JPH04126087A - New recombinant plasmid - Google Patents
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Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明はサッカロマイセス・オレアギノーサス（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓ）より
抽出したα−ガラクトシダーゼ遺伝子のプロモーター領
域、分泌配列領域、構造遺伝子領域を含むプラスミド及
びその利用に関するものである。Detailed Description of the Invention (Industrial Application Field) The present invention relates to Saccharomyces oleaginosus (Saccharomyces oleaginosa)
The present invention relates to a plasmid containing the promoter region, secretion sequence region, and structural gene region of the α-galactosidase gene extracted from Charomyces oleaginosus, and its use.
また本発明は、α−ガラクトシダーゼ遺伝子の構造を解
明するのにも成功したものであって、αガラクトシダー
ゼの大量生産はもとより他の異種蛋白を効率よく分泌さ
せる技術にも応用することができるものである。The present invention also succeeded in elucidating the structure of the α-galactosidase gene, and can be applied not only to mass production of α-galactosidase but also to techniques for efficiently secreting other foreign proteins. be.
（従来の技術）
α−ガラクトシダーゼは、メリビオースやラフィノース
の様なα−ガラクトシドに作用して糖鎖の非還元末端の
α−ガラクトシドを分解する酵素であって甜菜糖製造工
業においては糖液中に含有するラフィノースが蔗糖の結
晶作用を阻害するなど製糖作業に有害物となっているこ
とより、アブシディアあるいはモルチェレラ等の糸状菌
菌体含有のα−ガラクトシダーゼを利用して糖液中のラ
フィノースの分解除去を行い、製糖作業の改善、砂糖収
量歩留りの向上を図っている。(Prior art) α-galactosidase is an enzyme that acts on α-galactosides such as melibiose and raffinose to degrade α-galactoside at the non-reducing end of sugar chains. Since the raffinose contained in the sugar solution is harmful to sugar production by inhibiting the crystallization of sucrose, raffinose in the sugar solution is decomposed and removed using α-galactosidase contained in the cells of filamentous fungi such as Absidia or Morcellella. The company is working to improve sugar manufacturing operations and increase sugar yield.
一方、製パン業におけるパン用酵母に使用されているサ
ツカロマイセス・セレビシェ
（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の培養に用いる糖質源
は甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜などの糖蜜が用いられているが甜
菜糖蜜にあっては、その中に非醗酵性糖分を含むため、
含有する全糖質分を醗酵原料に利用することができない
。On the other hand, molasses such as cane molasses and sugar beet molasses are used as carbohydrate sources for culturing S. cerevisiae (S, cerevisiae), which is used for bread yeast in the bakery industry. , because it contains non-fermentable sugar,
The total carbohydrate content cannot be used as a fermentation raw material.
また近年の製糖技術の発達に伴いこれら糖蜜中の醗酵性
糖分は減少傾向にあり、パン用酵母の培養には好ましく
ない無機、有機化合物の濃度が高くなっている。Furthermore, with the recent development of sugar production technology, the fermentable sugar content in these molasses has been decreasing, and the concentration of inorganic and organic compounds that are undesirable for culturing bread yeast has been increasing.
前記甜菜糖蜜中における非醗酵性糖分は主にラフィノー
スであるが、パン用酵母サツカロマイセス・セレビシェ
はこれを資化できないため、甜菜糖蜜を使用する場合ラ
フィノースの糖分利用について、１／３醗酵といわれて
いるものしか行われていない。すなわち、ラフィノース
はガラクトース、グルコース、フラクトースからなる３
糖類であるが、これに対してサツカロマイセス・セレビ
シェは、グルコースとフラクトースの結合は切るがガラ
クトースとグルコースからなるメリビオースを残してい
るものである。The non-fermentable sugar in the sugar beet molasses is mainly raffinose, but the bakery yeast Saccharomyces cerevisiae cannot assimilate this, so when sugar beet molasses is used, the sugar content of raffinose is utilized as 1/3 fermentation. Only those who are present are being carried out. That is, raffinose consists of galactose, glucose, and fructose.
In contrast, Satucharomyces cerevisiae breaks the bond between glucose and fructose, but leaves behind melibiose, which is composed of galactose and glucose.
また、本発明は、このような技術の現状におり）で、α
−ガラクトシド結合を切断する酵素であるα−ガラクト
シダーゼの効率的利用を遺伝子レベルでとらえ且つそれ
にはじめて成功したものである。In addition, the present invention is based on the current state of such technology), and α
This is the first time that we have succeeded in understanding the efficient use of α-galactosidase, an enzyme that cleaves galactoside bonds, at the genetic level.
α−ガラクトシダーゼまたはメリビアーゼの遺伝子に関
し、サツカロマイセス・カールスペルゲンシス（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒ ｅｎｓｉｓ
）由来のものは最近になってその構造が解明されてはし
１るが（特表昭６２−５０２０２５号）、本発明に係る
サッカロマイセス・オレアギノーサス（Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓｏｌｅａ ｊｎｏｓｕｓ）由来のα−ガラ
クトシダーゼ遺伝子とは後記するところからも明らかな
ようにその構造が相違しており、両者は全く別異のもの
である。Regarding the α-galactosidase or melibiase gene, Saccharomyces carlspergensis (Sac
charomyces carlsber ensis
) derived from Saccharomyces oleaginosus (Saccharomyces oleaginosa) according to the present invention, although the structure of the one derived from
As will be clear from what will be described later, the structure is different from the α-galactosidase gene derived from (mycesolea jnosus), and the two are completely different.
（発明が解決しようとする課題）
本発明は、ラフィノースを含有する糖蜜を充分に発酵資
化しうるパン酵母の開発、つまり特にビート糖蜜培地を
用いても充分に培養しうるパン酵母の開発を目的として
なされたものである。(Problems to be Solved by the Invention) The purpose of the present invention is to develop a baker's yeast that can sufficiently ferment and assimilate molasses containing raffinose, that is, to develop a baker's yeast that can be sufficiently cultured even in particular using a beet molasses medium. This was done as a.
またそれに関連して、本発明は、ビート糖液中に存在す
るラフィノースを分解してビート糖の収率を高めるため
に従来用いられていた糸状菌に代りうる新しい菌体を開
発する目的でなされたものである。Furthermore, in connection with this, the present invention was made for the purpose of developing a new fungus that can replace the filamentous fungus that has been conventionally used in order to increase the yield of beet sugar by decomposing the raffinose present in the beet sugar solution. It is something that
（課題を解決するための手段）
本発明は上記目的を達成するためになされたものであっ
て、目的とする微生物を遺伝子工学的手法によって創製
することとした。(Means for Solving the Problems) The present invention was made to achieve the above-mentioned object, and the objective microorganism was created by genetic engineering techniques.
そこで本発明者らは、上記の様な糖質源とじて糖蜜中に
含まれている非醗酵性糖分、特にラフィノースについて
注目し、パン酵母と同属の酵母中より抽出したα−ガラ
クトシダーゼ発現に関与している遺伝子をプラスミドベ
クターに挿入した組換えＤＮＡを得、この組換えＤＮＡ
をサツカロマイセス・セレビシェに導入して形質転換す
れば非醗酵性糖分のラフィノースも資化し得るパン用酵
母となし得るので、本発明者らは、先ずはしめに、この
パン用酵母に導入し得るプラスミドを開発することとし
た。Therefore, the present inventors focused on the non-fermentable sugars contained in molasses as the above-mentioned carbohydrate source, particularly raffinose, which is involved in the expression of α-galactosidase extracted from yeast of the same genus as baker's yeast. A recombinant DNA is obtained by inserting the gene into a plasmid vector, and this recombinant DNA is
By introducing and transforming Saccharomyces cerevisiae, a baker's yeast that can also assimilate raffinose, a non-fermentable sugar, can be obtained. I decided to develop it.
そして酵母におけるα−ガラクトシダーゼ遺伝子を求め
て、本発明者らは酵母中よりラフィノース醗酵性の強い
菌株について順次スクリーニングを行った結果、サッカ
ロマイセス・オレアギノーサス（針ｏ１ｅ吐帥亜匹）に
その存在を認め、α−ガラクトシダーゼ遺伝子を抽出す
る菌株としてサッカロマイセス・オレアギノーサスＩＦ
０１９９８を選択した。In search of the α-galactosidase gene in yeast, the present inventors sequentially screened yeast strains with strong raffinose fermentation properties, and as a result, they recognized the presence of the gene in Saccharomyces oleaginosa Saccharomyces oleaginosus IF as a strain from which to extract the α-galactosidase gene
01998 was selected.
以下本発明について詳細に説明する。The present invention will be explained in detail below.
まずα−ガラクトシダーゼの発現に関与している遺伝子
を含有するＤＮＡの調製について述べると、サッカロマ
イセス・オレアギノーサスは通常の酵母培養法により培
養して培養物を得ることができる。培養する培地として
はＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ペプトン２％、グルコ
ース２％）などが使用できる。First, to describe the preparation of DNA containing a gene involved in the expression of α-galactosidase, Saccharomyces oleaginosus can be cultured by a conventional yeast culture method to obtain a culture. As a culture medium, YPD medium (1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose) can be used.
このようにして得られた培養物は、通常３０００ｒｐｍ
で３分間程度遠心集菌し、サッカロマイセス・オレアギ
ノーサスの菌体を得る。The culture thus obtained is usually heated at 3000 rpm.
Collect the cells by centrifugation for about 3 minutes to obtain Saccharomyces oleaginosus cells.
得られた菌体から例えばロドリゲスらの方法第１６７頁
〜第１６９頁（Ｒｏｄｏｒｉｇｕｅｚ ａｎｄ Ｔａ１
ｔ ：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ （ＡｄｄｉｓｏｎＪｅｓｌｅｙＰｕｂ、 Ｃ
ｏ、 ）（１９８３）］により染色体ＤＮＡを得ること
ができる。From the obtained bacterial cells, for example, the method of Rodriguez et al., pages 167 to 169 (Rodriguez and Ta1
t: Recombinant DNA Techni
(AddisonJesleyPub, C
o, ) (1983)], chromosomal DNA can be obtained.
ついでこの染色体ＤＮＡは突出末端を生じさせる制限酵
素Ｂａｔ ＨＩ（日本ジーン製）またはＢａ１ＩＨＩと
アイソシゾマーである制限酵素Ｓａｕ ３ＡＩ（日本ジ
ーン！１りで部分分解し、部分分解ＤＮＡを得る。Next, this chromosomal DNA is partially digested with the restriction enzyme Bat HI (manufactured by Nippon Gene), which produces overhanging ends, or the restriction enzyme Sau 3AI (Nippon Gene! 1), which is an isoschizomer of Ba1IHI, to obtain partially digested DNA.
このようにして得た部分分解ＤＮＡは調製用電気泳動装
置ＥＬＦＥシステム（Ｇｅｎｏｆｉｔ製）を使用しアガ
ロース電気泳動法により分画して、サッカロマイセス・
オレアギノーサスより抽出したα−ガラクトシダーゼの
発現に関与している遺伝子を含む分画した部分分解ＤＮ
Ａを得る。The partially degraded DNA obtained in this way was fractionated by agarose electrophoresis using a preparative electrophoresis device ELFE system (manufactured by Genofit).
Fractionated partially degraded DNA containing a gene involved in the expression of α-galactosidase extracted from Oleaginosa
get an A.
次に本発明において用いることができるベクター ＤＮ
Ａとしては、酵母と大腸菌の両方を形質転換できるシャ
トルベクターを使用するもので、例えばプラスミドベク
ターＹＥｐ １３ （Ｊａｍｅｓ、 Ｒ，Ｂｒｏａｃｈ
ｅｔ、 ａｌ、 ： ＧＥＮＥ Ｖｏｌ、 ８１２１−
１３３（１９７９））などが好ましい。Next, vector DN that can be used in the present invention
A uses a shuttle vector that can transform both yeast and E. coli, such as the plasmid vector YEp 13 (James, R.
et, al, : GENE Vol, 8121-
133 (1979)) and the like are preferred.
