JPH039120B2 - - Google Patents
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Description
本発明は新規な制癌性物質、更に詳細にはフソ
バクテリウム属に属する菌をを培養し、この培養
液から得られる制癌作用を有する画分を蛋白質分
解酵素による酵素処理に付して得られる制癌性物
質TF−300及びその塩に関する。更にまた、本発
明はこの制癌性物質TF−300及びその塩を製造す
る方法並びにこれを含有する制癌剤に関する。
近年各種の癌患者の治療法において、宿主の免
疫機能を亢進させ、免疫機能の助けを借りながら
制癌効果を発現させる治療法が盛んとなつてき
た。かかる療法に使用される薬剤としては、各種
細菌の菌体、菌体培養物から得られる成分、ある
いは担子菌の子実体又はその培養菌体から得られ
る多糖体が知られている。しかし嫌気性菌を培養
し、その培養液から優れた制癌作用を有する成分
の研究は少なく、特にフソバクテリウム属に属す
る菌を培養し、その培養液から得られる成分並び
にその制癌作用については未だ知られていない。
本発明者は、ヒト口腔内より分離したフソバク
テリウム属に属する菌を培養し、その培養液から
菌体を除去した上清液から採取される成分につい
てその薬理作用を調べていたところ、特定の成分
が強い制癌作用を有すること、宿主介在性あるい
は宿主の免疫力を亢進させ、免疫力の助けを借り
ながら間接的に制癌作用を発現させる作用をも有
するものであることを見いだした。そして得られ
た制癌作用を有する有効画分を更に蛋白質分解酵
素による酵素処理に付して得られる特定の成分
は、制癌作用が強く、かつ副作用が少ない等制癌
剤として好ましい性質を有することを見いだし、
本発明を完成した。
本発明で利用される菌としては、菌を培養した
上清液から得られる制癌作用を有する画分を蛋白
質分解酵素による酵素処理に付せば制癌性物質
TF−300を生成するフソバクテリウム属に属する
菌であればよく、好適なものとしてはフソバクテ
リウム・ヌクレアタムが挙げられる。具体的に
は、例えばフソバクテリウム・ヌクレアタムTF
−031（FERM−Ｐ No.5077、ATCC−31647）お
よび微生物学の一般常識としてその性質を有する
菌株、すなわち自然変異株あるいは人工的に改良
された菌株等が利用される。
フソバクテリウム・ヌクレアタムTF−031の菌
学的性状を記載すれば以下のとおりである。
(1) 形態
細胞の形：紡錘形（第１図）
細胞の多形状の有無：なし
運動性の有無：なし
胞子の有無：なし
グラム染色：グラム陰性
抗酸性：陰性
(2) 培地における生育状態
TF−ａ寒天平板及び斜面培地
外形：円形
大きさ：約１mm
隆起：半球状
構造：露滴状
表面：平滑
辺縁：平滑
色：乳黄白色
透明度：不透明
TF−ａ液体培地
発育の程度：旺盛
濁り：凝塊
沈殿：なし
表面の発育：なし、約５mmまでは発育なし
ガス：なし
(3) 生理学的性質
硫化水素の生成：＋
硝酸塩の還元：−
酪酸の生成：＋
インドールの生成：＋
ウレアーゼー：−
カタラーゼ：−
デンプンの加水分解：−
酸素に対する態度：嫌気性
アンモニアの生成：＋
炭酸ガスの生成：＋
生育の範囲：PH５〜8.5
温度30〜45℃
糖からのガスの生成
Ｌ−アラビノース（−）、Ｄ−キシロース
（−）、Ｄ−グルコース（−）、Ｄ−マンノー
ス（−）、Ｄ−フラクトース（−）、Ｄ−ガラ
クトース（−）、麦芽糖（−）、シヨ糖（−）、
トレハロース（−）、ソルビツト（−）、アン
ニトール（−）、イノシツト（−）、グリセリ
ン（−）、デンプン（−）
以上の諸性状をバージーズ・マニユアル・オ
ブ・デイタミネイテイブ・バクテリオロジー第８
版に照らして検討すると、本菌株はフソバクテリ
ウム・ヌクレアタム（Fusobacterium
nucleatum）に酷似し、これに属する。
つぎに本発明の制癌性物質TF−300の製造法の
一例を図式化して説明すれば、次のとおりであ
る。
(1) 培養及び培養液から制癌作用を有する画分の
分離
菌の培養
｜
培養液
｜
上清液
｜
親水性有機溶媒→｜
｜
放置
｜
可溶部← 分離
｜
沈殿物
｜←水
PHによる分割
｜
制癌作用を有する画分の採取
(2) 酵素処理及び目的物の採取
上記により分割された画分
｜
水又は緩衝液に溶解又は懸濁
蛋白質分解酵素→｜
酵素処理
｜
（不溶部←分離）
｜
可溶部
｜
TF−300の採取
上記の製造法を具体的に示すと次のとおりであ
る。
(1) 培養及び培養液から制癌作用を有する画分の
分離工程
(a) 培養
フソバクテリウム属に属する菌の培養は、通常
の嫌気性菌の培養方法によつて行われる。即ち、
牛の脳、心臓抽出物、各種ペプトン類等の窒素
源；イースト・エクストラクト等のビタミン源；
塩化ナトリウム等の無機塩類；グルコース、ラク
トース等の炭素源；Ｌ−シスチン、亜硫酸ナトリ
ウム、チオグリコレート・ナトリウム等の還元剤
を含むような培地を水酸化ナトリウムでPH６〜
8.5好ましくは6.5〜7.5に調整し、菌を植えつけ、
嫌気的条件下、30〜42℃好ましくは32〜37℃で１
〜５日、好ましくは１〜４日静置あるいは撹拌培
養を行う。あるいは１〜２日、35〜42℃好ましく
は36〜38℃で培養後25〜35℃で更に１〜４日培養
してもよい。特に、下記成分表に記載の培地（以
下TF培地と称する）を使用するのが好ましいい。
しかし、窒素源として、牛の脳、心臓抽出物のブ
レイン・ハート・インヒユージヨンは必ずしも必
要ではなく、牛の心臓抽出物であるハート・イン
ヒユージヨン、牛肉エキス、魚肉エキス、トウモ
ロコシより抽出されたコーンステイプリカ等を代
用してもよく、また各種ペプトンにおいてプロテ
オース・ペプトン、フアイトン・ペプトンは必ず
しも必要ではなく、またトリプトケース・ペプト
ンをポリペプトンで代用することもできる。
尚、寒天を使用しないときは撹拌培養を行うの
が好ましい。
The present invention provides a novel anticancer substance, more specifically, a novel anticancer substance, which is obtained by culturing bacteria belonging to the genus Fusobacterium and subjecting the fraction having anticancer activity obtained from the culture solution to enzymatic treatment with a proteolytic enzyme. This invention relates to anticancer substance TF-300 and its salt. Furthermore, the present invention relates to a method for producing the anticancer substance TF-300 and its salt, and an anticancer drug containing the same. BACKGROUND ART In recent years, treatments for various cancer patients that enhance the host's immune function and exert anticancer effects with the help of the immune function have become popular. Known drugs used in such therapy include bacterial cells of various bacteria, components obtained from bacterial cell cultures, and polysaccharides obtained from the fruiting bodies of basidiomycetes or their cultured cells. However, there is little research on components that have excellent anticancer effects from the culture fluid obtained by culturing anaerobic bacteria, and in particular, there is still little research on the components obtained from the culture fluid obtained by culturing Fusobacterium bacteria and their anticancer effects. unknown. The present inventor cultivated bacteria belonging to the genus Fusobacterium isolated from the human oral cavity, and investigated the pharmacological effects of the components collected from the supernatant after removing the bacterial cells from the culture solution. It has been discovered that the drug has a strong anticancer effect, and that it also has the effect of increasing the host-mediated or host immunity and indirectly expressing the anticancer effect with the help of the immune force. The specific component obtained by further subjecting the resulting effective fraction with anticancer activity to enzymatic treatment with proteolytic enzymes has favorable properties as an anticancer drug, such as strong anticancer activity and few side effects. Found,
The invention has been completed. The bacteria used in the present invention can produce anti-cancer substances by subjecting the fraction with anti-cancer activity obtained from the supernatant of culturing the bacteria to enzymatic treatment with proteolytic enzymes.
Any bacterium belonging to the genus Fusobacterium that produces TF-300 may be used, and a preferred example is Fusobacterium nucleatum. Specifically, for example, Fusobacterium nucleatum TF
-031 (FERM-P No. 5077, ATCC-31647) and as a general knowledge in microbiology, strains having the same properties, such as natural mutant strains or artificially improved strains, are used. The mycological properties of Fusobacterium nucleatum TF-031 are as follows. (1) Morphology Cell shape: spindle-shaped (Fig. 1) Presence or absence of polymorphism of cells: None Presence or absence of motility: None Presence or absence of spores: None Gram staining: Gram negative Acid-fastness: Negative (2) Growth status in medium TF -a Agar plate and slant medium External shape: Circular Size: Approximately 1 mm Protuberance: Hemispherical structure: Dewdrop-shaped surface: Smooth Edge: Smooth Color: Milky white Transparency: Opaque TF-a liquid medium Growth level: Strong turbidity : Coagulation precipitation: None Surface growth: None, no growth up to about 5 mm Gas: None (3) Physiological properties Hydrogen sulfide production: + Nitrate reduction: - Butyric acid production: + Indole production: + Urease: - Catalase: - Hydrolysis of starch: - Attitude towards oxygen: Anaerobic Production of ammonia: + Production of carbon dioxide: + Growth range: PH5-8.5 Temperature 30-45°C Production of gas from sugar L-arabinose (- ), D-xylose (-), D-glucose (-), D-mannose (-), D-fructose (-), D-galactose (-), maltose (-), sucrose (-),
Trehalose (-), sorbitate (-), annitol (-), inosyte (-), glycerin (-), starch (-)
When considered in light of the edition, this strain is Fusobacterium nucleatum (Fusobacterium nucleatum).
nucleatum) and belongs to this group. Next, an example of the method for producing the anticancer substance TF-300 of the present invention will be schematically explained as follows. (1) Separation of fractions with anticancer activity from culture and culture solution Cultivation of bacteria | Culture solution | Supernatant | Hydrophilic organic solvent → | | Standing | Soluble part ← Separation | Precipitate | ← Water Depends on PH Division | Collection of fractions with anticancer activity (2) Enzyme treatment and collection of target product Fractions separated as above | Dissolved or suspended in water or buffer Proteolytic enzyme → | Enzyme treatment | (Insoluble part ← Separation) | Soluble part | Collection of TF-300 The above manufacturing method is specifically shown below. (1) Step of culturing and separating a fraction having anticancer activity from the culture solution (a) Cultivation The cultivation of bacteria belonging to the genus Fusobacterium is carried out by the usual culture method for anaerobic bacteria. That is,
Nitrogen sources such as cow brain, heart extract, various peptones; Vitamin sources such as yeast extract;
A medium containing inorganic salts such as sodium chloride; carbon sources such as glucose and lactose; and reducing agents such as L-cystine, sodium sulfite, and sodium thioglycollate is diluted with sodium hydroxide to pH 6~
Adjust to 8.5 preferably 6.5 to 7.5, inoculate the bacteria,
1 at 30-42℃ preferably 32-37℃ under anaerobic conditions.
Allow to stand or culture with stirring for ~5 days, preferably 1 to 4 days. Alternatively, after culturing at 35-42°C, preferably 36-38°C, for 1-2 days, the culture may be further cultured at 25-35°C for 1-4 days. In particular, it is preferable to use a medium (hereinafter referred to as TF medium) described in the ingredient list below.
However, as a nitrogen source, it is not always necessary to use brain heart intake, which is an extract of cow's brain and heart. Proteose peptone and phitone peptone are not necessarily necessary among various peptones, and tryptocase peptone can also be substituted with polypeptone. Incidentally, when agar is not used, it is preferable to perform stirring culture.
