JPH04145367A - Fraction quantitative method of hemoglobin alc (hbalc) and relative hemoglobin alc (hbalc) quantitative kit - Google Patents
Fraction quantitative method of hemoglobin alc (hbalc) and relative hemoglobin alc (hbalc) quantitative kitInfo
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Abstract
Description
［産業上の利用分野］
本発明はヘモグロビンＡＩＣ（ＨｂＡＩＣ）の分画定量
方法と、それを実施する為に構成されたヘモグロビンＡ
ＩＣ（ＨｂＡＩＣ）の分画定量方法に関する。
［従来技術］
抹消血中のグルコースは、ヘモグロビンＡ（ＨｂＡｏ）
のβ鎖のＮ末端（ヘパリン残基）とシッフ結合すること
により、不安定なアルジミン（ｐｒｅ−ＨｂＡｌｃ）と
なる。この反応は可逆反応で、生成したアルジミンが、
元のグルコースとヘモグロビン（ＨｂＡｏ）に分解する
場合と、アルジミンが更にアマトリ転換し、安定なケト
アミン（ＨｂＡｌｃ）となる場合がある。
現在、グリコヘモグロビン（）ｌｂＡｌｃ）値が、糖尿
病の血糖コントロールの指標として有用であると認識さ
れ、臨床領域で広く利用されている。
血液中には、前述のＨｊＡｏ、 Ｉ）ｒｅ−ＨｂＡｏ、
ＨｂＡＩｃが存在し、ｐｒｅ−ＨｂＡＩｃは採血時の
血糖値、採血後のグルコースの消費等により、大きく値
が変動する為、ＨｂＡｌｃのみを定量することが望まし
いとされている。ＨｂＡｌｃの定量方法には、エレクト
ロフォーカシング法、比色法、アフィニティークロマト
グラフィー法、ＨＰＬＣ法等がある。
現在、汎用されているＨＰＬＣ法では、（Ａ） ｐｒｅ
−ＨｂＡｌｃと）ｆｂＡｌｃとが混在する検体ヲクロマ
ト処理時間を長くすることにより両者を分離する方法
（Ｂ）検体の前処理により、ｐｒｅ−ＨｂＡｌｃを除去
し、クロマト処理時間を短縮する方法がある。
ｐｒｅ−ＨｂＡＩｃ ｔ７）除去方法Ｅ＆ｉ、（１）グ
ルコースを赤血球に消費させｐｒｅ−ＨｂＡＩＣを分解
する方法。
（２）グルコースを受は取る物質を添加し、ｐｒｅ−Ｈ
ｂＡＩｃを分解する方法。
（３）強力なアロステリックエフェクターを添加し、可
逆的に結合しているグルコースヲ追い出し、ｐｒｅ−）
１ｂＡｌｃを分解する方法がある。
この様に、ＨＰＬＣ法は、汎用されてはいるが、高価な
機器の購入が必要であり、煩雑な前処理が必須であるこ
と、１時間あたりの処理検体数が少ないこと等、解決す
べき問題が多い。
アフィニティクロマトグラフィー法の測定操作は、
（１）資料調製液で調製した検体をｍ−アミノフェニル
ボロン酸を固定化したアガロースを充填したカラムに添
加し、グリコヘモグロビンのグルコースのｃｉｓ−ジオ
ール基と、アガロースに固定化したｍ−アミノフェニル
ボロン酸と五員環を形成させる。
（２）緩衝液でアガロースを洗浄することにより、グリ
コヘモグロビン以外のヘモグロビンを、流出させる。
（３）溶出用緩衝液でグリコヘモグロビンを溶出させる
。
（４）グリコヘモグロビン画分の吸光度、非グリコヘモ
グロビン画分の吸光度を測定する。
（５）計算によりグリコヘモグロビン量を算出する。
であり、
（１）正確で特異性の高い測定値が得られる。
（２） ｐ ｒ ｅ−ＨｂＡ ｌ ｃの影響がない。
（３）胎児性ヘモグロビン（ＨｂＦ）、異常ヘモグロビ
ン（ＨｂＳ、 ＨｂＣ）の影響がない。
という特長がある。しかしながら、アフィニティークロ
マトグラフを用いる方法である為、測定操作を自動化す
ることが困難で、汎用されるには至っていない。
Ｕ問題を解決する為の手段］
本発明の発明者らは、
（１）官能基−Ｎ＝ＣＨ−（ＣＨｚ）−ＣＨ：Ｎ−を介
して、ｍ−７ミノフエニルボロン酸を共有結合させた試
験管、ビーズ、マイクロタイタープレート、磁性粒子等
の実験器具を用いる方法。
（２）ｍ−アミノメチルボロン酸を固定化したアフィニ
ティークロマトグラフィー担体を固相化した試験管、ビ
ーズ、マイクロタイタープレート、磁性粒子等の実験器
具を用いる方法。
がアフィニティークロマトグラフィー法の自動化、汎用
を可能にすることを見出した。
即ち、本発明によれば、
（１） ＨＰＬＣ法の煩雑な前処理が省略でき、単位時
間当たりの処理検体数の、飛躍的
な増大が期待できる。
（２）アフィニティークロマトグラフィー法の測定操作
の大幅な簡略化が可能となる。
（３）高価なアフィニティークロマトグラフィー担体の
使用量を減少させることにより、安価なＨｂＡＩｃ分画
定量キットの提供が可能となる。
以下に実施例を挙げて、本発明を更に詳細に説明する。
実施例Ｉ
Ａ、キット内容
（１）ｍ−フェニルボロン酸を共有結合させたマイロタ
イタープレート。
（２＞ ３．３°、 ５．５’−テトラメチルベンジン
