JPH04235998A - Additive for peptide synthesis solvent and synthesis of peptide using the same additive - Google Patents
Additive for peptide synthesis solvent and synthesis of peptide using the same additiveInfo
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Abstract
Description
【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
【０００１】0001
【産業上の利用分野】本発明は、ペプチド合成の際、ア
ミノ基に結合している保護基の脱落を防止するために、
溶媒に添加する添加剤及びその添加剤を使用したペプチ
ド合成方法に関するものである。[Industrial Application Field] The present invention aims to prevent the removal of protecting groups bonded to amino groups during peptide synthesis.
The present invention relates to an additive added to a solvent and a peptide synthesis method using the additive.
【０００２】0002
【従来の技術】異種類のアミノ酸の間でペプチドの化学
合成をした場合、異種類のアミノ酸が所望の順番でペプ
チド鎖を伸長させるとは限らない。そこで一方のアミノ
酸のα−アミノ基を何らかの方法で保護しα−カルボキ
シル基を活性化し、他方のアミノ酸のアミノ基と縮合す
る。さらにペプチド鎖を伸長させるには、この保護基を
何らかの方法で選択的に切断して次のカルボキシル成分
と縮合させればよい。ペプチドの化学合成は、この縮合
と、α−アミノ保護基の選択的除去の二つの操作の繰り
返しでなされる。従って、保護基は必要なときには切断
されなければならないが、それ以外のときには副反応を
防止する意味で強固に結合していなければならない。例
えば縮合反応中に導入するアミノ酸の保護基が切断され
てしまうと、アミノ酸が２量体、３量体の形で結合する
恐れがあり、保存中に保護基が切断されてしまうと反応
性の高いアミノ基が異常反応を起こす恐れもある。いず
れにしても目的のペプチドは得られ難い。特に長鎖ペプ
チドでは反応回数が多くなるので、各段階の反応は高収
率で行なわれないと目的物が得られにくい。BACKGROUND OF THE INVENTION When chemically synthesizing a peptide using different types of amino acids, the different types of amino acids do not necessarily extend the peptide chain in the desired order. Therefore, the α-amino group of one amino acid is protected by some method, the α-carboxyl group is activated, and it is condensed with the amino group of the other amino acid. In order to further extend the peptide chain, this protective group may be selectively cleaved by some method and condensed with the next carboxyl component. Chemical synthesis of peptides is accomplished by repeating two operations: this condensation and selective removal of the α-amino protecting group. Therefore, the protecting group must be cleaved when necessary, but at other times it must be strongly bound to prevent side reactions. For example, if the protecting group of an amino acid introduced during the condensation reaction is cleaved, the amino acids may bond in the form of dimers or trimers, and if the protecting group is cleaved during storage, the reactivity may increase. There is also a risk that high amino groups may cause abnormal reactions. In any case, it is difficult to obtain the desired peptide. Particularly in the case of long-chain peptides, the number of reactions is large, so it is difficult to obtain the desired product unless each step of the reaction is carried out with a high yield.
【０００３】このようなペプチドの化学合成は、溶液状
態でなされる液相法、または不溶性担体上で順次ペプチ
ド鎖を伸長していく固相法で行なわれる。これら合成に
使用する溶媒としては試薬の溶解性、反応性に優れたＮ
，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、
Ｎ−メチル−２−ピロリドン及びヘキサメチルホスホル
トリアミドなどが挙げられる。[0003] Chemical synthesis of such peptides is carried out by a liquid phase method in which the synthesis is carried out in a solution state, or by a solid phase method in which a peptide chain is sequentially extended on an insoluble carrier. The solvent used for these syntheses is N, which has excellent solubility and reactivity for reagents.
, N-dimethylformamide, dimethyl sulfoxide,
Examples include N-methyl-2-pyrrolidone and hexamethylphosphortriamide.
【０００４】アミノ酸の保護基としては、酸で切断され
るｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｕｔｙｌｏｘｙ
ｃａｒｂｏｎｙｌ、以下Ｂｏｃと記す）基、または塩基
で切断される９−フルオレニルメチルオキシカルボニル
（９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｏｘｙｃａｒｂ
ｏｎｙｌ、以下Ｆｍｏｃと記す）基の二つが使用されて
いる。それぞれの保護基をα−アミノ保護基に使用する
ペプチド合成方法は、Ｂｏｃ法及びＦｍｏｃ法と呼ばれ
る。Ｆｍｏｃ法は、Ｂｏｃ法に比べて以下のような利点
を持っているので、最近ではペプチド合成でＦｍｏｃ法
がよく使用されている。すなわちＦｍｏｃ法は、トリプ
トファンのように酸に不安定なアミノ酸をもつペプチド
合成でＢｏｃ法より有利である。また、合成の最終段階
で全保護基を除去するにあたり、トリフルオロ酢酸によ
る処理のような温和な酸処理で切断される側鎖保護基や
、固相法で使用される樹脂を使用することができ、Ｂｏ
ｃ法のようにフッ化水素のような強酸を必要とする方法
より副反応の起こる可能性が少ない。As a protecting group for amino acids, t-butyloxycarbonyl (t-butyloxycarbonyl), which is cleaved with acid, is used as a protecting group for amino acids.