【表】
(b) 培養液から上清液の採取（菌体の除去）
上で得た培養液から菌体を除去して上清液を得
る。菌体の除去は常法、例えば遠心分離、ハイフ
ロスーパーセル等の過助剤を用いる過法を採
取できるが、特に遠心分離法は操作、菌の除去度
合、上清液の収量の点で好ましい。
(c) 制癌作用を有する有効画分の分離
上で得られた上清液に親水性有機溶媒を加え
て、生ずる沈殿物を採取する。この際の上清液は
PH1.5〜７好ましくはPH２付近（PH1.5〜2.5）に調
整する。親水性有機溶媒としては、例えばエタノ
ール、メタノール等のアルコール類、アセトン等
のケトン類が挙げられるが、アルコール類特にエ
タノールが最もよい結果を与える。この親水性有
機溶媒はその濃度が30〜80％（容量比）、好まし
くは50〜80％（容量比）になるように添加するの
が好適である。親水性有機溶媒を加えた後、低
温、好ましくは約４〜５℃の温度で数時間〜数日
間放置し、沈殿物の生成を完結させる。
このようにして生じた沈殿物をデカンテーシヨ
ン、遠心分離、過等の通常の操作で分離する。
次いでこの沈殿物を一般には５〜20倍量の水を加
え、PHにより分割し有効画分を得る。例えばPH
7.5〜８に調整し、所望により不溶部を除去した
後、PH４付近（PH3.5〜4.5）に調整して得られる
水不溶部を遠心分離、過等の通常の方法で水不
溶部を採取する。あるいはPH7.5〜８に調整し、
所望により不溶部を除去した後、PH６付近（PH
5.5〜6.5）に調整して得られる水不溶部を常法に
より分離採取してもよく、更にはその水可溶部を
PH４付近（PH3.5〜4.5）に調整して得られる沈殿
物を常法により離採取してもよい。上記のように
して得られる画分の水不溶部あるいは沈殿物を次
の酵素処理及び目的物の採取工程に付す。
(2) 酵素処理及び目的物の採取工程
まず、上記の如くして得られた制癌作用を有す
る画分を水または緩衝液に溶解又は懸濁し、蛋白
質分解酵素を加え、常法に従つて酵素処理を行
う。
蛋白質分解酵素としては、プロナーゼ、パパイ
ン、トリプシンおよびキモトリプシン等が挙げら
れ、好ましくはプロナーゼおよびトリプシンが挙
げられる。酵素処理にあたつて、あるいは酵素処
理中、水溶液をPH７〜８に調整保持するのが好ま
しく、そのためには水酸化ナトリウム、水酸化カ
リウム、炭酸ソーダ、重炭酸ソーダ等が用いられ
る。また、酵素処理中、反応液の腐敗を防止する
ために、クロロホルム、トルエン等の有機溶媒を
少量添加するのが望ましい。そして、酵素の使用
量は、通常は酵素処理に付す粉末（固体）に対し
て、約１〜２％（重量比）付近の量が使用され
る。
上記酵素処理は通常30〜40℃にて１〜72時間、
好ましくは24〜48時間行う。また、例えば粉末
（固体）に対して酵素約１％（重量比）を加えて、
１〜24時間酵素処理を行い、更に約１％（重量
比）の酵素を加えて酵素処理を行つてもよい。
上記酵素処理後、所望により遠心分離、過等
の操作により不溶物を除去した水可溶部から制癌
性物質TF−300の画分を採取する。この水可溶部
からTF−300の画分を採取するには、例えばPHに
よる分割法、親水性有機溶媒による沈殿分別法イ
オン交換体による分割法および限外過等を１つ
以上組み合わせて処理すればよい。あるいはこれ
ら１つ以上の操作を２回くり返し行つてもよい。
具体的にその採取方法を例示すれば、上記水可溶
部を、好ましくはPH2.5以下に調整し（所望によ
りトリクロロ酢酸を添加してもよい）生ずる沈殿
物を除去し、可溶部に親水性有機溶媒、例えばア
ルコールを30〜80％（容量比）、好ましくは60〜
80％（容量比）になるように加え、生ずる目的物
の画分の沈殿物を採取し、所望により、ついでこ
の沈殿物を、例えばダウエツクス１−ｘ（商品
名）、アンバーライトIRA−400（商品名）等の強
塩基性陰イオン交換体等で処理して（この操作は
数回行つてもよい）その非吸着画分を採取し、常
法によつて濃縮、乾燥あるいは親水性有機溶媒に
よる沈殿法等の処理をすれば、本発明の制癌性物
質TF−300が得られる。
上記のようして得られる制癌性物質TF−300の
性状は次のとおりである。
(イ) 白灰色ないし淡褐色の粉末。
(ロ) マウスのエールリツヒ腹水型癌、エールリツ
ヒ結節型癌、ザルコーマ180癌細胞およびＢ−
16メラノーマ癌細胞の増殖を阻止し、免疫賦活
作用を有する。
(ハ) 水に溶解し、メタノール、エタノール、アセ
トン、ベンゼン、クロロホルム、酢酸エチル、
ジエチルエーテルに不溶。
(ニ) 明確な融点を示さず、約180℃より分解を始
め、195℃以上で著しく分解する。
(ホ) KBr錠剤法による赤外線吸収スペクトルは、
3500〜3300、2920、2850、1660〜1620、1580〜
1540、1460〜1400、1380〜1360、1120、1080〜
1020、970および820〜800cm-1の近傍に吸収帯
を有する。
(ヘ) PH７の水溶液の紫外線吸収スペクトルは吸収
末端に強い吸収があり、また246〜280nmの近
傍に吸収を示す。
(ト) モーリツシユ反応、フエノール硫酸反応、ア
ンスロン硫酸反応、インドール塩酸反応、ロウ
リー・フオリン反応は陽性、ニンヒドリン反応
は陰性。
(チ) 元素分析値
Ｃ：38％〜47％ Ｈ：５％〜７％ Ｎ：１％〜
４％
(リ) フエノール硫酸法による糖の含有率は約16％
〜60％（グルコース換算）、およびロウリー・
フオリン法による蛋白質の含有率は、約10％以
下（牛血清アルブミン換算）である。
(ヌ)ヌ） 分子量
数1000以上であるが、特定は極めて困難であ
る。
上記のようにして得られた制癌性物質TF−300
は、常法に従つて医薬上許容される非毒性塩とし
てもよい。具体的には、例えばナトリウム塩、カ
リウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、
カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩等が挙げら
れる。
次に、本発明の制癌性物質の薬理作用を示せば
次のとおりである。尚、以下の実験においては、
上記(1)−ｃの上清液に親水性有機溶媒を加えて得
られた沈殿物のPHによる分割において、その沈殿
物をPH４付近に調整して得られる水不溶部〔実施
例１−(3)〕、PH６付近に調整して得られる火不溶
部〔実施例２−(1)〕、PH６付近に調整して得られ
る水可溶部を更にPH４付近に調整して得られる沈
殿物〔実施例２−(2)〕をそれぞれ使用して蛋白質
分解酵素による酵素処理に付して得られたものを
それぞれTF−310、TF−320及びTF−330とし、
また酵素処理して得た上記TF−310を限外過に
付して得られた精製TF−310〔実施例８−(4)〕を
TF−310（精）として示した。
(1) 免疫賦活作用
一群３匹のICR系マウスを用い、被検物質を生
理食塩水に溶解させ、その溶液0.2mlを腹腔内投
与した。投与24時間後にPerikan Drawing
Ink17Black（ギユンター・ワグナー社製）１mlと
ゼラチン３％含有生理食塩水２mlを混合して調製
したカーボン浮遊液0.2mlをマウス尾静脈から注
入し、注入後１，５，10および15分後に眼窩から
ヘパリン被覆ヘマトクリツト毛細管を用いて血液
0.02mlを採取し、直ちに0.1％炭酸ナトリウム水
溶液1.6mlに希釈溶血させ、これを波長675nmで
比色し貧食係数（phagocytotic index）：Ｋ値を
Halpernらの数式により求めた。
また対照群には生理食塩水0.2mlを投与した。
Ｋ＝log Co−log ｃ／ｔ−to
（Co＝to時の血中炭末量、Ｃ＝ｔ時の血中炭
末量）
その結果は表−１のとおりである。[Table] (b) Collection of supernatant from culture solution (removal of bacterial cells) Remove bacterial cells from the culture solution obtained above to obtain supernatant. Bacterial cells can be removed by conventional methods, such as centrifugation or filtration using a supernatant such as Hyflo Super Cell, but centrifugation is particularly preferable in terms of operation, degree of bacterial removal, and yield of supernatant. . (c) Separation of effective fraction with anticancer activity Add a hydrophilic organic solvent to the supernatant obtained above and collect the resulting precipitate. The supernatant liquid at this time is
Adjust to PH1.5-7, preferably around PH2 (PH1.5-2.5). Examples of hydrophilic organic solvents include alcohols such as ethanol and methanol, and ketones such as acetone, but alcohols, particularly ethanol, give the best results. This hydrophilic organic solvent is suitably added so that its concentration is 30 to 80% (volume ratio), preferably 50 to 80% (volume ratio). After adding the hydrophilic organic solvent, it is left to stand at a low temperature, preferably at a temperature of about 4 to 5°C, for several hours to several days to complete the formation of a precipitate. The precipitate thus formed is separated by conventional procedures such as decantation, centrifugation, filtration, etc.
Next, generally 5 to 20 times the amount of water is added to this precipitate, and the fraction is divided based on pH to obtain an effective fraction. For example, PH
After adjusting the pH to 7.5 to 8 and removing the insoluble portion as desired, the water insoluble portion obtained by adjusting the pH to around 4 (PH3.5 to 4.5) is collected using a normal method such as centrifugation or filtration. do. Or adjust the pH to 7.5-8,
After removing the insoluble portion as desired, the pH is adjusted to around 6 (PH
5.5 to 6.5), and the water-insoluble part obtained can be separated and collected by a conventional method, and furthermore, the water-soluble part can be collected by
The precipitate obtained by adjusting the pH to around 4 (PH 3.5 to 4.5) may be separated and collected by a conventional method. The water-insoluble portion or precipitate of the fraction obtained as described above is subjected to the following enzyme treatment and target product collection steps. (2) Enzyme treatment and target product collection process First, the fraction with anticancer activity obtained as described above is dissolved or suspended in water or a buffer solution, a protease is added, and the mixture is treated according to a conventional method. Perform enzyme treatment. Examples of the protease include pronase, papain, trypsin, and chymotrypsin, with preference given to pronase and trypsin. In or during the enzyme treatment, it is preferable to adjust and maintain the pH of the aqueous solution at 7 to 8, and for this purpose, sodium hydroxide, potassium hydroxide, soda carbonate, sodium bicarbonate, etc. are used. Furthermore, during enzyme treatment, it is desirable to add a small amount of an organic solvent such as chloroform or toluene to prevent spoilage of the reaction solution. The amount of enzyme used is usually about 1 to 2% (weight ratio) based on the powder (solid) to be subjected to enzyme treatment. The above enzyme treatment is usually carried out at 30-40℃ for 1-72 hours.
Preferably it is carried out for 24 to 48 hours. Also, for example, by adding about 1% (weight ratio) of enzyme to the powder (solid),
Enzyme treatment may be performed for 1 to 24 hours, and further enzyme treatment may be performed by adding about 1% (weight ratio) of enzyme. After the above-mentioned enzyme treatment, a fraction of the anticancer substance TF-300 is collected from the water-soluble portion from which insoluble matter is removed by centrifugation, filtration, etc., if desired. To collect the TF-300 fraction from this water-soluble part, a combination of one or more of the following methods may be used, such as PH separation method, precipitation fractionation using a hydrophilic organic solvent, ion exchanger separation method, and ultrafiltration. do it. Alternatively, one or more of these operations may be repeated twice.
To give a specific example of the collection method, the water-soluble part is preferably adjusted to PH2.5 or less (trichloroacetic acid may be added if desired), the resulting precipitate is removed, and the soluble part is Hydrophilic organic solvent, e.g. alcohol 30-80% (volume ratio), preferably 60-80%
80% (volume ratio), collect the precipitate of the resulting fraction of the target product, and if desired, add this precipitate to, for example, Dowex 1-x (trade name), Amberlite IRA-400 ( Treat with a strong basic anion exchanger such as (trade name) (this operation may be repeated several times), collect the non-adsorbed fraction, and concentrate and dry it using a conventional method or dissolve it in a hydrophilic organic solvent. The anticancer substance TF-300 of the present invention can be obtained by a precipitation method or the like. The properties of the anticancer substance TF-300 obtained as described above are as follows. (a) White-gray to light brown powder. (b) Mouse Ehrrich ascites-type carcinoma, Ehrrich's nodule-type carcinoma, Sarcoma 180 cancer cells, and B-
16 It inhibits the proliferation of melanoma cancer cells and has immunostimulatory effects. (c) Dissolved in water, methanol, ethanol, acetone, benzene, chloroform, ethyl acetate,
Insoluble in diethyl ether. (d) It does not exhibit a clear melting point, and begins to decompose at about 180°C, and significantly decomposes at temperatures above 195°C. (e) The infrared absorption spectrum obtained by the KBr tablet method is
3500~3300, 2920, 2850, 1660~1620, 1580~
1540, 1460~1400, 1380~1360, 1120, 1080~
It has absorption bands near 1020, 970 and 820-800 cm -1 . (f) The ultraviolet absorption spectrum of an aqueous solution with a pH of 7 has strong absorption at the absorption end and also shows absorption in the vicinity of 246 to 280 nm. (G) Moritsch reaction, phenol sulfuric acid reaction, Anthrone sulfuric acid reaction, indole-hydrochloric acid reaction, Lowry-Follin reaction are positive, and ninhydrin reaction is negative. (H) Elemental analysis value C: 38% to 47% H: 5% to 7% N: 1% to
4% (li) Sugar content by phenol sulfuric acid method is approximately 16%
~60% (glucose equivalent), and Lowry
The protein content determined by the phorin method is approximately 10% or less (calculated as bovine serum albumin). (nu)nu) Molecular weight: More than a few thousand, but it is extremely difficult to identify. Anticancer substance TF-300 obtained as above
may be converted into a pharmaceutically acceptable non-toxic salt according to a conventional method. Specifically, for example, alkali metal salts such as sodium salts and potassium salts, magnesium salts,
Examples include alkaline earth metal salts such as calcium salts. Next, the pharmacological effects of the anticancer substance of the present invention are as follows. In addition, in the following experiment,
In the separation by pH of the precipitate obtained by adding a hydrophilic organic solvent to the supernatant liquid of (1)-c above, the water-insoluble part obtained by adjusting the precipitate to around PH4 [Example 1-( 3)], the fire-insoluble part obtained by adjusting the pH to around 6 [Example 2-(1)], and the precipitate obtained by further adjusting the water-soluble part obtained by adjusting the pH to around 6 to around 4 [ The products obtained by subjecting Example 2-(2) to enzymatic treatment with a proteolytic enzyme were designated as TF-310, TF-320 and TF-330, respectively.
In addition, purified TF-310 [Example 8-(4)] obtained by subjecting the above TF-310 obtained by enzyme treatment to ultrafiltration was used.
Shown as TF-310 (Semi). (1) Immune stimulatory effect Using a group of three ICR mice, the test substance was dissolved in physiological saline, and 0.2 ml of the solution was administered intraperitoneally. Perikan Drawing 24 hours after administration
0.2 ml of a carbon suspension prepared by mixing 1 ml of Ink17Black (manufactured by Guilnter Wagner) and 2 ml of physiological saline containing 3% gelatin was injected into the mouse tail vein, and 1, 5, 10, and 15 minutes after injection, the carbon suspension was injected into the mouse via the orbit. Blood was collected using heparin-coated hematocrit capillary tubes.
Collect 0.02ml, immediately dilute it with 1.6ml of 0.1% sodium carbonate aqueous solution, hemolyze it, compare the color at a wavelength of 675nm, and calculate the phagocytotic index (K value).
It was calculated using the formula of Halpern et al. In addition, 0.2 ml of physiological saline was administered to the control group. K=log Co-log c/t-to (Co=to amount of charcoal in the blood, C=blood charcoal amount at t) The results are shown in Table-1.
【表】
表−１で明らかなように、対照群に比し、本発
明の目的物質投与群は網内系マクロフアージが活
性化され正常マウスの細胞性免疫が増大した。
(2) 制癌作用
(イ) エールリツヒ腹水型腫瘍における抗腫瘍効果
ICR系マウス（雌、６週令）にエールリツヒ
腹水型癌細胞をマウス１匹当り１×105個腹腔
内接種した。ついで被検物質を生理食塩水に溶
解させ、その溶液0.2mlを癌細胞接種後１日目
から、１日１回、７日間連続腹腔内投与した。
また対照群には生理食塩水0.2ml／１回を同様
に投与した。
その結果は表−２のとおりである。
Ｔ／Ｃ＝投与群の生存日数／対照群の生存日数×10
0（％）[Table] As is clear from Table 1, the reticuloendothelial system macrophages were activated and the cell-mediated immunity of normal mice was increased in the target substance administration group of the present invention compared to the control group. (2) Anticancer effect (a) Antitumor effect on Ehrlitsu ascites tumor ICR mice (female, 6 weeks old) were intraperitoneally inoculated with 1×10 5 Ehrlitsu ascites cancer cells per mouse. Next, the test substance was dissolved in physiological saline, and 0.2 ml of the solution was intraperitoneally administered once a day for 7 consecutive days starting from the first day after inoculation of the cancer cells.
In addition, to the control group, 0.2 ml of physiological saline was administered once. The results are shown in Table-2. T/C = Survival days of treatment group/Number of survival days of control group x 10
0 (%)
【表】
(ロ) ザルコーマ180癌細胞に対する抗腫瘍効果
ICR系マウス（雌、６週令）にザルコーマ
180癌細胞をマウス一匹当り１×107個腋下部皮
下に移殖した。次いで、被検物質を生理食塩水
又は５％ブドウ糖水溶液に溶解させ、その溶液
0.2mlを癌細胞移殖後１日目から、１日１回、
７日間連続静脈内または筋肉内投与した。また
対照群には、５％ブドウ糖水溶液又は生理食塩
水0.2ml／回を同様に投与した。その結果を表
−３に示す。[Table] (b) Antitumor effect against Sarcoma 180 cancer cells Sarcoma was applied to ICR mice (female, 6 weeks old)
180 cancer cells were transplanted subcutaneously into the axillary region at 1×10 7 cells per mouse. Next, the test substance is dissolved in physiological saline or 5% glucose aqueous solution, and the solution
0.2ml once a day from the first day after cancer cell transplantation.
It was administered intravenously or intramuscularly for 7 consecutive days. In addition, to the control group, 0.2 ml/time of 5% glucose aqueous solution or physiological saline was administered in the same manner. The results are shown in Table-3.