または、その水可溶化誘導体を含む水溶液。
（３）過酸化ストロンチウムまたは、過酸化水素を含む
水溶液。
４）標準へモグロビ７ Ａｌｃ （Ｈ，ｂＡｌｃ）。
５）試料調製液。
６緩衝液。
７）洗浄液。
８）反応停止液。
Ｂ、測定操作
（１）被検血液を試料調製液で溶血させた。
（２） （１）の操作をした検体を緩衝液で希釈し、
マイクロタイタープレートの各人に２００ ＪＪＩづつ
分取した。
（３） （２）のＪｔ作をしたマイクロタイタープレ
ートにシールをし、室温で３０分インキユベートシた。
（４）マイクロタイタープレートの各人の内容液を捨て
、洗浄液３００ ＪＪＩで３回洗浄した。
（５） （４）の操作をしたマイクロタイタープレー
トの各人にキットの（３）と（４）の等量混液２００
ｐｌを添加、混和し、３７度で１０分間インキュベート
した。
（６） （５）の操作をしたマイクロタイタープレー
トの各人に反応停止液１００ ＪＪＩを添加し、４５０
ｎｍの吸光度を測定した。
（７）標準ＨｂＡＩｃを用いて同一操作をして描いた検
量線から検体のＨｂＡｌｃ値を求めた。
実施例２゜
Ａ、キット内容
（１）官能基−Ｎ＝ＣＨ−（ＣＨ２） 、−ＣＨ＝Ｎ−
を固定化し、その官能基に、計アミノメチルボロン酸を
共有結合させた、マイクロタイタープレート（２）酵素
標識抗ヒトヘモグロビンＡｌｃ （ＨｂＡｌｃ）抗体。
（３）酵素標識抗体溶解液。
（４）標準ヘモグロビンＡｌｃ （ＨｂＡＩＣ）。
（５）酵素基質。
（６）緩衝液。
（７）洗浄液。
（８）反応停止液。
Ｂ、測定操作
（１）被検血液を試料調製液で溶血させた。
（２） （１）の操作をした検体を緩衝液で希釈し、
マイクロタイタープレートの各人に２００ ｐｌづつ分
取した。
（３） （２）の操作をしたマイクロタイタープレー
トにシールをし、室温で３０分インキュベートした。
（４）マイクロタイタープレートの各人の内容液を捨て
、洗浄液３００ Ｊｌｌで３回洗浄した。
（５） （４）の操作をしたマイクロタイタープレー
トの各人に酵素標識抗体２００ ＪＪＩを添加し、３７
度で１時間インキュベートした。
（６）マイクロタイタープレートの各人の内容液を捨て
、各人を洗浄液３００ 、ｐｉで３回洗浄した。
（７） （６）のｉ作をしたマイクロタイタープレー
トの各人に、酵素基質液２００ ＪＪＩを添加、混和し
、３７度で１時間インキュベートした（８） （７）
の操作をしたマイクロタイタープレートの各人に反応停
止液＋００ ＪＪＩを添加し、４９２ ｎｍの吸光度を
測定した。
（９）標準ＨｂＡｌｃを用いて同一操作をして描いた検
量線から検体のＨｂＡｌｃ値を求めた。
実施例３゜
Ａ、キット内容
（１）ｍ−フェニルボロン酸を共有結合させた試験管。
（２） ３．３°、 ５．５’−テトラメチルベンジン
または、その水可溶化誘導体を含む水溶液。
（３）過酸化ストロンチウムまたは、過酸化水素を含む
水溶液。
（４）標準ヘモグロビンＡｌｃ （ＨｂＡＩｃ）。
（５）試料調製液。
（６）緩衝液。
（７）反応停止液。
Ｂ、測定操作
（１）被検血液を試料調製液で溶血させた。
（２） （１）の操作をした検体を緩衝液で希釈し、
キット（１）の試験管に２ ｍｌづつ分取した。
（３） （２）の操作をした試験管を室温で３０分間
インキュベートした。
（４） （３）の操作をした試験管の内容液を捨て、
洗浄液２ ｍｌで３回洗浄した。
（５） （４）の操作をした各試験管に（３）と（４
）の等量混液２ ｍｌを添加、混和し、３７度で１０分
間インキュベートした。
（６） （５）の操作をした各試験管に反応停止液１
ｍｌを添加、混和し、４５０ ｎｍの吸光度を測定した
。
（７）標準ＨｂＡｌｃを用いて同一操作をして描いた検
量線から検体のＩ（ｂＡｌｃ値を求めた。
実施例４゜
Ａ、キット内容
（１）ｍ−アミノメチルボロン酸を固定化したアフィニ
ティークロマトグラフィー担体を固相化した試験管。
（２）酵素標識抗ヒトヘモグロビンＡｌｃ （ＨｂＡｌ
ｃ）抗体。
酵素標識抗体溶解液。
標準ヘモグロビンＡｌｃ （ＨｂＡＩＣ）。
酵素基質。
緩衝液。
洗浄液。
反応停止液。
測定操作
被検血液を試料調製液で溶血させた。
（１）の操作をした検体を緩衝液で希釈し、キット（１
）の試験管に２ ｍｌづつ分取した。
（３） （２）の操作をした試験管を室温で３０分間
インキュベートした。
（４） （３）の操作をした試験管の内容液を捨て、
洗浄液２ ｍｌで３回洗浄した。
（５） （４）の操作をした各試験管に酵素標識抗体
２ ｍｌを添加し、３７度で１時間インキユベートシた
。
（６） （５）の操作をした各試験管の内容を捨て、
各試験管を洗浄液２ ｍｌで洗浄した。
（７） （６）の操作をした各試験管に、酵素基質液
２ ｍｌを添加、混和し、３７度で１時間インキュベー
トした。
（８） （７）の操作をした各試験管に、反応停止液
ｌ ｍｌを添加し、４９２ ｎｍの吸光度を測定した。
（９）標準ＨｂＡ］ｃを用いて同一操作をして描いた検
量線から検体のＨｂＡｌｃ値を求めた。
実施例５
Ａ、キット内容
（１）ｍ−アミノメチルボロン酸を固定化したアフィニ
