JPH038196B2 - - Google Patents

Info

Publication number
JPH038196B2
JPH038196B2 JP29549785A JP29549785A JPH038196B2 JP H038196 B2 JPH038196 B2 JP H038196B2 JP 29549785 A JP29549785 A JP 29549785A JP 29549785 A JP29549785 A JP 29549785A JP H038196 B2 JPH038196 B2 JP H038196B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
padiase
adsorbent
present
solution
purification
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired
Application number
JP29549785A
Other languages
Japanese (ja)
Other versions
JPS62155088A (en
Inventor
Kyoshi Sugawara
Hidenari Takahara
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kirin Brewery Co Ltd
Original Assignee
Kirin Brewery Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kirin Brewery Co Ltd filed Critical Kirin Brewery Co Ltd
Priority to JP29549785A priority Critical patent/JPS62155088A/en
Publication of JPS62155088A publication Critical patent/JPS62155088A/en
Publication of JPH038196B2 publication Critical patent/JPH038196B2/ja
Granted legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 技術分野 本発明は、タンパク質アルギニン残基脱イミノ
酵素(以下、PADIase=peptidylarginine
deiminaseという)の精製法に関する。換言すれ
ば、本発明は、精製されたPADIaseの製造法に
関する。 PADIaseは、種々の動物組織、例えば脳、骨
格筋など、に広くその存在が確認されている可溶
性酵素であり、ペプチド鎖中のアルギニン残基に
特異的に作用して脱イミノ反応によりこれをシト
ルリン残基に変換する活性を有する有用なタンパ
ク質修飾酵素である。PADIaseの酵素学的性質
に関しては、ウサギ骨格筋由来のものについて本
発明者により〔ジヤーナル・オブ・バイオケミス
トリー(J.Biochem.)94、1945(1983)〕、またウ
シ脳由来のものについてクビルス(Joseph
Kubilus)らにより(ビオキミカ・エ・ビオフイ
ジカ・アクタ(Biochimica et Biophysica
Acta)745(1983)、285〜〕それぞれ詳細に報告
されている。 先行技術 PADIaseの精製法については、既にいくつか
の提案がなされている。クビルスらは、前記報告
中で、牛の脳由来のPADIaseを五段階のカラム
クロマトグラフイー(DEAE−セルロース、
DEAE−セフアデツクス、ハイドロキシアパタイ
ト、アルギニン・アガロース・リシン・アガロー
ス)により、SDS−PAGEで単一バンドとなるま
で精製しているが、このときの収率は高々4%で
あり、酵素比活性〔タンパク質単位重量当りの酵
素活性(以下同じ)〕の濃縮度は1100倍であつた。
さらに、グビルスらは、牛の表皮組織より
PADIaseを三段階のカラムクロマトグラフイー
(DEAE−セルロース、SP−セフアデツクス、ア
ルギニン・アガロース)で精製する方法について
も報告〔ザ・ジヤーナル・オブ・インベステイゲ
ーテイブ・ダーマトロジー(The Journal of
Investigative Dermatology)85:232−234
(1985)〕している。この方法の収率は26%であ
り、酵素比活性の濃縮度は472倍であつた。 一方、本発明者らは、先にウサギの骨格筋中の
PADIaseを基本的に六段階からなる精製法につ
いて報告〔ジヤーナル・オブ・バイオケミストリ
ー(J.Biochem.)94、1945〜1953(1983)〕して
いるが、この方法の収率は16%であり、酵素比活
性の濃縮度は879倍であつた。また、この精製法
においては、ダイズのトリプシン・インヒビター
をリガンドとするアフイニテイークロマトグラフ
イーが一つの段階として採用されており、この段
階においてリガンドに結合したPADIaseは水酸
化ナトリウム水溶液により溶出されていて、この
アフイニテイークロマトグラフイーによる
PADIaseの収率は49%で、酵素比活性の濃縮度
は3.8倍であつた。 以上のように、PADIase精製法としては種々
の方法が提案されているが、いずれも操作が煩雑
で収率も低く、未だ満足しうる精製法が提案され
ていないのが現状である。 〔発明の概要〕 要 旨 本発明者らは、上記諸問題を解決し、比較的簡
便かつ高収率でPADIaseを精製し得る方法を提
供することを目的として種々研究した結果、溶液
中のPADIaseを特定のペプチドないしタンパク
質に特定の条件下で吸着・溶離させることが有効
であることを見出して、本発明を完成させた。 すなわち、本発明によりPADIaseの精製法は、
溶液中のタンパク質アルギニン残基脱イミノ酵素
を、カルシウムイオンの存在下に、トリプシンイ
ンヒビターを不溶性担体に担持させてなる吸着剤
に吸着させ、この吸着剤をカルシウムイオンを含
む洗浄液で洗浄したのち、カルシウムイオンとの
キレート形成能を有するキレート剤水溶液を用い
てこの吸着剤よりタンパク質アルギニン残基脱イ
ミノ酵素を溶離させること、を特徴とするもので
ある。 発明の効果 本発明の精製法によれば、一段階処理で溶液中
のPADIaseを60%以上の収率で、その酵素比活
性を20倍以上に濃縮することができる。さらに、
本発明の好ましい実施態様の一つとして、本発明
の精製法をイオン交換クロマトグラフイーと組み
合わせて用いれば、二段階からなる簡便な操作に
より、動物組織の抽出液よりPADIaseを非常に
効率よく(収率:50%以上、酵素比活性の濃縮
率:1790倍、得られたPADIaseはSDS−PAGE
で単一バンド)精製することできる(実施例2参
照)。 本発明によつて一段階で高い収率と高い濃縮率
とを得ることができたことは多段階の処理を必要
としていた従来の精製法からみて予想外のことで
あり、特にトリプシンインヒビターをリガンドと
するアフイニテイークロマトグラフイーからなる
単位精製工程で溶離剤として水酸化ナトリウムを
使用した場合の収率および濃縮度、特に後者、と
比較したときの本発明カルシウムキレート剤によ
る溶離の特異さは思いがけなかつたことというこ
とができよう。 〔発明の具体的説明〕 吸着剤 本発明で吸着剤の吸着基として使用するペプチ
ドないしタンパク質は、上位概念的にいえばその
分子表面にアルギニン残基を突出させて有するも
のである。このようなペプチドないしタンパク質
としては活性部位残基としてアルギニン残基を有
するトリプシン・インヒビターがあり、その具体
例としては、ダイズ・クニツツ・トリプシン・イ
ンヒビター(以下、STI=Soybean Trypsin
