浄を行った。得られたペプ
チド及び樹脂の混合物から３０％酢酸にてペプチドを抽
出し凍結乾燥によって約７００ｍｇの粗ペプチドを得た
。得られた粗ペプチドを０．１％トリフルオロ酢酸に溶
解した後、オクタデシルシラン（ＯＤＳ）カラム（Ｃｏ
ｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８ ２５０×２０ｍｍ、ナカ
ライテスク社製）により、０．１％のトリフルオロ酢酸
を含むアセトニトリルの直線的濃度勾配（０〜４０％／
４０分、１０ｍｌ／分）にて展開した。目的とするペプ
チドはアセトニトリル濃度約３０％に溶出された。この
ようにして得られたペプチドのアミノ酸配列は、Ｖａｌ
−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ であるこ
とは、アミノ酸分析およびプロテインシーケンサー（ア
プライドバイオシステムズ製４７７Ａ）により確認され
た。又、実施例１と同様の条件でＴＬＣを行ったところ
、Ｒｆ値は０．５９であった。This resin was reacted in anhydrous hydrogen fluoride containing 10% anisole at 0° C. for 1 hour, and then the hydrogen fluoride was distilled off and washed with ether. The peptide was extracted from the obtained mixture of peptide and resin with 30% acetic acid and freeze-dried to obtain about 700 mg of crude peptide. After dissolving the obtained crude peptide in 0.1% trifluoroacetic acid, it was applied to an octadecylsilane (ODS) column (Co
A linear concentration gradient of acetonitrile containing 0.1% trifluoroacetic acid (0 to 40%/
40 minutes, 10ml/min). The target peptide was eluted at an acetonitrile concentration of about 30%. The amino acid sequence of the peptide thus obtained is Val
-Pro-Tyr-Pro-Pro-Phe was confirmed by amino acid analysis and protein sequencer (477A manufactured by Applied Biosystems). Further, when TLC was performed under the same conditions as in Example 1, the Rf value was 0.59.
【００２０】なおペプチドの純品はＯＤＳカラム（Ｃｏ
ｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８，１５０×４６ｍｍ、ナカラ
イテスク社製）から０．１％トリフルオロ酢酸を含むア
セトニトリルの直線的濃度勾配（０〜４０％／４０分、
１ｍｌ／分）では、アセトニトリル濃度３０％濃度にお
いてシャープな単一ピークを示した。[0020] Pure peptide products can be obtained using an ODS column (Co
A linear concentration gradient of acetonitrile containing 0.1% trifluoroacetic acid (0 to 40%/40 minutes,
1 ml/min), a sharp single peak was observed at 30% acetonitrile concentration.
【００２１】[0021]
【実施例４】 Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｐ
ｒｏ−Ｐｈｅ の合成実施例１と同様にＳａｍ ｔｗ
ｏペプチド（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ社製）により、同装置
の標準プロトコールに従って合成した。１ｇ当たり０．
５ｍｍｏｌのｔ−Ｂｏｃ−Ｐｈｅ を結合したアシルオ
キシメチル樹脂２ｇをペプチド合成装置の反応容器にセ
ットし、４５％（Ｖ／Ｖ）トリフルオロ酢酸、２．５％
（Ｖ／Ｖ）アニソール、５２．５％（Ｖ／Ｖ）ジクロロ
メタンによる洗浄の後、１０％（Ｖ／Ｖ）ジイソプロピ
ルエチルアミンを含むジクロロメタンにて樹脂中和し、
ジクロロメタンにより洗浄した。その後６．７ｍｍｏｌ
のｔ−Ｂｏｃ−Ｐｒｏ及び６．７ｍｍｏｌのジイソプロ
ピルカルボジイミド（それぞれ理論当量の６．７倍）を
含む３４ｍｌのジクロロメタン、ジメチルフォルムアミ
ド混合液中で２時間室温にて反応せしめた。ジメチルフ
ォルムアミド及びジクロロメタンにて順次洗浄した後、
０．４Ｍ Ｎ−アセチルイミダゾールを含むジメチル
フォルムアミド中で未反応のαアミノ基をアセチル化し
た。[Example 4] Val-Pro-Phe-Gln-P
Same as Synthesis Example 1 of ro-Phe, Sam tw
o peptide (manufactured by Biosearch) according to the standard protocol of the same device. 0.0% per 1g.
