【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
本発明はγ−ヒドロキシアルギニンを含有する
ジペプチドに関する。
さらに詳しくは本発明は一般式（）：
Ｈ−Ｘ−（γ−HO）Arg−OH （）
（式中、Ｘはイソロイシン、ロイシンまたはバ
リンである）で示されるγ−ヒドロキシアルギニ
ンを含有するジペプチドに関する。化合物（）
はアミノペプチダーゼＢ活性阻害作用を示すとと
もに、リウマチ関節炎に対する予防効果ならびに
治療効果を示すなど興味ある生理活性を有するも
のである。
γ−ヒドロキシアルギニンは異常アミノ酸であ
り、天然に豊富に存在するものではないため、γ
−ヒドロキシアルギニンを含有するペプチドを化
学合成によつて製造することはいまだなされてい
なかつた。
本発明者らは天然からえたγ−ヒドロキシアル
ギニンを原料として化学合成法によつてγ−ヒド
ロキシアルギニンを含有するペプチドの製造を検
討していたが、一般式（）：
（式中、Ａはカルボベンゾキシ基またはｐ−メ
トキシベンジルオキシカルボニル基、Ｂは２，
４，６−トリメチルベンゼンスルホニル基、２，
６−ジメチル−４−メトキシベンゼンスルホニル
基または４−メトキシベンゼンスルホニル基であ
る）で示されるγ−ヒドロキシアルギニンの保護
基化体を合成し、ついで該化合物（）とＸの保
護基化体とのペプチド形成反応を行ない、酸によ
り全保護基を脱離せしめ精製することによつて一
般式（）：
Ｈ−Ｘ−（γ−HO）Arg−OH （）
（式中、Ｘは前記と同じ）で示されるγ−ヒド
ロキシアルギニンを含有する新規なジペプチドが
えられることを見出し、本発明を完成するにいた
つた。
一般にペプチドの化学合成にあたつてはアミノ
酸側鎖官能基の保護が必要であるが、本発明にお
けるγ−ヒドロキシアルギニン含有ペプチドの製
造に際しては、γ−ヒドロキシアルギニンの側鎖
官能基をつぎに示す方法によつて保護する。すな
わち、まずα−アミノ基を常法によりカルボベン
ゾキシクロリドで処理してN〓−カルボベンゾキ
シ−γ−ヒドロキシアルギニンとし、ついで2.5
当量以上の２，４，６−トリメチルベンゼンスル
ホニルクロリドと反応せしめてグアニジノ基を
２，４，６−トリメチルベンゼンスルホニル（以
下Mtsという）化して保護する。叙上の反応にお
いて、γ−ヒドロキシ基はα−カルボキシル基と
の間で閉環して式（）ａ：
で示されるγ−ラクトン体となり、γ−ヒドロキ
シ基ならびにα−カルボキシル基の保護基化も同
時に完成する。
叙上のごとくしてえられるγ−ヒドロキシアル
ギニンの保護基化体の化合物（）は全く新規な
化合物であるとともに、γ−ヒドロキシアルギニ
ンを含有するペプチドの製造において鍵化合物と
なる重要な中間体であり、一部保護基の除去を工
夫することにより酸成分としてもまたアミン成分
としても利用できるので多数の生理活性ペプチド
の製造に応用できる。
本発明の製造法は叙上のごとき新規なγ−ヒド
ロキシアルギニン保護基化体の化合物（）とＸ
の保護基化体とを反応させることによつて一般式
（）：
Ｈ−Ｘ−（γ−HO）Arg−OH （）
（式中、Ｘは前記と同じ）で示される新規なジ
ペプチドを合成するものであるが、ペプチド形成
の方法は一般に多用されている活性エステル法、
DCC／HOSu法あるいは酸無水物法などを利用す
ることができる。その中でも活性エステル法を利
用するのが好ましい。すなわち、Ｘのα−アミノ
基をカルボベンゾキシ基、（４−CH3O）カルボ
ベンゾキシ基あるいはｔ−ブチルオキシカルボニ
ル基などで保護した一般式（）：
（式中、Ｚはカルボベンゾキシ基、Ｘは前記と
同じ）で示されるＮ−ヒドロキシサクシイミドエ
ステル体と酸、好ましくは25％HBr／酢酸で処
理してα−アミノ保護基を除去してえられる式
（）ｂ：
（式中、Mtsは前記と同じ）で示される化合物
とをジメチルホルムアミド（以下、DMFという）
中、室温で終夜反応させることによつて目的とす
るジペプチドの保護基化体がえられる。ついで該
製造法の最終工程である全保護基の脱離反応を酸