【表】【table】
【表】
を示す。
(ハ) エールリツヒ結節型腫瘍における抗腫瘍効果
ICR系マウス（雌、６週令）にエールリツヒ癌
細胞をマウス一匹当り、４×106個腋下部皮下
に移殖した。次いで、被検物質を５％ブドウ糖
水溶液に溶解させ、その溶液0.2mlを癌細胞移
殖後８日目から、１日１回、隔日５日間投与し
た。また対照群には５％ブドウ糖水溶液0.2
ml／回を同様に投与した。癌細胞移殖後15日目
に腫瘍重量を測定した。腫瘍重量は腫瘍部位の
長径ａmmと短径ｂmmをノギスにて測定し、次式
によつて求めた。
腫瘍重量＝ａ×b2／２（mg）
その結果を表−４に示す。[Table] is shown below.
(c) Antitumor effect in Ehrlichi nodular tumor
Ehrlichi cancer cells (4 x 10 6 cells per mouse) were subcutaneously transplanted into the lower axilla of ICR mice (female, 6 weeks old). Next, the test substance was dissolved in a 5% glucose aqueous solution, and 0.2 ml of the solution was administered once a day, every other day for 5 days, starting on the 8th day after cancer cell transplantation. In addition, for the control group, 5% glucose aqueous solution 0.2
ml/time was administered in the same manner. Tumor weight was measured 15 days after cancer cell transplantation. The tumor weight was determined by measuring the major axis (amm) and minor axis (bmm) of the tumor site using calipers, and using the following formula. Tumor weight = a×b 2 /2 (mg) The results are shown in Table 4.
【表】
(ニ) Ｂ−16メラノーマ癌細胞に対する抗腫瘍効果
BDF1系マウス（雄、７週令）にメラノーマ
癌細胞をマウス一匹当り１×106個腋下部皮下
に移殖した。次いで被検物質を生理食塩水又は
５％ブドウ糖水溶液に溶解させ、その溶液0.2
mlを癌細胞移殖後１日目から、１日１回、７日
間連続腹腔内投与するか、15日目から、１日１
回６日間連続腫瘍内投与するか、または13日目
から、１日１回６日間隔日腫瘍内へと腹腔へと
同時に投与した。また、対照群には生理食塩水
または５％ブドウ糖水溶液0.2ml／回を同様に
投与した。その結果を表−５に示す。[Table] (d) Antitumor effect on B-16 melanoma cancer cells 1×10 6 melanoma cancer cells per mouse were subcutaneously transplanted into BDF 1 strain mice (male, 7 weeks old) under the armpit. Next, the test substance is dissolved in physiological saline or 5% glucose aqueous solution, and the solution is 0.2
ml intraperitoneally once a day for 7 consecutive days from the 1st day after cancer cell transplantation, or once a day from the 15th day.
It was administered intratumorally for 6 consecutive days, or from day 13 onwards, it was administered intratumorally and intraperitoneally once a day every other day for 6 days. In addition, to the control group, physiological saline or 5% glucose aqueous solution 0.2 ml/time was administered in the same manner. The results are shown in Table-5.
【表】【table】
【表】
目の結果を示す。
(3) 急性毒性
マウス（ICR系、♀、６週令：iv投与）にお
ける制癌性物質TF−300（TF−310）、TF−310
（精）、TF−320、TF−320（精）、TF−330、
TF−330（精））LD50値はいずれも10mg／Kg以
上であつた。
以上の薬理実験から明らかなように本発明方法
によつて得られた制癌性物質TF−300は、制癌剤
として有用なものであり、各種の癌疾患に使用さ
れ効果が期待されるものである。
本発明の制癌性物質TF−300はそのまま、ある
いは非毒性塩として、常法により経口、注射、坐
薬等の剤形として利用される。経口剤としては、
種々の賦形剤を含んでいてもよく、カプセル剤、
錠剤、散剤、顆粒剤とすることができる。また注
射剤としては、皮下、筋肉内、静脈内注射剤のい
ずれでもよく、懸濁液、溶液もしくは使用時溶解
させる粉末等の剤形が用いられる。また注射剤に
は食塩、ブドウ糖又は局所麻酔剤を含んでいても
よい。
本発明の制癌性物質TF−300及びその非毒性塩
を患者に使用する場合、その投与量は患者の症状
に応じて適宜選択されるが、一般に成人では
0.005〜50mg／Kgを１日１〜数回に分け投与する
のが好ましく、投与方法としては経口又は皮下、
筋肉内、静脈内もしくは患部への注射によるのが
好ましい。
次に本発明の実施例及び製剤例を挙げて説明す
る。
実施例 １
(1) 10のジヤー・フアメンター（丸菱理化研究
所製）に、１の蒸留水に対し、トリプトケー
ス・ペプトン17ｇ・ハート・インヒユージヨン
10ｇ、イースト・エクストラクト３ｇ、食塩
7.5ｇ、グルコース12ｇ、ラクトース10ｇ、亜
硫酸ナトリウム0.1ｇおよびチオグリコレー
ト・ナトリウム0.5ｇを含有するTF−ｅ倍地８
を加え、120℃で30分間滅菌する。培養液に、
冷却後窒素ガスを100ml／分にて１時間通気す
る。
あらかじめ上述のTF−ｅ培地に前培養した
フソバクテリウム・ヌクレアタムTF−031
（FERM−Ｐ No.5077、ATCC−31647）の前
培養液１を滅菌条件下で接種する。培養は37
℃で窒素ガスを流入（65ml／分）しながら、撹
拌（30rpm）下３日間行う。培養終了後、培養
液にセライト160ｇおよびセルロースパウダー
80ｇを加え撹拌し、これを減圧下で過し除菌
した培養液上清7.8を得た。
(2) (1)で得られた培養液上清7.8に濃塩酸117ml
を加え、PH2.0に調整した後、エタノール11.7
を加え、60％エタノール溶液とし、４℃で24
時間放置する。次いでデカンテーシヨンにて溶
液部分を除き、沈殿物を採取するために４℃で
遠心分離（６×103rpm、５分）する。この沈
殿物をPH2.0の60％エタノール水妄液400ml、エ
タノール400ml、アセトン200mlおよびジエチル
エーテル200mlで順次洗浄した後減圧乾燥して
粉末3.9ｇを得る。
(3) (2)で得られた粉末を水25mlに懸濁し、1N−
水酸化ナトリウム水溶液を加えPH7.5〜8.0とな
し、室温で30分間撹拌した後、1N−塩酸を加
えPH4.0に調整する。次いで、氷冷下２時間撹
拌した後、遠心分離（１×104rpm、10分）し、
沈殿物と上清液を分離する。この沈殿物をPH
4.0に調整した水10mlで洗浄し、沈殿物と洗浄
液を遠心分離（１×104rpm、10分）する。沈
殿物をエタノール10mlで洗浄した後、減圧乾燥
して制癌性物質TF−210を1.5ｇ得る。
このものは、次のような性状を有する。
(イ) 白灰色ないし淡褐色の粉末。
(ロ) マウスのエールリツヒ腹水型癌、エールリ
ツヒ結節型癌、ザルコーマー180癌細胞およ
びＢ−16メラノーマ癌細胞の増殖を阻止し、
免疫賦活作用を有する。
(ハ) メタノール、エタノール、アセトン、ベン
ゼン、クロロホルム、酢酸エチル、ジエチル
エーテルに不溶。
(ニ) 明確な融点を示さず、約160℃〜235℃で分
解する。
(ホ) KBr錠剤法による赤外線吸収スペクトル
は、3600〜3200、2950〜2920、1680〜1620、
1550〜1510、1440、1380、1240〜1220および
1120〜1020cm-1の近傍に吸収帯を有する。
（第２図）。
(ヘ) PH７での水可溶画分の水溶液の紫外線吸収
スペクトルは吸収末端に強い吸収があり、ま
た248〜265nmの近傍に吸収を示す（第３
図）。
(ト) モーリツシユ反応、フエノール硫酸反応、
アンスロン硫酸反応、インドール塩酸反応、
ロウリー・フオリン反応は陽性。
(チ) 元素分析値
Ｃ：40％〜43％ Ｈ：５％〜７％ Ｎ：９％
〜10％
(リ) PH７での水可溶画分のフエノール硫酸法に
よる糖の含有率は約５％〜25％（グルコース
換算）、およびロウリー・フオリン法による
蛋白質の含有率は約20％〜50％（牛血清アル
ブミン換算）である。
(4) (3)で得られた制癌性物質TF−210の1.5ｇを
水15mlに懸濁し、撹拌下に1N−水酸化ナトリ
ウム水溶液を加えてPH7.8に調整する。37℃に
加温し、プロナーゼＥ（科研化学製商品名；
1000000チロジン単位／ｇ）15mgを添加した後、
トルエンを数滴加えて、撹拌下、PH7.8〜8.0、
37〜40℃で24時間酵素処理を行う。処理液を遠
心分離（4000rpm、10分）し、上清液と沈殿物
を分離し、沈殿物にPH8.0に調整した水３mlを
加え、遠心分離（4000rpm、10分）し、沈殿物
と洗浄液を分離する。洗浄液に先の上清液を合
わせてこれに1N−塩酸を加えてPH2.0に調整す
れば沈殿が析出する。この溶液を５℃で12時間
放置した後、遠心分離（１×104rpm、10分）
し、上清液と沈殿物に分離し、沈殿物にPH2.0
に調整した水３mlを加え、遠心分離（１×
104rpm、10分）し、沈殿物と洗浄液を分離す
る。洗浄液に先の上清液を合わせてエタノール
を加え80％エタノール溶液とし、氷冷下で２時
間撹拌した後、遠心分離（4000rpm、10分）
し、沈殿物と上清液を分離する。沈殿物を80％
エタノール水溶液５mlおよびエタノール５mlで
順次洗浄した後、減圧乾燥して制癌性物質TF
−310の画分を327mg得る。
この粉末327mgを水５mlに溶解させ、1N−水
酸化ナトリウム水溶液を加えてPH7.0に調整し、
あらかじめ1N−水酸化ナトリウム水溶液にて
OH型に調整したアンバーライトIRA400（ロー
ム・アンド・ハアス社製商品名）45mlを充填し
たカラムにかけ、水200mlを流した際のカラム
通過液を全て合わせて、1N−塩酸をを加えて
PH7.0に調整する。これを減圧下に濃縮し孔径
0.3μmのミリポアフイルター（日本ミリポア・
リミテツド製商品名）にて過、次いで凍結乾
燥して制癌性物質TF−310の凍結乾燥品を210
mg得る。
このものは次のような性状を有する。
(イ) 白灰色ないし淡褐色の粉末。
(ロ) マウスのエールリツヒ腹水型癌、エールリ
ツヒ結節型癌、ザルコーマ180癌細胞および
Ｂ−16メラノーマ癌細胞の増殖を阻止し免疫
賦活作用を有する。
(ハ) 水に溶解し、メタノール、エタノール、ア
セトン、ベンゼン、クロロホルム、酢酸エチ
ル、ジエチルエーテルに不溶。
(ニ) 明確な融点を示さず、約180℃より分解を
始め、195℃以上で著しく分解する。
(ホ) KBr錠剤法による赤外線吸収スペクトル
は、3500〜3300、2920、2850、1660〜1620、
1580〜1540、1460〜1400、1380〜1360、
1120、1080〜1020、970および820〜800cm-1
の近傍に吸収帯を有する（第４図）。
(ヘ) PH７の水溶液の紫外線吸収スペクトルは、
吸収末端に強い吸収があり、また246〜259の
近傍に吸収を示す（第５図）。
(ト) TSK−GELG3000SW（東洋曹達株式会社
の商品名、カラム、：7.5mmφ×600mm×２）
による高速液体クロマトグラム（溶出液：PH
７の0.1モルリン酸緩衝液、流速0.8ml／分、
室温）は220nmの紫外線吸光度測定において
は、溶媒先端部分、28〜32分付近、43〜64分
付近にかけて吸収を有し、260nmの紫外線吸
光測定においては溶媒先端部分、42〜60分付
近にかけて吸収を有する（第６図）。
(チ) モーリツシユ反応、フエノール硫酸反応、
アンスロン硫酸反応、インドール塩酸反応、
ロウリー・フオリン反応は陽性、ニンヒドリ
ン反応は陰性。
(リ) 元素分析値
Ｃ：38.0％〜42％ Ｈ：5.0％〜７％ Ｎ：
１％〜４％
(ヌ) フエノール硫酸法による糖の含有率は、約
20％〜60％（グルコース換算）およびロウリ
ー・フオリン法による蛋白質の含有率は約10
％以下（牛血清アルブミン換算）である。
(5) 上記で得られた制癌性物質TF−310 140mgを
水50mlに溶解し、ウルトラフイルターUK−50
（東洋紙株式会社製限外過膜商品名：分画
分子量５×104）にて限外過して100倍に濃縮
する。この濃縮液を孔径0.2μmのミリポアフイ
ルター（日本ミリポアリミテツド製商品名）に
て過し、次いで凍結乾燥して制癌性物質TF
−310の精製凍結乾燥品88mgを得る。このよう
にして得られた制癌性物質TF−310の精製品は
特許請求の範囲に記載の性状を有し、糖含率
（ゲルコース換算）は約16〜30％であつた。
実施例 ２
(1) 実施例１−(2)の方法で得られた粉末3.9ｇを
水25mlで懸濁し、1N−水酸化ナトリウム水溶
液を加え、PH7.5〜8.0となし、室温で30分間撹
拌した後、1N−塩酸を加えPH6.0に調整する。
次いで氷冷下、２時間撹拌した後、遠心分離
（１×104rpm、10分）し、沈殿物と上清液を分
離する。この沈殿物をPH6.0に調整した水５ml
で洗浄し、沈殿物と洗浄液を遠心分離（１×
104rpm、10分）する。洗浄液は、先に得られ
た上清液と合わせて実施例３−(1)に記載する処
理に付す。一方、沈殿物をエタノール５mlで洗
浄した後、減圧乾燥して制癌性物質TF−220を
1.06ｇ得る。
このものは、次のような性状を有する。
(イ) 白灰色ないし淡褐色の粉末。
(ロ) マウスのエールリツヒ腹水型癌、エールリ
ツヒ結節型癌、ザルコーマー180癌細胞およ
びＢ−16メラノーマ癌細胞の増殖を阻止し、
免疫賦活作用を有する。
(ハ) メタノール、エタノール、アセトン、ベン
ゼン、クロロホルム、酢酸エチル、ジエチル
エーテルに不溶。
(ニ) 明確な融点を示さず、160℃〜240℃で分解
する。
(ホ) KBr錠剤法による赤外線吸収スペクトル
は、3600〜3200、2950〜2920、1680〜1620、
1550〜1510、1440、1380、1240〜1220および
1120〜1020cm-1の近傍に吸収帯を有する。
（第７図）。
(ヘ) PH７での水可溶画分の水溶液の紫外線吸収
スペクトルは吸収末端に強い吸収があり、ま
た248〜266nmの近傍に吸収を示す（第８
図）。
(ト) モーリツシユ反応、フエノール硫酸反応、
アンスロン硫酸反応、インドール塩酸反応、
ロウリー・フオリン反応は陽性。
(チ) 元素分析値
Ｃ：40％〜42％ Ｈ：５％〜７％ Ｎ：７％
〜９％
(リ) PH７での水可溶面分のフエノール硫酸法に
よる糖の含有率は約５％〜20％（グルコース
換算）、およびロウリー・フオリン法による
蛋白質の含有率は約10％以下（牛血清アルブ
ミン換算）である。
(2) (1)で得られた制癌性物質TF−220の１ｇを水
10mlに懸濁し、撹拌下に1N−水酸化ナトリウ
ム水溶液を加えてPH7.8に調整する。37℃に加
温し、プロナーゼＥ（科研化学製商品名；
1000000チロジン単位／ｇ）15mgを添加した後、
トルエンを数滴加えて、撹拌下、PH7.8〜8.0、
37〜40℃で24時間酵素処理を行う。処理液を遠
心分離（4000rpm、10分）し、上清液と沈殿物