Inhibitorという)、タマネギ・トリプシン・イン
ヒビター、ウシ膵臓分泌型トリプシン・インヒビ
ター、およびこれらと相同性を示すポリペプチド
を例示することができる。 本発明においては、これらのペプチドないしタ
ンパク質を不溶性担体に担持させてすなわち固定
化して使用する。固定化法としては、合目的的な
任意の公知方法を使用することができる。具体的
には、不溶性担体としてはアガロース、デキスト
ラン、セルロース、ポリアクリルアミド等を、ま
た固定化はアミノ基、カルボキシル基等を官能基
とする共有結合法、不溶性担体のマトリツクス中
への物理的封じ込め法等によることができる。な
お、このようにしてペプチドないしタンパク質を
固定化(担持)させた不溶性担体からなる吸着剤
は、精製操作上取扱いが容易であるような粒状物
として調製されるのがふつうである。 PADIase 本発明において精製の対象となるPADIaseと
しては特に限定はなく、本発明で吸着基として使
用するペプチドないしタンパク質に吸着し得る任
意のものが用いられる。このようなPADIaseの
具体例としては、例えば、前記の文献に報告され
ている酵素(ウサギの骨格筋、牛の脳、牛の上皮
等に由来するもの)などがあげられる。 なお、本発明で「PADIase」とは、タンパク
質またはペプチド分子中のアルギニン残基に作用
してこれをシルトリン残基に変換する活性を有す
る酵素を意味する。 PADIaseの精製 本発明においては、PADIase水溶液を精製の
対象とするが、動物組織中のPADIaseを精製す
る場合には、該組織を水溶液中で均質化する等の
処理に付すことによりPADIaseを予め抽出して
から、該抽出液を本発明により精製すればよい。
また、PADIaseを高純度に精製する場合は、溶
液中のPADIaseを、予め陰イオン交換クロマト
グラフイーにより精製(予備精製)してから、本
発明の方法により精製するのが効果的である。こ
の予備精製のための陰イオン交換クロマトグラフ
イーにおいては、陰イオン交換体としては陰イオ
ン交換基としてDEAE基(ジエチルアミノエチ
ル)、AH基(アミノヘキシル)、等を有するもの
が好適であり、溶液中のPADIaseを好ましくは
PH6〜9においてこれらの陰イオン交換体に吸着
させ、これを適当な洗浄液で洗浄した後、塩化ナ
トリウム、塩化カルシウム等の塩類溶液を用いて
PADIaseを溶出させればよい。なお、この陰イ
オン交換クロマトグラフイーの具体的実施様態に
ついては、ジヤーナル・オブ・バイオケミストリ
ー(J.Biochm.)94、1945(1983)にも報告され
ている。 PADIaseの水溶液を本発明により精製するに
は、まず該水溶液をカルシウムイオンの共存下で
前記吸着剤と接触させ、該水溶液中のPADIase
を該吸着剤上の吸着基としてのペプチドないしタ
ンパク質に吸着させる。共存させるカルシウムイ
オンの濃度は0.2mM以上、特に0.6mM以上、が
好ましい。カルシウムイオンの供給源としては、
水溶性カルシウム化合物、例えば塩化カルシウ
ム、その他がある。なお、精製中のPADIaseの
変性ないし分解を抑えるため、必要に応じて、
DTT、2−メルカプトエタノール等の還元剤、
プロテアーゼ・インヒビターその他を共存させて
おくのが好ましい。また、この吸着工程はカルシ
ウムイオンのみの存在下に行なうものではないの
であつて、カルシウムイオンの効果を阻害しない
限り、他の金属イオン、例えばアルカリ金属イオ
ンが、共存していてもよい。 次いで、PADIaseを吸着した吸着剤をカルシ
ウムイオンを含む洗浄液で洗浄する。この洗浄液
は、好ましくは0.2mM以上のカルシウムイオン
を含むものであつて、PADIaseを溶離すること
なく吸着剤に非特異的に吸着ないし付着している
物質を除去できるものが用いられ、具体的にはカ
ルシウムイオン供給源(その具体例については上
記参照)は別として塩化ナトリウム、塩化カリウ
ム等の水溶液を例示することができる。この洗浄
液はカルシウムイオンを含むものであり、従つて
これはカルシウム供給源(たとえば、塩化カルシ
ウム)の水溶液そのものであつてもよい。 その後、カルシウムイオンとキレート形成能を
有するキレート剤の水溶液を用いて吸着剤に吸着
したPADIaseを溶離させる。この目的のために
使用することのできるキレート剤としては、エチ
レングリコール・ビス(β−アミノエチル・エー
テル)−N、N、N′、N′−四酢酸(EGTA)、エ
チレンジアミン四酢酸(EDTA)、クエン酸等を
例示することができる。また、キレート剤の濃度
については特に制限はないが、数mM以上の濃度
で使用するのが普通である。さらに、このキレー
ト剤の水溶液は必要に応じて塩化ナトリウム、塩
化カリウム等の塩酸を含んでいてもよい。 本発明で精製に供するPADIase溶液、洗浄液
およびキレート剤水溶液(溶離液)のPHは酵素を
失活させないPHであれば適宜選択し得るが、酵素
の回収率から特に6〜9の範囲にあることが望ま
しい。また、精製操作温度も、PADIaseを失活
させない温度であれば適宜選択し得るが、吸着剤
を繰り返し使用するためには低温、特に5℃以
下、で操作することが好ましい。 本発明精製法の実施態様としてはバツチ法とカ
ラムクロマトグラフイー(=アフイニテイークロ
マトグラフイー)法の二つが考えられるが、いず
れによつてもPADIaseの精製が可能である。こ
れらの具体的な操作手順そのものはタンパク精製
の分野において慣用されているものでありうるの
で、本発明において特記したところ以外のものに
ついてはこれらの慣用技術に準じて実施すればよ
い。 実験例 以下の実験例において、PADIaseの活性測定
はジヤーナル・オブ・バイオケミストリー(J.
Biochm.)、94 1945(1983)に記載の方法を用い
た。 参考例 (試料の調製) 新鮮なウサギの骨格筋を5倍量の緩衝液A(20
mMトリス塩酸PH7.6、10mM2−メルカプトエタ
ノール、1mMEDTA、0.43mMフエニルメチル
スルホニル・フルオライド)中でホモジナイザー
にて均一化し、得られたホモジネートをナイロン
ガーゼで炉過し、炉液を10000×gで30分間遠心
分離した。この上清を、予め0.1MNaClを含む緩
衝液Aで平衡化された「DEAE−セフアセル」
(フアルマシア社製)カラムにかけた。このカラ
ムを流出液のA280nmが0.05以下となるまでこの
緩衝液で洗浄した後、緩衝液A中のNaClの直線
的な濃度勾配(0.1→0.5M)によりPADIaseを溶
出させた。得られた活性画分をプールし、これに
等量の飽和硫酸アンモニウム水溶液を加えて
PADIaseを沈澱させて50%飽和硫酸アンモニウ
ム水溶液中にサスペンシヨンとして保存した。 実施例 1 参考例により得られたPADIase(約470U、
25U/mg−タンパク質)を遠心分離して集め、10
mMCaCl2を含む緩衝液B(20mMトリス塩酸
(PH:7.6)、10%グリセロール、0.1MNaCl、10m
M2−メルカプトエタノール、10mMDTT)に溶
解し、多量の同緩衝液に対して透析した後、同緩
衝液で予め平衡化された「STI−セフアロース」
カラム(1.0×12cm)〔ジヤーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリー(j.Biol.Chem.)、245
3059(1970)〕にかけた。次いで、このカラムを同
緩衝液で洗浄後、10mMEGTAを含む緩衝液B
でカラムよりPADIaseを溶出させた。このとき
のタンパク質および酵素活性の溶出パターンは、
添付の図面に示す通りであつた。なお、タンパク
質はリードおよびノースコート(Read&
Northcote)法〔アナリテイカル・バイオケミス
トリー(Anal.Biochem.)、166、53(1981)〕によ
り測定した。この操作で得られたPADIaseの比