により行なうが、とくに少量のアニソールを加え
たトリフルオロメタンスルホン酸とトリフルオロ
酢酸との等量混合物を用いて行なうのが好まし
い。
叙上のごとくしてえられる粗ペプチドをCM−
セフアデツクスＣ−25を用いたイオン交換カラム
クロマトグラフイで精製分離し、0.1Nアンモニ
アで溶出させた主要溶出画分を集めて凍結乾燥す
る。かかる方法により一般式（）で表わされる
γ−ヒドロキシアルギニン含有ジペプチドがγ−
ヒドロキシアルギニンから収率20〜40％でえられ
る。
本発明の化合物（）は興味ある生理活性を有
する。たとえばリンパ球や癌細胞膜に存在する酵
素であるアミノペプチダーゼＢの活性を阻害する
作用を有することから、免疫系を介する抗炎症
剤、抗アレルギー剤、免疫療法剤、制ガン剤など
としても有効である。また化合物（）の一つで
あるイソロイシル−γ−ヒドロキシアルギニンは
ルイス系雌性ラツト（８週令）においてフロイン
トコンプリートアジユバントにより惹起されるア
ジユバント関節炎に対し１カ月間の連続静脈内投
与によつて一次炎症ならびに二次炎症を抑制し、
さらに治療試験においても関節腫脹を減少させる
作用を有する。
なお本発明における出発物質であるγ−ヒドロ
キシアルギニンはMetarhizium anisopliae（メタ
リジウム・アニソプリアエ）が産生するK582ペ
プチドから調製したものである（S.Kondo ら、
J.Antibiotic 33，p533〜542（1980））。
なお、本明細書中の各略号は、それぞれ
IUPAC−IUBに基づく略号または当該分野にお
ける慣例略号で表示したつぎに示すアミノ酸、ペ
プチド、保護基、活性基または試薬を示す。
（γ−HO）Arg：γ−ヒドロキシアルギニン、
Ile：イソロイシン、Leu：ロイシン、Val：バリ
ン（とくに表示のないばあい、アミノ酸はＬ体で
ある）、Ｚ：カルボベンゾキシ基、Boc：ｔ−ブ
トキシカルボニル基、Mts：２，４，６−トリメ
チルベンゼンスルホニル基、TFA：トリフルオ
ロ酢酸、TFMSA：トリフルオロメタンスルホン
酸、oSu：Ｎ−ヒドロキシサクシイミド、DCC：
ジシクロヘキシルカルボジイミド、DMF：ジメ
チルホルムアミド、BuOH：ブタノール、
AcOH：酢酸、MeOH：メタノール、AcOEt：
酢酸エチル、Et3N：トリエチルアミン。
つぎに実施例および試験例をあげて本発明をさ
らに詳しく説明するが、本発明はかかる実施例の
みに限定されるものではない。
実施例 １ Ｚ−（γ−HO）Arg−OH合成
Ｈ−（γ−OH）Arg−OH1ｇ（0.0052モル）を
NaHCO3（4.42mg）水溶液７mlに加え、氷水で冷
却下にＺ−Cl1.43ｇ（0.008モル）を加え、つい
でNaHCO3（880mg）の水溶液８mlを加えて激し
く撹拌した。30分後室温にもどし、さらに２時間
反応させ、析出した油状物が固化したところで反
応液をデカントで除き、水およびエーテルで洗浄
し、減圧乾燥して無色粉末の目的物質をえた。
収量：1.2ｇ（70.4％）、mp：160゜（分解）
施光度：〔α〕30 D＝＋18.4゜（Ｃ＝2.0、60％ DMF
水溶液）
薄層クロマトグラフイ（以下、T.L.Cという）
Rf（nBuOH：AcOH：H2O＝４：１：２）＝
0.54
坂口反応（＋）、ニンヒドリン反応（−）
実施例 ２ Ｚ−（γ−HO）Arg（Mts）−OH
−lactoneの合成
Ｚ−（γ−OH）Arg−OH1.2ｇ（0.0037モル）
を4N−NaOH3.7mlとアセトン15mlの混液に懸濁
し、０℃冷却下にMts−Cl2.02ｇ（0.00925モル）
のアセトン溶液５mlを加えて撹拌した。30分後室
温にもどし、約４時間反応させ、析出した沈殿を
別したのち反応液を濃縮し、残渣を酢酸エチ
ル溶液とし、洗浄後MgSO4上で乾燥した。酢酸
エチルを留去し、残つた粗結晶を酢酸エチル−エ
ーテルで再結晶して無色粉末の目的物質をえた。
収量：820mg（45.5％）mp：167〜170℃
施光度：〔α〕30 D＝−17.2（Ｃ＝1.0、MeOH）T.