上記シャトルベクターＹＥｐ １３のテトラサイクリン
耐性遺伝子部位に唯一存在する制限酵素Ｂａ１ｌＨＩ切
断部位を制限酵素Ｂａｍ ＨＩ（日本ジーン製）で酵素
濃度２〜３ ｕｎｉｔｓ／ベクター１μｇ、温度３７℃
で１時間以上作用させて切断してベクターＤＮＡを得る
。The only restriction enzyme Ba1lHI cleavage site present in the tetracycline resistance gene site of the shuttle vector YEp 13 was treated with the restriction enzyme Bam HI (manufactured by Nippon Gene) at an enzyme concentration of 2 to 3 units/vector 1 μg and a temperature of 37°C.
The vector DNA is obtained by cleaving the DNA for more than 1 hour.
次いでＤＮＡリガーゼを作用させた場合ベクター自身で
の自己環状化を防ぐため、切断したベクターをアルカリ
フォスファターゼで処理しＤＮＡの５′末端の燐酸基を
除去する。使用できるアルカリフォスファターゼにはＢ
ＡＰ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ＡｌｋａｌｉｎｅＰｈｏｓ
ｐｈａｔａｓｅ）あるいはＣＩＰ（Ｃａｌｆ Ｉｎｔｅ
ｓｔｉｎａｌＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）がある。Next, in order to prevent self-circularization of the vector itself when DNA ligase is applied, the cut vector is treated with alkaline phosphatase to remove the phosphate group at the 5' end of the DNA. Alkaline phosphatase that can be used is B
AP (Bacterial Alkaline Phos
phatase) or CIP (Calf Inte
Stinal Phosphatase).
ＣＩＰ （ベーリンガーマンハイム製）を、切断したベ
クターＤＮＡに酵素濃度０．００３ｕｎｉｔｓ／ベクタ
一１μｇ、温度４５℃で１時間作用させた後、同量の酵
素を再添加し温度４５℃で１時間作用させ５′末端の脱
燐酸を行なったベクターＤＮＡを得る。After allowing CIP (manufactured by Boehringer Mannheim) to act on the cut vector DNA at an enzyme concentration of 0.003 units/1 μg of vector at a temperature of 45°C for 1 hour, the same amount of enzyme was added again and allowed to act at a temperature of 45°C for 1 hour. A vector DNA whose 5' end has been dephosphorylated is obtained.
次いで先に述べたサッカロマイセス・オレアギノーサス
より抽出したα−ガラクトシダーゼの発現に関与する遺
伝子を含有する部分分解ＤＮＡ （以下パラセンジャー
ＤＮＡという）とベクターＤＮＡ を混合して、ＤＮＡ
リガーゼを用いて組換え体ＤＮＡを作成する。例えばＤ
ＮＡライゲーションキット（全酒造製）を使用した場合
、ＤＮＡ混合溶液１容に対し４〜５倍容のＡ液と１容の
Ｂ液を添加混合し温度１６℃で３０分から１２時間保温
し作用させ、反応後にイソプロパツール沈殿として組換
え体ＤＮＡを回収する。Next, the partially degraded DNA (hereinafter referred to as parasenger DNA) containing the gene involved in the expression of α-galactosidase extracted from Saccharomyces oleaginosus as described above and the vector DNA are mixed to generate DNA.
Recombinant DNA is created using ligase. For example, D
When using the NA ligation kit (manufactured by Zenshuzo), add and mix 4 to 5 times the volume of solution A and 1 volume of solution B to 1 volume of the DNA mixed solution, and incubate at 16°C for 30 minutes to 12 hours to allow it to work. After the reaction, the recombinant DNA is recovered as an isopropanol precipitate.
この組換え体ＤＮＡを用いて大腸菌ＡＧＩあるいは５Ｃ
５Ｉ（いずれもフナコシ薬品より購入）等の形質転換を
塩化カルシウム／塩化ルビジウム法により行い、組換え
体ＤＮＡの増幅を行い、増幅した組換え体ＤＮＡはアル
カリ金属法により抽出する。Using this recombinant DNA, E. coli AGI or 5C
5I (all purchased from Funakoshi Pharmaceutical Co., Ltd.) etc. is performed by the calcium chloride/rubidium chloride method, the recombinant DNA is amplified, and the amplified recombinant DNA is extracted by the alkali metal method.
この組換え体ＤＮＡを用いてサツカロマイセス・セレビ
シェ例えばＤＢＹ ７４６株の形質転換を行い、形質転
換した菌体はグルコース１％、ウラシル、トリプトファ
ン、ヒスチジンを各々２４ρｐｇ含むＩ寒天培地に塗抹
し、通常３０℃、好ましくは２５℃でコロニーが形成す
るまで培養した後α−ガラクトシダーゼ生産株を検出し
得ることができる。This recombinant DNA is used to transform Satucharomyces cerevisiae, for example, DBY strain 746, and the transformed cells are plated on an I agar medium containing 1% glucose, 24 pg each of uracil, tryptophan, and histidine, and usually at 30°C. α-galactosidase producing strains can be detected after culturing at 25°C, preferably until colony formation.
この組換え体ＤＮＡによる酵母の形質転換はプロトプラ
スト法、アルカリ金属法等によって行うことができる。Transformation of yeast with this recombinant DNA can be performed by the protoplast method, the alkali metal method, or the like.
また、α−ガラクトシダーゼ生産株の検出には指示薬を
用いる方法が適宜使用される。例えば指示薬としては、
Ｘ−α−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インド
リル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド）を用い、このＸ−
ａ −ｇａｌ （和光紬薬製）を２００ｐｐｍ含む軟寒
天Ｉ培地を重層すれば、コロニーが染色されるので目的
菌株を検出することができる。Furthermore, a method using an indicator is appropriately used to detect α-galactosidase producing strains. For example, as an indicator,
Using X-α-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-α-D-galactopyranoside), this
If a soft agar I medium containing 200 ppm of a-gal (manufactured by Wako Tsumugi Pharmaceutical Co., Ltd.) is overlaid, the colonies will be stained and the target bacterial strain can be detected.
上記の様にして得られたサッカロマイセス・オレアギノ
ーサスより抽出したα−ガラクトシダーゼの発現に関与
する遺伝子を含有するパラセンジャーＤＮＡ をベクタ
ーＤＮＡに挿入した組換え体ＤＮＡにより形質転換され
てα−ガラクトシダーゼを生産する酵母について、これ
を培養することにより酵素を発現せしめる。The parasenger DNA containing the gene involved in the expression of α-galactosidase extracted from Saccharomyces oleaginosus obtained as described above is inserted into the vector DNA, and transformed with the recombinant DNA to produce α-galactosidase. The enzyme is expressed by culturing yeast.
そしてこの発現したα−ガラクトシダーゼについて、５
Ｏ５−ポリアクリルアミド電気泳動を行った後、ニトロ
セルロース膜にブロッティングし、抗α−ガラクトシダ
ーゼ血清と結合したものをプロティンＡ法により分子量
を測定したところ、６２．０００付近と検出され、サッ
カロマイセス・オレアギノーサスの生産するα−ガラク
トシダーゼの分子量と一致し、他の生化学的性質も一致
した。Regarding this expressed α-galactosidase, 5
After performing O5-polyacrylamide electrophoresis, it was blotted onto a nitrocellulose membrane, and the molecular weight of the product bound with anti-α-galactosidase serum was measured using the protein A method. The molecular weight and other biochemical properties of the α-galactosidase produced were consistent.
また、α−ガラクトシダーゼを発現した酵母を形質転換
したサッカロマイセス・オレアギノーサスより抽出した
パラセンジャーＤＮＡを組込んだＹＥＰ１３組換え体ベ
クターは、発現した酵母より抽出して大腸菌に導入し、
大腸菌形質転換体を得たが、それらの菌株は後記するよ
うに微生物工業技術研究所にそれぞれ寄託されている。In addition, a YEP13 recombinant vector incorporating parasenger DNA extracted from Saccharomyces oleaginosus transformed into yeast expressing α-galactosidase was extracted from the yeast expressing α-galactosidase and introduced into Escherichia coli.
E. coli transformants were obtained, and these strains have been deposited at the National Institute of Microbial Technology, as described below.
上記したように、本発明によれば大腸菌形質転換体が作
成できるだけでなく、本発明のサッカロマイセス・オレ
アギノーサスより抽出したα−ガラクトシダーゼの発現
に関与する遺伝子を含有するパラセンジャーＤＮＡを含
むＤＮＡはサツカロマイセス・セレビシェを始めＹＥｐ
１３の持つ２μｓ ＤＮＡ複製開始点を利用しプラス
ミドの複製を行える酵母及びその他の微生物に導入して
形質転換することができ、それぞれの形質転換体を得る
ことができる。As described above, according to the present invention, not only can an Escherichia coli transformant be created, but also the DNA containing the parasenger DNA containing the gene involved in the expression of α-galactosidase extracted from Saccharomyces oleaginosus of the present invention can be used to prepare E. coli transformants. Starting with Celebishe, YEp
Using the 2 μs DNA replication origin of 13, it can be introduced and transformed into yeast and other microorganisms capable of plasmid replication, and the respective transformants can be obtained.
そして本発明にはこれらの形質転換体も包含されるので
あるが１本発明に係る形質転換体とは。The present invention includes these transformants, but what is the transformant according to the present invention?
単離した形質転換体自体のほか、それを培養して得た培
養液及び／又は菌体含有物等の培養物、これらを濃縮、
乾燥、又は希釈した処理物を広く指すものである。In addition to the isolated transformant itself, the culture solution and/or the bacterial cell-containing material obtained by culturing the transformant, these can be concentrated,
It broadly refers to dried or diluted processed products.
これらの形質転換体を適宜培養すればα−ガラクトシダ
ーゼが菌体外及び／又は菌体内に産生されるので、酵素
製法における常法にしたがって、酵素含有物、酵素液、
粗製酵素等としてこれを採取し、必要あれば精製して純
粋な酵素として分離すれば、α−ガラクトシダーゼが得
られる。If these transformants are cultured appropriately, α-galactosidase will be produced outside and/or inside the cells, so enzyme-containing materials, enzyme solutions,
α-galactosidase can be obtained by collecting the crude enzyme and, if necessary, purifying it and separating it as a pure enzyme.
このように本発明に係る形質転換体は、α−ガラクトシ
ダーゼ産生能にすぐれているので、ラフィノースやメリ
ビオースを分解ないし発酵せしめることができ、ガラク
トース及びグルコースとすることができる。また、例え
ばＳ、セレビシェ等にあってはグルコースとフラクトー
スの結合も本来切断しうるものであるので、この形質転
換体を用いた場合には、メリビオースはもとよりラフィ
ノースも完全に３種類の単糖に分解することができる。As described above, the transformant according to the present invention has an excellent ability to produce α-galactosidase, and therefore can decompose or ferment raffinose and melibiose into galactose and glucose. In addition, for example, S. cerevisiae and the like can originally cleave the bond between glucose and fructose, so when this transformant is used, not only melibiose but also raffinose can be completely converted into three types of monosaccharides. Can be disassembled.
換言すればメリビオース、ラフィノースからガラクトー
ス、グルコース、更にはフラクトースを製造することが
できるのである。In other words, galactose, glucose, and even fructose can be produced from melibiose and raffinose.
上記のほか、この形質転換体の有用な応用としては特に
ビート糖液の処理が挙げられる。ビート糖液には砂糖の
結晶作用を阻害する有害物質としてラフィノースが含有
されているのであるが、糖液をこの形質転換体で処理す
れば、それが産生ずるα−ガラクトシダーゼの作用によ
ってラフィノースが分解除去されるため、製糖作業が向
上し砂糖の収率も大幅に増加する。In addition to the above, useful applications of this transformant include, in particular, the treatment of beet sugar solution. Beet sugar solution contains raffinose as a harmful substance that inhibits sugar crystallization, but when sugar solution is treated with this transformant, raffinose is degraded by the action of α-galactosidase produced by it. This improves sugar production and significantly increases sugar yield.