活性は560U/mgタンパク質であつてその濃縮度
は22.4倍であり、収率は60%であつた。また、得
られたPADIaseは、SDS−PAGEで単一バンド
(電気泳動的に均一)であつた。 実施例 2 新鮮なウサギの骨格筋3.0Kgを用いて、参考例
並びに実施例1と同一の条件でPADIaseの精製
を行なつた。このときの精製結果は、下表に示す
通りであつた。なお、このとき得られた
PADIaseもSDS−PAGEで単一バンドであつた。 【表】
[Detailed Description of the Invention] [Background of the Invention] Technical Field The present invention relates to protein arginine residue deiminase (hereinafter referred to as PADIase = peptidylarginine deiminase).
Concerning the purification method of deiminase). In other words, the present invention relates to a method for producing purified PADIase. PADIase is a soluble enzyme that has been widely confirmed to exist in various animal tissues, such as the brain and skeletal muscle, and it specifically acts on arginine residues in peptide chains, converting them into citrulline through a deimination reaction. It is a useful protein-modifying enzyme that has the activity of converting into residues. Regarding the enzymatic properties of PADIase, the one derived from rabbit skeletal muscle was reported by the present inventor [J.Biochem. 94, 1945 (1983)], and the one derived from bovine brain was reported by Kubirus ( Joseph
(Biochimica et Biophysica acta) by Kubilus et al.
Acta) 745 (1983), 285~] Each is reported in detail. Prior Art Several proposals have already been made regarding methods for purifying PADIase. In the above report, Kubirus et al. reported that PADIase derived from bovine brain was subjected to five-step column chromatography (DEAE-cellulose,
DEAE-cephadex, hydroxyapatite, arginine-agarose-lysine-agarose) is used to purify the product until a single band is obtained on SDS-PAGE, but the yield is only 4% at most, and the enzyme specific activity [protein The concentration of enzyme activity per unit weight (the same applies hereinafter) was 1100 times.
Furthermore, Gubils et al.
A method for purifying PADIase by three-step column chromatography (DEAE-cellulose, SP-cephadex, arginine agarose) was also reported [The Journal of Investigative Dermatology].
Investigative Dermatology) 85:232-234
(1985)]. The yield of this method was 26% and the enrichment of enzyme specific activity was 472 times. On the other hand, the present inventors previously reported that
A purification method for PADIase that basically consists of six steps was reported [J.Biochem. 94, 1945-1953 (1983)], but the yield of this method was 16%. , the enrichment degree of enzyme specific activity was 879 times. In addition, this purification method employs affinity chromatography using soybean trypsin inhibitor as a ligand, and in this step, PADIase bound to the ligand is eluted with an aqueous sodium hydroxide solution. , by this affinity chromatography
The yield of PADIase was 49%, and the concentration of specific enzyme activity was 3.8 times. As mentioned above, various methods have been proposed as PADIase purification methods, but all of them require complicated operations and have low yields, and so far no satisfactory purification method has been proposed. [Summary of the Invention] Summary The present inventors have conducted various studies aimed at solving the above problems and providing a relatively simple and high-yield method for purifying PADIase. The present invention was completed by discovering that it is effective to adsorb and elute peptides or proteins under specific conditions. That is, the method for purifying PADIase according to the present invention is as follows:
The protein arginine residue deiminase in the solution is adsorbed in the presence of calcium ions to an adsorbent made of trypsin inhibitor supported on an insoluble carrier, and after washing this adsorbent with a washing solution containing calcium ions, calcium This method is characterized in that protein arginine residue deiminase is eluted from this adsorbent using an aqueous solution of a chelating agent that has the ability to form a chelate with ions. Effects of the Invention According to the purification method of the present invention, PADIase in a solution can be concentrated in a yield of 60% or more and the enzyme specific activity can be concentrated by 20 times or more in a single step treatment. moreover,
As one of the preferred embodiments of the present invention, if the purification method of the present invention is used in combination with ion exchange chromatography, PADIase can be purified from animal tissue extracts very efficiently ( Yield: 50% or more, Enzyme specific activity enrichment rate: 1790 times, the obtained PADIase was subjected to SDS-PAGE
(see Example 2). The fact that the present invention was able to obtain high yields and high enrichment rates in one step was unexpected in view of conventional purification methods that required multiple steps. The uniqueness of the elution with the calcium chelating agent of the present invention is unexpected when compared with the yield and concentration, especially the latter, when sodium hydroxide is used as the eluent in a unit purification step consisting of affinity chromatography. You could say that it happened. [Detailed Description of the Invention] Adsorbent Generally speaking, the peptide or protein used as the adsorption group of the adsorbent in the present invention has an arginine residue protruding from its molecular surface. Examples of such peptides or proteins include trypsin inhibitors having an arginine residue as an active site residue; a specific example is soybean trypsin inhibitor (STI).
Inhibitor), onion trypsin inhibitor, bovine pancreatic secretory trypsin inhibitor, and polypeptides showing homology thereto. In the present invention, these peptides or proteins are supported on an insoluble carrier, that is, immobilized, and used. As the immobilization method, any suitable known method can be used. Specifically, insoluble carriers include agarose, dextran, cellulose, polyacrylamide, etc.; immobilization involves covalent bonding using amino groups, carboxyl groups, etc. as functional groups, and physical containment of the insoluble carrier in a matrix. etc. The adsorbent made of an insoluble carrier on which peptides or proteins are immobilized (supported) in this manner is usually prepared in the form of granules that are easy to handle during purification operations. PADIase The PADIase to be purified in the present invention is not particularly limited, and any substance that can adsorb to the peptide or protein used as an adsorption group in the present invention can be used. Specific examples of such PADIases include enzymes (derived from rabbit skeletal muscle, bovine brain, bovine epithelium, etc.) reported in the above-mentioned literature. In the present invention, "PADIase" refers to an enzyme having the activity of acting on an arginine residue in a protein or peptide molecule and converting it into a silthrin residue. Purification of PADIase In the present invention, an aqueous PADIase solution is the target of purification, but when purifying PADIase in animal tissue, PADIase is extracted in advance by subjecting the tissue to a treatment such as homogenizing it in an aqueous solution. After that, the extract may be purified according to the present invention.