L.C
Rf（CHCl3：MeOH：AcOH＝95：３：２）＝
0.35
Rf（CHCl3：AcOEt＝１：４）＝0.42
坂口反応（−）、ニンヒドリン反応（−）
IRスペクトル（cm-1）
1785（ν−ラクトン）
MSスペクトル（ｍ／ｅ）488（M+）
NMRスペクトル（δ値：ppm）、（DMSO中）
2.20（3H，ｓ）、2.60（6H，ｓ）、4.40（Ｈ，
ｍ）、
4.6（Ｈ，ｍ）、5.10（2H，ｓ）、7.3（5H，ｓ）
元素分析値：C23H28O6N4Sとして
理論値（％）：C56.54 H5.78 N11.47
実測値（％）：C56.60 H5.84 N11.36
再結晶用液を留去すると約800mgの油状物が残
り、T.L.C上ラクトン体とともにかなりのＺ−
（γ−HO）Arg（Mts）−OH体の存在が認められ
た。そこで該油状物をピリジン３mlに溶かし、
Mts−Cl2当量を加えて冷所に一晩放置すること
によつてラクトン体の油状物（約900mg）をえた。
この油状物のまま、つぎの脱保護基（脱Ｚ）化反
応に用いることも可能であつた。
この反応におけるラクトン体の総収率は油状物
を含めると88.5％であつた。
実施例 ３ Ｈ−（γ−HO）Arg（Mts）−OH−
lactone・HBr塩の合成
Ｚ−（γ−HO）Arg（Mts）−OH−lactone800
mg（0.0016モル）を酢酸10mlに懸濁し、冷却下25
％HBr−酢酸溶液10ml（20当量）を加えた。均
一となつた溶液を室温で約50分間撹拌し、反応物
を減圧濃縮し、残留物は固化し、無水エーテル中
で砕きながらよく洗浄し、沈殿を取して淡い灰
色の粉末の目的物質をえた。
収量：600mg（86％）mp：142゜（分解）
施光度：〔α〕30 D＝−8.0゜（Ｃ＝1.0、60％DMF水
溶液）
T.L.C
Rf（ｎ−BuOH：AcOH：H2O＝４：１：２）＝
0.57
Rf（CHCl3：MeOH：AcOH＝85：10：５）＝
0.05
坂口反応（−）、ニンヒドリン反応（＋）
IRスペクトル（cm+）
1785（ν−ラクトン）
実施例 ４ Ｚ−Ile−（γ−HO）Arg（Mts）−
OH−lactnonの合成
Ｈ−（γ−HO）Arg（Mts）−OH−lactone・
HBr1ｇ（0.0023モル）をDMF5mlに溶解し、
Et3N240mg（0.0023モル）を加え、ついでＺ−Ile
−OSu834mg（0.0023モル）のDMF（５ml）溶液
を加えて室温で一晩反応させた。反応液を減圧濃
縮し、残留物を酢酸エチル溶液とし、10％クエン
酸および水で洗浄したのちMgSO4上で乾燥した。
酢酸エチルを留去し、残留物をエーテルで粉末と
し、取して淡い灰色粉末の目的物質をえた。
収量：900mg（65％）mp：110〜111゜（分解）
施光度：〔α〕30 D＝−17.0゜（Ｃ＝1.22、MeOH）
T.L.C
Rf（CHCl3：AcOEt＝１：４）＝0.45
IRスペクトル（cm-1）
1780（ν−ラクトン）
MSスペクトル（ｍ／ｅ）
601（M+）
実施例 ５ Ｈ−Ile−（γ−HO）Arg−OHの
合成