また、従来、ビート廃糖蜜やビート糖洗液その化ビート
工場からの廃水にはラフィノースといった罷発酵性ない
しは非発酵性糖が含まれているが、本発明によれば上記
したような形質転換体を用いて廃糖蜜、又はそれを含ん
だ廃水を処理することが可能となり、公害防止技術とし
ても本発明はすぐれている。もちろん、ビート糖蜜やそ
の関連廃水のみでなく、ラフィノースやメリビオース等
α−ガラクトシド結合を有する糖類を含有する廃水であ
ればすべての廃水も本発明によって有効に処理すること
ができる。In addition, conventionally, beet molasses, beet sugar washing liquid, and wastewater from beet factories contain fermentable or non-fermentable sugars such as raffinose, but according to the present invention, the above-mentioned transformants can be used. It becomes possible to treat blackstrap molasses or wastewater containing the same, and the present invention is also excellent as a pollution prevention technology. Of course, not only beet molasses and related wastewater, but also any wastewater containing saccharides having α-galactoside bonds such as raffinose and melibiose can be effectively treated by the present invention.
そのうえ、廃糖蜜は、バイオテクノロジーや発酵工業に
おいて培地として多用されるものであるが、従来、パン
酵母はラフィノースをｌ／３シが発酵することができな
いため、ラフィノースを含有する甜菜糖蜜はパン酵母の
培養には適してぃなかった。しかしながら、本発明に係
る形質転換体で廃糖蜜を予じめ処理しておいたり、ある
いは本発明にしたがって形質転換したパン酵母を使用し
たりすれば、甜菜糖蜜もパン酵母用の好適培地として充
分に使用することができる。このようにして甜菜糖蜜を
処理しておけば、パン酵母のみならずα−ガラクトシダ
ーゼを有しない微生物であっても、これを甜菜糖蜜で充
分効率的に生育、培養することができるのである。Moreover, blackstrap molasses is often used as a culture medium in biotechnology and fermentation industries, but traditionally baker's yeast cannot ferment raffinose by 1/3, so sugar beet molasses containing raffinose is used as a medium for baker's yeast. It was not suitable for culturing. However, if blackstrap molasses is treated in advance with the transformant according to the present invention, or if baker's yeast transformed according to the present invention is used, then sugar beet molasses is also sufficient as a suitable medium for baker's yeast. It can be used for. By treating the sugar beet molasses in this way, not only baker's yeast but also microorganisms that do not have α-galactosidase can be grown and cultured in the sugar beet molasses sufficiently efficiently.
更にまた本発明においては、上記のようにしてＳ、オレ
アギノーサスＩＦ０１９９８よりクローニングしたα−
ガラクトシダーゼ遺伝子について、デイレ−ジョンプラ
スミドを用いる方法を利用してその構造を解明し、塩基
配列を決定するのにも成功したものである。Furthermore, in the present invention, α-
We also succeeded in elucidating the structure of the galactosidase gene using a method using a degradation plasmid and determining its nucleotide sequence.
すなわち、先ずはじめにＤＡＮ発現用のベクター（ＹＥ
ｐ １３等）に挿入されているＤＮＡ断片をシーフェン
ス用ベクターにつなぎ換える。ここに、シーフェンス用
ベクターは、外来ＤＮＡを組み込むためにそのベクター
をただ１ケ所切断する制限酵素の切断点を複数個連ねた
構造（マルチクローニングサイト）を持ち、挿入された
外来ＤＮＡをＭ１３ファージ粒子に組み込ませて培地中
に放出するためのＤＮＡ配列と、外来ＤＮＡ を鋳型と
してシーフェンス反応を行うための相補鎖の合成開始部
位（プライマー）等を備えたベクターである。That is, first, a vector for DAN expression (YE
p13 etc.) is transferred to the Sea Fence vector. Here, the Sea Fence vector has a structure (multi-cloning site) in which multiple restriction enzyme cleavage points are connected to cut the vector at only one place in order to incorporate the foreign DNA, and the inserted foreign DNA is transferred to the M13 phage. This vector is equipped with a DNA sequence to be incorporated into particles and released into a medium, and a complementary strand synthesis initiation site (primer) to perform a siefence reaction using foreign DNA as a template.
シーフェンス用ベクターとしては、ｐＵｃ１１８、ｐＵ
ｃ１１９といったＰＵＣ系ベクターのほかにｐＢｌｕｅ
ｓｃｒｉｐｔ等が知られているが、本発明における塩基
配列の決定には後者のベクターを用いた。Vectors for sea fence include pUc118, pU
In addition to PUC-based vectors such as c119, pBlue
script and the like are known, and the latter vector was used for determining the base sequence in the present invention.
塩基配列の決定はシーフェンス用ベクターに繋ぎかえら
れたＤＮＡ断片の一端から順に行うが、度に読み取れる
範囲は最大で４００ベースなので。The base sequence is determined sequentially from one end of the DNA fragment ligated to the Sea Fence vector, but the maximum range that can be read at each time is 400 bases.
読み取るＤＮＡを一端から順に３００ベ一ス程度ずつ何
段階か欠失させたプラスミド（デイレ−ジョンプラスミ
ド）を作成しなければならない。It is necessary to create a plasmid (degeneration plasmid) in which the DNA to be read is deleted in several steps of approximately 300 bases from one end.
このようにして多数のデイレ−ジョンプラスミドを作成
した後、オートシークエンサーでデータを読み取りこれ
らをつなぎ合わせて、α−ガラクトシダーゼ遺伝子のプ
ロモーター、分泌配列、構造遺伝子のすべてを含む塩基
配列を決定し、第３図に示すような結果を得た。After creating a large number of delay plasmids in this way, the data was read using an autosequencer and these were pieced together to determine the nucleotide sequence containing all of the α-galactosidase gene promoter, secretion sequence, and structural gene. The results shown in Figure 3 were obtained.
これらの塩基配列は、Ｓ、カールスベルゲンシス由来の
メリビアーゼ遺伝子のそれとは異なることも明らかにさ
れ（第４図、第６図）、本発明に係るα−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子が新規物質であることも確認された。It was also revealed that these nucleotide sequences are different from that of the melibiase gene derived from S. carlsbergensis (Figures 4 and 6), confirming that the α-galactosidase gene according to the present invention is a new substance. It was done.
本発明に係るα−ガラクトシダーゼ遺伝子を利用するこ
とによって、前記したようにα−ガラクトシダーゼ関連
の各種の有効用途の途が拓けるほか、この遺伝子には菌
体外に蛋白質を分泌するためのシグナル配列が含有され
ているので、この分泌能力を利用した異種蛋白分泌ベク
ターも構築することができ、各種の蛋白質の大量生産に
本発明を利用することも可能である。By using the α-galactosidase gene according to the present invention, in addition to opening up various effective uses related to α-galactosidase as described above, this gene also contains a signal sequence for secreting the protein outside the bacterial body. Therefore, it is possible to construct a heterologous protein secretion vector that utilizes this secretion ability, and it is also possible to utilize the present invention for mass production of various proteins.
（実施例） 以下実施例を挙げてさらに具体的に説明する。(Example) The present invention will be described in more detail below with reference to Examples.
（１）酵母染色体ＤＮＡ （パンセンジャーＤＮＡの調
！１）サッカロマイセス・オレアギノーサスＩＦ０１９
９８株をＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ペプトン２％、
グルコース２％）５００ｍＱに接種し温度３０℃で約３
６時間振盪培養し培養物を得た。この培養物を３ 、
ＯＯＯｒｐｍで３分間遠心分離処理し、得られた湿潤菌
体を２０鵬ΩのＳＢ液（０，２Ｍ Ｔｒｉｓ、 Ｃ１、
ＬＭ ５ｏｒｂｉｔｏｌ、０．１ＭＥＤＴＡ、０．１Ｍ
２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、ｐＨ７，５）
に懸濁し、これに細胞壁溶解酵素ザイモリエース２０−
Ｔ （生化学工業製）をＴＥＮ液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
、 Ｃ１，１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＮａＣ１、ｐＨ
７，５）に３Ｂ／’ｍｆｌの濃度で溶解した物を１ｍｆ
ｌ加え、３０℃で時々撹拌して１時間保温する。(1) Yeast chromosomal DNA (Pansenger DNA style! 1) Saccharomyces oleaginosas IF019
98 strains were grown in YPD medium (yeast extract 1%, peptone 2%,
Glucose 2%) was inoculated into 500mQ and at a temperature of 30℃
A culture was obtained by shaking culture for 6 hours. 3 of this culture,
Centrifugation was performed at OOOrpm for 3 minutes, and the resulting wet bacterial cells were diluted with 20Ω SB solution (0.2M Tris, C1,
LM 5orbitol, 0.1MEDTA, 0.1M
2-mercaptoethanol, pH 7,5)
The cell wall lytic enzyme Zymolyase 20-
T (Seikagaku Corporation) was mixed with TEN solution (10mM Tris).
, C1, 1mM EDTA, 10mM NaCl, pH
7,5) at a concentration of 3B/'mfl.
1 and keep warm at 30°C for 1 hour with occasional stirring.
これを遠心集菌し、再びこの菌体に２０鵬ΩのＳＢ液を
加え均一に混合し、次いで、この混合物にＴＥＮ液２０
＋ｎｆｌ、リボヌクレアーゼ溶液〔０，１阿Ｎ６−ａＣ
ｅｔａｔｅ、０．３Ｍ ＥＤＴＡ、 ｐ）１４．８にリ
ボヌクレアーゼＡ （シグマ製）を］Ｏ＋ａｇ／＋ｅΩ
溶解し沸騰水中で１０分間加熱したもの）０．２５ｍｆ
ｌ及び界面活性剤ＳＤＳ （和光紬薬）の２０％水溶液
２ｍＱを加え２時間静かに振盪処理、さらにプロナーゼ
溶液ＣＴＥＮ液にプロナーゼＥ（科研化学製）を２ ｍ
ｇ ／ ｍＱ溶解し３７℃で１５分間保温したもの〕を
０ 、５＋ａＱ添加し、３７℃で時々撹拌しながら２時
間保温した。ついで、これを６５℃に昇温し３０分静置
、ついで室温まで冷却する処理で溶液中のＲＮＡ、蛋白
質の分解を行った。次にフェノール処理、クロロホルム
処理を行った後、液量の２．５倍のエタノールを加え混
合、水中に静置し糸状に沈殿したＤＮＡを採取した。採
取したＤＮＡは再びＴＥＮ液２５ｍｆｌに溶解してリボ
ヌクレアーゼ溶液０．０５鵬Ω加え３７℃で１時間処理
し残存したＲＮＡを分解し、フェノール処理、クロロホ
ルム処理を行いリボヌクレアーゼを除いた後、前記同様
のエタノール沈殿によって酵母染色体ＤＮＡを得た。The bacteria were collected by centrifugation, and 20Ω of SB solution was added to the bacteria again and mixed uniformly. Then, this mixture was added with 20Ω of TEN solution.
+nfl, ribonuclease solution [0,1A N6-aC
etate, 0.3M EDTA, p) 14.8 with ribonuclease A (manufactured by Sigma)] O+ag/+eΩ
Dissolved and heated in boiling water for 10 minutes) 0.25mf
1 and 2 mQ of a 20% aqueous solution of surfactant SDS (Wako Tsumugi Yakuhin), and gently shaken for 2 hours. Furthermore, 2 m of pronase E (manufactured by Kaken Chemical Co., Ltd.) was added to the pronase solution CTEN solution.
g/mQ dissolved and kept warm at 37°C for 15 minutes] was added and kept at 37°C for 2 hours with occasional stirring. Next, the temperature of the solution was raised to 65° C., allowed to stand for 30 minutes, and then cooled to room temperature, thereby decomposing RNA and protein in the solution. Next, after performing phenol treatment and chloroform treatment, 2.5 times the volume of ethanol was added and mixed, and the mixture was left standing in water to collect the DNA that had precipitated in the form of a thread. The collected DNA was again dissolved in 25 mfl of TEN solution, added with 0.05 Ω of ribonuclease solution, and treated at 37°C for 1 hour to decompose the remaining RNA. After removing ribonuclease by phenol treatment and chloroform treatment, the same procedure as above was performed. Yeast chromosomal DNA was obtained by ethanol precipitation.
