【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
＜産業上の利用分野＞
本発明は1α，23，25，26−テトラヒドロキシ
ビタミンD3に関する。更に詳細には、本発明は
腸管からのカルシウム吸収を促進し、血清中のカ
ルシウムレベルを上昇させる作用を有し、それ故
骨軟化症等の治療薬として有用な1α，23，25，
26−テトラヒドロキシビタミンD3に関する。
＜従来の技術＞
近年、1α，25−ジヒドロキシビタミンD3の代
謝産物として1α，25−ジヒドロキシビタミンD3
−26，23−ラクトンか単離されその医薬品として
の可能性が種々検討されている〔アーカスブス・
オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフイ
ジツクス（Arch.Biochem.Biophys.），204，387
−．391（1980）；ヘブス・レーターズ（FEBS
Lett.），134，207−211（1981）；バイオケミスト
リー（Biochemistry），23，1473−1478（1984）〕。
1α，25−ジヒドロキシビタミンD3−26，23−
ラクトンの薬理作用としては、骨形成を促進し、
骨吸収を抑制する作用を有することが報告されて
いる〔ジヤーナル・オブ・ステロイド・バイオケ
ミストリー（J.Steroid.Biochem.），20，611−
616（1984）；バイオケミカル・アンド・バイオフ
イジクス・リサーチ・コミユニケーシヨンズ
（Bioche−m.Biophys.Res.Commun.），127，693
−698（1985）〕。
そして1α，25−ジヒドロキシビタミンD3の代
謝経路として、1α，25−ジヒドロキシビタミン
D3が最初1α，23（Ｒ），25−トリヒドロキシビタ
ミンD3あるいは1α，25（Ｒ），26−トリヒドロキ
シビタミンD3に変換され、次いで1α，23（Ｓ），
25（Ｒ），26−テトラヒドロキシビタミンD3を経
由をして1α，25−ジヒドロキシビタミンD3−26，
23−ラクトンが生成されることが提案されている
〔ビタミンＤ（VitaminD）：ケミカル・バイオケ
ミカル・アンド・クリニカル・アツプデート、ウ
オルター・デ・グレイター・アンドカンパニ，ベ
ルリン（Chemical，Biochemical and Clinical
Update，Walter de Gruyter and Company，
Berlin），402−403（1985）。しかしながらこの提
案では、実際に1α，23（Ｓ），25（Ｒ），26−テト
ラヒドロキシビタミンD3等の代謝産物を単離し
ておらず、あくまで推定であり、その薬理作用も
不明である。
＜発明が解決しようとする問題点＞
本発明者らは、1α，25−ジヒドロキシビタミ
ンD3の代謝産物の一種と予想される1α，23，25，
26−テトラヒドロキシビタミンD3を得、その薬
理作用を検討することを目的として鋭意研究した
結果、1α，25−ジヒドロキシビタミンD3−26，
23−ラクトンを還元することによつて化学合成的
に1α，23，2526−テトラヒドロキシビタミンD3
が得られ、かかる化合物は、腸管からのカルシウ
ム吸収を促進し、血清中のカルシウムレベルを上
昇せしめる作用を有し医薬品として極めて有用で
あることを、特に1α，23（Ｒ），25（Ｒ），26−テ
トラヒドロキシビタミンD3が強力な薬理作用を
有し医薬品として有用であることを見出し本発明
に到達したものである。
＜問題点を解決するための手段＞
本発明では下記式
で表わされる1α，23，25，26−テトラヒドロキ
シビタミンD3が提供される。かかる化合物は、
従来単離されたことがなくまたその生理活性につ
いても不明な化合物である。
上記式において、23位及び25位の炭素は不斉炭
素に基づく全ての立体異性体を包含する。すなわ
ち本発明の化合物を挙げると次のとおりである。
1α，23（Ｓ），25（Ｓ），26−テトラヒドロキシ
ビタミンD3、
1α，23（Ｒ），25（Ｒ），26−テトラヒドロキシ
ビタミンD3、
1α，23（Ｓ），25（Ｒ），26−テトラヒドロキシ
ビタミンD3、
1α，23（Ｒ），25（Ｓ），26−テトラヒドロキシ
ビタミンD3。
1α，23，25，26−テトラヒドロキシビタミン
D3は、腸管におけるカルシウム吸収を促進し、
血清中のカルシウムレベルを上昇させる作用を有
し、例えば骨粗鬆症、骨軟化症等の骨疾患の治療
薬として極めて有用なものである。なかでも特
に、1α，23（Ｒ），25（Ｒ），26−テトラヒドロキ
シビタミンD3が治療薬として有望なものである。
で表わされる1α，25−ジヒドロキシビタミンD3
−26，23−ラクトンを不活性有機溶媒中、水素化
金属類で還元することによつて得られる。
1α，25−ジヒドロキシビタミンD3−26，23−
ラクトンは、例えば、U.S.PatertNo.４，307，
231，特開昭59−144778号公報等に記載の方法に
より製造し得る。不活性有機溶媒としては、例え
ばエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサンな
どのエーテル類；トルエン、キシレンなどの芳香
族炭化水素類が好ましく挙げられる。水素化金属
類としては、例えばリチウム水素化アルミニウ
ム、ジイソブチル水素化アルミニウム等が挙げら
れる。反応は通常、室温で、30分〜２時間撹拌す
ることによつて進行する。反応後、目的物を単離
精製するには公知の方法、例えば再結晶、クロマ
トグラフイー等の手段により行なうことができ
る。
＜発明の効果＞
本発明で提供される1α，23，25，26−テトラ
ヒドロキシビタミンD3は、腸管からのカルシウ
ム吸収を促進し、血清中のカルシウムレベルを上
昇させる作用を有し、骨粗鬆症、骨軟化症等の治
療薬として極めて有用である。
＜実施例＞
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明す
る。
実施例 １
1α，23，25，26−（OH）4D3の４種立体異性体
の合成
原料化合物1α，25−（OH）2D3−26，23−ラク
トンの４種立体異性体は公知の方法〔アーカイブ
ス・オブ・バイオケミストリー・アンドバイオフ
イズクス（Arch.Biochem.Biophys.）242，82−
89（1985）〕で合成した。1α，23（Ｓ）25（Ｓ）26
−（OH）4D3の合成は以下の様に合成した。200μ
ｇの23（Ｓ）25（Ｓ）−1α，25−（OH）2D3−26，23
−ラクトンを１mlの無水テトラヒドロフランに溶
解し、これに１mgのリチウム水素化アルミニウム
を加え25℃で60分間反応した。反応は２mlの水を
加えることによつて停止し、反応生成物は２mlの