CF3SO3H6.2ｇとTFA4.7ｇおよびアニソール
450mgの混液に冷却下、Ｚ−Ile−（γ−HO）Arg
（Mts）−OH−lactone500mg（0.0083モル）を加
えて室温にもどして約１時間撹拌した。反応液に
無水エーテルを加え、析出した油状物をエーテル
で洗つたのち、少量の水に溶解し、アンバーライ
トCG−400（酢酸型）樹脂５ｇを加えて30分間撹
拌したのち、樹脂を別した。
液を1N−NaOHでアルカリ性とし、しばら
く放置したのち酢酸で中和してCM−セフアデツ
クスＣ−25のカラム（2.5×13cm）を用いてカラ
ムクロマトグラフイーを行ない、0.1Nアンモニ
アで溶出させ、主要溶出画分を集め、凍結乾燥し
て精製した。
収量：140mg（56％）
施光度：〔α〕30 D＝−5.7゜（Ｃ＝1.1、H2O T.L.C
Rf（ｎ−BuOH：AcOH：H2O＝４：１：２）＝
0.30
Rf（Ｃ−NH4OH：ｎ−PrOH＝７：13）＝0.05
坂口反応（＋）、ニンヒドリン反応（＋）
アミノ酸分析値（モル比）
Ile：0.90、（γ−HO）Arg：1.00
実施例 ６ Ｈ−Val−（γ−HO）Arg−OH
の合成
Ｈ−（γ−HO）Arg（Mts）−OH−lactone−
HBr608ｇ（0.0014モル）をDMF3mlに溶解し、
Et3N141mg（0.0014モル）を加えついでBoc−
Val−oSu440mg（0.0014モル）のDMF溶液（３
ml）を加えて室温で一晩反応させた。反応液を減
圧濃縮し、酢酸エチル溶液として10％クエン酸お
よび水などで洗浄したのちMgSO4上で乾燥した。
酢酸エチルを留去し、残留物をエーテルで粉末と
し取した。えられたBoc−Val−（γ−HO）
Arg（Mts）−OH−lactone体560mg（72.3％）を
CF3SO3H−TFA−アニソール中に加えて全保護
基を除去し、実施例５と同様にCM−Sephadex
Ｃ−25によるカラムクロマトグラフイを行ない、
主要画分を集め、凍結乾燥して精製した。
収量：150mg（37.01％）
施光度：〔α〕30 D＝−11.08゜（Ｃ＝0.695、H2O）
T.L.C
Rf（ｎ−BuOH：AcOH：H2O＝４：１：２）＝
0.20
坂口反応（＋）、ニンヒドリン反応（＋）
アミノ酸分析値（モル比）
Vel：1.19、（γ−HO）Arg：1.00
実施例 ７ Ｈ−Leu−（γ−HO）−Arg−OH
の合成
Ｈ−（γ−HO）Arg（Mts）−OH−lactone・
HBr543mg（0.00125モル）をDMF中、Boc−Leu
−OSu410mg（0.00125モル）と一晩反応させ、灰
色粉末としてBoc−Leu−（γ−HO）Arg（Mts）
−OH−lactone550mg（73％）をえた。ついで
CF3SO3H−TFA−アニソールの溶液中に加え、
室温で１時間反応させて全保護基を除去した。実
施例５と同様にCM−セフアデツクスＣ−25のカ
ラムクロマトグラフイにより溶出させ、主要画分
を集め、凍結乾燥して精製した。
収量：190mg（50.2％）
施光度〔α〕30 D＝−8.52゜（Ｃ＝0.575、H2O）T.