ティークロマトグラフィー担体（懸濁液）
（２） ３．３’ 、 ５．５°−テトラメチルベンジ
ンまたは、その水可溶化誘導体を含む水溶液。
（３）過酸化ストロンチウムまたは、過酸化水素を含む
水溶液。
（４）標準へモグロビ７ Ａｌｃ （ＨｂＡｌｃ）。
（５）試料調製液。
（６）緩衝液。
（７）反応停止液。
Ｂ、測定操作
（１）被検血液を試料調製液で溶血させた。
（２） （１）の操作をした検体を緩衝液で希釈し、
その５０ＪＪｌを試験管に秤取し、更に、キットの（１
）の担体懸濁液５０）１１を秤取、混和した。
（３） （２）の操作をした試験管を室温で３０分間
インキュベートした。
（４） （３）の操作をした試験管を洗浄液２ ｍｌ
で３回洗浄した。
（５） （４）の操作をした各試験管にキットの（３
）と（４）の等量混液２ ｔｎｌを添加、混和し、３７
度で１０分間インキュベートした（混和後、３分後、８
分後に、更に、混和した）。
（６） （５）の操作をした各試験管に反応停止液１
ｍｌを添加、混和し、３．００Ｏｒｐｍで、１０分間遠
心分離した後、その上清の４５０ ｎｍの吸光度を測定
した。
（７）標準ＨｂＡｌｃを用いて同一操作をして描いた検
量線から検体のＨｂＡｌｃ値を求めた。
実施例６゜
Ａ、キット内容
（１） ｍ−フェニルボロン酸を共有結合させたビーズ
。
（２） ３．３’ 、 ５．５−テトラメチルベンジン
または、その水可溶化誘導体を含む水溶液。
（３）過酸化ストロンチウムまたは、過酸化水素を含む
水溶液。
（４）標準ヘモグロビンＡｌｃ （ＨｂＡｌｃ）。
（５）試料調製液。
（６）緩衝液。
（７）洗浄液。
（８）反応停止液。
Ｂ、測定操作
（１）被検血液を試料調製液で溶血させた。
（２） （１）の操作をした検体を緩衝液で希釈し、
その５０ア１を試験管に秤取し、更に、キットの（１）
のビーズ１個を秤取、混和した。
（３） （２）の操作をした試験管に蓋をし、室温で
３０分インキュベートした。
（４）各試験管の内容液を捨て、洗浄液２ ｍｌで３回
洗浄した。
（５）新しく準備した各試験管にキットの（３）と（４
）の等量混液２ ｍｌを添加、混和し、（４）の操作を
したビーズを入れ、３７度で１０分間インキュベートし
た。
（６） （５）の操作をした各試験管に反応停止液１
ｍｌを添加し、４５０ ｒ＋＋ｒ＋の吸光度を測定した
。
（７）標準ＨｂＡＩｃを用いて同一操作をして描いた検
量線から検体のＨｂＡｌｃ値を求めた。
実施例７゜
Ａ、キット内容
（１）ｍ−フェニルボロン酸を共有結合させたビズ。
（２）酵素標識抗ヒトヘモグロビンＡｌｃ （ＨｂＡｌ
ｃ）抗体。
（３）酵素標識抗体溶解液。
（４）標準ヘモグロビンＡｌｃ （ＨｂＡＩＣ）。
（５）酵素基質。
（６）緩衝液。
（７）洗浄液。
（８）反応停止液。
Ｂ、測定操作
全自動分析装置を用いて、以下のフローチャトに従い、
ＨｂＡＩＣの分画定量を行なった。[Industrial Application Field] The present invention relates to a method for fractionating and quantifying hemoglobin AIC (HbAIC) and a hemoglobin A IC configured to carry out the method.
The present invention relates to a method for fractional quantification of IC (HbAIC). [Prior art] Glucose in peripheral blood is hemoglobin A (HbAo)
By forming a Schiff bond with the N-terminus (heparin residue) of the β chain of , it becomes unstable aldimine (pre-HbAlc). This reaction is reversible, and the aldimine produced is
In some cases, aldimine is decomposed into the original glucose and hemoglobin (HbAo), and in other cases, aldimine is further converted into amatri to become stable ketoamine (HbAlc). Currently, glycated hemoglobin ()lbAlc) values are recognized as useful as an index of blood sugar control in diabetes and are widely used in the clinical field. In the blood, the above-mentioned HjAo, I)re-HbAo,