酢酸エチルで２回抽出した。抽出物は4.6×250mm
のゾルバツクスSilカラムを用いた高速液体クロ
マトグラフイーにのせ20％イソプロパノール−ノ
ルマルヘキサン系で溶出させて1α，23（Ｓ）25
（Ｓ）26−（OH）4D3を精製した。この方法によつ
て57.882μｇの1α，23（Ｓ）25（Ｓ）26−（OH）4D3
を合成した。同様の方法により200μｇの23（Ｒ）
25（Ｒ）−，23（Ｓ）25（Ｒ）−，および23（Ｒ）25
（Ｓ）−1α，25−（OH）2D3−26，23−ラクトンか
ら57.174μｇの1α，23（Ｒ）25（Ｒ）26−
（OH）4D3，51.635μｇの1α，23（Ｓ）25（Ｒ）26−
（OH）4D3および53.802μｇの1α，23（Ｒ）25（Ｓ）
26−（OH）4D3を合成した。合成した化合物の構
造決定は紫外線吸収スペクトル（UVスペクト
ル）およびマススペクトルによつて行なつた。す
なわち、合成した1α，23（Ｓ）25（Ｒ）26−
（OH）4D3のUVスペクトルは、264nｍに極大級数
を、228nｍに極小吸収を示し、典型的な５，６
−シス−トリエン構造を有することがわかつた。
合成した1α，23（Ｓ）25（Ｒ）26−（OH）4D3のマ
ススペクトルは次のピークを与えた。分子イオン
（M+）448，430（M+−H2O），412（M+−2H2O）
394（M+−3H2O），376（M+−4H2O），287（M+−
側鎖）、269（M+側鎖−H2O），251（M+−側鎖−
2H2O），152（Ａ環フラグメント）134（Ａ環フラ
グメント−H2O）このマススペクトルより側鎖
に３個の水酸基が存在することが分かり合成の出
発物質からの考え1α，23（Ｓ）25（Ｒ）26−
（OH）4D3になつていることが分かつた。他の合
成化合物についても全く同じUVスペクトルとマ
ススペクトルを測定し、同様にして構造決定し
た。
実施例 ２
チツク小腸粘膜細胞質内1α，25−（OH）2D3−
リセプターに対する結合親和性の検討
チツク小腸粘膜細胞質内1α，25−（OH）2D3リ
セプターの単離およびリセプター結合親和性は公
知の方法〔ステロイズ（Steroids），37，33−43
（1981）〕で検討した。
すなわち12×75mmのポリプロピレンチユーブに
20pgの〔26，27−メチル−3H〕1α，25−
（OH）2D3（158Ci／ｍmol，16800dpm）と実施例
１で得られた種々のビタミンD3類縁体を50μの
エタノールに溶解して加えこれにリン酸バツフア
ー（PH7.4）１mlにチツク小腸粘膜細胞質内1α，
25−（OH）2D3−リセプター蛋白質0.3mgと１mgの
ゲラチンを溶解したものを加え25℃で１時間反応
させた。反応後40％ポリエチレングリコール6000
溶液１mlを各々のチユーブに加えはげしく撹拌後
４℃で2260×ｇ60分間遠心分離した。沈澱部分の
チユーブをカツターナイフで切り取り液体シンチ
レーシヨン用バイアルに入れ８mlのジオキサンシ
ンチレーターを加えて放射能を液体シンチレーシ
ヨンカウンターで測定した。
結果は表１に示した。表１から明らかなように
チツク小腸粘膜細胞質内1α，25−（OH）2D3−リ
セプターに結合した〔 3H〕1α，25−（OH）2D3
を置換させる能力は1α，23（Ｒ）25（Ｒ）26−
（OH）4D3が最も強く次いで1α，23（Ｓ）25（Ｓ）
26−（OH）4D3，1α，23（Ｓ）25（Ｒ）26−
（OH）4D3，および1α，23（Ｒ）25（Ｒ）26−
（OH）4D3の順に弱くなり1α，25−（OH）2D3に比
較してそれぞれ１／10.5、１／100.4、１／215.9
および１／442.7のリセプター結合親和性を有し
ていた。このことから1α，23（Ｒ），25（Ｒ），26
−（OH）4D3が最も強い1α，25−（OH）2D3様活性
を有することが予想される。
<Industrial Application Field> The present invention relates to 1α,23,25,26-tetrahydroxyvitamin D3 . More specifically, the present invention provides 1α, 23, 25,
Regarding 26-tetrahydroxyvitamin D3 . <Prior art> In recent years, 1α,25-dihydroxyvitamin D3 has been developed as a metabolite of 1α,25-dihydroxyvitamin D3.
-26,23-lactone has been isolated and its potential as a pharmaceutical has been investigated [Arcusbus
of Biochemistry and Biophysics (Arch.Biochem.Biophys.), 204 , 387
−． 391 (1980); Hebs Raters (FEBS
Lett.), 134 , 207-211 (1981); Biochemistry, 23 , 1473-1478 (1984)]. 1α,25-dihydroxyvitamin D 3 −26,23−
The pharmacological action of lactone is to promote bone formation,
It has been reported that it has the effect of inhibiting bone resorption [J.Steroid.Biochem., 20 , 611-
616 (1984); Biochemical and Biophysics Research Communications (Bioche-m.Biophys.Res.Commun.), 127 , 693
−698 (1985)]. And as a metabolic pathway of 1α,25-dihydroxyvitamin D3 , 1α,25-dihydroxyvitamin
D 3 is first converted to 1α,23(R),25-trihydroxyvitamin D 3 or 1α,25(R),26-trihydroxyvitamin D 3 and then 1α,23(S),
1α,25-dihydroxyvitamin D 3 -26 via 25(R),26-tetrahydroxyvitamin D 3 ,
It has been proposed that 23-lactones are produced [Vitamin D: Chemical, Biochemical and Clinical Updates, Walter de Graeter & Company, Berlin (Chemical, Biochemical and Clinical Updates).
