JPH04182398A

JPH04182398A - 結晶作製方法

Info

Publication number: JPH04182398A
Application number: JP30578290A
Authority: JP
Inventors: Kotaro Oka; 浩太郎岡; Takaharu Asano; 高治浅野; Shozo Fujita; 省三藤田
Original assignee: Fujitsu Ltd
Current assignee: Fujitsu Ltd
Priority date: 1990-11-09
Filing date: 1990-11-09
Publication date: 1992-06-29

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔概要〕自由界面拡散法により単結晶を作製する結晶作製方法に
関し、自由界面拡散法により簡易に結晶を作製し、結晶条件か
容易に決定可能で動作信頼性を高くすることを目的とし
、生体高分子溶液と結晶化剤とを界面接触させ、自由界面
拡散法により該生体高分子溶液を結晶化させる結晶作製
方法において、第１の容器に前記生体高分子溶液を封入
すると共に、第２の容器に前記結晶化剤を封入する第１
の工程と、該生体高分子溶液及び該結晶化剤を界面接触
させる第２の構成と、該結晶化剤か該生体高分子溶液に
拡散して該生体高分子溶液が結晶化する所定時間後に、
該第１の容器を所定数に仕切る第３の工程とを含む構成
とし、または、前記第１の工程は、前記第１の容器及び
第２の容器を低透水性、低吸水性の部材で形成して前記
生体高分子溶液及び結晶化剤を封入する構成とする。

〔産業上の利用分野〕

本発明は、自由界面拡散法により単結晶を作製する結晶
作製方法に関する。

例えば、タンパク質の構造解析を行うことは、生体機能
の解明には必須であり、この構造解析は良質なタンパク
質結晶を成長させてＸ線解析により行う。そのため、不
貝物を含有せず且つ欠陥のない生体高分子の単結晶の作
製を行う必要かある。

〔従来の技術〕

従来より、タンパク質結晶を成長させる方法として、静
置バッチ法、蒸気拡散法、自由界面拡散法が提案されて
きた。これらを簡単に説明すると、静置バッチ法は、タ
ンパク質溶液に結晶他剤溶液を加え、混合・静置して結
晶成長させるものである。蒸気拡散法は、タンパク質溶
液と結晶他剤溶液とを隔ててタンパク質溶液内の水分を
ゆっくりと除去し、タンパク質を過飽和状態にして結晶
成長させるものである。また、自由界面拡散法は、タン
パク質溶液と結晶他剤溶液との界面を保った状態で接触
させ、結晶化剤か拡散によりゆっくりとタンパク質溶液
内に浸透することで過飽和状態にして結晶成長させるも
のである。

これらの方法で実験を行う場合、タンパク質溶液と結晶
他剤溶液を隔てている間仕切りを取除いて行うスライド
方式が採用される。この方式は、密閉した環境で実験す
ることか可能であり、装置がコンパクトであると共に、
可動部が少な（宇宙でのタンパク質結晶成長を行うため
の装置とじて動作の信頼性か保証されている。

一方、タンパク質を結晶化させる方法として、塩濃度勾
配法がある。この方法は、結晶化条件を決定する場合、
または結晶化条件が知られていないタンパク質を結晶化
させる場合に採用される。

塩濃度勾配法は、タンパク質溶液と結晶他剤溶液を混合
する際に、結晶化剤の濃度を徐々に変化させてタンパク
質溶液と混合させる方法である。

この場合、タンパク質結晶化装置としてパイプライン方
式のものが既に考えられており、結晶化剤を注入するシ
リンジポンプ、攪拌手段であるスタータ、パイプを小室
に区切るための電磁弁等を有する。この装置は、単にタ
ンパク質結晶化を行うだけでなく、結晶化に最適な塩濃
度条件を探索することかできる。

〔発明か解決しようとする課題〕

しかしながら、従来の静置バッチ法、蒸気拡散法、自由
界面拡散法では結晶化条件が未知である場合には、決定
することかできない。一方、塩濃度勾配法では上述のよ
うに可動部か多いと共に、大型となる。また、シリンジ
ポンプを使用することから、シリンジ部に結晶化剤か固
着する場合かあると共に、常にシリンジ部とピストン部
からのタンパク質溶液、結晶化剤溶液の蒸発を考慮しな
ければならず、動作の信頼性か必ずしも保証されないと
いう問題かある。

そこで、本発明は上記課題に鑑みなされたもので、自由
界面拡散法により簡易に結晶を作製し、結晶条件か容易
に決定可能て動作信頼性の高い結晶作製方法を提供する
ことを目的とする。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、自由界面拡散法により塩濃度勾配を形成させ
るもので、第１図に本発明の原理説明図を示す。第１図
において、第１の工程では、第１の容器に生体高分子溶
液を封入すると共に、第２の容器に結晶化剤を封入する
。第２工程では、該生体高分子と該結晶化剤とを界面接
触させる。そして、第３の工程では、該結晶化剤が該生
体商号−〇　− 子溶液に拡散して該生体高分子溶液か結晶化する所定時
間後に、該第１の容器を所定数に仕切るものである。