を分離し、沈殿物にPH8.0に調整した水３mlを
加え、遠心分離（4000rpm、10分）し、沈殿物
と洗浄液を分離する。洗浄液に先の上清液を合
わせて、これに1N−塩酸を加えてPH2.0に調整
すれば沈殿が析出する。この溶液を５℃で12時
間放置した後、遠心分離（１×104rpm、10分）
し、上清液と沈殿物に分離し、沈殿物にPH2.0
に調整した水３mlを加え、遠心分離（１×
104rpm、10分）し、沈殿物と洗浄液を分離す
る。洗浄液に先の上清液を合わせてエタノール
を加え80％エタノール溶液とし、氷冷下で２時
間撹拌した後、遠心分離（4000rpm 10分）し、
沈殿物と上清液を分離する。沈殿物を80％エタ
ノール水溶液５mlおよびエタノール５mlで順次
洗浄した後、減圧乾燥して制癌性物質TF−320
の画分を163mg得る。
この粉末150mgを水５mlに溶解させ、1N−水
酸化ナトリウム水溶液を加えてPH7.0に調整し、
あらかじめ1N−水酸化ナトリウム水溶液にて
OH型に調整したアンバーライトIRA 400（ロ
ーム・アンド・ハアス社製商品名）25mlを充填
したカラムにかけ、水100mlを流した際のカラ
ム通過液を全て合わせて、1N−塩酸を加えて
PH7.0に調整する。これを減圧下に濃縮し孔径
0.3μmのミリポアフイルター（日本ミリポア・
リミテツド製商品名）にて過、次いで凍結乾
燥して制癌性物質TF−320の凍結乾燥品を110
mg得る。
このものはつぎのような性状を有する。
(イ) 白灰色ないし淡褐色の粉末。
(ロ) マウスのエールリツヒ腹水型癌の増殖を阻
止し免疫賦活作用を有する。
(ハ) 水に溶解し、メタノール、エタノール、ア
セトン、ベンゼン、クロロホルム、酢酸エチ
ル、ジエチルエーテルに不溶。
(ニ) 明確な融点を示さず、約180℃より分解を
始め、195℃以上で著しく分解する。
(ホ) KBr錠剤法による赤外線吸収スペクトル
は、3500〜3300、2920、2850、1660〜1620、
1580〜1540、1460〜1400、1380〜1360、
1120、1080〜1020、970および820〜800cm-1
の近傍に吸収帯を有する（第９図）。
(ヘ) PH７の水溶液の紫外線吸収スペクトルは、
吸収末端に強い吸収があり、また250〜
270nmの近傍に吸収を示す（第10図）。
(ト) TSK−GEL G3000SW（東洋曹達株式会社
の商品名、カラム：7.5mmφ×600mm×２）に
よる高速液体クロマトグラム（溶出液：PH７
の0.1モルリン酸緩衝液、流速0.8ml／分、室
温）は220nmの紫外線吸光度測定において
は、溶媒先端部分、28〜32分付近、43〜64分
付近にかけて吸収を有し、260nmの紫外線吸
光度測定においては溶媒先端部分、35〜56分
付近にかけて吸収を有する（第１１図）。
(チ) モーリツシユ反応、フエノール硫酸反応、
アンスロン硫酸反応、インドール塩酸反応、
ロウリー・フオリン反応は陽性、ニンヒドリ
ン反応は陰性。
(リ) 元素分析値
Ｃ：38％〜42％ Ｈ：５％〜７％ Ｎ：１％
〜４％
(ヌ) フエノール硫酸法による糖の含有率は、約
20％〜60％（グルコース換算）およびロウリ
ー・フオリン法による蛋白質の含有率は約10
％以下（牛血清アルブミン換算）である。
(3) 上記で得られた制癌性物質TF−320、100mg
を水50mlに溶解し、ウルトラフイルターUK−
50（東洋紙株式会社製限外過膜商品名：分
画分子量５×104）にて限外過して100倍に濃
縮する。この濃縮液を孔径0.2μmのミリポアフ
イルター（日本ミリポアリミテツド製商品名）
にて過し、次いで凍結乾燥して制癌性物質
TF−320の精製凍結乾燥品72mgを得る。このよ
うにして得られた制癌性物質TF−320の精製品
は特許請求の範囲に記載の性状を有し、糖含率
（グルコース換算）は約16〜30％であつた。
実施例 ３
(1) 実施例２−(1)で得られた洗浄液と上清液を合
わせた溶液に1N−塩酸を加えてPH4.0に調整し
た後、５℃以下で12時間放置する。次いで遠心
分離（１×104rpm、10分）し、沈殿物と上清
液を分離する。この沈殿物をPH4.0に調整した
水５mlで洗浄し、沈殿物と洗浄液を遠心分離
（１×104rpm、10分）する。沈殿物をエタノー
ル５mlで洗浄した後、減圧乾燥して制癌性物質
TF−230を0.48ｇ得る。
このものは、次のような性状を有する。
(イ) 白灰色ないし淡褐色の粉末。
(ロ) マウスのエールリツヒ腹水型癌、エールリ
ツヒ結節型癌、ザルコーマー180癌細胞およ
びＢ−16メラノーマ癌細胞の増殖を阻止し、
免疫賦活作用を有する。
(ハ) メタノール、エタノール、アセトン、ベン
ゼン、クロロホルム、酢酸エチル、ジエチル
エーテルに不溶。
(ニ) 明確な融点を示さず、185℃〜225℃で分解
する。
(ホ) KBr錠剤法による赤外線吸収スペクトル
は、3600〜3200、2950〜2920、1680〜1620、
1550〜1510、1440、1380、1240〜1220および
1120〜1020cm-1の近傍に吸収帯を有する。
（第１２図）。
(ヘ) PH７の水溶液の紫外線吸収スペクトルは吸
収末端に強い吸収があり、また249〜264nm
の近傍に吸収を示す（第１３図）。
(ト) モーリツシユ反応、フエノール硫酸反応、
アンスロン硫酸反応、インドール塩酸反応、
ロウリー・フオリン反応は陽性。
(チ) 元素分析値
Ｃ：42％〜45％ Ｈ：５％〜７％ Ｎ：10％
〜11％
(リ) フエノール硫酸法による糖の含有率は約５
％〜25％（グルコース換算）、およびロウリ
ー・フオリン法による蛋白質の含有率は約30
％〜60％（牛血清アルブミン換算）である。
(2) (1)で得られた制癌性物質TF−230の0.48ｇを
水５mlに懸濁し、撹拌下に1N−水酸化ナトリ
ウム水溶液を加えてPH7.8に調整する。37℃に
加温し、プロナーゼＥ（科研化学制商品名；
1000000チロジン単位／ｇ）5.0mgを添加した
後、トルエンを数滴加えて、撹拌下、PHを7.8
〜8.0、37〜40℃で24時間酵素処理を行う。処
理液を遠心分離（4000rpm、10分）し、上清液
と沈殿物を分離し、沈殿物にPH8.0に調整した
水３mlを加え、遠心分離（4000rpm、10分）
し、沈殿物と洗浄液を分離する。洗浄液に先の
上清液を合わせて、これに1N−塩酸を加えて
PH2.0に調整すれば沈殿が析出する。この溶液
を５℃で12時間放置した後、遠心分離（１×
104rpm、10分）し、上清液と沈殿物に分離し、
沈殿物にPH2.0に調整された水３mlを加え、遠
心分離（１×104rpm、10分）し、沈殿物と洗
浄液を分離する。洗浄液に先の上清液を合わせ
てエタノールを加え80％エタノール溶液とし、
氷冷下で２時間撹拌した後、遠心分離
（4000rpm、10分）し、沈殿物と上清液を分離
する。沈殿物を80％エタノール水溶液５mlおよ
びエタノール５mlで順次洗浄した後、減圧乾燥
して制癌性物質TF−330の画分を100mg得る。
この粉末100mgを水５mlに溶解させ、1N−水
酸化ナトリウム水溶液を加えてPH7.0に調整し、
あらかじめ1N−水酸化ナトリウム水溶液にて
OH型に調整したアンバーライトIRA 400（ロ
ーム・アンド・ハアス社製商品名）15mlを充填
したカラムにかけ、水60mlを流した際のカラム
通過液を全て合せて、1N−塩酸を加えてPH7.0
に調整する。これを減圧下に濃縮し、孔径
0.3μmのミリポアフイルター（日本ミリポア・
リミテツド製商品名）にて過、次いで凍結乾
燥して制癌性物質TF−330の凍結乾燥品を70mg
得る。
このものは次のような性状を有する。
(イ) 白灰色ないし淡褐色の粉末。
(ロ) マウスのエールリツヒ腹水型癌の増殖を阻
止し免疫賦活作用を有する。
(ハ) 水に溶解し、メタノール、エタノール、ア
セトン、ベンゼン、クロロホルム、酢酸エチ
ル、ジエチルエーテルに不溶。
(ニ) 明確な融点を示さず、約180℃より分解を
始め、195℃以上で著しく分解する。
(ホ) KBr錠剤法による赤外線吸収スペクトル
は、3500〜3300、2920、2850、1660〜1620、
1580〜1540、1460〜1400、1380〜1360、
1120、1080〜1020、970および820〜800cm-1
の近傍に吸収帯を有する。（第１４図）。
(ヘ) PH７の水溶液の紫外線吸収スペクトルは、
吸収末端に強い吸収があり、また250〜
260nmの近傍に吸収を示す（第１５図）。
(ト) TSK−GEL Ｇ 3000SW（東洋曹達株式会
社の商品名、カラム：7.5mmφ×600mm×２）
による高速液体クロマトグラム（溶出液：PH
７の0.1モルリン酸緩衝液、流速0.8ml／分、
室温）は220nmの紫外線吸光度測定において
は、溶媒先端部分、36〜64分付近にかけて吸
収を有し、260nmの紫外線吸光度測定におい
ては溶媒先端部分、35〜62分付近にかけて吸
収を有する（第１６図）。
(チ) モーリツシユ反応、フエノール硫酸反応、
アンスロン硫酸反応、インドール塩酸反応、
ロウリー・フオリン反応は陽性、ニンヒドリ
ン反応は陰性。
(リ) 元素分析値
Ｃ：38％〜42％ Ｈ：５％〜７％ Ｎ：１％
〜４％
(ヌ) フエノール硫酸法による糖の含有率は、約
20％〜60％（グルコース換算）およびロウリ
ー・フオリン法による蛋白質の含有率は約10
％以下（牛血清アルブミン換算）である。
(3) 上記で得られた制癌性物質TF−330 70mgを
水50mlに溶解し、ウルトラフイルターUK−50
（東洋紙株式会社製限外過膜商品名：分画
分子量５×104）にて限外過して100倍に濃縮
する。この濃縮液を孔径0.2μmのミリポアフイ
ルター（日本ミリポアリミテツド製商品名）に
て過し、次いで凍結乾燥して制癌性物質TF
−330の精製凍結乾燥品49mgを得る。このよう
にして得られた制癌性物質TF−330の精製品は
特許請求の範囲に記載の性状を有し、一般に糖
含率（グルコース換算）は約16〜30％であり、
代表的なものの、赤外線吸収スペクトルおよび
紫外線吸収スペクトルは第１７図および第１８
図のとおりであつた。
実施例 ４
(1) 10のジヤー・フアメンター（丸菱理化研究
所製）に１の蒸留水に対し、トリプトケー
ス・ペプトン17ｇ、ハート・インヒユージヨン
20ｇ、イースト・エクストラクト３ｇ、食塩
7.5ｇ、グルコース12ｇ、ラクトース10ｇ、亜
硫酸ナトリウム0.1ｇおよびチオグリコレー
ト・ナトリウム0.5ｇを含有するTF−ｄ培地８
を加え、120℃で30分間滅菌する。培養液に
冷却後、窒素ガスを100ml／分にて１時間通気
する。あらかじめ上述のTF−ｄ培地にて前培
養したフソバクテリウム・ヌクレアタムTF−
031（FERM−Ｐ No.5077、ATCC−31647）の
前培養液１を滅菌条件下で接種する。培養は
37℃、窒素ガスを流入（65ml／分）しながら、
撹拌（30rpm）下、３日間行う。培養終了後、
培養液にセライト160ｇおよびセルロースパウ
ダー80ｇを加え撹拌し、これを減圧下で過
し、除菌した培養液上清7.8を得た。
(2) (1)で得られた培養液上清7.8に濃塩酸117ml
を加え、PH2.0に調整した後、エタノール11.7
を加え、60％エタノール溶液とし、４℃で24
時間放置する。次いで、デカンテーシヨンにて
溶液部分を除き、沈殿物を採取するために４℃
で遠心分離（６×103rpm、５分）する。この
沈殿物をPH2.0の60％エタノール水溶液400ml、
エタノール400ml、アセトン200mlおよびジエチ
ルエーテル200mlで順次洗浄した後、減圧乾燥
して粉末4.5ｇを得る。
(3) (2)で得られた粉末を、それぞれ実施例１−
(3)、実施例２−(1)および実施例３−(1)と同様に
処理して、制癌性物質TF−210、TF−220およ
びTF−230をそれぞれ得る。
(4) (3)で得られた制癌性物質TF−210、TF−220
およびTF−230をそれぞれ実施例１−(4)、実施
例２−(2)および実施例３−(2)と同様に処理し
て、制癌性物質TF−310、TF−320およびTF
−330の凍結乾燥品を、それぞれ220mg、120mg
および75mgを得る。
実施例 ５
実施例１−(3)で得られた制癌性物質TF−210の
1.5ｇを、プロナーゼＥの代りにトリプシン（デ
イフコ社製）15mgを用いて酵素処理する点、およ
び酵素処理後PH２に調整した水可溶部から沈殿物
を採取する際に、80％エタノール溶液の代りに60
％エタノール溶液とする点以外は実施例１−(4)と
同様に操作し、制癌性物質TF−310の凍結乾燥品
200mgを得る。
同様にして以下の制癌性物質TF−320および
TF−330の凍結乾燥品をそれぞれ得る。[Table] Shows the results for eyes.
(3) Acute toxicity Anticancer substance TF-300 (TF-310), TF-310 in mice (ICR strain, female, 6 weeks old: iv administration)
(Precision), TF-320, TF-320 (Precision), TF-330,
TF-330 (Serious)) LD 50 values were all 10 mg/Kg or higher. As is clear from the above pharmacological experiments, the anticancer substance TF-300 obtained by the method of the present invention is useful as an anticancer agent, and is expected to be effective when used for various cancer diseases. . The anticancer substance TF-300 of the present invention can be used as it is or as a non-toxic salt in the form of oral, injection, suppository, etc. dosage forms in a conventional manner. As an oral agent,
Capsules, which may contain various excipients,
It can be made into tablets, powders, and granules. The injection may be subcutaneous, intramuscular, or intravenous, and may be in the form of a suspension, solution, or powder to be dissolved before use. The injection may also contain salt, glucose, or a local anesthetic. When administering the anticancer substance TF-300 of the present invention and its non-toxic salt to a patient, the dosage is appropriately selected depending on the patient's symptoms, but in general, for adults,
It is preferable to administer 0.005 to 50 mg/Kg in one to several divided doses a day, and administration methods include oral, subcutaneous,
Preferably, it is administered intramuscularly, intravenously or by injection into the affected area. Next, the present invention will be explained by giving examples and formulation examples. Example 1 (1) Into 10 jar fermenters (manufactured by Marubishi Rika Kenkyusho), 17 g of tryptocase peptone and heart infusion were added to 1 portion of distilled water.