Furthermore, when purifying PADIase to a high purity, it is effective to purify PADIase in a solution in advance by anion exchange chromatography (prepurification) and then purify it by the method of the present invention. In this anion exchange chromatography for preliminary purification, it is preferable to use anion exchangers having DEAE groups (diethylaminoethyl), AH groups (aminohexyl), etc. as anion exchange groups, and Preferably PADIase in
It is adsorbed onto these anion exchangers at pH 6 to 9, washed with an appropriate washing solution, and then washed with a salt solution such as sodium chloride or calcium chloride.
All you have to do is elute PADIase. A specific embodiment of this anion exchange chromatography is also reported in Journal of Biochemistry (J. Biochm.) 94, 1945 (1983). In order to purify an aqueous solution of PADIase according to the present invention, the aqueous solution is first brought into contact with the adsorbent in the presence of calcium ions, and the PADIase in the aqueous solution is
is adsorbed onto the peptide or protein as an adsorption group on the adsorbent. The concentration of calcium ions coexisting is preferably 0.2 mM or more, particularly 0.6 mM or more. As a source of calcium ions,
Water soluble calcium compounds such as calcium chloride, etc. In addition, in order to suppress denaturation or decomposition of PADIase during purification, if necessary,
Reducing agents such as DTT and 2-mercaptoethanol,
It is preferable to coexist with protease inhibitors and the like. Furthermore, this adsorption step is not carried out in the presence of only calcium ions, and other metal ions, such as alkali metal ions, may coexist as long as they do not inhibit the effects of calcium ions. Next, the adsorbent that has adsorbed PADIase is washed with a washing solution containing calcium ions. This washing solution preferably contains 0.2mM or more of calcium ions and is capable of removing substances nonspecifically adsorbed or attached to the adsorbent without eluting PADIase. Apart from the calcium ion source (see above for specific examples), examples of the source include aqueous solutions of sodium chloride, potassium chloride, and the like. This cleaning solution contains calcium ions and therefore may be an aqueous solution of a calcium source (eg calcium chloride) itself. Thereafter, the PADIase adsorbed on the adsorbent is eluted using an aqueous solution of a chelating agent that has the ability to form a chelate with calcium ions. Chelating agents that can be used for this purpose include ethylene glycol bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA), ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) , citric acid, etc. Further, there is no particular restriction on the concentration of the chelating agent, but it is usually used at a concentration of several mM or more. Furthermore, the aqueous solution of the chelating agent may contain hydrochloric acid such as sodium chloride, potassium chloride, etc., if necessary. The pH of the PADIase solution, washing solution, and aqueous