また、前記第１及び第２の容器を低透水性、低吸水性の
部材で形成し、または前記第２及び第３の工程のそれぞ
れにおいて、所定の温度下で結晶化か行われる。

〔作用〕

第１図に示すように、本発明はスライド方式またはパイ
プライン方式により自由界面拡散法を簡易に行うもので
ある。すなわち、送液等を行うことなく、密閉した環境
で生体高分子の結晶成長を行うことが可能となる。また
、生体高分子溶液と結晶化剤との界面接触により、結晶
化剤が除々に第１の容器の奥へと拡散することから、塩
濃度勾配が形成され、生体高分子溶液の結晶状態で結晶
化条件を決定することか可能となる。

ここで、パイプライン方式を採用する場合は、第１及び
第２の容器を柔軟性のある低透水性、低吸水性の部材て
形成することで自由界面拡散法を簡易に行うものである
。

また、上述の第２及び第３の工程において、それぞれ所
定の温度下で結晶化を行わせることから、不定形沈澱物
が析出しない条件として、第２工程で形成された結晶核
を第３の工程で穏やかに成長させることが可能となる。

〔実施例〕

第２図に本発明のスライド方式による一実施例の構成図
を示す。第２図は本発明の生体高分子結晶化装置を示し
たもので、本実施例では生体高分子をタンパク質として
説明する。

第２図において、結晶化セルである第１及び第２の容器
１，２が第１のスライド板３により仕切られている。ま
た、第１の容器１は第２及び第３のスライド板４，５に
より仕切り可能に形成されている。なお、第１の容器ｌ
は２つのスライド板４．５により仕切り可能としている
が、３つ以上のスライド板て細かく仕切ってもよい。

このような結晶化装置に、まず、第１の容器１内にタン
パク質溶液６（ミオグロビン１．０％、硫安５５％飽和
）を封入し、第２の容器２に結晶化剤７が封入される（
第２図（Ａ））。この結晶化剤７は硫安溶液（９７％飽
和）又は硫安結晶か用いられる。この場合、第２及び第
３のスライド板４゜５は第１の容器ｌを仕切らない開放
状態になっており、第１のスライド板３は第１及び第２
の容器１．２を仕切ってタンパク質溶液６と結晶化剤７
とを分離している。

ここで、第１のスライド板３をスライドさせて開放状態
とすると、タンパク質溶液６と結晶化剤７とが界面接触
する（第２図（Ｂ））。このように界面接触すると結晶
化剤７またはタンパク質溶液に溶解した結晶化剤７ａは
第１の容器ｌ内のタンパク質溶液６内に拡散する（第２
図（Ｃ））。この結果、タンパク質溶液６中に結晶化剤
（硫安）の濃度勾配が形成され、所定時間後、適当な硫
安濃度においてタンパク質は至適硫安濃度で結晶化し、
結晶成長する。

結晶化する所定時間経過後に、第２及び第３のスライド
板４，５を閉じて、該第１の容器Ｉを３つのコンパート
メント８ａ、８ｂ、８ｃに仕切る（第２図（Ｄ））。そ
して、タンパク質結晶９を保持９回収し、回収したコン
パートメント８ａ〜８ｃ内の溶液条件を調べることによ
り、結晶化条件を決定することかできる。すなわち、第
２図（Ｃ）、（Ｄ）において、結晶化剤７はタンパク質
溶液６に徐々に拡散することから、塩濃度勾配はコンパ
ートメント８ｃ内の濃度が高く、第２の容器２より遠い
コンパートメント８ｂ、８ａはど濃度が低くなる。従っ
て、塩濃度勾配中のどの位置でタンパク質の結晶化が起
るかを知ることにより、結晶化条件を容易に決定するこ
とかてきる。

次に、第３図に、本発明のパイプライン方式による一実
施例の構成図を示す。第３図において、第１のピンチコ
ック１０の圧着１分割により第１及び第２の容器１，２
が分離される。この第１及び第２の容器１．　２は、低
透水性、低吸水性の例えば内径２．４ｍｍ及び長５０ｍ
ｍのテフロン系チュー　Ｉｍ− ブのＰＦＡ　（４フッ化エチレン−パーフロロアルコキ
シエチレン共重合体）やＦＥＰ　（４フッ化エチレン−
〇フッ化プロピレン共重合体）で形成される。これは長
期試験を行う場合に適することから使用されるものであ
る。

いま、第１の容器１の開放端より生体高分子溶液である
タンパク質溶液６（ミオグロビン１．０９６溶液、硫安
５５％飽和）を充填し、該開放端をヒートシールｌｌａ
の熱圧着て密閉して封入する（第３図（Ａ））。一方、
第２の容器２は開放端より約５ｍｍで第１のピンチコッ
ク１０て形成さ第１たものて、該開放端より硫安溶液（
９７％飽和）または硫安結晶の結晶化剤７か充填される
。そして、該開放端をヒートシール１１ｂの熱圧着て密
閉して封入する（第３図（Ａ））。