10g, yeast extract 3g, salt
TF-e medium 8 containing 7.5 g, glucose 12 g, lactose 10 g, sodium sulfite 0.1 g and sodium thioglycolate 0.5 g
and sterilize at 120°C for 30 minutes. In the culture solution,
After cooling, nitrogen gas is bubbled through at 100 ml/min for 1 hour. Fusobacterium nucleatum TF-031 pre-cultured in the above-mentioned TF-e medium
(FERM-P No. 5077, ATCC-31647) preculture solution 1 is inoculated under sterile conditions. Culture is 37
C. for 3 days with nitrogen gas flow (65 ml/min) and stirring (30 rpm). After culturing, add 160g of celite and cellulose powder to the culture solution.
80 g was added and stirred, and this was filtered under reduced pressure to remove bacteria to obtain a culture supernatant 7.8. (2) Add 117ml of concentrated hydrochloric acid to 7.8ml of the culture supernatant obtained in (1).
After adding and adjusting the pH to 2.0, ethanol 11.7
Add to make a 60% ethanol solution and incubate at 4℃ for 24 hours.
Leave it for a while. Then, the solution portion was removed by decantation, and the mixture was centrifuged at 4° C. (6×10 3 rpm, 5 minutes) to collect the precipitate. This precipitate is washed successively with 400 ml of 60% ethanol solution at pH 2.0, 400 ml of ethanol, 200 ml of acetone and 200 ml of diethyl ether, and then dried under reduced pressure to obtain 3.9 g of powder. (3) Suspend the powder obtained in (2) in 25 ml of water and
Add aqueous sodium hydroxide solution to adjust the pH to 7.5-8.0, stir at room temperature for 30 minutes, then add 1N hydrochloric acid to adjust the pH to 4.0. Next, after stirring for 2 hours under ice cooling, centrifugation (1 x 10 4 rpm, 10 minutes) was carried out.
Separate the precipitate and supernatant. This precipitate has a pH of
Wash with 10 ml of water adjusted to 4.0, and centrifuge the precipitate and washing solution (1 x 10 4 rpm, 10 minutes). The precipitate was washed with 10 ml of ethanol and then dried under reduced pressure to obtain 1.5 g of anticancer substance TF-210. This material has the following properties. (a) White-gray to light brown powder. (b) Inhibits the proliferation of Ehrrich's ascites-type carcinoma, Ehrlichi's nodular-type carcinoma, Sarcomer 180 cancer cells, and B-16 melanoma cancer cells in mice;
Has immunostimulatory effect. (c) Insoluble in methanol, ethanol, acetone, benzene, chloroform, ethyl acetate, and diethyl ether. (d) It does not exhibit a clear melting point and decomposes at approximately 160°C to 235°C. (e) The infrared absorption spectrum obtained by the KBr tablet method is 3600-3200, 2950-2920, 1680-1620,
1550~1510, 1440, 1380, 1240~1220 and
It has an absorption band near 1120 to 1020 cm -1 .
(Figure 2). (f) The ultraviolet absorption spectrum of an aqueous solution of the water-soluble fraction at pH 7 has strong absorption at the absorption end, and also shows absorption near 248 to 265 nm (the third
figure). (g) Moritsch reaction, phenol sulfuric acid reaction,
Anthrone sulfuric acid reaction, indole hydrochloric acid reaction,
Lowry-Follin reaction was positive. (H) Elemental analysis value C: 40% to 43% H: 5% to 7% N: 9%
~10% (li) The water-soluble fraction at pH 7 has a sugar content of approximately 5% to 25% (glucose equivalent) by the phenol sulfuric acid method, and a protein content of approximately 20% to 25% (calculated as glucose) by the Lowry-Follin method. 50% (bovine serum albumin equivalent). (4) Suspend 1.5 g of the anticancer substance TF-210 obtained in (3) in 15 ml of water, and adjust the pH to 7.8 by adding 1N aqueous sodium hydroxide solution while stirring. Heat to 37℃, pronase E (product name manufactured by Kaken Chemical Co., Ltd.;
1000000 tyrosine units/g) after adding 15mg,
Add a few drops of toluene and, while stirring, adjust the pH to 7.8-8.0.
Perform enzyme treatment for 24 hours at 37-40 °C. Centrifuge the treated solution (4000 rpm, 10 minutes) to separate the supernatant and precipitate, add 3 ml of water adjusted to PH8.0 to the precipitate, centrifuge (4000 rpm, 10 minutes), and separate the precipitate. Separate the cleaning solution. If you combine the washing solution with the supernatant solution and add 1N hydrochloric acid to adjust the pH to 2.0, a precipitate will separate out. After leaving this solution at 5°C for 12 hours, centrifugation (1 x 10 4 rpm, 10 minutes)
The supernatant liquid and precipitate are separated, and the precipitate has a pH of 2.0.
Add 3 ml of water adjusted to
10 4 rpm, 10 minutes) and separate the precipitate and washing solution. Combine the washing solution with the supernatant, add ethanol to make an 80% ethanol solution, stir on ice for 2 hours, and then centrifuge (4000 rpm, 10 minutes).
and separate the precipitate and supernatant. 80% precipitation
After sequentially washing with 5 ml of ethanol aqueous solution and 5 ml of ethanol, the anticancer substance TF was dried under reduced pressure.
327 mg of −310 fraction is obtained. Dissolve 327 mg of this powder in 5 ml of water, add 1N aqueous sodium hydroxide solution to adjust the pH to 7.0,
In advance with 1N sodium hydroxide aqueous solution.
Pour into a column packed with 45 ml of Amberlite IRA400 (trade name manufactured by Rohm & Haas) adjusted to OH type, and pour 200 ml of water. Combine all the liquid that passed through the column, and add 1N hydrochloric acid.
Adjust to PH7.0. This is concentrated under reduced pressure and the pore size
0.3μm Millipore filter (Japan Millipore)
Limited (trade name) and then freeze-dried to obtain 210 freeze-dried products of the anticancer substance TF-310.
Get mg. This material has the following properties. (a) White-gray to light brown powder. (b) It inhibits the proliferation of Ehrlichi's ascites-type carcinoma, Ehrlichi's nodule-type carcinoma, Sarcoma 180 cancer cells, and B-16 melanoma cancer cells and has an immunostimulatory effect. (c) Soluble in water, insoluble in methanol, ethanol, acetone, benzene, chloroform, ethyl acetate, diethyl ether. (d) It does not exhibit a clear melting point, and begins to decompose at about 180°C, and significantly decomposes at temperatures above 195°C. (E) The infrared absorption spectrum obtained by the KBr tablet method is 3500-3300, 2920, 2850, 1660-1620,
1580~1540, 1460~1400, 1380~1360,
1120, 1080~1020, 970 and 820~800cm -1
It has an absorption band near (Fig. 4). (f) The ultraviolet absorption spectrum of an aqueous solution with a pH of 7 is
There is strong absorption at the absorption end and absorption near 246 to 259 (Figure 5). (G) TSK-GELG3000SW (Toyo Soda Co., Ltd. product name, column: 7.5mmφ x 600mm x 2)
High performance liquid chromatogram (eluent: PH
7 of 0.1 molar phosphate buffer, flow rate 0.8 ml/min,
When measuring UV absorbance at 220 nm, absorption occurs at the front of the solvent, around 28 to 32 minutes, and around 43 to 64 minutes, and when measuring UV absorption at 260 nm, absorption occurs at the front of the solvent, around minutes 42 to 60. (Figure 6). (H) Moritsch reaction, phenol sulfuric acid reaction,
Anthrone sulfuric acid reaction, indole hydrochloric acid reaction,
The Lowry-Follin reaction was positive, and the ninhydrin reaction was negative. (li) Elemental analysis value C: 38.0% to 42% H: 5.0% to 7% N:
1% to 4% (nu) The sugar content by the phenol sulfuric acid method is approximately
20% to 60% (glucose equivalent) and protein content by Lowry-Follin method is approximately 10%
% or less (bovine serum albumin equivalent). (5) Dissolve 140 mg of the anticancer substance TF-310 obtained above in 50 ml of water, and
(Toyo Paper Co., Ltd. ultrafiltration membrane trade name: molecular weight cut off 5×10 4 ) to concentrate 100 times. This concentrated solution was passed through a Millipore filter (trade name manufactured by Nippon Millipore Limited) with a pore size of 0.2 μm, and then freeze-dried to obtain the anticancer substance TF.
Obtain 88 mg of purified lyophilized product of −310. The thus obtained purified product of the anticancer substance TF-310 had the properties described in the claims, and the sugar content (calculated as gelose) was about 16 to 30%. Example 2 (1) 3.9 g of the powder obtained by the method of Example 1-(2) was suspended in 25 ml of water, 1N aqueous sodium hydroxide was added to adjust the pH to 7.5 to 8.0, and the suspension was heated at room temperature for 30 minutes. After stirring, add 1N hydrochloric acid to adjust the pH to 6.0.
After stirring for 2 hours under ice-cooling, the mixture is centrifuged (1×10 4 rpm, 10 minutes) to separate the precipitate and supernatant. 5 ml of water adjusted to pH 6.0 for this precipitate
The precipitate and washing solution were centrifuged (1x
10 4 rpm, 10 minutes). The washing liquid is subjected to the treatment described in Example 3-(1) together with the previously obtained supernatant liquid. On the other hand, after washing the precipitate with 5 ml of ethanol, it was dried under reduced pressure to remove the anticancer substance TF-220.
Obtain 1.06g. This material has the following properties. (a) White-gray to light brown powder. (b) Inhibits the proliferation of Ehrrich's ascites-type carcinoma, Ehrlichi's nodal carcinoma, Sarcomer 180 cancer cells, and B-16 melanoma cancer cells in mice;
Has immunostimulatory effect. (c) Insoluble in methanol, ethanol, acetone, benzene, chloroform, ethyl acetate, and diethyl ether. (d) It does not show a clear melting point and decomposes at 160°C to 240°C. (e) The infrared absorption spectrum obtained by the KBr tablet method is 3600-3200, 2950-2920, 1680-1620,
1550~1510, 1440, 1380, 1240~1220 and
It has an absorption band near 1120 to 1020 cm -1 .
(Figure 7). (F) The ultraviolet absorption spectrum of an aqueous solution of the water-soluble fraction at pH 7 has strong absorption at the absorption end and also shows absorption near 248 to 266 nm (8th
figure). (g) Moritsch reaction, phenol sulfuric acid reaction,
Anthrone sulfuric acid reaction, indole hydrochloric acid reaction,
Lowry-Follin reaction was positive. (H) Elemental analysis value C: 40% to 42% H: 5% to 7% N: 7%
~9% (Li) The water-soluble surface content at pH 7 is approximately 5% to 20% (glucose equivalent) by the phenol sulfuric acid method, and the protein content by the Lowry-Follin method is approximately 10% or less. (in terms of bovine serum albumin). (2) 1 g of the anticancer substance TF-220 obtained in (1) was added to water.
Suspend in 10 ml and adjust the pH to 7.8 by adding 1N aqueous sodium hydroxide solution while stirring. Heat to 37℃, pronase E (product name manufactured by Kaken Chemical Co., Ltd.;
1000000 tyrosine units/g) after adding 15mg,
Add a few drops of toluene and, while stirring, adjust the pH to 7.8-8.0.
Perform enzyme treatment for 24 hours at 37-40 °C. Centrifuge the treated solution (4000 rpm, 10 minutes) to separate the supernatant and precipitate, add 3 ml of water adjusted to PH8.0 to the precipitate, centrifuge (4000 rpm, 10 minutes), and separate the precipitate and Separate the cleaning solution. Combine the washing solution with the supernatant solution and add 1N hydrochloric acid to adjust the pH to 2.0 to precipitate. After leaving this solution at 5°C for 12 hours, centrifugation (1 x 10 4 rpm, 10 minutes)
The supernatant liquid and precipitate are separated, and the precipitate has a pH of 2.0.
Add 3 ml of water adjusted to
10 4 rpm, 10 minutes) and separate the precipitate and washing solution. Combine the washing solution with the supernatant and add ethanol to make an 80% ethanol solution. After stirring on ice for 2 hours, centrifuge (4000 rpm 10 minutes).
Separate the precipitate and supernatant. The precipitate was sequentially washed with 5 ml of 80% ethanol aqueous solution and 5 ml of ethanol, and then dried under reduced pressure to form the anticancer substance TF-320.
163 mg of the fraction was obtained. Dissolve 150 mg of this powder in 5 ml of water, add 1N aqueous sodium hydroxide solution to adjust the pH to 7.0,
In advance with 1N sodium hydroxide aqueous solution.
Pour into a column packed with 25 ml of Amberlite IRA 400 (trade name, manufactured by Rohm & Haas) adjusted to OH type, and pour 100 ml of water. Combine all the liquid that passed through the column, and add 1N-hydrochloric acid.
Adjust to PH7.0. This is concentrated under reduced pressure and the pore size
0.3μm Millipore filter (Japan Millipore)
Limited (product name)) and then lyophilized to obtain 110 ml of lyophilized anticancer substance TF-320.
Get mg. This material has the following properties. (a) White-gray to light brown powder. (b) It inhibits the growth of Ehrrich's ascites-type carcinoma in mice and has immunostimulatory effects. (c) Soluble in water, insoluble in methanol, ethanol, acetone, benzene, chloroform, ethyl acetate, diethyl ether. (d) It does not exhibit a clear melting point, and begins to decompose at about 180°C, and significantly decomposes at temperatures above 195°C. (E) The infrared absorption spectrum obtained by the KBr tablet method is 3500-3300, 2920, 2850, 1660-1620,
1580~1540, 1460~1400, 1380~1360,
1120, 1080~1020, 970 and 820~800cm -1
It has an absorption band near (Fig. 9). (f) The ultraviolet absorption spectrum of an aqueous solution with a pH of 7 is
There is strong absorption at the absorption end, and 250~
It exhibits absorption near 270 nm (Figure 10). (g) High performance liquid chromatogram using TSK-GEL G3000SW (trade name of Toyo Soda Co., Ltd., column: 7.5 mmφ x 600 mm x 2) (eluent: PH7
(0.1 M phosphate buffer, flow rate 0.8 ml/min, room temperature) has absorption at the solvent front, around 28 to 32 minutes, and around 43 to 64 minutes when measuring UV absorbance at 220 nm, and when measuring UV absorbance at 260 nm. There is an absorption at the front end of the solvent, around 35 to 56 minutes (Fig. 11). (H) Moritsch reaction, phenol sulfuric acid reaction,
Anthrone sulfuric acid reaction, indole hydrochloric acid reaction,
The Lowry-Follin reaction was positive, and the ninhydrin reaction was negative. (li) Elemental analysis value C: 38% to 42% H: 5% to 7% N: 1%
~4% (nu) The sugar content by the phenol sulfuric acid method is approximately
20% to 60% (glucose equivalent) and protein content by Lowry-Follin method is approximately 10%
% or less (bovine serum albumin equivalent). (3) Anticancer substance TF-320 obtained above, 100mg
Dissolve it in 50ml of water and apply ultra filter UK-
50 (product name of ultrafiltration membrane manufactured by Toyo Shi Co., Ltd.: molecular weight cut off 5×10 4 ) and concentrated 100 times. Filter this concentrated solution through a Millipore filter (trade name manufactured by Nippon Millipore Limited) with a pore size of 0.2 μm.
and then lyophilized to produce anticancer substances.