Update，Walter de Gruyter and Company，
Berlin), 402-403 (1985). However, this proposal does not actually isolate metabolites such as 1α, 23(S), 25(R), 26-tetrahydroxyvitamin D3 , etc., and is only a guess, and its pharmacological effects are also unknown. <Problems to be Solved by the Invention> The present inventors have discovered that 1α,23,25, which is predicted to be a type of metabolite of 1α,25-dihydroxyvitamin D3 ,
As a result of intensive research aimed at obtaining 26-tetrahydroxyvitamin D 3 and examining its pharmacological effects, we found that 1α,25-dihydroxyvitamin D 3 -26,
1α,23,2526-tetrahydroxyvitamin D 3 chemically synthesized by reducing 23-lactone
This compound has the effect of promoting calcium absorption from the intestinal tract and increasing the calcium level in serum, and is extremely useful as a pharmaceutical. The present invention was achieved by discovering that , 26-tetrahydroxyvitamin D 3 has a strong pharmacological effect and is useful as a pharmaceutical. <Means for solving the problem> In the present invention, the following formula 1α,23,25,26-tetrahydroxyvitamin D 3 is provided. Such compounds are
It is a compound that has never been isolated and its physiological activity is unknown. In the above formula, the carbons at the 23rd and 25th positions include all stereoisomers based on asymmetric carbon atoms. That is, the compounds of the present invention are as follows. 1α,23(S),25(S),26-tetrahydroxyvitamin D3 , 1α,23(R),25(R),26-tetrahydroxyvitamin D3,1α ,23(S),25(R ), 26-tetrahydroxyvitamin D3 , 1α,23(R),25(S),26-tetrahydroxyvitamin D3 . 1α,23,25,26-tetrahydroxyvitamin
D3 promotes calcium absorption in the intestinal tract,
It has the effect of increasing serum calcium levels and is extremely useful as a therapeutic agent for bone diseases such as osteoporosis and osteomalacia. Among these, 1α,23(R),25(R),26-tetrahydroxyvitamin D3 is particularly promising as a therapeutic agent. 1α,25-dihydroxyvitamin D expressed as 3
Obtained by reducing -26,23-lactone with metal hydride in an inert organic solvent. 1α,25-dihydroxyvitamin D 3 −26,23−
Lactones are, for example, US Patert No. 4, 307,
231, JP-A-59-144778, and the like. Preferred examples of the inert organic solvent include ethers such as ether, tetrahydrofuran, and dioxane; and aromatic hydrocarbons such as toluene and xylene. Examples of metal hydrides include lithium aluminum hydride, diisobutyl aluminum hydride, and the like. The reaction usually proceeds at room temperature by stirring for 30 minutes to 2 hours. After the reaction, the target product can be isolated and purified by known methods such as recrystallization, chromatography, etc. <Effects of the Invention> The 1α,23,25,26-tetrahydroxyvitamin D3 provided by the present invention has the effect of promoting calcium absorption from the intestinal tract and increasing serum calcium levels, and is effective against osteoporosis, It is extremely useful as a therapeutic agent for osteomalacia, etc. <Example> Hereinafter, the present invention will be explained in more detail with reference to Examples. Example 1 Synthesis of four stereoisomers of 1α,23,25,26-(OH) 4D3 The four stereoisomers of the starting compound 1α,25-(OH) 2D3-26,23 - lactone are Known methods [Archives of Biochemistry and Biophys. 242, 82-