carbonyl (hereinafter referred to as Boc) group, or 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (9-Fluorenylmethyloxycarb) which is cleaved with a base.
onyl (hereinafter referred to as Fmoc) groups are used. Peptide synthesis methods using each protecting group as an α-amino protecting group are called the Boc method and the Fmoc method. The Fmoc method has the following advantages over the Boc method, and has recently been frequently used in peptide synthesis. That is, the Fmoc method is more advantageous than the Boc method in the synthesis of peptides containing acid-labile amino acids such as tryptophan. In addition, when removing all protecting groups at the final stage of synthesis, it is possible to use side chain protecting groups that are cleaved by mild acid treatment such as treatment with trifluoroacetic acid, or resins used in solid phase methods. I can do it, Bo
There is less possibility of side reactions occurring than methods that require strong acids such as hydrogen fluoride, such as method c.
【０００５】図１はＦｍｏｃ基を使用したペプチドの合
成経路を示している。図１において使用する異種類のア
ミノ酸はＡとＢの２種類であり、目的とするペプチドは
Ａ−Ｂである。図１でＢアミノ酸中のアミノ基はＦｍｏ
ｃ基により保護されている。このＢアミノ酸のカルボキ
シル基は、樹脂に結合することにより他のアミノ基と反
応しないように保護されていて、合成終了までこの結合
は離れない。次に、Ｂアミノ酸中のアミノ基を保護して
いるＦｍｏｃ基は、ピペリジンを２０％含有した溶媒中
で除去される。Ａアミノ酸中のアミノ基はＦｍｏｃ基に
より保護されている。溶媒中でＡアミノ酸の活性化した
カルボキシル基と、Ｂアミノ酸中のアミノ基とを縮合さ
せて結合する。このＡアミノ酸とＢアミノ酸の縮合反応
を繰り返してペプチドＡ−Ｂを生成する。そして、最後
にＡアミノ酸中のアミノ基に結合しているＦｍｏｃ基と
、Ｂアミノ酸中のカルボキシル基に結合している樹脂を
脱離させて、所望のペプチドが得られる。FIG. 1 shows a synthetic route for peptides using the Fmoc group. The different types of amino acids used in FIG. 1 are two types, A and B, and the target peptide is AB. In Figure 1, the amino group in amino acid B is Fmo
Protected by c group. The carboxyl group of this B amino acid is protected from reacting with other amino groups by bonding to the resin, and this bond remains until the synthesis is completed. Next, the Fmoc group protecting the amino group in the B amino acid is removed in a solvent containing 20% piperidine. The amino group in the A amino acid is protected by an Fmoc group. The activated carboxyl group of the A amino acid and the amino group of the B amino acid are condensed and bonded in a solvent. This condensation reaction of amino acids A and B is repeated to generate peptide AB. Finally, the Fmoc group bonded to the amino group in the A amino acid and the resin bonded to the carboxyl group in the B amino acid are removed to obtain the desired peptide.
【０００６】前記Ｆｍｏｃ法では合成用溶媒としてＮ，
Ｎ−ジメチルホルムアミドやＮ−メチル−２−ピロリド
ンを使用するのが一般的である。[0006] In the Fmoc method, N,
N-dimethylformamide and N-methyl-2-pyrrolidone are commonly used.
【０００７】[0007]
【発明が解決しようとする課題】前記のペプチド合成中
において、Ａアミノ酸中のアミノ基に結合しているＦｍ
ｏｃ基が脱離すると前記した副反応を生じてＡ−Ａ−Ｂ
、Ａ−Ａ−Ａ−Ｂのような不純なペプチドが生成される
ことになる。従って、ペプチド合成中においては、Ａア
ミノ酸中のアミノ基に結合しているＦｍｏｃ基が安定に
保持されなければならない。[Problem to be Solved by the Invention] During the above peptide synthesis, Fm bonded to the amino group in the A amino acid
When the oc group is eliminated, the side reaction described above occurs and A-A-B
, A-A-A-B will be produced. Therefore, during peptide synthesis, the Fmoc group bonded to the amino group in the A amino acid must be stably maintained.
【０００８】本発明者らは前記の溶媒を用いると縮合反
応の間は保持されていなければならないＡアミノ酸中の
アミノ基に結合したＦｍｏｃ基が脱離し、不純なペプチ
ドを生成してしまうことを発見した。このＦｍｏｃ基脱
離による副反応は合成サイクルすべてに係ってくるため
、それによって生じる不純ペプチドは合成サイクルの数
を基準にすると指数関数的に増加する。従ってこの副反
応は、これまで長鎖ペプチドの合成が困難だった原因の
中でも極めて重要なものであることが判明した。ペプチ
ド鎖が長くなりアミノ酸残基の増加に伴って高純度のペ
プチドを得ることが困難になる。The present inventors have discovered that when the above-mentioned solvent is used, the Fmoc group bonded to the amino group in the A amino acid, which must be retained during the condensation reaction, is detached and an impure peptide is produced. discovered. Since this side reaction due to Fmoc group elimination is involved in all synthesis cycles, the number of impure peptides generated thereby increases exponentially based on the number of synthesis cycles. Therefore, this side reaction has been found to be extremely important among the reasons why it has been difficult to synthesize long-chain peptides. As the peptide chain becomes longer and the number of amino acid residues increases, it becomes difficult to obtain highly pure peptides.