Obtain 72 mg of purified lyophilized product of TF-320. The thus obtained purified product of the anticancer substance TF-320 had the properties described in the claims, and had a sugar content (in terms of glucose) of about 16 to 30%. Example 3 (1) After adjusting the pH to 4.0 by adding 1N hydrochloric acid to a solution of the washing solution and supernatant obtained in Example 2-(1), the solution is left at 5° C. or lower for 12 hours. Then, centrifugation (1×10 4 rpm, 10 minutes) is performed to separate the precipitate and supernatant. This precipitate is washed with 5 ml of water adjusted to pH 4.0, and the precipitate and washing solution are centrifuged (1×10 4 rpm, 10 minutes). After washing the precipitate with 5 ml of ethanol, the anticancer substance was dried under reduced pressure.
Obtain 0.48g of TF-230. This material has the following properties. (a) White-gray to light brown powder. (b) Inhibits the proliferation of Ehrrich's ascites-type carcinoma, Ehrlichi's nodular-type carcinoma, Sarcomer 180 cancer cells, and B-16 melanoma cancer cells in mice;
Has immunostimulatory effect. (c) Insoluble in methanol, ethanol, acetone, benzene, chloroform, ethyl acetate, and diethyl ether. (d) It does not show a clear melting point and decomposes at 185°C to 225°C. (e) The infrared absorption spectrum obtained by the KBr tablet method is 3600-3200, 2950-2920, 1680-1620,
1550~1510, 1440, 1380, 1240~1220 and
It has an absorption band near 1120 to 1020 cm -1 .
(Figure 12). (F) The ultraviolet absorption spectrum of an aqueous solution with a pH of 7 has strong absorption at the absorption end, and a wavelength of 249 to 264 nm.
Absorption is shown in the vicinity of (Fig. 13). (g) Moritsch reaction, phenol sulfuric acid reaction,
Anthrone sulfuric acid reaction, indole hydrochloric acid reaction,
Lowry-Follin reaction was positive. (H) Elemental analysis value C: 42% to 45% H: 5% to 7% N: 10%
~11% (li) The sugar content by the phenol sulfuric acid method is approximately 5
% to 25% (glucose equivalent), and the protein content by the Lowry-Follin method is approximately 30%
% to 60% (bovine serum albumin equivalent). (2) Suspend 0.48 g of the anticancer substance TF-230 obtained in (1) in 5 ml of water, and adjust the pH to 7.8 by adding 1N aqueous sodium hydroxide solution while stirring. Heat to 37℃, pronase E (Kaken Chemical System product name;
After adding 5.0 mg of 1000000 tyrosine units/g, add a few drops of toluene and adjust the pH to 7.8 while stirring.
Perform enzyme treatment for 24 hours at ~8.0, 37-40 °C. Centrifuge the treated solution (4000 rpm, 10 minutes), separate the supernatant and precipitate, add 3 ml of water adjusted to PH8.0 to the precipitate, and centrifuge (4000 rpm, 10 minutes).
and separate the precipitate and washing solution. Combine the washing solution with the supernatant solution and add 1N hydrochloric acid to this.
If the pH is adjusted to 2.0, a precipitate will form. This solution was left at 5°C for 12 hours, then centrifuged (1x
10 4 rpm, 10 minutes) and separate into supernatant and precipitate,
Add 3 ml of water adjusted to pH 2.0 to the precipitate and centrifuge (1 x 10 4 rpm, 10 minutes) to separate the precipitate and washing solution. Combine the washing solution with the supernatant solution and add ethanol to make an 80% ethanol solution.
After stirring on ice for 2 hours, centrifugation (4000 rpm, 10 minutes) is performed to separate the precipitate and supernatant. The precipitate was washed successively with 5 ml of 80% ethanol aqueous solution and 5 ml of ethanol, and then dried under reduced pressure to obtain 100 mg of the anticancer substance TF-330 fraction. Dissolve 100 mg of this powder in 5 ml of water, add 1N aqueous sodium hydroxide solution to adjust the pH to 7.0,
In advance with 1N sodium hydroxide aqueous solution.
A column packed with 15 ml of Amberlite IRA 400 (trade name, manufactured by Rohm & Haas) adjusted to OH type was applied to the column, and 60 ml of water was passed through the column. All the liquid that passed through the column was combined, and 1N-hydrochloric acid was added to adjust the pH to 7. 0
Adjust to. This is concentrated under reduced pressure and the pore size
0.3μm Millipore filter (Japan Millipore)
Limited (trade name) and then freeze-dried to obtain 70 mg of the anti-cancer substance TF-330 freeze-dried product.
obtain. This material has the following properties. (a) White-gray to light brown powder. (b) It inhibits the growth of Ehrrich's ascites-type carcinoma in mice and has immunostimulatory effects. (c) Soluble in water, insoluble in methanol, ethanol, acetone, benzene, chloroform, ethyl acetate, diethyl ether. (d) It does not exhibit a clear melting point, and begins to decompose at about 180°C, and significantly decomposes at temperatures above 195°C. (E) The infrared absorption spectrum obtained by the KBr tablet method is 3500-3300, 2920, 2850, 1660-1620,
1580~1540, 1460~1400, 1380~1360,
1120, 1080~1020, 970 and 820~800cm -1
It has an absorption band near . (Figure 14). (f) The ultraviolet absorption spectrum of an aqueous solution with a pH of 7 is
There is strong absorption at the absorption end, and 250~
It exhibits absorption near 260 nm (Figure 15). (g) TSK-GEL G 3000SW (trade name of Toyo Soda Co., Ltd., column: 7.5mmφ x 600mm x 2)
High performance liquid chromatogram (eluent: PH
7 of 0.1 molar phosphate buffer, flow rate 0.8 ml/min,
When measuring ultraviolet absorbance at 220 nm, there is absorption at the solvent front end around 36 to 64 minutes, and when measuring ultraviolet light absorbance at 260 nm, there is absorption at the solvent front end around 35 to 62 minutes (Figure 16). ). (H) Moritsch reaction, phenol sulfuric acid reaction,
Anthrone sulfuric acid reaction, indole hydrochloric acid reaction,
The Lowry-Follin reaction was positive, and the ninhydrin reaction was negative. (li) Elemental analysis value C: 38% to 42% H: 5% to 7% N: 1%
~4% (nu) The sugar content by the phenol sulfuric acid method is approximately
20% to 60% (glucose equivalent) and protein content by Lowry-Follin method is approximately 10%
% or less (bovine serum albumin equivalent). (3) Dissolve 70 mg of the anticancer substance TF-330 obtained above in 50 ml of water, and
(Toyo Paper Co., Ltd. ultrafiltration membrane trade name: molecular weight cut off 5×10 4 ) to concentrate 100 times. This concentrated solution was passed through a Millipore filter (trade name manufactured by Nippon Millipore Limited) with a pore size of 0.2 μm, and then freeze-dried to obtain the anticancer substance TF.
Obtain 49 mg of purified lyophilized product of −330. The purified product of the anticancer substance TF-330 obtained in this way has the properties described in the claims, and generally has a sugar content (in terms of glucose) of about 16 to 30%,
Typical infrared absorption spectra and ultraviolet absorption spectra are shown in Figures 17 and 18.
It was as shown in the diagram. Example 4 (1) Tryptocase peptone 17g, Heart Infusion to 10 parts jar fermenter (manufactured by Marubishi Rika Kenkyusho) and 1 part distilled water
20g, yeast extract 3g, salt
TF-d medium 8 containing 7.5 g, glucose 12 g, lactose 10 g, sodium sulfite 0.1 g and sodium thioglycolate 0.5 g
and sterilize at 120°C for 30 minutes. After cooling the culture solution, nitrogen gas is aerated at 100 ml/min for 1 hour. Fusobacterium nucleatum TF-, which was precultured in the above-mentioned TF-d medium,
031 (FERM-P No. 5077, ATCC-31647) is inoculated under sterile conditions. Culture is
At 37℃, while flowing nitrogen gas (65ml/min),
The test is carried out for 3 days under stirring (30 rpm). After culturing,
160 g of Celite and 80 g of cellulose powder were added to the culture solution and stirred, and the mixture was filtered under reduced pressure to obtain 7.8 g of culture solution supernatant from which bacteria had been removed. (2) Add 117ml of concentrated hydrochloric acid to 7.8ml of the culture supernatant obtained in (1).
After adding and adjusting the pH to 2.0, ethanol 11.7
Add to make a 60% ethanol solution and incubate at 4℃ for 24 hours.
Leave it for a while. Next, the solution portion was removed by decantation, and the temperature was heated at 4°C to collect the precipitate.
Centrifuge (6 x 10 3 rpm, 5 minutes). This precipitate was mixed with 400 ml of 60% ethanol aqueous solution with pH 2.0.
After sequentially washing with 400 ml of ethanol, 200 ml of acetone and 200 ml of diethyl ether, the mixture was dried under reduced pressure to obtain 4.5 g of powder. (3) The powder obtained in (2) was added to Example 1-
(3), treated in the same manner as in Example 2-(1) and Example 3-(1) to obtain anticancer substances TF-210, TF-220 and TF-230, respectively. (4) Anticancer substances TF-210 and TF-220 obtained in (3)
and TF-230 were treated in the same manner as in Example 1-(4), Example 2-(2), and Example 3-(2), respectively, to obtain the anticancer substances TF-310, TF-320 and TF.
−330 lyophilized product, 220mg and 120mg respectively
and get 75 mg. Example 5 The anticancer substance TF-210 obtained in Example 1-(3)
1.5g was treated with an enzyme using 15mg of trypsin (manufactured by Difco) instead of pronase E, and when collecting the precipitate from the water-soluble part adjusted to pH 2 after the enzyme treatment, an 80% ethanol solution was used. 60 instead
A freeze-dried product of the anticancer substance TF-310 was prepared in the same manner as in Example 1-(4) except for making a % ethanol solution.
Get 200mg. Similarly, the following anticancer substances TF-320 and
Freeze-dried products of TF-330 are obtained.
【表】
実施例 ６
実施例１−(3)、実施例２−(1)又は実施例３−(1)
でそれぞれ得られた制癌性物質TF−210、TF−
220又はTF−230を、実施例１−(4)、実施例２−
(2)又は実施例３−(2)と同様にそれぞれ酵素処理し
た後、PH２に調整した水可溶部から沈殿物を採取
する際、80％エタノール溶液とする代りに60％エ
タノール溶液に調整し、以後それぞれの実施例と
同様の操作を行い制癌性物質TF−310、TF−320
又はTF−330の凍結乾燥品をそれぞれ190mg、98
mg又は66mg得る。
実施例 ７
実施例１−(3)、実施例２−(1)又は実施例３−(1)
でそれぞれ得られた制癌性物質TF−210、TF−
220又はTF−230を、実施例１−(4)、実施例２−
(2)又は実施例３−(2)と同様にそれぞれ酵素処理し
た後、PH２に調整した水可溶部から沈殿物を採取
する代りに、40％トリクロロ酢酸水溶液を加え、
トリクロロ酢酸の濃度を10％としたときの水可溶
部を80％エタノール溶液に調整して、沈殿物を採
取し、以後それぞれの実施例と同様の操作を行
い、制癌性物質TF−310、TF−320又はTF−330
の凍結乾燥品を192mg、102mg又は65mg得る。
実施例 ８
(1) 90のジヤー・フアメンター（丸菱理化研究
所製：MSJ−U2型）に、70の蒸留水に対し、
トリプトケース・ペプトン1190ｇ、ハート・イ
ンヒユージヨン1050ｇ、イースト・エクストラ
クト210ｇ、食塩525ｇ、グルコース840ｇ、ラ
クトース700ｇ、亜硫酸ナトリウム７ｇ、チオ
グリコレート・ナトリウム35ｇおよび第２リン
酸カリウム175ｇを含有するTF−ｆ培地を加
え、118℃で15分間滅菌する。培養液に、冷却
後窒素ガスを250ml／分にて１時間通気する。
あらかじめ上述のTF−ｆ培地にて前培養し
たフソバクテリウム・ヌクレアタムTF−031
（FERM−Ｐ No.5077、ATCC−31647）の前
培養液約900mlを上述した培養液に接種する。
培養は約33℃で窒素ガスを流入（250ml／分）
しながら撹拌（90r.p.m）下４日間行う。培養
終了後、培養液にセライト10ｇ／およびセル
ロースパウダー５ｇ／を加え撹拌し、これを
減圧下で過し除菌した培養液上清約65を得
た。
(2) (1)で得られた培養液上清7.5に濃塩酸113ml
を加え、PH2.0に調整した後、エタノール11.4
を加え、60％エタノール溶液とし、４℃で24
時間放置する。次いでデカンテーシヨンにて溶
液部分を除き、沈殿物を採取するために４℃で
遠心分離（４×103rpm、10分）する。この沈
殿物をPH2.0の60％エタノール水溶液100mlで２
回、エタノール150ml、メタノール150mlに２回
およびアセトン150mlで順次洗浄した後、風乾
して粉末3.0ｇを得る。
(3) (2)で得られた粉末を水30mlに懸濁し、4N−
水酸化ナトリウム水溶液を加えPH7.5〜8.0とな
し、室温で15分間撹拌した後、4N−塩酸を加
えてPH4.0に調整する。次いで氷冷下２時間静
置した後、遠心分離（１×104rpm、10分）し、
上清液と沈殿物を分離する。この沈殿物に洗浄
のために水６mlを加え懸濁液となし、4N−水
酸化ナトリウム水溶液を加えPH7.5〜8.0に調整
する。次いで室温で15分間撹拌し、その後4N
−塩酸を加えてPH4.0に調整し、氷冷下２時間
静置する。その後遠心分離（１×104rpm、10
分）し、沈殿物を採取する。この沈殿物をPH
4.0に調整した水４mlにて洗浄し、遠心分離
（１×104rpm、10分）して湿重量で6.2ｇの沈
殿物（TF−210）を得る。このようにして得ら
れた制癌性物質TF−210は、実施例１で得られ
たものと同じ性状を有していた。
(4) (3)で得られたTF−210 6.2ｇ（湿重量）を水
６mlに懸濁し、撹拌下に飽和炭酸アンモニウム
水溶液を加えてPH7.8に調整する。これを37℃
に加温し、プロナーゼＥ（科研化学製商品名；
1000000チロジン単位／ｇ）21mgを添加した後、
トルエンを数滴加えて振盪下、PH7.8〜8.0、37
〜40℃で２時間酵素処理を行う。次いで、処理
液に4N−塩酸を加えPH1.0とし沈殿を析出させ
る。この懸濁液を氷冷下２時間静置した後、遠
心分離（１×104rpm、10分）し、上清液を分
取する。この上清液にエタノール29mlを加え、
60％エタノール水溶液となし、沈殿物を析出さ
せる。これを氷冷下２時間静置した後遠心分離
（６×103rpm、10分）して沈殿物を採取する。
沈殿物を60％エタノール水溶液５ml、エタノー
ル10mlおよびアセトン10mlで順次洗浄した後、
風乾して制癌性物質TF−310 315mgを得る。こ
れを30mlの水に溶解させ、4N−水酸化ナトリ
ウム水溶液にてPH8.0に調整し、ダウエツクス
１×４（ダウケミカル社製商品名）Cl型30mlを
充填したカラムにかけ水100mlを流した際のカ
ラム通過液を全て合わせてPH6.5〜7.0となる様
に調整する。これをウルトラフイルターUK−
50（東洋紙株式会社製限外過膜商品名；分
画分子量５×104）にて限外過を行ない100倍
まで濃縮する。この濃縮液を孔径0.3μmのミリ
ポアフイルター（日本ミリポアリミテツド製商
品名）にて過し、次いで凍結乾燥して制癌性
物質TF−310の精製凍結乾燥品230mgを得る。
このようにして得られた制癌性物質TF−310の
精製品は特許請求の範囲に記載の性状を有し、
一般にその糖含率（グルコース換算）は約16〜
30％であり、代表的なものの赤外線吸収スペク
トル、紫外線吸収スペクトルおよび高速液体ク
ロマトグラムはそれぞれ第１９図、第２０図お
よび第２１図のとおりであつた。
製剤例 １
制癌性物質TF−310の凍結乾燥品１mgをバイア
ル瓶に充填した。これは使用時滅菌生理食塩水又
はリドカイン0.5％含有溶液等に溶解させ注射液
として用いる。
製剤例 ２
制癌性物質TF−320の凍結乾燥品１mgをバイア
ル瓶に充填した。これは使用時滅菌生理食塩水又
はリドカイン0.5％含有溶液等に溶解させ注射液
として用いる。
製剤例 ３
制癌性物質TF−330の凍結乾燥品１mgをバイア
ル瓶に充填した。これは使用時滅菌生理食塩水又
はリドカイン0.5％含有溶液等に溶解させ注射液
として用いる。
製剤例 ４
制癌性物質TF−310を含むPH7.0〜7.5の水溶液
をバイアル瓶に充填し、0.5又は１mg単位の制癌
性物質TF−310凍結乾燥品を得る。これは、使用
時滅菌生理食塩水、リドカイン0.5％含有溶液又
は５％ブドウ糖水溶液等に溶解させ注射液として
使用する。
製剤例 ５
制癌性物質TF−310（精）を含むPH7.0〜7.5の
水溶液をバイアス瓶に充填し、0.5又は１mg単位
の制癌性物質TF−310（精）凍結乾燥品を得る。
これは使用時、滅菌生理食塩水、リドカイン0.5
％含有溶液又は５％ブドウ糖水溶液等に溶解させ
注射液として使用する。
製剤例 ６
制癌性物質TF−320を含むPH7.0〜7.5の水溶液
をバイアル瓶に充填し、0.5又は１mg単位の制癌
性物質TF−320凍結乾燥品を得る。これは使用
時、滅菌生理食塩水、リドカイン0.5％含有溶液
又は５％ブドウ糖水溶液等に溶解させ注射液とし
て使用する。
製剤例 ７
制癌性物質TF−330を含むPH7.0〜7.5の水溶液
をバイアル瓶に充填し、、0.5又は１mg単位の制癌
性物質TF−330凍結乾燥品を得る。これは使用
時、滅菌生理食塩水、リドカイン0.5％含有溶液
又は５％ブドウ糖水溶液等に溶解して注射液とし
て使用する。[Table] Example 6 Example 1-(3), Example 2-(1) or Example 3-(1)
Anticancer substances TF-210 and TF- obtained respectively in
220 or TF-230, Example 1-(4), Example 2-
(2) Or when collecting the precipitate from the water-soluble part adjusted to pH 2 after enzyme treatment in the same manner as in Example 3-(2), adjust to 60% ethanol solution instead of 80% ethanol solution. After that, the same operations as in each example were performed to obtain the anticancer substances TF-310 and TF-320.