次いで制限酵素Ｂａｇ ＨＩとアイソシゾマーである制
限酵素Ｓａｕ ３ＡＩを用いた部分分解によるパンセン
ジャーＤＮＡの調製条件は、モレキュラー・クローニン
グ第２８２頁〜第２８５頁記載の段階希釈法［Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ Ｔ、 ｅｔ、 ａｌ、：Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
ｃｌｏｎｉｎｇ （ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、 １９８２）により、
酵素添加量をＤＮＡ１μｇ当りＢａａ ＨＩは２．３１
ｕｎｉｔｓ、 ５ａｕ３ＡＩは０．１２７ ｕｎｉｔ
ｓと決定し、３７℃で１時間作用させ、各々の認識部位
を切断させた後、反応液を常法通りフェノール処理、ク
ロロホルム処理、エタノール沈殿処理を行い、部分分解
ＤＮＡを３３０μｇ調製し、これを分取用電気泳動装置
ＥＬＦＥシステム（Ｇｅｎｏｆｉｔ製）により分画した
。Next, the conditions for preparing Pansenger DNA by partial digestion using the restriction enzyme Bag HI and the isoschizomeric restriction enzyme Sau 3AI are as follows: the serial dilution method described on pages 282 to 285 of Molecular Cloning [Mani
atis T,et,al,:Mo1ecular
cloning (ColdSpring Harb)
or Laboratory), 1982),
The amount of enzyme added was 2.31 Baa HI per 1 μg of DNA.
units, 5au3AI is 0.127 units
s was determined and reacted at 37°C for 1 hour to cleave each recognition site, the reaction solution was treated with phenol, chloroform, and ethanol precipitation in the usual manner to prepare 330 μg of partially degraded DNA. was fractionated using a preparative electrophoresis device ELFE system (manufactured by Genofit).
分画後４フラクションおきに５μΩずつ採取し、アガロ
ース電気泳動を行い分画された大きさを確認し、適当な
りＮＡの長さごとにまとめてフェノール処理、クロロホ
ルム処理の後、エタノール沈殿処理を行い、部分分解Ｄ
ＮＡを回収し、パンセンジャーＤＮＡとした。分画した
長さと収量を第１表に示す。After fractionation, collect 5 μΩ from every 4 fractions, perform agarose electrophoresis to confirm the fractionated size, and perform phenol treatment, chloroform treatment, and ethanol precipitation treatment for appropriate NA lengths. , partial decomposition D
The NA was collected and used as Pansenger DNA. The fractionated lengths and yields are shown in Table 1.
第
１表
２．０１〜２．６６
２．６６〜３．５４
３．１９〜３，８９
３．６７〜４．６２
１３．７
１１．３
１］、３
１６．９
２．０１〜２，６０
２．６０〜３．３４
３．３４〜３．９８
３．９８〜４．６２
６．０９〜７．５６
１３．７
６．６８〜８．５１
１５．３
６．７３〜７．５９
８．２２〜９．３８
１７．６
１６．０
１３．６５〜１９．２８
２１．８
Ｓ−１２１６，６０〜２１．１３
１８．４
（２）ベクターＤＮＡの調製とベクターＤＮＡとパンセ
ンジャーＤＮＡのライゲーション
シャトルベクターＶＥｐ １３に対して、ベクター１μ
ｇ当り２ ｕｎｉｔｓのＢａｍ ＨＩを３７℃で１＠作
用させてＹＥｐ １３の制限酵母Ｂａｍ ＨＩ部位を完
全に切断し、常法通りフェノール処理、クロロホルム処
理、エタノール沈殿処理した後、このＢａｍ ＨＩで切
断されたＤＮＡ断片の自己環状化を防止するため、 モ
レキュラー・クローニング第１３３頁〜第】３４頁記載
の方法（Ｍａｎｉａｔｊｓ Ｔ、 ｅｔ、 ａｌ、：Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ ｃｌｒｎｉＢ （Ｃｏ］ｄＳｐｒｉ
ｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、 １９８
２）によりＣＩＰ処理を行いベクターＤＮＡを調製した
。Table 1 2.01-2.66 2.66-3.54 3.19-3,89 3.67-4.62 13.7 11.3 1], 3 16.9 2.01-2, 60 2.60-3.34 3.34-3.98 3.98-4.62 6.09-7.56 13.7 6.68-8.51 15.3 6.73-7.59 8 .22-9.38 17.6 16.0 13.65-19.28 21.8 S-1216,60-21.13 18.4 (2) Preparation of vector DNA and ligation of vector DNA and Pansenger DNA Vector 1μ for shuttle vector VEp 13
The restriction yeast Bam HI site of YEp 13 was completely cleaved by applying 2 units of Bam HI per g at 37°C, and after treatment with phenol, chloroform, and ethanol precipitation in the usual manner, the yeast was cleaved with this Bam HI. In order to prevent self-circularization of the DNA fragments obtained, the method described in Molecular Cloning, pages 133 to 34 (Maniatjs T, et al.: M
o1ecular clrniB (Co]dSpri
ngHarbor Laboratory), 198
2), vector DNA was prepared by CIP treatment.
さらにこのベクターＤＮＡは、前記（１）において得た
パンセンジャーＤＮＡとともにＤＮＡライゲーションキ
ット（宝酒造製）を使用してライゲーションを行い、２
つのＤＮＡを反応連結させた。ついで反応液１容に対し
５Ｍ塩化ナトリウム０．２５容とインプロパツール０．
７５容を添加しインプロパツール沈殿によって組換え体
ベクターを得た。Furthermore, this vector DNA was ligated with the Pansenger DNA obtained in (1) above using a DNA ligation kit (manufactured by Takara Shuzo), and 2
The two DNAs were linked together. Next, 0.25 volume of 5M sodium chloride and 0.25 volume of Improper Tool were added to 1 volume of the reaction solution.
A recombinant vector was obtained by adding 75 volumes and precipitation with Improper Tools.
（３）組換え体ベクターの調製
上記ライゲーションにより作成した組換え体ベクターは
大腸菌ＡＧＩ（フナコシ薬品（株）により入手）を使い
モレキュラー・クローニング第２５２頁〜第２５３頁記
載の塩化カルシウム／塩化ルビジウム法［Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ Ｔ、 ｅｔ、 ａｌ、：Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ｃ
ｌｏｎｉｎｇ （ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、 １９８２）により形質転
換菌ＡＧＩとした。ついでこの形質転換菌をアンピシリ
ン（シグマ製）４０ｐｐｌｉを添加したＬＢ培地（トリ
プトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム２％
、ｐ）１７．５） ５ ｆｆ１（ｌで３７℃で１晩培養
した後、この１ｒｒ＋Ｑを４０ｐｐｍのアンピシリンを
含むＬＢ培地１Ωに接種し３７℃で３〜４時間攪拌しつ
つＯＤ、、、。＝０．５〜０．６まで培養した後、クロ
ラムフェニルコール（シグマ製）を２００ｐｐｍ添加し
て再び３７℃で１４〜１５時間攪拌しつつ培養を続けた
あと３００Ｏｒｐｍ、１０分の遠心で集菌し、モレキュ
ラー・クローニング第３６８頁〜３６９頁記載のアルカ
リＳＤＳ法［Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ、 ｅｔ。(3) Preparation of recombinant vector The recombinant vector created by the above ligation was carried out using E. coli AGI (obtained from Funakoshi Pharmaceutical Co., Ltd.) using the calcium chloride/rubidium chloride method described on pages 252-253. [Maniat
is T, et, al, : Molecular c
loning (ColdSpring Harbor
Laboratory), 1982), and the transformed strain was designated as AGI. The transformed bacteria were then grown in LB medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 2% sodium chloride) supplemented with 40 ppli of ampicillin (manufactured by Sigma).
, p) 17.5) After culturing overnight at 37°C with 5ff1(l), this 1rr+Q was inoculated into LB medium 1Ω containing 40 ppm ampicillin, and the OD was maintained at 37°C for 3 to 4 hours with stirring. = 0.5 to 0.6, 200 ppm of chloramphenylcol (manufactured by Sigma) was added, the culture was continued at 37°C for 14 to 15 hours with stirring, and the cells were collected by centrifugation at 300 rpm for 10 minutes. The alkaline SDS method described in Molecular Cloning, pages 368-369 [Maniatis T, et.
ａｌ、：Ｍｏ１ｅｃｕｌａ ｃｌｏｎｉｇ（Ｃｏｌｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）、
１９８２）の試薬量を５０倍に変更して組紐換え体ベク
ターを抽出した。これを超遠心機で精製した後、セント
リコン１０（アミコン社製）で脱塩し、エタノール沈殿
を行い精製組換えベクターを得た。増幅し超遠心で精製
した組換え体ベクターの種類と使用したパンセンジャー
ＤＮＡの対応関係を第２表に示す。al, :Mo1ecula cloning(Cold
Spring Harbor Laboratory),
(1982), the recombinant vector was extracted by changing the amount of reagent 50 times. This was purified using an ultracentrifuge, desalted using Centricon 10 (manufactured by Amicon), and ethanol precipitated to obtain a purified recombinant vector. Table 2 shows the correspondence between the types of recombinant vectors amplified and purified by ultracentrifugation and the Pansenger DNA used.
第２表
ＹＥｐ Ｓｌｌ Ｓ５． Ｓ６． Ｓ７．５８ｙ
Ｅｐ Ｓ７ Ｓ５． Ｓ６． Ｓ７．５８ＹＥｐ
Ｓ８ Ｓ９． Ｓ］Ｏ，Ｓｌｌ、 ５１２ＹＥ
ｐ Ｂ４−］ Ｂ９． ＢＩＯＹＥｐ Ｂ６
Ｂ４． Ｂ５． Ｂ６■乍８８ ＢＩＯ，Ｂｌ
ｌ、Ｂ１２１ ： ］ ２６０
３：］ ７０７
３ ： ］ ８６］
１ ： １ ８６２
３：１ ７２９
３ ： １ ６９３
（４）酵母の形質転換及びα−ガラクトシダーゼ生産株
の検出
サツカロマイセス・センビシよりＢＹ７４６ （α接合
型、ｔｒｐｌ ｈｉｓ３１ｅｕ２ ｕｒａ３） をＹ
ＰＤ培地５０ＩＩＩＱ中で５×１０７個／ｍＱとなるま
で振盪培養し３，０００ｒｐ＋ｎ、３分間で遠心集菌を
行いＴＥ緩衝液で洗浄した。つしで菌体を４ｍＱの酢酸
リチウム中に懸濁し３０℃で４分振盪した後１．５社の
エッペンドルフチューブ番；１００μρずつ分注し、こ
れに（３）記載の精製したカン力ロマイセス・オレアギ
ノーサスにより抽出したα−ガラクトシダーゼの発現に
関与する遺伝仔を含む部分分解ＤＮＡを組み込んだ組換
え体ベクターを１０μｇ添加して３０℃で３０分振盪、
対いで７０％ＰＥＧ４０００を１１０μＱ添加し１時間
静置した後４２℃て５分間熱処理してサツカロマイセス
・セレビシ：内に組換え体ベクターを導入した。次いで
室温で放冷し、上澄を遠心分離で除き菌体は滅菌水で６
浄して形質転換をおえだ。Table 2 YEp Sll S5. S6. S7.58y
Ep S7 S5. S6. S7.58YEp
S8 S9. S]O, Sll, 512YE
p B4-] B9. BIOYEp B6
B4. B5. B6■乍88 BIO, Bl
l, B121: ] 260 3:] 707 3: ] 86] 1: 1 862 3: 1 729 3: 1 693 (4) Transformation of yeast and detection of α-galactosidase producing strain BY746 (α-mating type, trpl his31eu2 ura3)
The cells were cultured with shaking in PD medium 50IIIQ until the concentration was 5 x 107 cells/mQ, centrifuged at 3,000 rp+n for 3 minutes, and washed with TE buffer. After suspending the bacterial cells in 4 mQ of lithium acetate and shaking at 30°C for 4 minutes, the purified Eppendorf tubes (1.5) were dispensed into 100 μρ portions, and the purified cellulomyces cells described in (3) 10 μg of a recombinant vector incorporating a partially degraded DNA containing a gene involved in the expression of α-galactosidase extracted from M. oleaginosa was added, and the mixture was shaken at 30°C for 30 minutes.