HbAIc exists, and the value of pre-HbAIc fluctuates greatly depending on the blood sugar level at the time of blood collection, consumption of glucose after blood collection, etc., so it is considered desirable to quantify only HbAlc. Methods for quantifying HbAlc include electrofocusing, colorimetry, affinity chromatography, HPLC, and the like. In the currently widely used HPLC method, (A) pre
-HbAlc and fbAlc are mixed in a sample, and there is a method of separating them by lengthening the chromatography time. (B) There is a method of pre-treating the sample to remove pre-HbAlc and shortening the chromatography time. pre-HbAIc t7) Removal method E&i, (1) method of causing glucose to be consumed by red blood cells and decomposing pre-HbAIC. (2) Adding a substance that receives and removes glucose, pre-H
Method of decomposing bAIc. (3) Adding a strong allosteric effector and expelling the reversibly bound glucose, pre-)
There is a method to decompose 1bAlc. As described above, although the HPLC method is widely used, it requires the purchase of expensive equipment, requires complicated pretreatment, and the number of samples processed per hour is small, which should be resolved. There are many problems. The measurement operation of the affinity chromatography method is as follows: (1) The sample prepared with the material preparation solution is added to a column packed with agarose on which m-aminophenylboronic acid is immobilized, and the cis-diol group of glucose of glycated hemoglobin is A five-membered ring is formed with m-aminophenylboronic acid immobilized on agarose. (2) By washing the agarose with a buffer solution, hemoglobin other than glycated hemoglobin is allowed to flow out. (3) Elute glycated hemoglobin with an elution buffer. (4) Measure the absorbance of the glycated hemoglobin fraction and the absorbance of the non-glycosylated hemoglobin fraction. (5) Calculate the amount of glycated hemoglobin. (1) Accurate and highly specific measurement values can be obtained. (2) There is no influence of pre-HbAlc. (3) There is no effect of fetal hemoglobin (HbF) or abnormal hemoglobin (HbS, HbC). It has this feature. However, since this method uses affinity chromatography, it