【０００９】[0009]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記した
ようなＦｍｏｃ基脱離による副反応を起こす原因につい
て究明した。その結果、Ｆｍｏｃ基がルイス塩基によっ
て脱離されることから考察し、溶媒そのものの塩基性が
その最大の要因であることが解った。なお、Ｎ，Ｎ−ジ
メチルホルムアミドを溶媒とした場合は、水分によりギ
酸とジメチルアミンに分解することが知られているので
、このジメチルアミンがＦｍｏｃ基脱離の原因ではない
かとも考えられた。しかし水分含量及びジメチルアミン
ともにＦｍｏｃ基脱離の主要原因ではないことが確認で
きた。[Means for Solving the Problems] The present inventors have investigated the cause of the side reaction caused by the elimination of the Fmoc group as described above. As a result, considering that the Fmoc group is eliminated by a Lewis base, it was found that the basicity of the solvent itself was the biggest factor. Note that when N,N-dimethylformamide is used as a solvent, it is known that it decomposes into formic acid and dimethylamine due to moisture, so it was thought that this dimethylamine may be the cause of Fmoc group elimination. However, it was confirmed that neither water content nor dimethylamine were the main causes of Fmoc group elimination.
【００１０】そこで本発明者らは、以下の二通りの考え
で溶媒の塩基性を緩和することを試みた。The present inventors therefore attempted to reduce the basicity of the solvent based on the following two ideas.
【００１１】一つは合成用溶媒として塩基性のない、他
の溶媒を探索することである。メチルセロソルブ、カル
ビトール、ジグライム、テトラメチル尿素が副反応を起
こさない溶媒であるが、合成に使用する保護アミノ酸の
溶解性が良くないのでこの方法は不適当である。One is to search for other non-basic solvents as synthesis solvents. Methyl cellosolve, carbitol, diglyme, and tetramethylurea are solvents that do not cause side reactions, but this method is inappropriate because the protected amino acids used in the synthesis have poor solubility.
【００１２】二つ目の方法は、添加剤を加えることによ
ってＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチル−２−
ピロリドンの塩基性を抑制し、Ｆｍｏｃ基脱離を防ごう
というものである。検討した結果、ルイス酸の添加が有
効であることがわかり、例えばＮ−ヒドロキシベンゾト
リアゾールやＮ−ヒドロキシサクシンイミドはこの目的
に使用する添加剤として優れた試薬であることを見い出
した。The second method is to prepare N,N-dimethylformamide, N-methyl-2-
The aim is to suppress the basicity of pyrrolidone and prevent the Fmoc group from being eliminated. As a result of investigation, it was found that the addition of a Lewis acid was effective, and for example, N-hydroxybenzotriazole and N-hydroxysuccinimide were found to be excellent reagents as additives used for this purpose.
【００１３】前記の知見の下になされた本発明のペプチ
ド合成溶媒用の添加剤は、１−ヒドロキシベンゾトリア
ゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド及び３−ヒドロ
キシ−３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−ベ
ンゾトリアジンから選ばれる少なくとも１種類の添加剤
である。アミノ基が保護基に結合している第１のアミノ
酸中のカルボキシル基と第２のアミノ酸中のアミノ基と
を結合させてペプチドを合成する際、第１のアミノ酸を
溶解しているルイス塩基性溶媒に添加され、アミノ基が
保護基から外れることを防止する。The additives for the peptide synthesis solvent of the present invention, which were made based on the above knowledge, are 1-hydroxybenzotriazole, N-hydroxysuccinimide, and 3-hydroxy-3,4-dihydro-4-oxo-1. , 2,3-benzotriazine. When synthesizing a peptide by bonding the carboxyl group in the first amino acid whose amino group is bonded to a protecting group with the amino group in the second amino acid, the Lewis basicity in which the first amino acid is dissolved is Added to the solvent to prevent the amino group from coming off the protecting group.
【００１４】前記したアミノ基の保護基は、９−フルオ
レニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基である。The above-mentioned protecting group for the amino group is a 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) group.
【００１５】前記したルイス塩基性溶媒は、Ｎ，Ｎ−ジ
メチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチ
ル−２−ピロリドン及びヘキサメチルホスホルトリアミ
ドから選ばれる少なくとも１種類の溶媒である。The Lewis basic solvent mentioned above is at least one solvent selected from N,N-dimethylformamide, dimethylsulfoxide, N-methyl-2-pyrrolidone and hexamethylphosphorotriamide.