2 g of acyloxymethyl resin bound with 5 mmol of t-Boc-Phe was set in a reaction vessel of a peptide synthesizer, and 45% (V/V) trifluoroacetic acid, 2.5%
After washing with (V/V) anisole and 52.5% (V/V) dichloromethane, the resin was neutralized with dichloromethane containing 10% (V/V) diisopropylethylamine,
Washed with dichloromethane. Then 6.7 mmol
t-Boc-Pro and 6.7 mmol of diisopropylcarbodiimide (each 6.7 times the theoretical equivalent) in a 34 ml dichloromethane/dimethylformamide mixture for 2 hours at room temperature. After sequentially washing with dimethylformamide and dichloromethane,
Unreacted α-amino groups were acetylated in dimethylformamide containing 0.4M N-acetylimidazole.
【００２２】この樹脂をジクロロメタンにて洗浄した後
、上記と同様にデブロッキングを行い、以下同様にＣ末
端側からｔ−Ｂｏｃ−Ｇｌｎ，ｔ−Ｂｏｃ−Ｐｈｅ，ｔ
−Ｂｏｃ−Ｐｒｏ，ｔ−Ｂｏｃ−Ｖａｌ を結合せしめ
ｔ−Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ
−Ｐｈｅ 樹脂を得た。この樹脂を１０％アニソールを
含む無水フッ化水素中で１時間０℃にて反応させた後、
フッ化水素の留去及びエーテルによる洗浄を行った。得
られたペプチド及び樹脂の混合物から３０％酢酸にてペ
プチドを抽出し凍結乾燥によって約７００ｍｇの粗ペプ
チドを得た。得られた粗ペプチドを０．１％トリフルオ
ロ酢酸に溶解した後、オクタデシルシラン（ＯＤＳ）カ
ラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８ ２５０×２０
ｍｍ、ナカライテスク社製）により、０．１％のトリフ
ルオロ酢酸を含むアセトニトリルの直線的濃度勾配（０
〜４０％／４０分、１０ｍｌ／分）にて展開した。目的
とするペプチドはアセトニトリル濃度約３２％で溶出さ
れた。このようにして得られたペプチドのアミノ酸配列
は、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ
であることは、アミノ酸分析およびプロテインシーケ
ンサー（アプライドバイオシステムズ製４７７Ａ）によ
り確認された。又、実施例１と同様の条件でＴＬＣを行
ったところＲｆ値は０．７１であった。After washing this resin with dichloromethane, deblocking was performed in the same manner as above, and t-Boc-Gln, t-Boc-Phe, t-Boc-Gln, t-Boc-Phe, and t
-Boc-Pro, t-Boc-Val combined and t-Boc-Val-Pro-Phe-Gln-Pro
-Phe resin was obtained. After reacting this resin in anhydrous hydrogen fluoride containing 10% anisole at 0°C for 1 hour,
Hydrogen fluoride was removed by distillation and washing with ether was performed. The peptide was extracted from the obtained mixture of peptide and resin with 30% acetic acid and freeze-dried to obtain about 700 mg of crude peptide. After dissolving the obtained crude peptide in 0.1% trifluoroacetic acid, it was applied to an octadecylsilane (ODS) column (Cosmosil 5C18 250×20
mm, manufactured by Nacalai Tesque), a linear concentration gradient of acetonitrile containing 0.1% trifluoroacetic acid (0
~40%/40 min, 10 ml/min). The target peptide was eluted at an acetonitrile concentration of about 32%. The amino acid sequence of the peptide thus obtained is Val-Pro-Phe-Gln-Pro-Phe.
This was confirmed by amino acid analysis and protein sequencer (Applied Biosystems 477A). Further, when TLC was performed under the same conditions as in Example 1, the Rf value was 0.71.
【００２３】なおペプチドの純品はＯＤＳカラム（Ｃｏ
ｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８，１５０×４６ｍｍ、ナカラ
イテスク社製）から０．１％トリフルオロ酢酸を含むア
セトニトリルの直線的濃度勾配（０〜４０％／４０分、
１ｍｌ／分）では、アセトニトリル濃度３２％濃度にお
いてシャープな単一ピークを示した。[0023] Pure peptide products can be obtained using an ODS column (Co
A linear concentration gradient of acetonitrile containing 0.1% trifluoroacetic acid (0 to 40%/40 minutes,
1 ml/min), a sharp single peak was observed at an acetonitrile concentration of 32%.
【００２４】[0024]
【発明の効果】本発明により動脈弛緩活性を有する新規
なペプチドが提供される。本発明のペプチドは医薬品、
生化学試薬として利用可能である。INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention provides a novel peptide having arterial relaxing activity. The peptide of the present invention is a drug,
It can be used as a biochemical reagent.