To the mixture, 110 μQ of 70% PEG4000 was added, left to stand for 1 hour, and then heat-treated at 42° C. for 5 minutes to introduce the recombinant vector into Saccharomyces cerevisi. Next, let it cool at room temperature, remove the supernatant by centrifugation, and remove the bacterial cells with sterile water.
Purify and transform.
次いで形質転換酵母菌体はグルコース１％、ウラシル、
トリプトファン、ヒスチジンを２４ｐｐｍｉ加したり寒
天培地に適宜希釈して塗抹して３０℃で培養を行い成育
してきたコロニーに２００μΩｍのＸ−α−ｇａｌと１
％のメリビオースを含む軟寒天ＭＭを５ｍ１重層すると
α−ガラクトシダーゼを生産する菌扮は、Ｘ−α−ｇａ
ｌを分解しコロニーが青色に染色したことによって検出
した。α−ガラクトシダーゼを発現させることのできた
組換え体ベクターの菌株名と得られた発現株数を第３表
に示す。Next, the transformed yeast cells were treated with 1% glucose, uracil,
Tryptophan and histidine were added at 24 ppmi, diluted appropriately and spread on agar medium, cultured at 30°C, and the growing colonies were treated with 200 μΩm of X-α-gal and 1
When layered with 5 ml of soft agar MM containing % melibiose, the bacteria that produce α-galactosidase are X-α-ga
The colony was detected by staining it blue. Table 3 shows the strain names of recombinant vectors that were able to express α-galactosidase and the number of expression strains obtained.
第３表
ＹＥｐ Ｓ４ ４．７６〜９．３８ １８
６４ ４ＹＥｐ Ｓ７ ４．７６
〜９．３８ ３１３６ ５ＹＥｐ
Ｓ４ ８．０３〜１１．４８ ４４８６
４１ＹＥｐ Ｂ４−１ ３．９８
〜６．７３ ６６６４ １前記に
より検出したＸ−α−ｇａｌを分解する菌株は各プレー
トより各１株を釣菌し単コロニーに分離して２０ｍｆｌ
のＭ阿培地で３０℃、２日間振盪培養し遠心によって集
菌し一旦滅菌水で洗浄後、ＳＮバッファー（ＩＭ ５ｏ
ｒｂｉｔｏｌ、０．１Ｍ ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈ
ａｎｏｌ） ５ｍＲに懸濁し３７℃で１０分間振盪して
遠心集菌してこれを１ｙｓｉｓバツフア −（ＩＮ ５
ｏｒｂｉｔｏｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃ１，１０ｍＭ
ＥＤＴＡ、 ｐＨ７，５、Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ ２０
−Ｔ １００ｕｎｉｔｓ／ｍρ）５１に懸濁してスフ二
口プラストが生成するまで３７℃に保温し、 その後Ｓ
ｏ１． ＩＩ （０，２Ｎ ＮａＯＨ１１％５ＤＳ）
２００μΩを加えて溶菌し、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐ
）１ｓ、０）を１５０μＱを添加混合して一２０℃に１
０分装いた後１５，０ＯＯｒｐ諺で１０分間遠心分離し
た。Table 3 YEp S4 4.76-9.38 18
64 4YEp S7 4.76
~9.38 3136 5YEp
S4 8.03~11.48 4486
41YEp B4-1 3.98
~6.73 6664 1 For the X-α-gal-degrading strains detected above, pick one strain from each plate, separate into single colonies, and add 20 mfl.
Culture with shaking for 2 days at 30°C in M-A medium, collect bacteria by centrifugation, wash once with sterile water, and add to SN buffer (IM 5o).
rbitol, 0.1M 2-mercaptoeth
Anol) was suspended in 5mR, shaken at 37°C for 10 minutes, and centrifuged to collect the bacteria.
orbitol, 50mM Tris-C1, 10mM
EDTA, pH 7.5, Zymolyase 20
-T 100 units/mρ) 51 and kept at 37°C until a two-mouthed plast is formed, then S
o1. II (0,2N NaOH11%5DS)
Bacteria were lysed by adding 200μΩ, and 3M sodium acetate (p
) 1s, add 150μQ of 0), mix and heat to -20℃.
After incubation for 0 minutes, the mixture was centrifuged for 10 minutes at 15,0 OOrp.
上澄液にはα−ガラクトシダーゼを発現するために必要
なりＮＡ配列をパラセンジャーＤＮＡとして持つ組換え
体ベクターが抽出されているのでフェノール処理、クロ
ロホルム処理、エタノール沈殿処理によって回収する。A recombinant vector having an NA sequence as a parasenger DNA necessary for expressing α-galactosidase is extracted from the supernatant, and is recovered by phenol treatment, chloroform treatment, and ethanol precipitation treatment.
上記によって得た組換え体ベクターを使用し大腸菌５Ｃ
５Ｉ（フナコシ薬品より購入）の形質転換を行い８処理
について形質転換体を得ることができたので、その結果
髪第４表に示す。Using the recombinant vector obtained above, E. coli 5C
5I (purchased from Funakoshi Pharmaceutical Co., Ltd.) and transformants were obtained for 8 treatments, and the results are shown in Table 4.
第４表
酵母菌株名 ５４−Ｉ ５７−Ｉ ５７−２
８６−１大腸菌形質転換体数 １０ ２８
４０ １また、上記形質転換体はアンピシ
リン耐性を持つ物であったことで、形質転換で導入され
た組換え体ベクターはＹＥｐ １３を作用した組換えベ
クターであることが確認できた。Table 4 Yeast strain name 54-I 57-I 57-2
86-1 E. coli transformant number 10 28
401 Furthermore, since the above transformant was resistant to ampicillin, it was confirmed that the recombinant vector introduced by transformation was a recombinant vector treated with YEp13.
この結果、サッカロマイセス・オレアギノーサスより抽
出のα−ガラクトシダーゼの発現に関与する遺伝子を含
むパラセンジャーＤＮＡを組み入れた組換え体ベクター
名はその発現した酵母名をとってＹＥＢ８−１と命名し
、それによって形質転換した大腸菌形質転換体は、それ
ぞれ、 Ｅ、 ｃｏｌｉ Ｂ８−１（微工研菌寄第１０
８１１号）、同様にＥ、 ｃｏｌｉ Ｂ６−１（ＹＥＢ
６−１形質転換体）（微工研菌寄第１０８０８号）、同
様にＥ、 ｃｏｌｉ ５４−１（ＹＥＳ４−１形質転換
体）（微工研菌寄第１０８０７号）、同様にＥ、 ｃｏ
ｌｉ Ｓ７−１（ＹＥＳ７−１形質転換体）（微工研菌
寄第１．０８０９号）、同様にＥ、 ｃｏｌｉＳ７−２
（ＹＥＳ７−２形質転換体）（微工研菌寄第１０８１
０号）として微生物工業技術研究所に寄託しである。As a result, the recombinant vector incorporating the parasenger DNA containing the gene involved in the expression of α-galactosidase extracted from Saccharomyces oleaginosus was named YEB8-1 after the name of the yeast in which it was expressed. The transformed E. coli transformants were E. and coli B8-1 (Feikoken Bacteria No. 10).
No. 811), similarly E. coli B6-1 (YEB
E. coli 54-1 (YES4-1 transformant) (FEI Bacteria No. 10807), similarly E, coli
li S7-1 (YES7-1 transformant) (Feikoken Bacterial Serial No. 1.0809), similarly E, coli S7-2
(YES7-2 transformant)
It has been deposited with the Microbial Technology Research Institute as No. 0).
なお、酵母菌株Ｂ８−１．８８−１１、Ｂ８−１３、Ｂ
８−１４は同一の組換えプラスミドによる形質転換体で
あったのでＹＥＢ８−１による大腸菌形質転換体Ｅ、
ｃｏｌｉＢ８−１を代表とした。In addition, yeast strains B8-1.88-11, B8-13, B
Since 8-14 was a transformant using the same recombinant plasmid, E. coli transformant E using YEB8-1,
coli B8-1 was used as a representative.
これら形質転換体に挿入されているパラセンジャーＤＮ
Ａの制限酵素地図を第１図に示した。Parasenger DN inserted into these transformants
The restriction enzyme map of A is shown in FIG.
（５）形質転換体によるα−ガラクトシダーゼの生産、
及びこのα−ガラクトシダーゼとサッカロマイセス・オ
レアギノーサスの生産するα−ガラクトシダーゼの同一
性の確認。(5) Production of α-galactosidase by the transformant,
and confirmation of the identity of this α-galactosidase and α-galactosidase produced by Saccharomyces oleaginosus.
組換え体ベクターにより形質転換した酵母を用いてα−
ガラクトシダーゼを生産せしめ、この酵母が生産したα
−ガラクトシダーゼとサッカロマイセス・オレアギノー
サスの生産したα−ガラクトシダーゼが同一であること
を確認するため、ウェスタンブロッティングを行いプロ
ティンＡ法で検出した。試料には（４）項においてα−
ガラクトシダーゼの発現のあった形質転換酵母の培養を
行った上清とサッカロマイセス・オレアギノーサスを形
質転換体と同様にして培養したものをセントリコン１０
（アミコン製）で約４００倍↓こ脱塩濃縮したものを使
用した。α-
The α produced by this yeast causes galactosidase to be produced.
- To confirm that galactosidase and α-galactosidase produced by Saccharomyces oleaginosus are the same, Western blotting was performed and detection was performed using the protein A method. The sample has α-
The supernatant obtained by culturing the transformed yeast expressing galactosidase and Saccharomyces oleaginosus cultured in the same manner as the transformant were used as Centricon 10.
(manufactured by Amicon) was desalted and concentrated approximately 400 times.
これらの試料の蛋白質をローリ−法（Ｅ、 Ｆ。Proteins from these samples were analyzed using the Lowry method (E, F).
Ｈａｒｔｒｅｅ ： Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４８，４２２−４２７（１９７２
）により求め、１２％５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気
泳動を行った。体動は２０穴のコームを使ったゲルの右
端から分子量マーカー（オリエンタル酵母製）、形質転
換酵母培養液８点、サッカロマイセス・オレアギノーサ
ス培養液の順にル−ス当り２μｇ添加し、 同じサンプ
ルを同し順番に残りの穴に添加した。泳動終了後ゲルを
半分に切り一方を通常通り染色し、他の一方はエレクト
ロブロッティングを行いニトロセルロースメンブレンに
蛋白を転写した。その結果を第２図に示す。Hartree: Analytical Bio
Chemistry, 48, 422-427 (1972
), and 12% 5DS-polyacrylamide electrophoresis was performed. To measure body movement, use a 20-hole comb to add a molecular weight marker (manufactured by Oriental Yeast), 8 transformed yeast culture solutions, and Saccharomyces oleaginosa culture solution at 2 μg per gel in that order from the right end of the gel, and then add the same sample. were added to the remaining wells in sequence. After the electrophoresis was completed, the gel was cut in half, one half was stained as usual, and the other half was subjected to electroblotting to transfer the protein to a nitrocellulose membrane. The results are shown in FIG.
第２図の結果から明らかなように、通常の染色を行った
ものは多数のバンドが検出されたが抗αガラクトシダー
ゼ血清と反応したものはただ１つのバンドのみが検出さ
れ、両者を比較した結果同一のものと判定された。As is clear from the results in Figure 2, many bands were detected in the case of conventional staining, but only one band was detected in the case of reaction with anti-α-galactosidase serum. It was determined that they were the same.
（６）形質転換酵母の醗酵力試酸
形質転換酵母として（４）項で述にた組換えベクターＹ
ＥＢ８−１を組み込んだサツカロマイセス・セレビシよ
りＢＹ ７４６を使用し次の条件で醗酵力試酸を行った
。(6) Fermentation ability test of transformed yeast The recombinant vector Y described in section (4) as the transformed yeast
A fermentation test was conducted under the following conditions using BY 746 from Satucharomyces cerevisi into which EB8-1 had been incorporated.