L.C
Rf（ｎ−BuOH：AoOH：H2O＝４：１：２）
＝0.40
坂口反応（＋）、ニンヒドリン反応（＋）
アミノ酸分析値（モル比）
Leu：1.30、（γ−HO）Arg：1.00
試験例
(1) アミノペプチダーゼＢ活性阻害作用
ラツト肝臓ホモジネート6500×ｇ上清を酵素源
とし、アルギニル−β−ナフチルアミドを基質と
してアミノペプチダーゼＢ活性阻害作用を調べ
た。結果を第１表に示す。
The present invention relates to dipeptides containing γ-hydroxyarginine. More specifically, the present invention relates to a dipeptide containing γ-hydroxyarginine of the general formula (): H-X-(γ-HO)Arg-OH (), where X is isoleucine, leucine or valine. Regarding. Compound()
It has interesting physiological activities, such as inhibiting aminopeptidase B activity, as well as preventive and therapeutic effects on rheumatoid arthritis. γ-Hydroxyarginine is an abnormal amino acid and is not abundant in nature, so γ-hydroxyarginine
- It has not yet been possible to produce a peptide containing hydroxyarginine by chemical synthesis. The present inventors have been considering the production of a peptide containing γ-hydroxyarginine by a chemical synthesis method using naturally occurring γ-hydroxyarginine as a raw material, and the general formula (): (In the formula, A is a carbobenzoxy group or p-methoxybenzyloxycarbonyl group, B is 2,
4,6-trimethylbenzenesulfonyl group, 2,
6-dimethyl-4-methoxybenzenesulfonyl group or 4-methoxybenzenesulfonyl group) is synthesized, and then the compound () and the protected group of X are synthesized. By carrying out a peptide formation reaction, removing all protecting groups with acid, and purifying, the general formula (): H-X-(γ-HO)Arg-OH () (in the formula, X is the same as above) The present inventors have discovered that a novel dipeptide containing γ-hydroxyarginine can be obtained, and have completed the present invention. Generally, in the chemical synthesis of peptides, it is necessary to protect the amino acid side chain functional groups, but in the production of γ-hydroxyarginine-containing peptides in the present invention, the side chain functional groups of γ-hydroxyarginine are protected as follows. Protect by method. That is, first, the α-amino group is treated with carbobenzoxy chloride in a conventional manner to form N-carbobenzoxy-γ-hydroxyarginine, and then 2.5
The guanidino group is protected by converting it into 2,4,6-trimethylbenzenesulfonyl (hereinafter referred to as Mts) by reacting with an equivalent or more amount of 2,4,6-trimethylbenzenesulfonyl chloride. In the above reaction, the γ-hydroxy group is ring-closed with the α-carboxyl group to form the formula (a): A γ-lactone body is formed, and the protective group formation of the γ-hydroxy group and the α-carboxyl group is completed at the same time. Compound (), which is a protected group of γ-hydroxyarginine obtained as described above, is a completely new compound, and is also an important intermediate that is a key compound in the production of peptides containing γ-hydroxyarginine. By removing some of the protecting groups, it can be used as both an acid component and an amine component, so it can be applied to the production of many physiologically active peptides. The production method of the present invention comprises the above-mentioned novel γ-hydroxyarginine protected compound () and
A novel dipeptide represented by the general formula (): H-X-(γ-HO)Arg-OH () (wherein, However, the method of peptide formation is the commonly used active ester method,
DCC/HOSu method or acid anhydride method can be used. Among these, it is preferable to use the active ester method. That is, the general formula () in which the α-amino group of X is protected with a carbobenzoxy group, (4-CH 3 O) carbobenzoxy group, or t-butyloxycarbonyl group: (In the formula, Z is a carbobenzoxy group, and X is the same as above) is treated with an acid, preferably 25% HBr/acetic acid to remove the α-amino protecting group. The resulting formula ()b: (In the formula, Mts is the same as above) and dimethylformamide (hereinafter referred to as DMF)
By reacting overnight at room temperature, the desired protected dipeptide can be obtained. Next, the final step of the production method, which is the elimination reaction of all protecting groups, is carried out using an acid, and it is particularly preferable to carry out the reaction using an equal amount mixture of trifluoromethanesulfonic acid and trifluoroacetic acid to which a small amount of anisole has been added. The crude peptide obtained as described above was CM-
It is purified and separated by ion exchange column chromatography using Sephadex C-25, and the main eluted fractions eluted with 0.1N ammonia are collected and freeze-dried. By this method, the γ-hydroxyarginine-containing dipeptide represented by the general formula () is converted into γ-
Obtained from hydroxyarginine with a yield of 20-40%. The compounds of the invention () have interesting biological activities. For example, since it has the effect of inhibiting the activity of aminopeptidase B, an enzyme present in lymphocytes and cancer cell membranes, it is effective as an immune system-mediated anti-inflammatory agent, anti-allergic agent, immunotherapeutic agent, anti-cancer agent, etc. In addition, one of the compounds (), isoleucyl-γ-hydroxyarginine, was administered intravenously for one month to treat adjuvant arthritis induced by Freund's complete adjuvant in female Lewis rats (8 weeks old). Suppresses primary and secondary inflammation,
Furthermore, it has been shown to reduce joint swelling in therapeutic trials. Note that γ-hydroxyarginine, which is the starting material in the present invention, was prepared from K582 peptide produced by Metarhizium anisopliae (S. Kondo et al.