is difficult to automate the measurement operation, so it has not been widely used. Means for Solving Problem U] The inventors of the present invention have (1) covalently bonded m-7 minophenylboronic acid via the functional group -N=CH-(CHz)-CH:N-. methods using laboratory equipment such as test tubes, beads, microtiter plates, and magnetic particles. (2) A method using laboratory equipment such as test tubes, beads, microtiter plates, and magnetic particles on which an affinity chromatography carrier immobilized with m-aminomethylboronic acid is immobilized. We have discovered that this enables automation and general-purpose affinity chromatography methods. That is, according to the present invention, (1) The complicated pretreatment of the HPLC method can be omitted, and a dramatic increase in the number of specimens processed per unit time can be expected. (2) The measurement operation of affinity chromatography can be significantly simplified. (3) By reducing the amount of expensive affinity chromatography carrier used, it becomes possible to provide an inexpensive HbAIc fraction quantification kit. The present invention will be explained in more detail with reference to Examples below. Example I A. Kit contents (1) Mylotiter plate to which m-phenylboronic acid is covalently bonded. (2> 3.3°, 5.5'-Aqueous solution containing tetramethylbenzine or its water-solubilized derivative. (3) Aqueous solution containing strontium peroxide or hydrogen peroxide. 4) Standard hemoglobin 7 Alc ( H, bAlc). 5) Sample preparation solution. 6 buffer. 7) Cleaning liquid. 8) Reaction stop solution. B. Measurement procedure (1) Test blood was hemolyzed with a sample preparation solution. (2) Dilute the sample processed in (1) with a buffer solution,
200 JJI was aliquoted to each person in a microtiter plate. (3) The microtiter plate prepared with Jt in (2) was sealed and incubated at room temperature for 30 minutes. (4) The contents of each microtiter plate were discarded and washed three times with washing solution 300 JJI. (5) For each person in the microtiter plate who performed the procedure in (4), add 200 ml of a mixture of equal amounts of (3) and (4) from the kit.