chelating agent solution (eluent) used for purification in the present invention can be appropriately selected as long as it does not deactivate the enzyme, but it should be in the range of 6 to 9 in particular from the viewpoint of enzyme recovery rate. is desirable. Further, the purification operation temperature can be appropriately selected as long as it does not deactivate PADIase, but in order to use the adsorbent repeatedly, it is preferable to operate at a low temperature, particularly 5° C. or lower. There are two possible embodiments of the purification method of the present invention: a batch method and a column chromatography (=affinity chromatography) method, and PADIase can be purified by either method. Since these specific operating procedures themselves may be those commonly used in the field of protein purification, procedures other than those specifically mentioned in the present invention may be carried out according to these commonly used techniques. Experimental Example In the following experimental example, the activity of PADIase was measured using the Journal of Biochemistry (J.
Biochm.), 94 1945 (1983) was used. Reference example (sample preparation) Fresh rabbit skeletal muscle was mixed with 5 times the volume of buffer A (20
The homogenate was homogenized in a homogenizer (mM Tris-HCl PH7.6, 10mM 2-mercaptoethanol, 1mM MEDTA, 0.43mM phenylmethylsulfonyl fluoride), the resulting homogenate was filtered through a nylon gauze, and the furnace solution was heated at 10,000 x g. Centrifuged for 30 minutes. This supernatant was added to "DEAE-Sefacel" which had been equilibrated with buffer A containing 0.1M NaCl.
(manufactured by Pharmacia) column. After washing the column with this buffer until the A280nm of the effluent was 0.05 or less, PADIase was eluted with a linear concentration gradient of NaCl in buffer A (0.1→0.5M). The obtained active fractions were pooled and an equal volume of saturated ammonium sulfate aqueous solution was added to this.
The PADIase was precipitated and stored in suspension in 50% saturated aqueous ammonium sulfate. Example 1 PADIase (approximately 470U,
25U/mg protein) was collected by centrifugation and
Buffer B containing mMCaCl2 (20mM Tris-HCl (PH: 7.6), 10% glycerol, 0.1M NaCl, 10mM
"STI-Sepharose" dissolved in M2-mercaptoethanol, 10mM MDTT), dialyzed against a large amount of the same buffer, and equilibrated in advance with the same buffer.
Column (1.0 x 12cm) [Journal of Biological Chemistry (j.Biol.Chem.), 245 ,
3059 (1970)]. Next, after washing this column with the same buffer, buffer B containing 10mMEGTA was added.
PADIase was eluted from the column. The elution pattern of protein and enzyme activity at this time is
It was as shown in the attached drawing. In addition, the proteins are Read and Northcote (Read & Northcote).
Northcote method [Analytical Biochem., 166 , 53 (1981)]. The specific activity of PADIase obtained by this operation was 560 U/mg protein, the concentration was 22.4 times, and the yield was 60%. Furthermore, the obtained PADIase showed a single band (electrophoretically homogeneous) on SDS-PAGE. Example 2 Using 3.0 kg of fresh rabbit skeletal muscle, PADIase was purified under the same conditions as in Reference Example and Example 1. The purification results at this time were as shown in the table below. In addition, obtained at this time
PADIase also showed a single band on SDS-PAGE. 【table】