J. Antibiotic 33 , p533-542 (1980)). In addition, each abbreviation in this specification is
The following amino acids, peptides, protecting groups, active groups, or reagents are represented by IUPAC-IUB abbreviations or customary abbreviations in the field. (γ-HO)Arg: γ-hydroxyarginine,
Ile: isoleucine, Leu: leucine, Val: valine (unless otherwise indicated, amino acids are in the L form), Z: carbobenzoxy group, Boc: t-butoxycarbonyl group, Mts: 2,4,6- Trimethylbenzenesulfonyl group, TFA: trifluoroacetic acid, TFMSA: trifluoromethanesulfonic acid, oSu: N-hydroxysuccinimide, DCC:
Dicyclohexylcarbodiimide, DMF: dimethylformamide, BuOH: butanol,
AcOH: acetic acid, MeOH: methanol, AcOEt:
Ethyl acetate, Et3N : triethylamine. Next, the present invention will be explained in more detail with reference to Examples and Test Examples, but the present invention is not limited to these Examples. Example 1 Z-(γ-HO)Arg-OH synthesis H-(γ-OH)Arg-OH1g (0.0052 mol)
In addition to 7 ml of an aqueous solution of NaHCO 3 (4.42 mg), 1.43 g (0.008 mol) of Z-Cl was added while cooling with ice water, and then 8 ml of an aqueous solution of NaHCO 3 (880 mg) was added and stirred vigorously. After 30 minutes, the temperature was returned to room temperature, and the reaction was continued for another 2 hours. When the precipitated oil solidified, the reaction solution was removed by decantation, washed with water and ether, and dried under reduced pressure to obtain the desired substance as a colorless powder. Yield: 1.2g (70.4%), MP: 160° (decomposition) Light intensity: [α] 30 D = +18.4° (C = 2.0, 60% DMF
aqueous solution) Thin layer chromatography (hereinafter referred to as TLC) R f (nBuOH:AcOH: H2O =4:1:2)=
0.54 Sakaguchi reaction (+), ninhydrin reaction (-) Example 2 Z-(γ-HO)Arg(Mts)-OH
-Synthesis of lactone Z-(γ-OH)Arg-OH1.2g (0.0037mol)
was suspended in a mixture of 3.7 ml of 4N-NaOH and 15 ml of acetone, and 2.02 g (0.00925 mol) of Mts-Cl was added under cooling to 0°C.
5 ml of an acetone solution was added and stirred. After 30 minutes, the mixture was returned to room temperature and allowed to react for about 4 hours. After separating the precipitate, the reaction solution was concentrated, and the residue was dissolved in ethyl acetate, washed, and dried over M g SO 4 . Ethyl acetate was distilled off, and the remaining crude crystals were recrystallized from ethyl acetate-ether to obtain the desired substance as a colorless powder. Yield: 820 mg (45.5%) mp: 167-170℃ Light exposure: [α] 30 D = -17.2 (C = 1.0, MeOH) T.
LC R f (CHCl 3 :MeOH:AcOH=95:3:2)=
0.35 R f (CHCl 3 : AcOEt = 1:4) = 0.42 Sakaguchi reaction (-), ninhydrin reaction (-) IR spectrum (cm -1 ) 1785 (ν-lactone) MS spectrum (m/e) 488 (M + ) NMR spectrum (δ value: ppm), (in DMSO) 2.20 (3H, s), 2.60 (6H, s), 4.40 (H,
m), 4.6 (H, m), 5.10 (2H, s), 7.3 (5H, s) Elemental analysis value: Theoretical value (%) as C 23 H 28 O 6 N 4 S: C56.54 H5.78 N11 .47 Actual value (%): C56.60 H5.84 N11.36 When the recrystallization solution was distilled off, approximately 800 mg of oil remained, and TLC revealed that a considerable amount of Z- was present along with the lactone body.