【００１６】同じく本発明のペプチド合成溶媒用の添加
剤を使用したペプチド合成方法は、１−ヒドロキシベン
ゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド及び３
−ヒドロキシ−３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２
，３−ベンゾトリアジンから選ばれる少なくとも１種類
の添加剤を添加したルイス塩基性溶媒中に、アミノ基が
保護基に結合している第１のアミノ酸を溶解する。次に
、その第１のアミノ酸中のカルボキシル基を第２のアミ
ノ酸のアミノ基と結合させて後、第１のアミノ酸中のア
ミノ基に結合した保護基を外すのである。Similarly, the peptide synthesis method using the additive for the peptide synthesis solvent of the present invention includes 1-hydroxybenzotriazole, N-hydroxysuccinimide and 3-hydroxybenzotriazole.
-hydroxy-3,4-dihydro-4-oxo-1,2
A first amino acid having an amino group bonded to a protecting group is dissolved in a Lewis basic solvent to which at least one additive selected from , 3-benzotriazine is added. Next, the carboxyl group in the first amino acid is bonded to the amino group of the second amino acid, and then the protecting group bonded to the amino group in the first amino acid is removed.
【００１７】前記したアミノ基の保護基は、９−フルオ
レニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基である。The above-mentioned protecting group for the amino group is a 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) group.
【００１８】前記のルイス塩基性溶媒は、Ｎ，Ｎ−ジメ
チルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチル
−２−ピロリドン及びヘキサメチルホスホルトリアミド
から選ばれる少なくとも１種類の溶媒である。The Lewis basic solvent is at least one solvent selected from N,N-dimethylformamide, dimethylsulfoxide, N-methyl-2-pyrrolidone and hexamethylphosphortriamide.
【００１９】前記の添加剤が１−ヒドロキシベンゾトリ
アゾールであるときは、その添加量は前記溶媒１リット
ル中、少なくとも０．５ミリモル必要である。When the additive is 1-hydroxybenzotriazole, the amount added should be at least 0.5 mmol per liter of the solvent.
【００２０】前記の添加剤がＮ−ヒドロキシサクシンイ
ミドであるときは、その添加量は前記溶媒１リットル中
、少なくとも１００ミリモル必要である。When the additive is N-hydroxysuccinimide, the amount added should be at least 100 mmol per liter of the solvent.
【００２１】前記の添加剤が３−ヒドロキシ−３，４−
ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン
であるときは、その添加量は前記溶媒１リットル中、少
なくとも０．５ミリモルで必要である。[0021] The additive is 3-hydroxy-3,4-
When dihydro-4-oxo-1,2,3-benzotriazine is used, the amount added must be at least 0.5 mmol per liter of the solvent.
【００２２】ペプチドのＦｍｏｃ合成法で、溶媒中に添
加剤として１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、３−ヒ
ドロキシ−３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３
−ベンゾトリアジン、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド、
またはこれらの混合物を加えることにより、Ｆｍｏｃ基
の脱離を抑制することができる。In the Fmoc synthesis method for peptides, 1-hydroxybenzotriazole and 3-hydroxy-3,4-dihydro-4-oxo-1,2,3 are added as additives to the solvent.
-benzotriazine, N-hydroxysuccinimide,
Alternatively, by adding a mixture of these, elimination of the Fmoc group can be suppressed.
【００２３】前記添加剤の添加量は、１−ヒドロキシベ
ンゾトリアゾールでは０．５ミリモル以上で効果が認め
られ、１ミリモルで実用レベルにおいて有効であるが、
１ミリモル以上添加しても効果は同じである。また、Ｎ
−ヒドロキシサクシンイミドでは１００ミリモル以上で
効果が認められ、１０００ミリモルで実用レベルで有効
であるが、１０００ミリモル以上添加しても効果は同じ
である。３−ヒドロキシ−３，４−ジヒドロ−４−オキ
ソ−１，２，３−ベンゾトリアジンでは０．５ミリモル
以上で効果が認められ、１ミリモルで実用レベルにおい
て有効であるが、１ミリモル以上添加しても効果は同じ
である。これらの添加剤はラセミ化抑制剤として、これ
までペプチドの合成で常用されてきた試薬であり、この
添加剤を加えることによって合成反応に支障をきたす恐
れはない。Regarding the amount of the additive added, for 1-hydroxybenzotriazole, an effect is recognized at 0.5 mmol or more, and an amount of 1 mmol is effective at a practical level.
The effect is the same even if 1 mmol or more is added. Also, N
-Hydroxysuccinimide is effective at 100 mmol or more, and is effective at a practical level at 1000 mmol, but the effect is the same even if 1000 mmol or more is added. 3-Hydroxy-3,4-dihydro-4-oxo-1,2,3-benzotriazine is effective at 0.5 mmol or more, and 1 mmol is effective at a practical level, but if 1 mmol or more is added, However, the effect is the same. These additives are reagents that have been commonly used in peptide synthesis as racemization inhibitors, and there is no fear that the addition of these additives will interfere with the synthesis reaction.