■ 好気的培養の結果
０．５％グルコース、０．５％メリビオースを炭素源と
したＭ阿培地を使用し、サツカロマイセス・セレビシよ
りＢＹ ７４６に組換えベクターＹＥＢ８−１ を組み
込んだ場合と、組み込まない場合で振盪培養を行い収量
と残存糖分の分析を行った。この際、それぞれの菌株の
要求する核酸、アミノ酸は２４ｐｐｔｎ添加した。結果
は第５表に示す。■ Results of aerobic culture Using M-A medium with 0.5% glucose and 0.5% melibiose as carbon sources, the recombinant vector YEB8-1 was integrated into BY 746 from Satucharomyces cerevisi and when it was not integrated. Shaking culture was performed in the absence of the yeast, and the yield and residual sugar content were analyzed. At this time, 24 ppt of nucleic acids and amino acids required by each strain were added. The results are shown in Table 5.
第５表
形質転換体 Ｎ、 Ｄ、 Ｎ、 Ｄ、
２１０非転換体 ０．５３
Ｎ、 ０． ８０上記の結果からも明らかなよう
に、パン酵、母を、ビート糖蜜等ラフィノース、メリビ
オース含有糖液を使用して培養しても、これらの糖を充
分に資化し、培養、増殖できることが判る。Table 5 Transformants N, D, N, D,
210 Non-convertible 0.53
N, 0. 80 As is clear from the above results, even if baker's yeast and yeast are cultured using a sugar solution containing raffinose and melibiose, such as beet molasses, these sugars can be fully utilized, and the yeast can be cultured and grown. .
■ 醗酵試験の結果
前記において好気的培養した菌体を使用して醗酵試験を
行った。(2) Results of fermentation test A fermentation test was conducted using the microbial cells cultured aerobically as described above.
醗酵培地■：ビート糖蜜１０％（１１！酵性糖分）、０
．１Ｍクエン酸ナトリウムバッファ
（ｐＨ５，５）２（１０＋ｏＱ
＠酵培地■：ビート糖蜜１０％（ｒＲ酵性糖分）、要求
するアミノ酸、核酸を添加した
ＭＭ培地２００＋ｎ１２
接種菌体量：形質転換体〜１．３７ Ｘ ＩＱ’個非転
換体〜１，３７Ｘ１０Ｓｇ
ｗｌ酵試験は２週間行い、炭酸ガス発生量と残存糖分組
成を分析した。その結果及び使用した糖蜜の糖分組成、
ｒＲ＃収量時の残存糖分組成、炭酸ガス発生量（ＣＯ２
ｇ）を第６表に示す。この表のとおり形質転換酵母にあ
っては明らかにα−ガラクトシダーゼによりメリビオー
ス醗酵が行われ、炭酸ガス発生量も多く、非形質転換酵
母に比へ高い醗酵力を示した。Fermentation medium ■: Beet molasses 10% (11! fermentable sugar), 0
．． 1M sodium citrate buffer (pH 5,5) 2 (10 + oQ @ fermentation medium ■: MM medium 200 + n12 supplemented with beet molasses 10% (rR fermentable sugar), required amino acids and nucleic acids Amount of inoculum: Transformants ~ 1 .37 X IQ' non-convertible product ~ 1,37
rR# Residual sugar composition at yield, amount of carbon dioxide gas generated (CO2
g) is shown in Table 6. As shown in this table, the transformed yeast clearly carried out melibiose fermentation by α-galactosidase, produced a large amount of carbon dioxide gas, and exhibited a higher fermentation power than the non-transformed yeast.
第
表
形質転換体 １ ０．３３ ０．０７ ０．２０ １．
５４ ０．４９ ２．８８ ３．４０Ｕ Ｏ，２２
０，０６０，１５０，６７０，５２２，００４，９０非
転換体 Ｉ Ｏ，７８０，０７１，０６１，６９Ｎ、
Ｄ、 ２．９３２．５５ＩＩ １．０４ ０．１４
０．７４ ０．５８ Ｎ、Ｄ、 ２．９３ ２．
４５使用糖蜜 ２．＋３６．８７ ０．４２
０．５９したがって、本発明によれば、メリビオー
スやラフィノース等α−ガラクトシド含有物、例えばビ
ート廃糖蜜、ビート糖洗液その他ビート１１Ｆ製造工場
やビート処理工場からの廃液、を有利に処理することが
できる。また、ビート廃糖蜜を予じめ本発明に係る形質
転換体を作用せしめてガラクトースとグルコースの結合
を切断しておけば、ケーン廃糖蜜と同様に使用すること
ができ、各種発酵培地として有効に利用することができ
る。Table 1 Transformants 1 0.33 0.07 0.20 1.
54 0.49 2.88 3.40U O,22
0,060,150,670,522,004,90 non-convertible I O,780,071,061,69N,
D, 2.932.55II 1.04 0.14
0.74 0.58 N, D, 2.93 2.
45 Molasses used 2. +36.87 0.42
0.59 Therefore, according to the present invention, it is possible to advantageously treat α-galactoside-containing substances such as melibiose and raffinose, such as beet molasses, beet sugar washing liquid, and other waste liquids from beet 11F manufacturing plants and beet processing plants. can. Furthermore, if beet molasses is treated with the transformant according to the present invention in advance to break the bond between galactose and glucose, it can be used in the same manner as cane molasses, and can be effectively used as a fermentation medium for various types. can be used.
（７）α−ガラクトシダーゼ遺伝子の構造Ｉ）デイレ−
ジョンプラスミドの作成
シーフェンス用ベクターとしてｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔ
を用い、先に得たα−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片を再クローニングした。(7) Structure of α-galactosidase gene I) Delay
Creation of John Plasmid pBIuescript as Seafence Vector
using the previously obtained D containing the α-galactosidase gene.
The NA fragment was recloned.
このようにして再クローニングしたｐＢＩ−ｕｅｓｃｒ
ｉｐｔを制限酵素Ｎｏｔ Ｉ及びＳａｃ Ｉで処理した
。pBI-uescr recloned in this way
ipt was treated with restriction enzymes Not I and Sac I.
次いで、Ｋ１１ｏ−５ｅｑｕｅｎｃｅ用デイレ−ジョン
キット（全酒造製）を利用して、先ずＥｘｏｍで処理し
た。Next, using a delay kit for K11o-5equence (manufactured by Zenshuzo), it was first treated with Exom.
Ｅｘｏ ｍはＤＮ、Ａの５′末端側が平滑末端もしくは
突出末端の場合にのみ相補ＤＮＡ鎖を３′から５′末端
側へ削り取って行く。したがって制限酵素Ｎｏｔ ！及
び５ａｃＩでプラスミドを二重切断しておけばＳａｃ
Ｉは５′陥没末端を形成するので、５′突出末端を形成
するＮｏｔ Ｉ側のみが削り取られた。Exom scrapes off the complementary DNA strand from the 3' to the 5' end only when the 5' end of the DNA A has a blunt end or a protruding end. Therefore, restriction enzymes Not! If the plasmid is double cut with 5acI and 5acI, Sac
Since I forms a 5' recessed end, only the Not I side forming a 5' overhanging end was shaved off.
次にＭＢヌクレアーゼ（ＨｕｎｇＢｅａｎヌクレアーゼ
）で処理し、１本１！ｉ ＤＮＡ部分を切除し平滑末端
にした。しかしＭＢヌクレアーゼだけでは完全に平滑化
できない場合があるので、Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅ
ｎｔで完全に平滑な２本鎖に修復し、ライゲーションを
行い閉環状のプラスミドとした。ここでＥｘｏｍの作用
時間を段階的に変えることにより、適当なデイレ−ジョ
ンを持ったプラスミドを作成した。Next, it is treated with MB nuclease (HungBean nuclease), and each strand is 1! i The DNA portion was excised to make blunt ends. However, since complete smoothing may not be possible with MB nuclease alone, Klenow Fragme
nt was used to repair it to a completely blunt double strand, and ligation was performed to obtain a closed circular plasmid. By changing the action time of Exom stepwise, a plasmid with an appropriate delay was created.
これらのプラスミドで大腸菌を形質転換し、得られたコ
ロニーから抽出したプラスミドの大きさを電気泳動で確
認し、デイレ−ジョンプラスミドのスクリーニングを行
い、デイレ−ジョン系列を作成した。Escherichia coli was transformed with these plasmids, the size of the plasmid extracted from the resulting colonies was confirmed by electrophoresis, and a delay plasmid was screened to create a delay series.
ｉ）α−ガラクトシダーゼ遺伝子の構造上記によって作
成したデイレ−ジョンプラスミドにより読み取ったデー
タを繋ぎ合わせて、αガラクトシダーゼ遺伝子のプロモ
ーター、分泌配列、構造遺伝子の全てを含む塩基配列を
決定した。i) Structure of α-galactosidase gene The data read by the degradation plasmid prepared above was combined to determine the base sequence containing all of the promoter, secretion sequence, and structural gene of the α-galactosidase gene.
このデータは第３図に示した。This data is shown in Figure 3.
シーフェンスデータの解析は、個々のディレージョンプ
ラスミドからオートシークエンサーで得られたデータの
接続を含め、ＤＮＡ塩基配列の解析はＤＮＡ解析用ソフ
トＧＥＮＥＴＹＸ （ＳＤＣ製）を使用して行った・
ｉ） ０ＲＦ（オープンリーディングフレーム）の検索
シーフェンスしたＤＮＡ配列の中からＤＮＡの遺伝情報
がメツセンジャーＲＮＡへ転写され蛋白へと翻訳される
部分であるＯＲＦを検索した。The analysis of sea fence data included the connection of data obtained from individual delay plasmids with an autosequencer, and the analysis of DNA base sequences was performed using the DNA analysis software GENETYX (manufactured by SDC). i) 0RF (Open Reading Frame) Search From the searched DNA sequences, we searched for ORF, which is the part where DNA genetic information is transcribed into metsenger RNA and translated into protein.
ＤＮＡコードでは、メツセンジャーＲＮＡの転写開始部
分はＡＴＧ、転写停止部分は、丁ＡＧ、 丁ＧＡ、子局
のいずれかであるので、開始コード、停止コードの検索
を行ないＯＲＦ決定を行った。In the DNA code, the transcription start part of Metsusenger RNA is ATG, and the transcription stop part is either Ding AG, Ding GA, or slave station, so the ORF was determined by searching for the start code and stop code.
精製したα−ガラクトシダーゼ遺伝子の分子量は６２，
５００ダルトンであった。 １ｋｂＤＮＡはアミノ酸３
３３個をコードでき、 そのアミノ酸の分子量はおよそ
３７，０００ダルトンなので、およそ１，５００塩基の
ＱＲＦが存在すると考えられた。The molecular weight of the purified α-galactosidase gene is 62,
It was 500 daltons. 1kb DNA has 3 amino acids
Since it can code for 33 amino acids and the molecular weight of the amino acids is approximately 37,000 Daltons, it was thought that a QRF of approximately 1,500 bases existed.
検索の結果、転写開始コードは第３図に示した塩基配列
において５２１番目のＡＴＧであり、転写停止コードは
１９３４番目のＴＡＡであること、その長さは１４１３
塩基でアミノ酸に翻訳された場合４７１残基であること
が分かった。As a result of the search, the transcription start code is the 521st ATG in the base sequence shown in Figure 3, the transcription stop code is the 1934th TAA, and its length is 1413.
It was found that there are 471 residues when translated from base to amino acid.
リ α−ガラクトシダーゼ遺伝子の相同性の比較すでに
決定されているＳ、 ｃａｒｌｓｂｅｒ ｅｎｓｉｓ及
び今回決定したＳ、 ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓのα−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子のＯＲＦ部分を比較し１両者の相
同性を調べた。Comparison of homology between α-galactosidase genes The ORF portions of the previously determined α-galactosidase genes of S. carlsberensis and the newly determined α-galactosidase genes of S. oleaginosus were compared to examine the homology between the two.
ＤＮＡレベルでは９４．３％の相同性（全塩基に占める
同一塩基の割合）があり、蛋白質レベルでは４７１アミ
ノ酸中１７個が異なったアミノ酸で、相同性は９６．４
％であった。アミノ酸組成と、それらから推定される蛋
白質の分子量は第７表に示した。At the DNA level, there is a homology of 94.3% (ratio of identical bases to all bases), and at the protein level, 17 out of 471 amino acids are different, giving a homology of 96.4%.