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of the drawing]

図面は、実施例1でのタンパク質および酵素活
性の溶出パターンを示すグラフである。
The figure is a graph showing the elution pattern of protein and enzyme activity in Example 1.

Claims (1)

【特許請求の範囲】[Claims] 1 溶液中のタンパク質アルギニン残基脱イミノ
酵素を、カルシウムイオンの存在下に、トリプシ
ンインヒビターを不溶性担体に担持させてなる吸
着剤に吸着させ、この吸着剤をカルシウムイオン
を含む洗浄液で洗浄したのち、カルシウムイオン
とのキレート形成能を有するキレート剤水溶液を
用いてこの吸着剤よりタンパク質アルギニン残基
脱イミノ酵素を溶離させることを特徴とする、タ
ンパク質アルギニン残基脱イミノ酵素の精製法。
1. Protein arginine residue deiminase in a solution is adsorbed in the presence of calcium ions on an adsorbent made of trypsin inhibitor supported on an insoluble carrier, and after washing this adsorbent with a washing solution containing calcium ions, 1. A method for purifying protein arginine residue deiminase, which comprises eluting the protein arginine residue deiminase from this adsorbent using an aqueous solution of a chelating agent having the ability to form a chelate with calcium ions.
JP29549785A 1985-12-26 1985-12-26 Purification of protein arginine deiminase Granted JPS62155088A (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP29549785A JPS62155088A (en) 1985-12-26 1985-12-26 Purification of protein arginine deiminase

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP29549785A JPS62155088A (en) 1985-12-26 1985-12-26 Purification of protein arginine deiminase

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPS62155088A JPS62155088A (en) 1987-07-10
JPH038196B2 true JPH038196B2 (en) 1991-02-05

Family

ID=17821374

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP29549785A Granted JPS62155088A (en) 1985-12-26 1985-12-26 Purification of protein arginine deiminase

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JPS62155088A (en)

Also Published As

Publication number Publication date
JPS62155088A (en) 1987-07-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Aronsson et al. Characterization of glyoxalase I purified from pig erythrocytes by affinity chromatography
JPH05227962A (en) Virus-safety refined human thrombin
US4259447A (en) Process for the production of urokinase in pure condition
US5831025A (en) Human activated protein C and process for preparing same
US4189350A (en) Process for purifying urokinase
JPH038196B2 (en)
US4160697A (en) Method for purification of crude urokinase
WO1988001294A1 (en) Process for separating single-strand tpa and double-strand tpa from each other
EP0358274B1 (en) Method for purifying tissue plasminogen activator
JPH0147997B2 (en)
JP2882828B2 (en) Method for purifying human urinary trypsin inhibitor
JPH0260316B2 (en)
KR830001822B1 (en) Production method of euro kinase
KR100392779B1 (en) Process for the preparation of authentic protein by use of immobilized aminopeptidase
JP2714817B2 (en) Method for producing urokinase precursor
JPH04365481A (en) Production of thrombin
JPH0779692B2 (en) Method for separating single-stranded t-PA and double-stranded t-PA
KR790001535B1 (en) Process for extracting urokinase
JPH04126092A (en) Removing of protein derived from escherichia coli
KR790001376B1 (en) Process for purifying and recovering urokinase
JPS5838150B2 (en) Kallikrein purification method
JPH0768274B2 (en) Method for producing plasminogen
JP2004244348A (en) Method for haptoglobin purification
JPH03244390A (en) Method for removing substance derived from escherichia coli
JPS5816874B2 (en) Purification method of urokinase

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

EXPY Cancellation because of completion of term