【００２４】アミノ酸誘導体のα−カルボキシル基の活
性化中間体として１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエ
ステルを経由する縮合反応もよく知られている。この方
法を用いた反応では１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
が生成物として溶液中に放出され、アミノ酸のペンタフ
ルオロフェニルエステルと触媒として１−ヒドロキシベ
ンゾトリアゾールを当量加える方法がある。しかし、こ
の量だけでは高純度のペプチドが得られず、やはりこれ
以外に添加する必要がある。A condensation reaction via 1-hydroxybenzotriazole ester as an activated intermediate of the α-carboxyl group of an amino acid derivative is also well known. In the reaction using this method, 1-hydroxybenzotriazole is released as a product into the solution, and there is a method in which equivalent amounts of pentafluorophenyl ester of an amino acid and 1-hydroxybenzotriazole are added as a catalyst. However, it is not possible to obtain a highly pure peptide with only this amount, and it is necessary to add something other than this amount.
【００２５】[0025]
【発明の効果】本発明のペプチド合成溶媒用の添加剤を
加えることにより、ペプチドの合成のためにアミノ酸の
アミノ基に結合した保護基の脱離を防止することができ
る。従って長鎖のペプチドの合成や全自動合成機を用い
たペプチド合成のように、溶媒中に保護基に結合したア
ミノ酸を長時間放置するような場合でも、その間、保護
基が脱離することなく副反応が防止できるので、純度が
高いペプチドを得ることができる。Effects of the Invention By adding the additive for the peptide synthesis solvent of the present invention, it is possible to prevent the removal of the protecting group bonded to the amino group of the amino acid for peptide synthesis. Therefore, even when an amino acid bonded to a protecting group is left in a solvent for a long time, such as in the synthesis of long-chain peptides or peptide synthesis using a fully automatic synthesizer, the protecting group will not be removed during that time. Since side reactions can be prevented, highly pure peptides can be obtained.
【００２６】[0026]
【実施例】以下、本発明の実施例を説明する。[Examples] Examples of the present invention will be described below.
【００２７】実施例１
図１において、Ｂに相当するアミノ酸にグリシン（Ｇｌ
ｙ）を使用し、グリシンのＮ末端アミノ基をＦｍｏｃ基
で保護する（以下、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−樹脂と記す。ま
た、以下の実験例でもこのような結合物質を同様に表す
）。グリシンはα−アミノ保護基としてのＦｍｏｃ基が
他のアミノ酸と比べて最も切断されやすく、比較するモ
デルとして適当である。Example 1 In FIG. 1, glycine (Gl) is added to the amino acid corresponding to B.
y) to protect the N-terminal amino group of glycine with an Fmoc group (hereinafter referred to as Fmoc-Gly-resin. Also, such a binding substance will be similarly represented in the following experimental examples). Glycine is suitable as a model for comparison because its Fmoc group as an α-amino protecting group is most easily cleaved compared to other amino acids.
【００２８】８５ｍｇのＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−樹脂に、以
下の溶媒を加えて前記の試料を三個調整した。第１の試
料は０．５ミリモル濃度となるように１−ヒドロキシベ
ンゾトリアゾール（同仁化学製）を添加したＮ，Ｎ−ジ
メチルホルムアミドを８０ミリリットル、第２の試料は
１ミリモル濃度となるように１−ヒドロキシベンゾトリ
アゾールを添加したＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを８
０ミリリットル加えた。第３の試料は比較として添加剤
を全く加えないＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを８０ミ
リリットル加えた。Three of the above samples were prepared by adding the following solvent to 85 mg of Fmoc-Gly-resin. The first sample contains 80 ml of N,N-dimethylformamide to which 1-hydroxybenzotriazole (manufactured by Dojindo Chemical Co., Ltd.) has been added to give a concentration of 0.5 mmol, and the second sample contains 1. -N,N-dimethylformamide with added hydroxybenzotriazole
Added 0ml. For the third sample, 80 ml of N,N-dimethylformamide without any additives was added as a comparison.
【００２９】切断されて溶媒中に遊離したＦｍｏｃ基に
由来する３０４ｎｍの吸光度を測定することにより、Ｆ
ｍｏｃ基の溶媒中における安定性を経時的に調べた。同
様にして２０％のピペリジンを含むＮ，Ｎ−ジメチルホ
ルムアミド中でＦｍｏｃ基を完全に切断したときの３０
４ｎｍの吸光度を１００としてＦｍｏｃ切断の割合を計
算した。図２にその結果を示してある。By measuring the absorbance at 304 nm derived from the Fmoc group released in the solvent after cleavage, F.
The stability of the moc group in a solvent was investigated over time. Similarly, when the Fmoc group was completely cleaved in N,N-dimethylformamide containing 20% piperidine, 30
The percentage of Fmoc cleavage was calculated using the absorbance at 4 nm as 100. Figure 2 shows the results.
【００３０】前記の溶媒としてジメチルスルホキシド、
Ｎ−メチル−２−ピロリドン及びヘキサメチルホスホル
トリアミドを使用した場合も同様に１−ヒドロキシベン
ゾトリアゾールの添加効果が確かめられた。[0030] As the solvent, dimethyl sulfoxide,
The effect of adding 1-hydroxybenzotriazole was similarly confirmed when N-methyl-2-pyrrolidone and hexamethylphosphortriamide were used.