%Met. Amino acid compositions and protein molecular weights estimated from them are shown in Table 7.
第７表。Table 7.
Ｓ＋ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓのアミノ酸組成＾Ｌ
＾＝ ３４７．２２％
ＣＹＳ＝ １０２．１２％
ＨＩＳ＝ ７１．４％
ＮＥＴ＝ １３２．７６％
ＴＨＲ＝ ２４５．］、００
％＊＝ Ｏ，００％
ＡＳＮ＝ ３５７．４３％
ＧＬＮ＝ １４２．９７％
ＩＬＥ＝ ２３４．８８％
ＰＨＥ＝ ２１４．４６％
ＴＲＰ＝ １２２．５５％
？？？： ０．００％
ＡＳＰ−３７１，８６％
ＧＬＵ＝ １７３．６］％
ＬＥ［Ｉ＝ ３８８．０７％
ＰＲＯ＝ １６３．４は
ＴＹＲ＝ ２５５．３１％
ＡＲＧ＝ １７３．６１％
ＧＬＹ＝ ４６９．７７％
ＬＹＳ＝ １９４．０３％
５ＥＲ＝ ４３９．１３％
ＶＡＬ＝ ２０４．２５％
第７表、２ Ｓ、ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓのアミノ酸組
成ＡＬＡ＝ ３７７．８６％ ＡＳＮ＝
ＣＹＳ＝ １０２．１？Ｊ ＧＬＮ：ＨＩＳ＝ ９
１．９１％ ＩＬＥ＝
ＮＥＴ＝ １３２．７６％ ＰＨＥ＝
ＴＨＲ＝ ２５５．３１％ ＴＲＰ＝
木＊＊二 ０ ．００％ ？？？二分子量＝５２
１３０．２２
３１６．５８％
］４２．９７％
２１４゜４６％
２１４．４６％
１２２．５５％
０ ．０Ｏ％
ＡＳＰ＝ ３９８．２８％
ＧＬＵ＝ １７３．６１％
ＬＥＵ＝ ３７７．８６％
ＰＲＯ＝ １７３．６１％
ＴＹＲ＝ ２５５．３１％
ＡＲＧ＝ １７３．６１％
ＧＬＹ＝ ４５９．５５％
ＬＹＳ＝ ２０４．２５％
５ＥＲ＝ ４０８．４９％
ＶＡＬ＝ ２１４．４６％
また、Ｓ、 ｏｌｅａ １ｎｏｓｕｓの１番目から２８
５０番目までを≦、姐此岨肛駐匝江のものと比較した結
果は第４図として示した。なお図中、上段（ファイル名
： ＴＡＭＥＬ ５）はト１朋１凹臣憇及び下段（ファ
イル名： ＳＣＭＥＬＩＣＡ）はＳ、 ｃａｒｌｓｂｅ
ｒ ｅｎｓｉｓのα−ガラクトシダーゼ遺伝子の塩基配
列をそれぞれ示した。Amino acid composition of S+carlsbergensis^L
^= 347.22% CYS= 102.12% HIS= 71.4% NET= 132.76% THR= 245. ], 00%*= O,00% ASN= 357.43% GLN= 142.97% ILE= 234.88% PHE= 214.46% TRP= 122.55%? ? ? : 0.00% ASP-371.86% GLU= 173.6]% LE[I= 388.07% PRO= 163.4 is TYR= 255.31% ARG= 173.61% GLY= 469.77% LYS = 194.03% 5ER = 439.13% VAL = 204.25% Table 7, 2 Amino acid composition of S. oleaginosus ALA = 377.86% ASN = CYS = 102.1? JGLN:HIS=9
1.91% ILE= NET= 132.76% PHE= THR= 255.31% TRP= Tree**2 0. 00%? ? ? Bi molecular weight = 52
130.22 316.58% ] 42.97% 214°46% 214.46% 122.55% 0. 00% ASP= 398.28% GLU= 173.61% LEU= 377.86% PRO= 173.61% TYR= 255.31% ARG= 173.61% GLY= 459.55% LYS= 204.25% 5ER = 408.49% VAL = 214.46% Also, S, olea 1nosus 1st to 28
Figure 4 shows the results of comparing up to the 50th ≦ with those of Jiakou Jixujiang. In the diagram, the upper row (file name: TAMEL 5) is To 1 Tomo 1 Koomi Ki, and the lower row (file name: SCMELICA) is S, carlsbe.
The base sequences of the α-galactosidase genes of S. r. ensis are shown.
同一の塩基は本で示し、また１の下に示した数字はシー
フェンスされた塩基の端からの番号である。Identical bases are indicated in book form, and the number below 1 is the number from the end of the seafenced base.
これらの結果から明らかなように、両者の遺伝子は明ら
かに相違しており、本発明に係るα−ガラクトシダーゼ
遺伝子が新規な構造を有していることが確認された。As is clear from these results, the two genes are clearly different, and it was confirmed that the α-galactosidase gene according to the present invention has a novel structure.
マ）α−ガラクトシダーゼ遺伝子のプロモーターの構造
Ｓ、 ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓとＳ、 ｃａｒｌｓｂｅ
ｒｇｅｎｓｉｓのα−ガラクトシダーゼ遺伝子のホモロ
ジー解析をプロモータ一部分及び、ＯＲＦの一部ではあ
るがシグナル配列部分について詳しく行った。M) Structure of the promoter of α-galactosidase gene S. oleaginosus and S. carlsbe
Homology analysis of the α-galactosidase gene of P. rgensis was performed in detail on a portion of the promoter and a portion of the signal sequence, which is a portion of the ORF.
ｍ−ＲＮＡへの転写を促進するとされるＬＩＡＳ領域な
塩基配列（第５図ＵＡＳの下に記載した配列のうち口で
囲った部分）が開始コード（ＡＴＧのＡを起点Ｏベース
とする）より上流−２５９から−２０６にかけて存在し
、恒組■珪肛■匣■のＵＡＳより８ベース下流に存在し
ていた。The base sequence of the LIAS region, which is said to promote transcription into m-RNA (the part of the sequence listed below UAS in Figure 5, surrounded by an opening) is derived from the start code (with A of ATG as the base O). It existed upstream from -259 to -206, and was 8 bases downstream from Tsunegumi's Keikou Hako's UAS.
また、ＲＮＡポリメラーゼ■が転写開始部位を認識する
ためのＴＡＴＡボックスは、旦、７ヨヨと同位置の−１
１９、−１１０、−６３に存在していた。In addition, the TATA box for RNA polymerase ■ to recognize the transcription start site is located at -1 at the same position as 7 yo.
19, -110, and -63.
ｖｉ）分泌配列（シグナル配列）の構造蛋白を菌体外に
分泌されるには細胞膜の脂質の層を通過する際の先導役
の働きをする１５〜３ｏ残基の疎水性の蛋白質が分泌さ
れる蛋白のＮ末端側に付着している必要がある。vi) Structural secretion sequence (signal sequence) In order for the protein to be secreted outside the bacterial cell, a hydrophobic protein with 15-3o residues that acts as a guide when passing through the lipid layer of the cell membrane is secreted. It must be attached to the N-terminus of the protein.
シーフェンシングの結果、蛋白を分泌生産するためのシ
グナル配列は旦１組ム珪肛り旦赳のシグナル配列（下段
に示した）と比較して塩基で４個、アミノ酸で２個の違
いがあった。As a result of sea fencing, the signal sequence for protein secretion production differed by 4 bases and 2 amino acids compared to the signal sequence of the Dan1 group (shown at the bottom). Ta.
第６図には両者を並記し、同一塩基は＊印で示した。In FIG. 6, both are shown side by side, and the same bases are marked with *.
両者のシグナル配列を構成している１８個のアミノ酸と
α−ガラクトシダーゼのＮ末端側１２アミノ酸を次に示
したアミノ酸の親水性、疎水性のパラメーター（第８表
、正の値が大きくなる程、疎水的である。）を用い隣り
合う５アミノ酸間の相加平均をプロットしたのが第７図
である。図中、実線はＳ、 ｏｌｅａ １ｎｏｓｕｓ、
破線は互、 ｃａｒｌｓｂｅｒ ｅｎｓｉｓを示し、
双方型なり合う部分は実線で示した。The hydrophilicity and hydrophobicity parameters of the amino acids shown below (Table 8, the larger the positive value, the more positive the Figure 7 shows a plot of the arithmetic average between five adjacent amino acids using the formula (hydrophobic). In the figure, solid lines indicate S, olea 1nosus,
Dashed lines indicate carlsber ensis,
The parts where both types are compatible are shown with solid lines.
１１ｅ（Ｉ）＝ ４．５０
Ｌｅｕ（Ｌ）＝ ３．８０
Ｃｙｓ（Ｃ）＝ ２．５０
Ａｌａ（Ａ）＝ １．８０
Ｔｈｒ（Ｔ）＝ −，７０
Ｓｅｒ（Ｓ）＝ −，８０
Ｐｒｏ（Ｐ）＝−１，６０
Ｇｌｕ（Ｅ） ＝−３，５０
Ａｓｐ（Ｄ） ＝−３，５０
１ｙｓ（Ｋン＝−３，９０
２、Ｖａｌ（Ｖ）＝ ４．２０
４、 Ｐｈｅ（Ｆ）＝ ２．８０
６、 Ｎｅｔ（Ｍ）＝ １．９０
８、 Ｇｌｙ（Ｇ）＝ −，４０
１０、Ｔｒｐ（Ｗ）＝ −，９０
１２、Ｔｙｒ（Ｙ）＝−１，３０
１４、Ｈｉｓ（Ｈ）＝−３，２０
１６、６ｉｎ（Ｑ）＝−３，５０
１８、Ａｓｎ（Ｎ）＝−３，５０
２０、Ａｒｇ（Ｒ）＝−４，５０
Ｓ、 ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓでＩｌｅ （イソ
ロイシン二疎水性）Ｓｅｔ （セリン：親水性）の部分
が恒剋９１凹臣肝では２個のＴｈｒ （スレオニン二親
水性）に置換されていることから疎水性は低くなってい
る可能性はあるが、両者の分泌能力の差はこのデータか
らは分からない。11e (I) = 4.50 Leu (L) = 3.80 Cys (C) = 2.50 Ala (A) = 1.80 Thr (T) = -, 70 Ser (S) = -, 80 Pro ( P) = -1,60 Glu (E) = -3,50 Asp (D) = -3,50 1ys (Kn = -3,90 2, Val (V) = 4.20 4, Phe (F) = 2.80 6, Net(M) = 1.90 8, Gly(G) = -,40 10, Trp(W) = -,90 12, Tyr(Y) = -1,30 14, His(H )=-3,20 16, 6in(Q)=-3,50 18, Asn(N)=-3,50 20, Arg(R)=-4,50 S, Ile in carlsbergensis (isoleucine dihydrophobic) Since the Set (serine: hydrophilic) part is replaced with two Thr (threonine dihydrophilic) parts in the liver, the hydrophobicity may be lower, but the secretion of both The difference in ability cannot be determined from this data.
６）蛋白分泌用ベクターの構築
Ｓ、 ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓのα−ガラクトシダーゼ
ニハ菌体外に蛋白質を分泌するためのシグナル配列が付
加しているので、本遺伝子のプロモーター、シグナル配
列以後に異種遺伝子を接続することで、異種遺伝子に由
来する蛋白質を分泌生産することが可能である。6) Construction of a vector for protein secretion S. Since a signal sequence for secreting the protein outside the α-galactosidase zeniha cell body of S. oleaginosus is added, a heterologous gene should be connected after the promoter and signal sequence of this gene. It is possible to secrete and produce proteins derived from heterologous genes.
以下に、この分泌能力を利用した異種蛋白分泌用ベクタ
ー設計の一例を示す。An example of vector design for heterologous protein secretion that utilizes this secretion ability is shown below.
第８図にはプロモーター領域、転写終結領域に存在する
各種制限酵素による切断地図を示した。FIG. 8 shows a cleavage map by various restriction enzymes present in the promoter region and transcription termination region.
異種遺伝子産物を分泌発現させるにはα−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子のＯＲＦ中のシグナル配列以後の構造遺伝子
部分に異種遺伝子を組み込む必要がある。In order to secrete and express a heterologous gene product, it is necessary to incorporate the heterologous gene into the structural gene portion after the signal sequence in the ORF of the α-galactosidase gene.