pl was added, mixed, and incubated at 37 degrees for 10 minutes. (6) Add 100 JJI of reaction stop solution to each person in the microtiter plate after the operation in (5), and add 450
The absorbance at nm was measured. (7) The HbAlc value of the specimen was determined from a calibration curve drawn by performing the same procedure using standard HbAIc. Example 2゜A, Kit contents (1) Functional group -N=CH-(CH2), -CH=N-
Microtiter plate (2) Enzyme-labeled anti-human hemoglobin Alc (HbAlc) antibody, in which aminomethylboronic acid is covalently bonded to the functional group of the enzyme-labeled anti-human hemoglobin Alc (HbAlc). (3) Enzyme-labeled antibody solution. (4) Standard hemoglobin Alc (HbAIC). (5) Enzyme substrate. (6) Buffer solution. (7) Cleaning liquid. (8) Reaction stop solution. B. Measurement procedure (1) Test blood was hemolyzed with a sample preparation solution. (2) Dilute the sample processed in (1) with a buffer solution,
200 pl was aliquoted to each person in a microtiter plate. (3) The microtiter plate prepared in (2) was sealed and incubated at room temperature for 30 minutes. (4) The contents of each microtiter plate were discarded and washed three times with 300 Jll of washing solution. (5) Add 200 JJI of enzyme-labeled antibody to each person in the microtiter plate after the operation in (4), and
The cells were incubated for 1 hour at 50°C. (6) The contents of each person's microtiter plate were discarded, and each person was washed three times with washing solution 300, pi. (7) Enzyme substrate solution 200 JJI was added to each person in the microtiter plate prepared in (6), mixed, and incubated at 37 degrees for 1 hour (8) (7)
A reaction stop solution +00 JJI was added to each microtiter plate after the above operation, and the absorbance at 492 nm was measured. (9) The HbAlc value of the specimen was determined from a calibration curve drawn using standard HbAlc in the same manner. Example 3゜A, Kit Contents (1) Test tube to which m-phenylboronic acid was covalently bound. (2) An aqueous solution containing 3.3°, 5.5'-tetramethylbenzine or a water-solubilized derivative thereof. (3) Aqueous solution containing strontium peroxide or hydrogen peroxide. (4) Standard hemoglobin Alc (HbAIc). (5) Sample preparation liquid. (6) Buffer solution. (7) Reaction stop solution. B. Measurement procedure (1) Test blood was hemolyzed with a sample preparation solution. (2) Dilute the sample processed in (1) with a buffer solution,
Aliquots of 2 ml were placed into the test tubes of kit (1). (3) The test tube subjected to the operation in (2) was incubated at room temperature for 30 minutes. (4) Discard the contents of the test tube after performing the procedure in (3).
Washed three times with 2 ml of washing solution. (5) Add (3) and (4) to each test tube after performing (4).
) was added, mixed, and incubated at 37 degrees for 10 minutes. (6) Add 1 part of the reaction stop solution to each test tube after performing the procedure in (5).
ml was added, mixed, and the absorbance at 450 nm was measured. (7) The I(bAlc value) of the specimen was determined from a calibration curve drawn using the same procedure using standard HbAlc. Example 4゜A, Kit contents (1) Affinity immobilized m-aminomethylboronic acid Test tube with immobilized chromatography carrier. (2) Enzyme-labeled anti-human hemoglobin Alc (HbAl
c) Antibodies. Enzyme-labeled antibody lysate. Standard hemoglobin Alc (HbAIC). Enzyme substrate. buffer solution. cleaning liquid. Reaction stop solution. Measurement procedure The test blood was hemolyzed with a sample preparation solution. Dilute the sample processed in (1) with a buffer solution and use the kit (1).
) into test tubes of 2 ml each. (3) The test tube subjected to the operation in (2) was incubated at room temperature for 30 minutes. (4) Discard the contents of the test tube after performing the procedure in (3).
Washed three times with 2 ml of washing solution. (5) 2 ml of enzyme-labeled antibody was added to each test tube subjected to the procedure in (4), and incubated at 37 degrees for 1 hour. (6) Discard the contents of each test tube after performing (5).
Each test tube was washed with 2 ml of wash solution. (7) 2 ml of enzyme substrate solution was added to each test tube subjected to the operation in (6), mixed, and incubated at 37 degrees for 1 hour. (8) 1 ml of reaction stop solution was added to each test tube subjected to the operation in (7), and the absorbance at 492 nm was measured. (9) The HbAlc value of the specimen was determined from a calibration curve drawn using the standard HbA]c in the same manner. Example 5 A. Kit contents (1) Affinity chromatography carrier (suspension) on which m-aminomethylboronic acid is immobilized (2) 3.3', 5.5°-tetramethylbenzine or its aqueous solution Aqueous solutions containing solubilized derivatives. (3) Aqueous solution containing strontium peroxide or hydrogen peroxide. (4) Standard hemoglobi-7 Alc (HbAlc). (5) Sample preparation liquid. (6) Buffer. (7) Reaction stop solution. B. Measurement procedure (1) Test blood was hemolyzed with a sample preparation solution. (2) Dilute the sample processed in (1) with a buffer solution,
Weigh out 50 JJl into a test tube, and add (1
) carrier suspension 50) 11 was weighed out and mixed. (3) The test tube subjected to the operation in (2) was incubated at room temperature for 30 minutes. (4) Wash the test tube in (3) with 2 ml of washing solution.