【００３１】また、前記溶媒のグレードを変えて１−ヒ
ドロキシベンゾトリアゾールの添加効果を調べた。市販
のペプチド合成グレードＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、特
級Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（和光純薬社製）及び
一級Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（和光純薬社製）の
各溶媒を使用して上記と同様にして行なったが、どのグ
レードの溶媒においても１−ヒドロキシベンゾトリアゾ
ールの添加効果が確認された。Furthermore, the effect of adding 1-hydroxybenzotriazole was investigated by changing the grade of the solvent. Commercially available peptide synthesis grade N,N-dimethylformamide (manufactured by Applied Biosystems), special grade N,N-dimethylformamide (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and primary N,N-dimethylformamide (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) solvents The effect of adding 1-hydroxybenzotriazole was confirmed in any grade of solvent.
【００３２】実施例２
グリシン（Ｇｌｙ）とロイシン（Ｌｅｕ） を使用し、
アミノ酸配列がＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ
であるペプチド樹脂（（Ｇ）１０Ｌ− 樹脂と記す）
をモデルペプチドとして選んだ。ロイシンは、アミノ酸
分析の際の基準とするためである。Ｆｍｏｃ固相合成法
で、溶媒として１ミリモル濃度となるように１−ヒドロ
キシベンゾトリアゾール（同仁化学製）を添加したＮ，
Ｎ−ジメチルホルムアミドを使用し、図１のＢに相当す
るＨ２ Ｎ−Ｌｅｕ−樹脂（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ社製）を０．２５ミリモルと、Ａに相当す
るＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＰＦＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
ＬＫＢ 社製）を０．５ミリモルと、それと当量の１−
ヒドロキシベンゾトリアゾールを加え、カップリング反
応を室温で８時間行なった。Ｆｍｏｃ基の除去を２０％
ピペリジンのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液で行な
い、Ｈ２ Ｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−樹脂を得た。この操作
を繰り返してアミノ酸配列がＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｙ−Ｌｅｕ であるペプチド樹脂（（Ｇ）１０Ｌ−
樹脂と記す）を調製した。合成した（Ｇ）１０Ｌ− 樹
脂を塩酸で１１０℃、２４時間加水分解後、アミノ酸分
析計でアミノ酸組成を調べた。Example 2 Using glycine (Gly) and leucine (Leu),
The amino acid sequence is Gly-Gly-Gly-Gly-Gl
y-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Leu
A peptide resin (denoted as (G)10L-resin) that is
was selected as a model peptide. This is because leucine is used as a standard in amino acid analysis. N, to which 1-hydroxybenzotriazole (manufactured by Dojindo Chemical Co., Ltd.) was added as a solvent to a concentration of 1 mmol using the Fmoc solid phase synthesis method.
Using N-dimethylformamide, H2 N-Leu-resin (Applied Bios
system) and 0.25 mmol of Fmoc-Gly-OPFP (Pharmacia Co., Ltd.) corresponding to A.
(manufactured by LKB) and 0.5 mmol of 1-
Hydroxybenzotriazole was added and the coupling reaction was carried out at room temperature for 8 hours. 20% removal of Fmoc group
A solution of piperidine in N,N-dimethylformamide was used to obtain H2N-Gly-Leu-resin. By repeating this operation, the amino acid sequence becomes Gly-Gly-Gly-
Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-G
ly-Leu peptide resin ((G)10L-
Resin) was prepared. The synthesized (G)10L-resin was hydrolyzed with hydrochloric acid at 110°C for 24 hours, and then the amino acid composition was examined using an amino acid analyzer.
【００３３】アミノ酸分析の結果は、Ｌｅｕ（１）：１
．００ 、Ｇｌｙ（１０）：１０．３７ であり、カッ
プリング反応中にＦｍｏｃ基が殆ど脱離されなかったこ
とを示している。[0033] The results of amino acid analysis showed that Leu(1):1
．． 00, Gly(10): 10.37, indicating that almost no Fmoc group was removed during the coupling reaction.
【００３４】比較例１
実施例１の第３の試料の場合と同様の実験を、Ｎ，Ｎ−
ジメチルホルムアミド以外の溶媒について行なった。溶
媒はＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドの他、ジメチルスル
ホキシド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、及びヘキサメ
チルホスホルトリアミドについて同様に行なった。図３
にその結果を示す。Comparative Example 1 An experiment similar to that for the third sample of Example 1 was carried out using N, N-
Experiments were conducted using solvents other than dimethylformamide. In addition to N,N-dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, N-methyl-2-pyrrolidone, and hexamethylphosphorotriamide were used as the solvent. Figure 3
The results are shown below.
【００３５】比較例２
比較例１で溶媒としてＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを
使用したものについて、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
に水１％加えて同様にして行ない、Ｆｍｏｃ基切断と水
分の関係を調べた。Comparative Example 2 Regarding Comparative Example 1 in which N,N-dimethylformamide was used as a solvent, the same procedure was carried out by adding 1% water to N,N-dimethylformamide to investigate the relationship between Fmoc group cleavage and water content. Ta.