Or 190 mg and 98 lyophilized products of TF-330, respectively.
mg or 66 mg. Example 7 Example 1-(3), Example 2-(1) or Example 3-(1)
Anticancer substances TF-210 and TF- obtained respectively in
220 or TF-230, Example 1-(4), Example 2-
(2) or after each enzyme treatment in the same manner as in Example 3-(2), instead of collecting the precipitate from the water-soluble portion adjusted to pH 2, a 40% aqueous trichloroacetic acid solution was added,
When the concentration of trichloroacetic acid is 10%, the water-soluble part is adjusted to an 80% ethanol solution, the precipitate is collected, and the same operations as in each example are performed to obtain the anticancer substance TF-310. , TF-320 or TF-330
Obtain 192mg, 102mg or 65mg of lyophilized product. Example 8 (1) For 70 g of distilled water, 90 g.
TF-f medium containing 1190 g tryptocase peptone, 1050 g heart injection, 210 g yeast extract, 525 g salt, 840 g glucose, 700 g lactose, 7 g sodium sulfite, 35 g sodium thioglycolate, and 175 g dibasic potassium phosphate. Add and sterilize at 118°C for 15 minutes. After cooling, nitrogen gas is bubbled through the culture solution at 250 ml/min for 1 hour. Fusobacterium nucleatum TF-031 precultured in the above-mentioned TF-f medium
(FERM-P No. 5077, ATCC-31647) is inoculated into the above-mentioned culture solution.
Cultivation is performed at approximately 33℃ with nitrogen gas flowing (250ml/min)
Stirring (90 rpm) for 4 days. After the culture was completed, 10 g of Celite and 5 g of cellulose powder were added to the culture solution and stirred, and the mixture was filtered under reduced pressure to obtain about 65% of the culture solution supernatant, which was sterilized. (2) Add 113ml of concentrated hydrochloric acid to 7.5ml of the culture supernatant obtained in (1).
After adding and adjusting the pH to 2.0, ethanol 11.4
Add to make a 60% ethanol solution and incubate at 4℃ for 24 hours.
Leave it for a while. Next, the solution portion is removed by decantation, and the mixture is centrifuged at 4° C. (4×10 3 rpm, 10 minutes) to collect the precipitate. This precipitate was dissolved in 100 ml of 60% ethanol aqueous solution with pH 2.0.
After washing with 150 ml of ethanol twice, 150 ml of methanol twice, and 150 ml of acetone, the mixture was air-dried to obtain 3.0 g of powder. (3) Suspend the powder obtained in (2) in 30 ml of water, and
Add aqueous sodium hydroxide solution to adjust the pH to 7.5-8.0, stir at room temperature for 15 minutes, then add 4N hydrochloric acid to adjust the pH to 4.0. Then, after standing for 2 hours under ice-cooling, centrifugation (1 x 10 4 rpm, 10 minutes) was carried out.
Separate the supernatant and precipitate. For washing, 6 ml of water is added to this precipitate to form a suspension, and a 4N aqueous sodium hydroxide solution is added to adjust the pH to 7.5-8.0. Then stir at room temperature for 15 minutes, then 4N
- Add hydrochloric acid to adjust the pH to 4.0 and let stand under ice cooling for 2 hours. Then centrifugation (1×10 4 rpm, 10
minutes) and collect the precipitate. This precipitate has a pH of
The precipitate was washed with 4 ml of water adjusted to 4.0 and centrifuged (1×10 4 rpm, 10 minutes) to obtain a precipitate (TF-210) with a wet weight of 6.2 g. The anticancer substance TF-210 thus obtained had the same properties as those obtained in Example 1. (4) 6.2 g (wet weight) of TF-210 obtained in (3) is suspended in 6 ml of water, and the pH is adjusted to 7.8 by adding saturated ammonium carbonate aqueous solution while stirring. This is 37℃
Pronase E (product name manufactured by Kaken Chemical Co., Ltd.;
After adding 21mg of 1000000 tyrosine units/g),
Add a few drops of toluene and shake, PH7.8-8.0, 37
Perform enzyme treatment for 2 hours at ~40°C. Next, 4N hydrochloric acid is added to the treatment solution to adjust the pH to 1.0 and precipitate out. This suspension is left to stand for 2 hours under ice-cooling, and then centrifuged (1×10 4 rpm, 10 minutes) to separate the supernatant. Add 29 ml of ethanol to this supernatant,
Dilute with 60% ethanol aqueous solution to precipitate. This was left to stand for 2 hours under ice cooling, and then centrifuged (6×10 3 rpm, 10 minutes) to collect the precipitate.
After sequentially washing the precipitate with 5 ml of 60% ethanol aqueous solution, 10 ml of ethanol, and 10 ml of acetone,
Air dry to obtain 315mg of anticancer substance TF-310. Dissolve this in 30 ml of water, adjust the pH to 8.0 with 4N sodium hydroxide aqueous solution, apply it to a column packed with 30 ml of Dowex 1x4 (trade name manufactured by Dow Chemical Company) Cl type, and pour 100 ml of water through it. Combine all the column-passing liquids and adjust the pH to 6.5-7.0. Ultrafilter UK-
50 (trade name of ultrafiltration membrane manufactured by Toyo Shi Co., Ltd.; molecular weight cut off: 5×10 4 ) and concentrated to 100 times. This concentrated solution is passed through a Millipore filter (trade name, manufactured by Nippon Millipore Limited) with a pore size of 0.3 μm, and then freeze-dried to obtain 230 mg of a purified freeze-dried product of the anticancer substance TF-310.
The purified product of the anticancer substance TF-310 thus obtained has the properties described in the claims,
Generally, its sugar content (glucose equivalent) is about 16~
30%, and typical infrared absorption spectra, ultraviolet absorption spectra, and high performance liquid chromatograms are as shown in FIGS. 19, 20, and 21, respectively. Formulation Example 1 1 mg of lyophilized anticancer substance TF-310 was filled into a vial. When used, it is dissolved in sterile physiological saline or a solution containing 0.5% lidocaine and used as an injection solution. Formulation Example 2 1 mg of lyophilized anticancer substance TF-320 was filled into a vial. When used, it is dissolved in sterile physiological saline or a solution containing 0.5% lidocaine and used as an injection solution. Formulation Example 3 1 mg of lyophilized anticancer substance TF-330 was filled into a vial. When used, it is dissolved in sterile physiological saline or a solution containing 0.5% lidocaine and used as an injection solution. Formulation Example 4 An aqueous solution containing the anticancer substance TF-310 with a pH of 7.0 to 7.5 is filled into a vial to obtain a freeze-dried product of the anticancer substance TF-310 in units of 0.5 or 1 mg. When used, it is used as an injection solution by dissolving it in sterile physiological saline, a solution containing 0.5% lidocaine, or a 5% aqueous glucose solution. Formulation Example 5 An aqueous solution of PH7.0 to 7.5 containing the anticancer substance TF-310 (preliminary) is filled into a bias bottle to obtain a freeze-dried product of the anticancer substance TF-310 (preliminary) in units of 0.5 or 1 mg.
When used, sterile saline, lidocaine 0.5
It is used as an injection by dissolving it in a solution containing 5% or 5% aqueous glucose solution. Formulation Example 6 An aqueous solution containing the anticancer substance TF-320 with a pH of 7.0 to 7.5 is filled into a vial to obtain a freeze-dried product of the anticancer substance TF-320 in units of 0.5 or 1 mg. When used, it is dissolved in sterile physiological saline, a solution containing 0.5% lidocaine, or a 5% aqueous glucose solution and used as an injection solution. Formulation Example 7 An aqueous solution containing the anticancer substance TF-330 with a pH of 7.0 to 7.5 is filled into a vial to obtain a freeze-dried product of the anticancer substance TF-330 in units of 0.5 or 1 mg. When used, it is used as an injection by dissolving it in sterile physiological saline, a solution containing 0.5% lidocaine, or a 5% aqueous glucose solution.
第１図は本発明で用いるフソバクテリウム・ヌ
クレアタムTF−031の形態を示す顕微鏡写真、第
２図は制癌性物質TF−210の赤外線吸収スペクト
ル、第３図は同物質の紫外線吸収スペクトル、第
４図は本発明の制癌性物質TF−310の赤外線吸収
スペクトル、第５図は同物質の紫外線吸収スペク
トル、第６図は同物質の高速液体クロマトグラ
ム、第７図は制癌性物質TF−220の赤外線吸収ス
ペクトル、第８図は同物質の紫外線吸収スペクト
ル、第９図は本発明の制癌性物質TF−320の赤外
線吸収スペクトル、第１０図は同物質の紫外線吸
収スペクトル、第１１図は同物質の高速液体クロ
マトグラム、第１２図は制癌性物質TF−230の赤
外線吸収スペクトル、第１３図は同物質の紫外線
吸収スペクトル、第１４図は本発明の制癌性物質
TF−330の赤外線吸収スペクトル、第１５図は同
物質の紫外線吸収スペクトル、第１６図は同物質
の高速液体クロマトグラム、第１７図は本発明の
制癌性物質TF−330（精）の赤外線吸収スペクト
ル、第１８図は同物質の紫外線吸収スペクトル、
第１９図は本発明の制癌性物質TF−310（精）の
赤外線吸収スペクトル、第２０図は同物質の紫外
線吸収スペクトル、第２１図は同物質の高速液体
クロマトグラムを示す。
Figure 1 is a micrograph showing the morphology of Fusobacterium nucleatum TF-031 used in the present invention, Figure 2 is the infrared absorption spectrum of the anticancer substance TF-210, Figure 3 is the ultraviolet absorption spectrum of the same substance, and Figure 4 is the ultraviolet absorption spectrum of the same substance. The figure shows the infrared absorption spectrum of the anticancer substance TF-310 of the present invention, Fig. 5 shows the ultraviolet absorption spectrum of the same substance, Fig. 6 shows the high performance liquid chromatogram of the same substance, and Fig. 7 shows the anticancer substance TF-310. Figure 8 is the infrared absorption spectrum of TF-320, Figure 8 is the UV absorption spectrum of the same substance, Figure 9 is the infrared absorption spectrum of the anticancer substance TF-320 of the present invention, Figure 10 is the UV absorption spectrum of the same substance, Figure 11. is a high-performance liquid chromatogram of the same substance, Figure 12 is the infrared absorption spectrum of the anticancer substance TF-230, Figure 13 is the ultraviolet absorption spectrum of the same substance, and Figure 14 is the anticancer substance of the present invention.
The infrared absorption spectrum of TF-330, Figure 15 is the ultraviolet absorption spectrum of the same substance, Figure 16 is the high performance liquid chromatogram of the same substance, and Figure 17 is the infrared rays of the anticancer substance TF-330 (preliminary) of the present invention. Absorption spectrum, Figure 18 is the ultraviolet absorption spectrum of the same substance,
FIG. 19 shows the infrared absorption spectrum of the anticancer substance TF-310 (Semi) of the present invention, FIG. 20 shows the ultraviolet absorption spectrum of the same substance, and FIG. 21 shows the high performance liquid chromatogram of the same substance.