The presence of (γ-HO)Arg(Mts)-OH form was observed. Therefore, dissolve the oil in 3 ml of pyridine,
A lactone oil (approximately 900 mg) was obtained by adding Mts-Cl2 equivalent and leaving it in a cold place overnight.
It was also possible to use this oil as it was in the next deprotection group (deZ) reaction. The total yield of lactone in this reaction was 88.5% including oil. Example 3 H-(γ-HO)Arg(Mts)-OH-
Synthesis of lactone/HBr salt Z-(γ-HO)Arg(Mts)-OH-lactone800
mg (0.0016 mol) was suspended in 10 ml of acetic acid and cooled for 25 min.
10 ml (20 equivalents) of % HBr-acetic acid solution was added. The homogeneous solution was stirred at room temperature for about 50 minutes, the reaction product was concentrated under reduced pressure, and the residue was solidified, washed thoroughly by trituration in anhydrous ether, and the precipitate was removed to obtain the target substance as a pale gray powder. I got it. Yield: 600 mg (86%) mp: 142° (decomposition) Light intensity: [α] 30 D = -8.0° (C = 1.0, 60% DMF aqueous solution) TLC R f (n-BuOH: AcOH: H 2 O = 4:1:2)=
0.57 R f (CHCl 3 :MeOH:AcOH=85:10:5)=
0.05 Sakaguchi reaction (-), ninhydrin reaction (+) IR spectrum (cm + ) 1785 (ν-lactone) Example 4 Z-Ile-(γ-HO)Arg(Mts)-
Synthesis of OH-lactone H-(γ-HO)Arg(Mts)-OH-lactone・
Dissolve 1g (0.0023mol) of HBr in 5ml of DMF,
Add 240 mg (0.0023 mol) of Et 3 N, then add Z-Ile
A solution of 834 mg (0.0023 mol) of -OSu in DMF (5 ml) was added, and the mixture was reacted overnight at room temperature. The reaction solution was concentrated under reduced pressure, and the residue was dissolved in ethyl acetate, washed with 10% citric acid and water, and then dried over M g SO 4 .
Ethyl acetate was distilled off, and the residue was triturated with ether and collected to give the desired substance as a pale gray powder. Yield: 900 mg (65%) mp: 110-111° (decomposition) Light intensity: [α] 30 D = -17.0° (C = 1.22, MeOH)
TLC R f (CHCl 3 : AcOEt = 1:4) = 0.45 IR spectrum (cm -1 ) 1780 (ν-lactone) MS spectrum (m/e) 601 (M + ) Example 5 H-Ile- (γ- HO) Synthesis of Arg-OH CF 3 SO 3 H6.2g, TFA4.7g and anisole
Add Z−Ile−(γ−HO)Arg to 450 mg of mixed solution under cooling.
500 mg (0.0083 mol) of (Mts)-OH-lactone was added, the temperature was returned to room temperature, and the mixture was stirred for about 1 hour. Anhydrous ether was added to the reaction solution, and the precipitated oil was washed with ether, then dissolved in a small amount of water, and 5 g of Amberlite CG-400 (acetic acid type) resin was added, stirred for 30 minutes, and the resin was separated. . The solution was made alkaline with 1N NaOH, left for a while, neutralized with acetic acid, and subjected to column chromatography using a CM-Sephadex C-25 column (2.5 x 13 cm), eluting with 0.1N ammonia, and The eluted fractions were collected and purified by lyophilization. Yield: 140 mg (56%) Light intensity: [α] 30 D = -5.7° (C = 1.1, H 2 O TLC R f (n-BuOH: AcOH: H 2 O = 4:1:2) =
0.30 R f (C- NH4OH :n-PrOH=7:13)=0.05 Sakaguchi reaction (+), ninhydrin reaction (+) Amino acid analysis value (molar ratio) Ile: 0.90, (γ-HO)Arg: 1.00 Example 6 H-Val-(γ-HO)Arg-OH
Synthesis of H-(γ-HO)Arg(Mts)-OH-lactone-
Dissolve 608g (0.0014mol) of HBr in 3ml of DMF,
Add 141 mg (0.0014 mol) of Et 3 N and then
Val-oSu440mg (0.0014mol) in DMF solution (3
ml) and reacted overnight at room temperature. The reaction solution was concentrated under reduced pressure, made into an ethyl acetate solution, washed with 10% citric acid and water, and then dried over M g SO 4 .