そこで、第１のピンクコック１０を開放状態とすると、
タンパク質溶液６と結晶化剤７とが界面接触し、該結晶
化剤７がタンパク質溶液６に徐々に拡散し、第２図と同
様に、タンパク質か結晶化を開始する（第３図（Ｂ））
。例えば、２４時間を経過したあたりからタンパク質結
晶の成長か観察できた。そして、１２０時間経過したと
ころで第１の容器ｌのチコーブを約１　ｃｍ刻みて第２
〜第５のピンチコック１２〜１５により圧着１分割して
、コンパートメント１６ａ〜１６ｄを形成する（第３図
（Ｃ））。このコンパートメント１６ａ〜１６ｄ内のう
ち、タンパク質結晶か成長した部位について硫安濃度を
アツベ式屈折率計により調へた結果、硫安濃度か７０９
６〜８０９６飽和の範囲で結晶化か起こっていることか
確認された。なお、結晶化の原理は第２図と同様である
。

このように、第２図、第３図からも明らかなように、簡
易に自由界面拡散法により、タンパク質（生体高分子）
の結晶を作製することかでき、塩濃度勾配中のとこでタ
ンパク質の結晶化か起きるかを知ることにより結晶化条
件を容易に決定することかできる。また、可動部か少な
いことから動作信頼性か高く、また、送液等の装置かな
く装置の小型化を図ることかできることによって、宇宙
でタンパク質結晶化を行い、地上への回収を容易に行う
ことができる。

次に、図示はしないか、本発明の他の実施例について説
明する。上述のタンパク質か、リボヌクレアーゼＳ、ミ
オグロビンなとのように温度により結晶化をコントロー
ルできる場合には、タンパク質溶液を一時的に昇温また
は降温させてタンパク質核を形成させ、その後温度を所
定温度にして結晶成長させることにより、不定形沈澱物
か析出しない条件として、既に形成した結晶核を穏やか
に成長させることかできる。例えば、第３図において、
ミオグロビンのタンパク質溶液６を用いた場合、装置全
体を結晶核か発生する温度（３７°Ｃ）とし、結晶化剤
７の濃度勾配を作製する（第３図（Ｂ））。そして、コ
ンパートメント１６ａ〜１６ｄに分割して後に２０°Ｃ
環境に当該装置を移すことにより、核形成をコントロー
ルしながら結晶化条件を調べることがてきる。

なお、上記実施例では、結晶化剤に硫安溶液又は硫安結
晶を用いた場合を示したが、これ以外の結晶化剤につい
ても容易に結晶化条件を調べることかてきる。

〔発明の効果〕

以上のように本発明によれば、自由界面拡散法により界
面接触後に第１の容器を仕切ることにより、簡易に結晶
を作製することかできると共に、結晶条件か容易に決定
可能であり、動作信頼性を高くすることができる。また
、結晶核形成と結晶成長とをそれぞれ所定の温度下で行
うことにより、結晶核を穏やかに成長させることかでき
、不定形沈澱物を析出せずに結晶化を行うことができる
。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の原理説明図、第２図は本発明のスライド方式による一実施例の構成図
、第３図は本発明のパイプライン方式による一実施例の構
成図である。図において、１は第１の容器、２は第２の容器、３は第１のスライド板、４は第２のスライド板、５は第３のスライド板、６はタンパク質溶液、７は結晶化剤、８　ａ　〜８　ｃ、　　Ｉ　６　ａ−１６ｄはコンパー
トメント９は結晶、１０は第１のピンチコックを示す。特許出願人　富　士　通　株式会社第１図Ｑ　　　　　　　　　　　　　口

Claims

【特許請求の範囲】

（１）生体高分子溶液（６）と結晶化剤（７）とを界面
接触させ、自由界面拡散法により該生体高分子溶液（６
）を結晶化させる結晶作製方法において、第１の容器（１）に前記生体高分子溶液（６）を封入す
ると共に、第２の容器（２）に前記結晶化剤（７）を封
入する第１の工程と、該生体高分子溶液（６）及び該結晶化剤（７）を界面接
触させる第２の構成と、該結晶化剤（７）が該生体高分子溶液（６）に拡散して
該生体高分子溶液（６）が結晶化する所定時間後に、該
第１の容器（１）を所定数に仕切る第３の工程と、を含むことを特徴とする結晶作製方法。
（２）前記第１の工程は、前記第１の容器（１）及び第
２の容器（２）を低透水性、低吸水性の部材で形成して
前記生体高分子溶液（６）及び結晶化剤（７）を封入す
ることを特徴とする請求項（１）記載の結晶作製方法。
（３）前記第２及び第３の工程において、それぞれ所定
の温度下で前記生体高分子（６）の結晶化を行うことを
特徴とする請求項（１）又は（２）記載の結晶作製方法
。