Claims (1)
−300生産菌を培養し、その培養液から得られる
制癌作用を有する画分を、蛋白質分解酵素による
酵素処理に付して得られる次の性状を有する制癌
性物質TF−300及びその塩。 (イ) 白灰色ないし淡褐色の粉末。 (ロ) マウスのエールリツヒ腹水型癌、エールリツ
ヒ結節型癌、ザルコーマ180癌細胞およびＢ−
16メラノーマ癌細胞の増殖を阻止し免疫賦活作
用を有する。 (ハ) 水に溶解し、メタノール、エタノール、アセ
トン、ベンゼン、クロロホルム、酢酸エチル、
ジエチルエーテルに不溶。 (ニ) 明確な融点を示さず、約180℃より分解を始
め、195℃以上で著しく分解する。 (ホ) KBr錠剤法による赤外線吸収スペクトルは、
3500〜3300、2920、2850、1660〜1620、1580〜
1540、1460〜1400、1380〜1360、1120、1080〜
1020、970および820〜800cm-1の近傍に吸収帯
を有する。 (ヘ) PH７の水溶液の紫外線吸収スペクトルは、吸
収末端に強い吸収があり、また246〜280nmの
近傍に吸収を示す。 (ト) モーリツシユ反応、フエノール硫酸反応、ア
ンスロン硫酸反応、インドール塩酸反応、ロウ
リー・フオリン反応は陽性、ニンヒドリン反応
は陰性。 (チ) 元素分析値 Ｃ：38％〜47％ Ｈ：５％〜７％ Ｎ：１％〜
４％ (リ) フエノール硫酸法による糖の含有率は、約16
％〜60％（グルコース換算）およびロウリー・
フオリン法による蛋白質の含有率は約10％以下
（牛血清アルブミン換算）である。 ２ フソバクテリウム属に属する制癌性物質TF
−300生産菌を培養して得た上清液に親水性有機
溶媒を加えて生ずる沈殿物の制癌作用を有する画
分を、蛋白質分解酵素による酵素処理に付しつい
で制癌性物質TF−300の画分を採取して得られた
ものである特許請求の範囲第１項記載の制癌性物
質TF−300及びその塩。 ３ フソバクテリウム属に属する制癌性物質TF
−300生産菌を培養して得た上清液に親水性有機
溶媒を加えて生ずる沈殿物をPHにより分割して得
られる制癌作用を有する画分を蛋白質分解酵素に
よる酵素処理に付しついで制癌性物質TF−300の
画分を採取して得られたものである特許請求の範
囲第１項又は第２項記載の制癌性物質TF−300及
びその塩。 ４ 蛋白質分解酵素による酵素処理が、プロナー
ゼ又はトリプシン処理である特許請求の範囲第１
〜３項いずれかの項記載の制癌性物質TF−300及
びその塩。 ５ フソバクテリウム属に属する制癌性物質TF
−300生産菌が、フソバクテリウム・ヌクレアタ
ムである特許請求の範囲第１〜４項いずれかの項
記載の制癌性物質TF−300及びその塩。 ６ フソバクテリウム属に属する制癌性物質TF
−300生産菌を培養して得た上清液に親水性有機
溶媒を加えて生ずる沈殿物の制癌作用を有する画
分を蛋白質分解酵素による酵素処理に付すことを
特徴とする制癌性物質TF−300及びその塩の製造
法。 ７ フソバクテリウム属に属する制癌性物質TF
−300生産菌を培養して得た上清液に親水性有機
溶媒を加えて生ずる沈殿物をPHにより分割して得
られる制癌作用を有する画分を蛋白質分解酵素に
よる酵素処理に付し、ついで制癌性物質TF−300
の画分を採取することを特徴とする特許請求の範
囲第６項記載の制癌性物質TF−300及びその塩の
製造法。 ８ 酵素処理後制癌性物質TF−300の画分を採取
する操作が少なくともPHによる分割法、親水性有
機溶媒による沈殿分別法、イオン交換体又は限外
過による分割法の１種以上を組み合わせて処理
し、制癌性物質TF−300の画分を採取する操作で
ある特許請求の範囲第７項記載の制癌性物質TF
−300及びその塩の製造法。 ９ 酵素処理後制癌性物質TF−300の画分を採取
する操作が蛋白質分解酵素による酵素処理後の水
可溶部をPHにより分割し、PH2.5以下に調整して
得られる水可溶部の有効画分に親水性有機溶媒を
加え、得られる沈殿物をイオン交換体で処理し、
その非吸着画分を限外過して採取する操作であ
る特許請求の範囲第７項又は第８項記載の制癌性
物質TF−300及びその塩の製造法。 １０ 上清液に親水性有機溶媒を加える操作が上
清液をPH２付近に調整したのち親水性有機溶媒を
加える操作である特許請求の範囲第６〜９項いず
れかの項記載の制癌性物質TF−300及びその塩の
製造法。 １１ 上清液に加える親水性有機溶媒がアルコー
ルである特許請求の範囲第６〜１０項いずれかの
項記載の制癌性物質TF−300及びその塩の製造
法。 １２ 親水性有機溶媒をその濃度が30％〜80％
（容量比）になるように上清液に加えることを特
徴とする特許請求の範囲第６〜１１項いずれかの
項記載の制癌性物質TF−300及びその塩の製造
法。 １３ 上清液に親水性有機溶媒を加えて得られる
沈殿物をPHにより分割する操作が沈殿物に水を加
え、PH４付近に調整して得られる水不溶部を採取
する操作である特許請求の範囲第７〜１２項いず
れかの項記載の制癌性物質TF−300及びその塩の
製造法。 １４ 上清液に親水性有機溶媒を加えて得られる
沈殿物をPHにより分割する操作が、沈殿物に水を
加え、PH６付近に調整して得られる水不溶部を採
取する操作である特許請求の範囲第７〜１３項い
ずれかの項記載の制癌性物質TF−300及びその塩
の製造法。 １５ 上清液に親水性有機溶媒を加えて得られる
沈殿物をPHにより分割する操作が、沈殿物に水を
加え、PH６付近に調整して得られる水可溶部を更
にPH４付近に調整し、得られる沈殿物を採取する
操作である特許請求の範囲第７〜１４項いずれか
の項記載の制癌性物質TF−300及びその塩の製造
法。 １６ 蛋白質分解酵素による酵素処理がプロナー
ゼ又はトリプシン処理である特許請求の範囲第６
〜１５項いずれかの項記載の制癌性物質TF−300
及びその塩の製造法。 １７ フソバクテリウム属に属する制癌性物質
TF−300生産菌を培養し、その培養液から得られ
る制癌作用を有する画分を、蛋白質分解酵素によ
り酵素処理に付して得られる次の性状を有する制
癌性物質TF−300又はその塩を含有することを特
徴とする制癌剤。 (イ) 白灰色ないし淡褐色の粉末。 (ロ) マウスのエールリツヒ腹水型癌、エールリツ
ヒ結節型癌、ザルコーマ180癌細胞およびＢ−
16メラノーマ癌細胞の増殖を阻止し免疫賦活作
用を有する。 (ハ) 水に溶解し、メタノール、エタノール、アセ
トン、ベンゼン、クロロホルム、酢酸エチル、
ジエチルエーテルに不溶。 (ニ) 明確な融点を示さず、約180℃より分解を始
め、195℃以上で著しく分解する。 (ホ) KBr錠剤法による赤外線吸収スペクトルは、
3500〜3300、2920、2850、1660〜1620、1580〜
1540、1460〜1400、1380〜1360、1120、1080〜
1020、970および820〜800cm-1の近傍に吸収帯
を有する。 (ヘ) PH７の水溶液の紫外線吸収スペクトルは、吸
収末端に強い吸収があり、また246〜280nmの
近傍に吸収を示す。 (ト) モーリツシユ反応、フエノール硫酸反応、ア
ンスロン硫酸反応、インドール塩酸反応、ロウ
リー・フオリン反応は陽性、ニンヒドリン反応
は陰性。 (チ) 元素分析値 Ｃ：38％〜47％ Ｈ：５％〜７％ Ｎ：１％〜
４％ (リ) フエノール硫酸法による糖の含有率は、約16
％〜60％（グルコース換算）およびロウリー・
フオリン法による蛋白質の含有率は約10％以下
（牛血清アルブミン換算）である。[Claims] 1. Anticancer substance TF belonging to the genus Fusobacterium
TF-300, an anticancer substance with the following properties, and its salts, obtained by culturing the -300 producing bacteria and subjecting the fraction with anticancer activity obtained from the culture solution to enzymatic treatment with a protease. . (a) White-gray to light brown powder. (b) Mouse Ehrrich ascites-type carcinoma, Ehrrich's nodule-type carcinoma, Sarcoma 180 cancer cells, and B-
16 It inhibits the proliferation of melanoma cancer cells and has immunostimulatory effects. (c) Dissolved in water, methanol, ethanol, acetone, benzene, chloroform, ethyl acetate,
Insoluble in diethyl ether. (d) It does not exhibit a clear melting point, and begins to decompose at about 180°C, and significantly decomposes at temperatures above 195°C. (e) The infrared absorption spectrum obtained by the KBr tablet method is
3500~3300, 2920, 2850, 1660~1620, 1580~
1540, 1460~1400, 1380~1360, 1120, 1080~
It has absorption bands near 1020, 970 and 820-800 cm -1 . (F) The ultraviolet absorption spectrum of an aqueous solution with a pH of 7 has strong absorption at the absorption end and also shows absorption in the vicinity of 246 to 280 nm. (G) Moritsch reaction, phenol sulfuric acid reaction, Anthrone sulfuric acid reaction, indole-hydrochloric acid reaction, Lowry-Follin reaction are positive, and ninhydrin reaction is negative. (H) Elemental analysis value C: 38% to 47% H: 5% to 7% N: 1% to
4% (Li) The sugar content by the phenol sulfuric acid method is approximately 16
% to 60% (glucose equivalent) and Lowry
The protein content determined by the phorin method is approximately 10% or less (calculated as bovine serum albumin). 2 Anticancer substance TF belonging to the Fusobacterium genus
-300 The anticancer substance TF-300 is produced by culturing the supernatant, which is obtained by adding a hydrophilic organic solvent to the precipitate, which has an anticancer effect. The anticancer substance TF-300 and its salts according to claim 1, which are obtained by collecting fractions of TF-300. 3 Anticancer substance TF belonging to the Fusobacterium genus
A hydrophilic organic solvent is added to the supernatant obtained by culturing -300-producing bacteria, and the resulting precipitate is divided by pH. The fraction with anticancer activity is obtained by enzymatic treatment with a protease. The anticancer substance TF-300 and its salts according to claim 1 or 2, which are obtained by collecting a fraction of the anticancer substance TF-300. 4. Claim 1, wherein the enzymatic treatment with a proteolytic enzyme is pronase or trypsin treatment.
The anticancer substance TF-300 and its salt according to any one of items 3 to 3. 5 Anticancer substance TF belonging to the Fusobacterium genus
The anticancer substance TF-300 and its salt according to any one of claims 1 to 4, wherein the -300 producing bacterium is Fusobacterium nucleatum. 6 Anticancer substance TF belonging to the Fusobacterium genus
-300 An anticancer substance characterized by subjecting the fraction having anticancer activity of the precipitate produced by adding a hydrophilic organic solvent to the supernatant obtained by culturing the producing bacteria to an enzymatic treatment with a proteolytic enzyme. Method for producing TF-300 and its salt. 7 Anticancer substance TF belonging to the Fusobacterium genus
A hydrophilic organic solvent is added to the supernatant obtained by culturing -300-producing bacteria, the resulting precipitate is divided by pH, and the resulting fraction with anticancer activity is subjected to enzymatic treatment with a protease. Next, the anticancer substance TF-300
7. The method for producing anticancer substance TF-300 and its salts according to claim 6, which comprises collecting a fraction of TF-300. 8. The operation of collecting a fraction of the anticancer substance TF-300 after enzyme treatment is a combination of at least one of a PH separation method, a precipitation fractionation method using a hydrophilic organic solvent, an ion exchanger, or an ultrafiltration method. The anti-cancer substance TF according to claim 7 is an operation of treating the anti-cancer substance TF-300 and collecting a fraction of the anti-cancer substance TF-300.
-300 and its salt manufacturing method. 9 The operation of collecting a fraction of the anticancer substance TF-300 after enzymatic treatment is to divide the water-soluble portion after enzymatic treatment with a proteolytic enzyme by pH, and adjust the pH to 2.5 or less. A hydrophilic organic solvent is added to the effective fraction of 50%, and the resulting precipitate is treated with an ion exchanger.
A method for producing the anticancer substance TF-300 and its salts according to claim 7 or 8, which comprises collecting the non-adsorbed fraction by ultrafiltration. 10. Anticancer properties according to any one of claims 6 to 9, wherein the operation of adding a hydrophilic organic solvent to the supernatant liquid is an operation of adjusting the supernatant liquid to around PH2 and then adding the hydrophilic organic solvent. Method for producing substance TF-300 and its salt. 11. The method for producing anticancer substance TF-300 and its salts according to any one of claims 6 to 10, wherein the hydrophilic organic solvent added to the supernatant liquid is alcohol. 12 Hydrophilic organic solvent with a concentration of 30% to 80%
12. The method for producing the anticancer substance TF-300 and its salts according to any one of claims 6 to 11, characterized in that the anticancer substance TF-300 and its salts are added to the supernatant liquid so as to have a volume ratio of TF-300. 13 The operation of dividing the precipitate obtained by adding a hydrophilic organic solvent to the supernatant liquid by pH is the operation of adding water to the precipitate, adjusting the pH to around 4, and collecting the resulting water-insoluble part. A method for producing the anticancer substance TF-300 and a salt thereof according to any one of items 7 to 12. 14 A patent claim in which the operation of dividing the precipitate obtained by adding a hydrophilic organic solvent to the supernatant liquid by pH is the operation of adding water to the precipitate and adjusting the pH to around 6 to collect the water-insoluble part. A method for producing the anticancer substance TF-300 and a salt thereof according to any one of items 7 to 13. 15 The operation of dividing the precipitate obtained by adding a hydrophilic organic solvent to the supernatant liquid by pH is the same as adding water to the precipitate, adjusting the pH to around 6, and further adjusting the water-soluble part obtained to around 4. 15. The method for producing the anticancer substance TF-300 and its salts according to any one of claims 7 to 14, which is an operation of collecting the obtained precipitate. 16 Claim 6, wherein the enzymatic treatment with a proteolytic enzyme is pronase or trypsin treatment.
The anticancer substance TF-300 described in any of the items 15 to 15
and a method for producing its salt. 17 Anticancer substances belonging to the genus Fusobacterium
TF-300 or its anticancer substance having the following properties is obtained by culturing TF-300 producing bacteria and enzymatically treating the fraction with anticancer activity obtained from the culture solution with a protease. An anticancer agent characterized by containing a salt. (a) White-gray to light brown powder. (b) Mouse Ehrrich ascites-type carcinoma, Ehrrich's nodule-type carcinoma, Sarcoma 180 cancer cells, and B-
16 It inhibits the proliferation of melanoma cancer cells and has immunostimulatory effects. (c) Dissolved in water, methanol, ethanol, acetone, benzene, chloroform, ethyl acetate,
Insoluble in diethyl ether. (d) It does not exhibit a clear melting point, and begins to decompose at about 180°C, and significantly decomposes at temperatures above 195°C. (e) The infrared absorption spectrum obtained by the KBr tablet method is
3500~3300, 2920, 2850, 1660~1620, 1580~
1540, 1460~1400, 1380~1360, 1120, 1080~
It has absorption bands near 1020, 970 and 820-800 cm -1 . (F) The ultraviolet absorption spectrum of an aqueous solution with a pH of 7 has strong absorption at the absorption end and also shows absorption in the vicinity of 246 to 280 nm. (G) Moritsch reaction, phenol sulfuric acid reaction, Anthrone sulfuric acid reaction, indole-hydrochloric acid reaction, Lowry-Follin reaction are positive, and ninhydrin reaction is negative. (H) Elemental analysis value C: 38% to 47% H: 5% to 7% N: 1% to
4% (Li) The sugar content by the phenol sulfuric acid method is approximately 16
% to 60% (glucose equivalent) and Lowry
The protein content determined by the phorin method is approximately 10% or less (calculated as bovine serum albumin).
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP1249139A JPH02223600A (en) | 1989-09-27 | 1989-09-27 | Carcinostatic substance tf-300, its production and carcinostatic agent containing the same |
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|---|---|---|---|
| JP1249139A JPH02223600A (en) | 1989-09-27 | 1989-09-27 | Carcinostatic substance tf-300, its production and carcinostatic agent containing the same |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02223600A JPH02223600A (en) | 1990-09-05 |
| JPH039120B2 true JPH039120B2 (en) | 1991-02-07 |
Family
ID=17188504
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1249139A Granted JPH02223600A (en) | 1989-09-27 | 1989-09-27 | Carcinostatic substance tf-300, its production and carcinostatic agent containing the same |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02223600A (en) |
-
1989
- 1989-09-27 JP JP1249139A patent/JPH02223600A/en active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02223600A (en) | 1990-09-05 |
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