Ethyl acetate was distilled off, and the residue was powdered with ether. Obtained Boc−Val−(γ−HO)
Arg(Mts)-OH-lactone 560mg (72.3%)
CF3SO3H - TFA-anisole was added to remove all protecting groups, and CM-Sephadex was added in the same manner as in Example 5.
Perform column chromatography using C-25,
The main fractions were collected and purified by lyophilization. Yield: 150 mg (37.01%) Light intensity: [α] 30 D = -11.08° (C = 0.695, H 2 O)
TLC R f (n-BuOH:AcOH: H2O =4:1:2)=
0.20 Sakaguchi reaction (+), ninhydrin reaction (+) Amino acid analysis value (molar ratio) Vel: 1.19, (γ-HO)Arg: 1.00 Example 7 H-Leu-(γ-HO)-Arg-OH
Synthesis of H-(γ-HO)Arg(Mts)-OH-lactone・
543 mg (0.00125 mol) of HBr in DMF, Boc-Leu
-Reacted overnight with 410 mg (0.00125 mol) of OSu to produce Boc-Leu-(γ-HO)Arg(Mts) as a gray powder.
-OH-lactone 550 mg (73%) was obtained. Then
Add to the solution of CF 3 SO 3 H−TFA−anisole,
All protecting groups were removed by reacting at room temperature for 1 hour. Elution was performed by column chromatography on CM-Sephadex C-25 in the same manner as in Example 5, and the main fractions were collected and purified by lyophilization. Yield: 190 mg (50.2%) Light intensity [α] 30 D = -8.52° (C = 0.575, H 2 O) T.
LC R f (n-BuOH:AoOH: H2O =4:1:2)
=0.40 Sakaguchi reaction (+), ninhydrin reaction (+) Amino acid analysis value (molar ratio) Leu: 1.30, (γ-HO)Arg: 1.00 Test example (1) Aminopeptidase B activity inhibition effect Rat liver homogenate 6500 x g The inhibitory effect on aminopeptidase B activity was investigated using the supernatant as an enzyme source and arginyl-β-naphthylamide as a substrate. The results are shown in Table 1.
【表】
第１表から明らかなように本発明の化合物は明
療なアミノペプチダーゼＢ活性阻害作用を示し
た。
(2) リウマチ関節炎に対する効果
ルイス系雌性ラツト（８週令）を使用し、フロ
イントコンプリートアジユバントによつて惹起さ
れるアジユバント関節炎に対する抑制作用によつ
てリウマチ関節炎に対する効果を調べた。予防実
験ではIle（γ−HO）Arg0.1〜1.0mg／Kg／日の１
カ月間連続静脈内投与によつて第１次炎症を20〜
40％、第２次炎症を40〜50％抑制した。治療実験
においても関節腫脹を0.1〜1.0mg／Kg／日の一カ
月間連続静脈内投与によつて20〜50％減少させ
た。叙上のごとく本発明の化合物は明確なアジユ
バント関節炎に対する抑制作用を示した。[Table] As is clear from Table 1, the compounds of the present invention exhibited a clear inhibitory effect on aminopeptidase B activity. (2) Effect on rheumatoid arthritis Using Lewis female rats (8 weeks old), the effect on rheumatoid arthritis was investigated by suppressing the adjuvant arthritis induced by Freund's complete adjuvant. In prevention experiments, Ile(γ-HO)Arg 0.1-1.0mg/Kg/day
Primary inflammation can be suppressed by continuous intravenous administration for 20 to 20 months.
40% and secondary inflammation by 40-50%. In therapeutic experiments, joint swelling was reduced by 20-50% by continuous intravenous administration of 0.1-1.0 mg/Kg/day for one month. As mentioned above, the compounds of the present invention showed a clear inhibitory effect on adjuvant arthritis.