Washed 3 times with (5) Add (3) of the kit to each test tube after performing (4).
) and (4) in equal amounts, add 2 tnl, mix, and make 37
Incubate for 10 minutes (after mixing, 3 minutes later, 8
After a few minutes, the mixture was further mixed). (6) Add 1 part of the reaction stop solution to each test tube after performing the procedure in (5).
ml was added, mixed, and centrifuged at 3.00 rpm for 10 minutes, and the absorbance of the supernatant at 450 nm was measured. (7) The HbAlc value of the specimen was determined from a calibration curve drawn using standard HbAlc in the same manner. Example 6゜A, Kit Contents (1) Beads to which m-phenylboronic acid is covalently bound. (2) An aqueous solution containing 3.3', 5,5-tetramethylbenzine or a water-solubilized derivative thereof. (3) Aqueous solution containing strontium peroxide or hydrogen peroxide. (4) Standard hemoglobin Alc (HbAlc). (5) Sample preparation liquid. (6) Buffer. (7) Cleaning liquid. (8) Reaction stop solution. B. Measurement procedure (1) Test blood was hemolyzed with a sample preparation solution. (2) Dilute the sample processed in (1) with a buffer solution,
Weigh out 50 A1 into a test tube, and add (1) of the kit.
One bead was weighed out and mixed. (3) The test tube subjected to the operation in (2) was covered and incubated at room temperature for 30 minutes. (4) The contents of each test tube were discarded and washed three times with 2 ml of washing solution. (5) Add (3) and (4) of the kit to each newly prepared test tube.
) was added and mixed, and the beads prepared in step (4) were added and incubated at 37 degrees for 10 minutes. (6) Add 1 part of the reaction stop solution to each test tube after performing the procedure in (5).
ml was added and the absorbance at 450 r++r+ was measured. (7) The HbAlc value of the specimen was determined from a calibration curve drawn using standard HbAIc in the same manner. Example 7゜A, Kit Contents (1) Biz to which m-phenylboronic acid is covalently bonded. (2) Enzyme-labeled anti-human hemoglobin Alc (HbAl
c) Antibodies. (3) Enzyme-labeled antibody solution. (4) Standard hemoglobin Alc (HbAIC). (5) Enzyme substrate. (6) Buffer. (7) Cleaning liquid. (8) Reaction stop solution. B. Measurement operation Using a fully automatic analyzer, follow the flowchart below.
Fractional quantification of HbAIC was performed.
１スタート ２検体サンプリング ３）第−試薬分生 ４ ビーズ投入 ５攪拌 ６インキユベーシヨン ７ ビーズ投入 ８第二試薬分注 ９）攪拌 （１０）インキュベーション （１１ビーズ洗浄 （１２ビーズトランス （１３酵素基質分注 （１４）攪拌 （１５）インキュベーション （１６）反応停止液分注 （１７）測光、データ処理 以下余白 1 start 2 sample sampling 3) No. 1 - Reagent fraction 4. Adding beads 5 Stir 6 incubation 7. Adding beads 8 Second reagent dispensing 9) Stirring (10) Incubation (11 bead washing (12 bead transformer (13 Enzyme substrate dispensing (14) Stirring (15) Incubation (16) Dispensing reaction stop solution (17) Photometry, data processing Margin below
Claims (7)
ティークロマトグラフィー担体に、ヘモグロビンＡｌｃ
（ＨｂＡｌｃ）を吸着、結合させた後、既知の方法（放
射イムノアッセイ法、 非放射イムノアッセイ法、テトラメチルベンジジン法、
フルオレイン法等）により、ヘモグロビンＡｌｃ（Ｈｂ
Ａｌｃ）を分画定量する方法。(1) Hemoglobin Alc was immobilized on an affinity chromatography carrier with m-aminomethylboronic acid
After adsorbing and binding (HbAlc), known methods (radioimmunoassay method, non-radioimmunoassay method, tetramethylbenzidine method,
Hemoglobin Alc (Hb
A method for fractional quantitative determination of Alc).