【００３６】Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドは水の存在
によりギ酸とジメチルアミンに分解することが知られて
いる。Ｆｍｏｃ基は塩基により切断されるのでこのジメ
チルアミンが原因ではないかと考えられるので、水分に
よるＦｍｏｃ基切断の影響を調べることがこの実験の目
的である。水の添加量を１％としたのは、通常、Ｎ，Ｎ
−ジメチルホルムアミドに含まれる水分は１％未満であ
り水分の影響を調べるには十分な量であると考えられる
ためである。It is known that N,N-dimethylformamide decomposes into formic acid and dimethylamine in the presence of water. Since the Fmoc group is cleaved by a base, it is thought that this dimethylamine may be the cause, so the purpose of this experiment was to investigate the influence of water on the cleavage of the Fmoc group. The amount of water added is 1% because it is usually N,N
This is because the moisture content in dimethylformamide is less than 1%, which is considered to be a sufficient amount to examine the influence of moisture.
【００３７】Ｆｍｏｃ基切断の程度は、Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルホルムアミドのみの系とＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミ
ドに水１％を加えた系とでは差は認められなかった。従
って、Ｆｍｏｃ基の切断は水分によるものではないこと
がわかった。No difference was observed in the degree of Fmoc group cleavage between the system containing only N,N-dimethylformamide and the system containing 1% water added to N,N-dimethylformamide. Therefore, it was found that the cleavage of the Fmoc group was not caused by water.
【００３８】また、ジメチルアミンの定量を常法により
、ジニトロフルオロベンゼンを使用し、３８１ｎｍの吸
光度を測定して行なった。実験中、ジメチルアミンは僅
かに増加するが、Ｆｍｏｃ基切断とは比例関係にはなか
った。また、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドのみの系と
、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに水１％を加えた系と
を比較してもジメチルアミンの発生量に差は殆ど認めら
れなかった。この結果は、ジメチルアミンの存在がＦｍ
ｏｃ基切断の直接的な要因ではないことを示している。Further, dimethylamine was determined by a conventional method using dinitrofluorobenzene and measuring the absorbance at 381 nm. During the experiment, dimethylamine increased slightly but was not proportional to Fmoc group cleavage. Further, when comparing a system containing only N,N-dimethylformamide and a system containing 1% water added to N,N-dimethylformamide, almost no difference was observed in the amount of dimethylamine generated. This result indicates that the presence of dimethylamine
This indicates that this is not a direct cause of oc group cleavage.
【００３９】比較例３
実施例２において溶媒として、１−ヒドロキシベンゾト
リアゾールを全く添加していないＮ，Ｎ−ジメチルホル
ムアミドを使用した他は、カップリングを同様にして行
なった。アミノ酸分析の結果は、Ｌｅｕ（１）：１．０
０ 、Ｇｌｙ（１０）：１１．１７ であり、カップリ
ング反応中にＦｍｏｃ基が脱離したため、目的数以上の
アミノ酸が導入されたと考えられる。なお、ペンタフル
オロフェニル／１−ヒドロキシベンゾトリアゾールの効
果は現れていない。Comparative Example 3 Coupling was carried out in the same manner as in Example 2, except that N,N-dimethylformamide to which no 1-hydroxybenzotriazole was added was used as the solvent. The result of amino acid analysis is Leu (1): 1.0
0, Gly(10): 11.17, and it is considered that more amino acids than the desired number were introduced because the Fmoc group was removed during the coupling reaction. Note that no effect of pentafluorophenyl/1-hydroxybenzotriazole was observed.
【図１】保護基を使用したペプチドの合成経路を示す図
である。FIG. 1 is a diagram showing a synthetic route for peptides using protecting groups.
【図２】本発明の添加剤を溶媒に添加した場合にアミノ
酸から脱離した保護基の量を示す図である。FIG. 2 is a diagram showing the amount of protecting groups eliminated from amino acids when the additive of the present invention is added to a solvent.
【図３】溶媒に添加剤を添加しない場合にアミノ酸から
脱離した保護基の量を示す図である。FIG. 3 is a diagram showing the amount of protecting groups removed from amino acids when no additives are added to the solvent.
ＤＭＦはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ＨＯＢＴは１
−ヒドロキシベンゾトリアゾール、ＤＭＳＯはジメチル
スルホキシド、ＮＭＰはＮ−メチル−２−ピロリドン、
ＨＭＰＡはヘキサメチルホスホルトリアミドである。DMF is N,N-dimethylformamide, HOBT is 1
-Hydroxybenzotriazole, DMSO is dimethyl sulfoxide, NMP is N-methyl-2-pyrrolidone,
HMPA is hexamethylphosphortriamide.