【００２５】[0025]
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント[Sequence list] Sequence number: 1 Array length: 7 Sequence type: amino acid Topology: linear Sequence type: Peptide Fragment type: middle fragment
【００２６】配列番号：２ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント[0026] SEQ ID NO: 2 Array length: 6 Sequence type: amino acid Topology: linear Sequence type: Peptide Fragment type: middle fragment
【００２７】配列番号：３ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント[0027] SEQ ID NO: 3 Array length: 5 Sequence type: amino acid Topology: linear Sequence type: Peptide Fragment type: middle fragment
【００２８】配列番号：４ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメントSEQ ID NO: 4 Array length: 4 Sequence type: amino acid Topology: linear Sequence type: Peptide Fragment type: middle fragment
【００２９】配列番号：５ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント[0029] SEQ ID NO: 5 Array length: 6 Sequence type: amino acid Topology: linear Sequence type: Peptide Fragment type: middle fragment
【００３０】配列番号：６ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド[0030] SEQ ID NO: 6 Array length: 6 Sequence type: amino acid Topology: linear Sequence type: Peptide
【００３１】配列番号：７ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド[0031] SEQ ID NO: 7 Array length: 5 Sequence type: amino acid Topology: linear Sequence type: Peptide
【００３２】配列番号：８ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチドSEQ ID NO: 8 Array length: 6 Sequence type: amino acid Topology: linear Sequence type: Peptide
【００３３】配列番号：９ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチドSEQ ID NO: 9 Array length: 5 Sequence type: amino acid Topology: linear Sequence type: Peptide
【００３４】配列番号：１０ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド[0034] SEQ ID NO: 10 Array length: 6 Sequence type: amino acid Topology: linear Sequence type: Peptide
【００３５】配列番号：１１ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド[0035] SEQ ID NO: 11 Array length: 6 Sequence type: amino acid Topology: linear Sequence type: Peptide
【００３６】配列番号：１２ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド[0036] SEQ ID NO: 12 Array length: 6 Sequence type: amino acid Topology: linear Sequence type: Peptide
【００３７】配列番号：１３ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド[0037] SEQ ID NO: 13 Array length: 6 Sequence type: amino acid Topology: linear Sequence type: Peptide
【００３８】配列番号：１４ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド[0038] SEQ ID NO: 14 Array length: 6 Sequence type: amino acid Topology: linear Sequence type: Peptide
【００３９】配列番号：１５ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド[0039] SEQ ID NO: 15 Array length: 6 Sequence type: amino acid Topology: linear Sequence type: Peptide
Claims (1)
酸配列を有する新規ペプチド（但しＸはジペプチドまた
は中性アミノ酸、Ｙは芳香族アミノ酸、Ｚは中性アミノ
酸をそれぞれ示す。）Claim 1: A novel peptide having the amino acid sequence X-Y-Z-Pro-Phe (where X represents a dipeptide or a neutral amino acid, Y represents an aromatic amino acid, and Z represents a neutral amino acid.)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3077441A JPH04275299A (en) | 1991-03-01 | 1991-03-01 | New physiologically active peptide |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3077441A JPH04275299A (en) | 1991-03-01 | 1991-03-01 | New physiologically active peptide |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04275299A true JPH04275299A (en) | 1992-09-30 |
Family
ID=13634116
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3077441A Pending JPH04275299A (en) | 1991-03-01 | 1991-03-01 | New physiologically active peptide |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04275299A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009033775A2 (en) * | 2007-09-11 | 2009-03-19 | Mondobiotech Laboratories Ag | Peptide alpmhir alone or in combination with peptide yvpfppf as therapeutic agent |
-
1991
- 1991-03-01 JP JP3077441A patent/JPH04275299A/en active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009033775A2 (en) * | 2007-09-11 | 2009-03-19 | Mondobiotech Laboratories Ag | Peptide alpmhir alone or in combination with peptide yvpfppf as therapeutic agent |
| WO2009046829A2 (en) * | 2007-09-11 | 2009-04-16 | Mondobiotech Laboratories Ag | Casoxin d as a therapeutic agent |
| WO2009046829A3 (en) * | 2007-09-11 | 2009-09-03 | Mondobiotech Laboratories Ag | Casoxin d as a therapeutic agent |
| WO2009033775A3 (en) * | 2007-09-11 | 2009-09-11 | Mondobiotech Laboratories Ag | Peptide alpmhir alone or in combination with peptide yvpfppf as therapeutic agent |
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