−を固定化し、その官能基に、ｍ−アミノメチルボロン
酸を共有結合させた、試験管、ビーズ、マイクロタイタ
ープレート、磁性粒子、等の実験器具を用いて既知の方
法（放射イムノアッセイ法、非放射イムノアッセイ法、
テトラメチルベンジジン法、フルオレイン法等）により
、ヘモグロビンＡｌｃ（ＨｂＡｌｃ）を分画定量する方
法。(2) Functional group -N=CH-(CH_2)_n-CH=N
- is immobilized and m-aminomethylboronic acid is covalently bound to its functional group using known methods (radioimmunoassay method, radioimmunoassay,
A method for fractionating and quantifying hemoglobin Alc (HbAlc) using the tetramethylbenzidine method, fluorine method, etc.
ティークロマトグラフィー担体を固相化した、試験管、
ビーズ、マイクロタイタープレート、磁性粒子、等の実
験器具を用いて既知の方法（放射イムノアッセイ法、非
放射イムノアッセイ法等）により、ヘモグロビンＡｌｃ
（ＨｂＡｌｃ）を分画定量する方法。(3) A test tube in which an affinity chromatography carrier on which m-aminomethylboronic acid is immobilized is immobilized,
Hemoglobin Alc is determined by known methods (radioimmunoassay, non-radioimmunoassay, etc.) using experimental equipment such as beads, microtiter plates, magnetic particles, etc.
A method for fractionating and quantifying (HbAlc).
実施の為に構成されたヘモグロビンＡｌｃ（ＨｂＡｌｃ
）定量分画キット。(4) Hemoglobin Alc (HbAlc) configured to carry out claims (1), (2), and (3).
) Quantitative fractionation kit.
ルの側面に固相化したマイクロタイタープレート。(5) A microtiter plate with an affinity chromatography carrier immobilized on the side of the well.
−を固定化し、その官能基に、ｍ−アミノメチルボロン
酸を共有結合させた、試験管、ビーズ、マイクロタイタ
ープレート、磁性粒子、等の実験器具。(6) Functional group -N=CH-(CH_2)_n-CH=N
Experimental instruments such as test tubes, beads, microtiter plates, magnetic particles, etc., in which - is immobilized and m-aminomethylboronic acid is covalently bonded to the functional group thereof.
ティークロマトグラフィー担体を固相化した、試験管、
ビーズ、マイクロタイタープレート、磁性粒子、等の実
験器具。(7) A test tube in which an affinity chromatography carrier on which m-aminomethylboronic acid is immobilized is immobilized,
Laboratory equipment such as beads, microtiter plates, magnetic particles, etc.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26877090A JPH04145367A (en) | 1990-10-06 | 1990-10-06 | Fraction quantitative method of hemoglobin alc (hbalc) and relative hemoglobin alc (hbalc) quantitative kit |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26877090A JPH04145367A (en) | 1990-10-06 | 1990-10-06 | Fraction quantitative method of hemoglobin alc (hbalc) and relative hemoglobin alc (hbalc) quantitative kit |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04145367A true JPH04145367A (en) | 1992-05-19 |
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ID=17463064
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26877090A Pending JPH04145367A (en) | 1990-10-06 | 1990-10-06 | Fraction quantitative method of hemoglobin alc (hbalc) and relative hemoglobin alc (hbalc) quantitative kit |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04145367A (en) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0666795A (en) * | 1992-06-16 | 1994-03-11 | Fujirebio Inc | Measuring method for glycated hemoglobin |
| JPH0862221A (en) * | 1994-07-18 | 1996-03-08 | Boehringer Mannheim Gmbh | Quantitative measuring method for glycated protein |
| US6162645A (en) * | 1997-03-13 | 2000-12-19 | Abbott Laboratories | Determination of % glycated hemoglobin |
| US6316265B1 (en) | 1997-03-13 | 2001-11-13 | Abbott Laboratories | Determination of % glycated hemoglobin |
| WO2002095407A1 (en) * | 2001-05-18 | 2002-11-28 | Srl, Inc. | Immunoassay method |
| CN109269858A (en) * | 2018-11-02 | 2019-01-25 | 郑州标源生物科技有限公司 | A kind of preparation method of liquid saccharified hemoglobin quality-control product |
-
1990
- 1990-10-06 JP JP26877090A patent/JPH04145367A/en active Pending
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN109269858A (en) * | 2018-11-02 | 2019-01-25 | 郑州标源生物科技有限公司 | A kind of preparation method of liquid saccharified hemoglobin quality-control product |
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