Claims (9)
Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド及び３−ヒドロキシ−３
，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリ
アジンから選ばれる少なくとも１種類の添加剤であって
、アミノ基が保護基に結合している第１のアミノ酸中の
カルボキシル基と第２のアミノ酸中のアミノ基と結合さ
せてペプチドを合成する際の、第１のアミノ酸を溶解し
ているルイス塩基性溶媒に添加され、該保護基がアミノ
基から外れることを防止するペプチド合成溶媒用の添加
剤。[Claim 1] 1-hydroxybenzotriazole,
N-hydroxysuccinimide and 3-hydroxy-3
, 4-dihydro-4-oxo-1,2,3-benzotriazine, wherein the carboxyl group in the first amino acid and the first amino acid whose amino group is bonded to the protecting group A peptide synthesis solvent that is added to the Lewis basic solvent in which the first amino acid is dissolved when the peptide is synthesized by combining it with the amino group in the second amino acid, and prevents the protecting group from coming off the amino group. additives for.
オキシカルボニル基であることを特徴とする請求項１に
記載のペプチド合成溶媒用の添加剤。2. The additive for a peptide synthesis solvent according to claim 1, wherein the protecting group is a 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group.
チルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチル
−２−ピロリドン及びヘキサメチルホスホルトリアミド
から選ばれる少なくとも１種類の溶媒であることを特徴
とする請求項１に記載のペプチド合成溶媒用の添加剤。3. A claim characterized in that the Lewis basic solvent is at least one solvent selected from N,N-dimethylformamide, dimethylsulfoxide, N-methyl-2-pyrrolidone, and hexamethylphosphortriamide. Item 1. Additive for the peptide synthesis solvent according to item 1.
Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド及び３−ヒドロキシ−３
，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリ
アジンから選ばれる少なくとも１種類の添加剤を添加し
たルイス塩基性溶媒中に、アミノ基が保護基に結合して
いる第１のアミノ酸を溶解し、その第１のアミノ酸中の
カルボキシル基を第２のアミノ酸のアミノ基と結合させ
て後、第１のアミノ酸中のアミノ基に結合した保護基を
外すことを特徴とするペプチドの合成方法。[Claim 4] 1-hydroxybenzotriazole,
N-hydroxysuccinimide and 3-hydroxy-3
, 4-dihydro-4-oxo-1,2,3-benzotriazine, in a Lewis basic solvent containing at least one additive selected from the group consisting of: Synthesis of a peptide characterized by dissolving the first amino acid, bonding the carboxyl group in the first amino acid with the amino group of the second amino acid, and then removing the protecting group bonded to the amino group in the first amino acid. Method.
オキシカルボニル基であることを特徴とする請求項４に
記載のペプチドの合成方法。5. The method for synthesizing a peptide according to claim 4, wherein the protecting group is a 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group.
チルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチル
−２−ピロリドン及びヘキサメチルホスホルトリアミド
から選ばれる少なくとも１種類の溶媒であることを特徴
とする請求項４に記載のペプチドの合成方法。6. A claim characterized in that the Lewis basic solvent is at least one solvent selected from N,N-dimethylformamide, dimethylsulfoxide, N-methyl-2-pyrrolidone, and hexamethylphosphortriamide. Item 4. A method for synthesizing the peptide according to item 4.
リアゾールであり、その添加量が前記溶媒１リットル中
、少なくとも０．５ミリモルであることを特徴とする請
求項４に記載のペプチドの合成方法。7. The method for synthesizing a peptide according to claim 4, wherein the additive is 1-hydroxybenzotriazole, and the amount added is at least 0.5 mmol per liter of the solvent.
イミドであり、その添加量が前記溶媒１リットル中、少
なくとも１００ミリモルであることを特徴とする請求項
４に記載のペプチドの合成方法。8. The method for synthesizing a peptide according to claim 4, wherein the additive is N-hydroxysuccinimide, and the amount added is at least 100 mmol per liter of the solvent.
−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジ
ンであり、その添加量が前記溶媒１リットル中、少なく
とも０．５ミリモルであることを特徴とする請求項４に
記載のペプチドの合成方法。9. The additive is 3-hydroxy-3,4
-dihydro-4-oxo-1,2,3-benzotriazine, and the amount thereof added is at least 0.5 mmol per liter of the solvent. .
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3005253A JPH04235998A (en) | 1991-01-21 | 1991-01-21 | Additive for peptide synthesis solvent and synthesis of peptide using the same additive |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| JP3005253A JPH04235998A (en) | 1991-01-21 | 1991-01-21 | Additive for peptide synthesis solvent and synthesis of peptide using the same additive |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04235998A true JPH04235998A (en) | 1992-08-25 |
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ID=11606056
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3005253A Pending JPH04235998A (en) | 1991-01-21 | 1991-01-21 | Additive for peptide synthesis solvent and synthesis of peptide using the same additive |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04235998A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2357755A (en) * | 1999-10-14 | 2001-07-04 | Brad Chem Technology Ltd | Corrosion inhibiting formulations |
-
1991
- 1991-01-21 JP JP3005253A patent/JPH04235998A/en active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2357755A (en) * | 1999-10-14 | 2001-07-04 | Brad Chem Technology Ltd | Corrosion inhibiting formulations |
| GB2357755B (en) * | 1999-10-14 | 2003-09-10 | Brad Chem Technology Ltd | Improvements in and relating to corrosion inhibiting formulations |
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