そのためにはα−ガラクトシダーゼの構造遺伝子を除去
しなければならないので、シグナル配列の中程に存在す
るｓｐｈ Ｉと停止コード部分に存在するＡｆｌ ＩＩ
で切断した。In order to do this, the structural gene of α-galactosidase must be removed, so sph I, which is present in the middle of the signal sequence, and Afl II, which is present in the stop code region.
I cut it with.
次いで、切除されたシグナル配列の修復と異種遺伝子の
挿入部位としての制限酵素切断部位の導入及び、各導入
部位に停止コードを対応させるためＴＡＡを１塩基ずつ
ずらして設けた合成りＮＡを作成した（第９図）。Next, we repaired the excised signal sequence, introduced a restriction enzyme cleavage site as a site for insertion of a heterologous gene, and created a synthetic DNA in which TAA was shifted one base at a time in order to correspond to each introduction site with a stop code. (Figure 9).
この合成りＮＡを構造遺伝子を切除したベクターにライ
ゲーションし、異種蛋白分泌用ベクターを構築した。こ
のベクターを用いることにより異種遺伝子で発現させる
ことができる。This synthetic NA was ligated to a vector in which the structural gene had been excised to construct a vector for secreting a heterologous protein. By using this vector, it is possible to express a heterologous gene.
なお本明細書において各種操作を行うに当り、その参考
とした文献例は次のとおりである。In performing various operations in this specification, examples of literature referred to are as follows.
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Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、 １５７（発明の効果）
本発明のサッカロマイセス・オレアギノーサスより抽出
したα−ガラクトシダーゼの発現に関与する遺伝子を含
有するパラセンジャーＤＮＡを含むＤＮＡは、サツカロ
マイセス・セレビシェを始めＹＥｐ１３の持つ２μ■Ｄ
ＡＮ複製開始質点を利用しプラスミドの複製を行える酵
母でα−ガラクトシダーゼ生産能のない酵母に導入し形
質転換した場合に、その形質転換体にα−ガラクトシダ
ーゼ生産能を付与することができる。References O Regarding yeast α-galactosidase gene sequencing Liljestrom P, L: Nuel,
Ac1ds Res, 137257°Sumner-5
mith Met, al.: Gene 36
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DNA techniques 101・M13 phage cloning and dideoxy sequencing method (Amajam Japan) About the parent-hydrophobicity of O protein・Doolittle R, F, et, al, :
J, Mo1. Biol, 157 (Effects of the Invention) The DNA containing the parasenger DNA containing the gene involved in the expression of α-galactosidase extracted from Saccharomyces oleaginosa of the present invention has the 2μD of YEp13 including Saccharomyces cerevisiae.
When yeast that is capable of replicating plasmids using the AN replication initiation mass point is introduced and transformed into a yeast that does not have the ability to produce α-galactosidase, the transformant can be endowed with the ability to produce α-galactosidase.
したがって本発明によれば、α−ガラクトシダーゼの工
業生産が可能となるばかりでなく、メリビオース、ラフ
ィノースの発酵ないし分解も可能となり、そのためにこ
れらの糖を含有する廃液処理も有利に行え、また、ビー
ト糖蜜を工業用培地として自由に使用することもできる
。Therefore, according to the present invention, not only the industrial production of α-galactosidase becomes possible, but also the fermentation and decomposition of melibiose and raffinose, which makes it possible to advantageously treat waste liquids containing these sugars. Molasses can also be freely used as an industrial medium.
また本発明によってα−ガラクトシダーゼ遺伝子の構造
が新たに解明されたので、上記効果が更に増進されるだ
けでなく、例えばそのシグナル配列を利用すれば異種蛋
白分泌用ベクターも構築することができるので、各種の
異種蛋白の効率的製造も可能となる。Furthermore, since the structure of the α-galactosidase gene has been newly elucidated by the present invention, not only the above effects will be further enhanced, but also a vector for secreting a heterologous protein can be constructed by using its signal sequence. It also becomes possible to efficiently produce various types of heterologous proteins.
したがって本発明は、この面からしてもバイオテクノロ
ジーに大きく貢献するものである。Therefore, the present invention greatly contributes to biotechnology from this aspect as well.
第１図は、各組換え体プラスミドに挿入されているパラ
センジャーＤＮＡの制限酵素地図であり、図中のＢ、Ｅ
、Ｐ、Ｓ、Ｘは、それぞれ次の制限酵素による切断位置
を示す。
Ｂ：Ｂａｍ ＨＩ Ｅ：Ｅｃｏ ＲＩ Ｐ：Ｐｓｔ Ｉ
Ｓ：Ｓａｕ ３ＡＩ Ｘ：ｂａ Ｉ
第２図は、形質転換体の生産するα−ガラクトシダーゼ
とサッカロマイセス・オレアギノーサスの生産するα−
ガラクトシダーゼの比較図であり、図中の数字はそれぞ
れ次のことを表わす。
１：分子量マーカー、２ ： Ｂ８−１．３ ： Ｂ８
−１１．４ ： Ｂ８−１３．５ ： Ｂ８−１４．６
： ５４−１．７：Ｓ７−１８：５７−１．９：Ｂ６
−１．１０ ： Ｓ、ｏｌｅａ １ｎｏｓｕｓＩＦＯ１
９９８第３図は、本発明に係るα−ガラクトシダーゼ遺
伝子の塩基配列を図示したものであり、第４図は、互０
組１穂肛駐旦江のα−ガラクトシダーゼ遺伝子の塩基配
列（下段）との相同性を比較した図面である。
第５図は、３． ｐ１６Ｂ １ｎｏｓｕｓのα−ガラク
トシダーゼプロモーターの構造を図示したものである。
第６図は、そのシグナル配列（上段）を図示するととも
に、Ｓ、 ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓのシグナル配
列の塩基配列（下段）とを比較したものであり、第７図
は親木−疎水プロット図である。
第８図は、α−ガラクトシダーゼ構造遺伝子周辺部分の
制限酵素地図を図示したものであり、第９図は、合成り
ＮＡによる分泌ベクターの作成図である。
代理人 弁理士 戸 １）親 男
図面の浄Ｗ（内存１、
第
Ｓ［）Ｓ−ポリアクリフレアミド＠う１め：変更なし）
図
ｐｒｏ士ｐｉｎ−Ａｍ
ＡＨＡ−
３曹贅ミFigure 1 is a restriction enzyme map of parasenger DNA inserted into each recombinant plasmid, and B and E in the figure are
, P, S, and X indicate the positions of cleavage by the following restriction enzymes, respectively. B: Bam HI E: Eco RI P: Pst I
S: Sau 3AI
This is a comparison diagram of galactosidase, and the numbers in the diagram represent the following, respectively. 1: Molecular weight marker, 2: B8-1.3: B8
-11.4: B8-13.5: B8-14.6
: 54-1.7:S7-18:57-1.9:B6
-1.10: S, olea 1nosusIFO1
998 Figure 3 illustrates the base sequence of the α-galactosidase gene according to the present invention, and Figure 4 shows the mutual nucleotide sequence.
This is a diagram comparing the homology with the base sequence of the α-galactosidase gene (lower row) of Group 1 Houkan Zadanjie. Figure 5 shows 3. FIG. 2 illustrates the structure of the α-galactosidase promoter of p16B 1nosus. FIG. 6 illustrates the signal sequence (upper row) and compares it with the base sequence of the S. carlsbergensis signal sequence (lower row), and FIG. 7 is a parent tree-hydrophobic plot. FIG. 8 shows a restriction enzyme map of the area surrounding the α-galactosidase structural gene, and FIG. 9 shows a diagram of the construction of a secretion vector using synthetic NA. Agent Patent Attorney Door 1) Parent Male Drawing Purification W (Inheritance 1, S [) S-Polyacryleamide @ U1: No change) Diagram Pro Pin-Am AHA- 3 Sobo Mi
Claims (17)
たα−ガラクトシダーゼ遺伝子のプロモーター領域、分
泌配列領域、構造遺伝子領域を含むプラスミド。(1) A plasmid containing the promoter region, secretory sequence region, and structural gene region of the α-galactosidase gene extracted from Saccharomyces oleaginosa.
たα−ガラクトシダーゼ遺伝子のプロモーター領域、分
泌配列領域、構造遺伝子領域を含むプラスミドをＹＥｐ
１３のテトラサイクリン耐性遺伝子のＢａｍＨＩ部位に
挿入したプラスミドベタクー。(2) YEp a plasmid containing the promoter region, secretory sequence region, and structural gene region of the α-galactosidase gene extracted from Saccharomyces oleaginosa.
Plasmid Betacou inserted into the BamHI site of the 13 tetracycline resistance gene.
たα−ガラクトシダーゼ遺伝子のプロモーター領域、分
泌配列領域、構造遺伝子領域を含むプラスミドをＹＥｐ
１３のテトラサイクリン耐性遺伝子のＢａｍＨＩ部位に
挿入したプラスミドベタクー、を用いて菌体を形質転換
してなる形質転換体。(3) YEp plasmid containing the promoter region, secretory sequence region, and structural gene region of the α-galactosidase gene extracted from Saccharomyces oleaginosa.
A transformant obtained by transforming bacterial cells using plasmid Betacou inserted into the BamHI site of the tetracycline resistance gene No. 13.
用するα−ガラクトシダーゼの製造方法。(4) A method for producing α-galactosidase using the transformant described in claim 3.
用するメリビオース及び／又はラフィノースの分解ない
し発酵方法。(5) A method for degrading or fermenting melibiose and/or raffinose using the transformant described in claim 3.
用するビート糖液の処理方法。(6) A method for treating beet sugar solution using the transformant described in claim 3.
用するビート糖蜜の処理方法。(7) A method for treating beet molasses using the transformant described in claim 3.
である特許請求の範囲第３〜７項のいずれか１項に記載
の菌体又は方法。(8) The bacterial cell or method according to any one of claims 3 to 7, wherein the transformant is a culture thereof and/or a processed product thereof.
ーゼ構造遺伝子。(9) α-galactosidase structural gene having the base sequence shown in FIG.
列を実質上含むものであることを特徴とするα−ガラク
トシダーゼ遺伝子のプロモーター。(10) A promoter for an α-galactosidase gene, characterized in that it substantially contains the DNA sequence of the promoter region shown in FIG.
とも１つ及び／又はＵＡＳ領域を含むものであることを
特徴とするα−ガラクトシダーゼ遺伝子のプロモーター
。(11) A promoter of an α-galactosidase gene, characterized in that it contains at least one TATA box and/or a UAS region shown in FIG.
列からなることを特徴とするシグナル配列。 【遺伝子配列があります】(12) A signal sequence comprising a base sequence corresponding to the amino acid sequence represented by the following formula. [There is a gene sequence]
するシグナル配列。 【遺伝子配列があります】(13) A signal sequence characterized by consisting of a base sequence represented by the following formula. [There is a gene sequence]
ＯＲＦ中のシグナル配列、及び（１１）項記載のα−ガ
ラクトシダーゼプロモーターを利用して異種蛋白を分泌
させる方法。(14) A method for secreting a heterologous protein using the signal sequence in the ORF of the α-galactosidase gene shown in FIG. 3 and the α-galactosidase promoter described in section (11).
ＯＲＦ中のシグナル配列以後の構造遺伝子部分に異種遺
伝子挿入部位となる塩基配列を配してなることを特徴と
するＤＮＡ配列。(15) A DNA sequence characterized in that a base sequence serving as a heterologous gene insertion site is arranged in the structural gene portion after the signal sequence in the ORF of the α-galactosidase gene shown in FIG.
る配列を含むものであることを特徴とする請求項１４に
記載のＤＮＡ配列。 【遺伝子配列があります】(16) The DNA sequence according to claim 14, wherein the base sequence of the heterologous gene insertion site includes a sequence represented by the following formula. [There is a gene sequence]
て構築してなることを特徴とする異種蛋白分泌用ベクタ
ー。(17) A vector for secreting a heterologous protein, which is constructed using the DNA sequence according to claim 14 or 15.
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