89 (1985)]. 1α, 23 (S) 25 (S) 26
−(OH) 4 D 3 was synthesized as follows. 200μ
g23(S)25(S)-1α,25-(OH ) 2D3-26,23
-Lactone was dissolved in 1 ml of anhydrous tetrahydrofuran, 1 mg of lithium aluminum hydride was added thereto, and the mixture was reacted at 25°C for 60 minutes. The reaction was stopped by adding 2 ml of water and the reaction product was extracted twice with 2 ml of ethyl acetate. Extract is 4.6×250mm
1α,23(S)25 was applied to high performance liquid chromatography using a Zolbax Sil column and eluted with 20% isopropanol-n-hexane system.
(S)26-(OH) 4D3 was purified . By this method , 57.882 μg of 1α,23(S)25(S)26-(OH) 4D3
was synthesized. 200μg of 23(R) by the same method
25(R)-, 23(S)25(R)-, and 23(R)25
(S)-1α,25-(OH) 2D3-26,23 - lactone to 57.174 μg of 1α,23(R)25(R)26-
(OH) 4 D 3 , 51.635 μg of 1α, 23 (S) 25 (R) 26−
(OH) 4D3 and 53.802μg of 1α,23(R)25(S)
26-(OH) 4D3 was synthesized . The structure of the synthesized compound was determined by ultraviolet absorption spectrum (UV spectrum) and mass spectrum. That is, the synthesized 1α,23(S)25(R)26−
The UV spectrum of (OH) 4 D 3 shows a maximum series at 264 nm and a minimum absorption at 228 nm, with typical 5,6
-cis-triene structure.
The mass spectrum of the synthesized 1α,23(S)25(R)26-(OH) 4D3 gave the following peaks. Molecular ion (M + ) 448, 430 (M + −H 2 O), 412 (M + −2H 2 O)
394 (M + −3H 2 O), 376 (M + −4H 2 O), 287 (M + −
side chain), 269 (M + side chain − H 2 O), 251 (M + − side chain −
2H 2 O), 152 (A-ring fragment) 134 (A-ring fragment - H 2 O) This mass spectrum shows that there are three hydroxyl groups in the side chain, and the idea from the starting material for synthesis is 1α, 23 (S )25(R)26−
(OH) I found out that it has become 4 D 3 . Exactly the same UV spectra and mass spectra were measured for other synthetic compounds, and their structures were determined in the same way. Example 2 1α,25−(OH) 2 D 3 − in the cytoplasm of small intestinal mucosa
Examination of binding affinity for receptors Isolation of 1α,25-(OH) 2D3 receptor in the cytoplasm of small intestinal mucosa and determination of receptor binding affinity were performed using known methods [Steroids, 37 , 33-43
(1981)]. In other words, a 12 x 75 mm polypropylene tube.
20pg [26,27-methyl-3H]1α,25-
(OH) 2D3 ( 158Ci /mmol, 16800dpm) and various vitamin D3 analogs obtained in Example 1 were dissolved in 50μ of ethanol and added to 1ml of phosphate buffer (PH7.4). 1α in the cytoplasm of the small intestinal mucosa,
A solution of 0.3 mg of 25-(OH) 2 D 3 -receptor protein and 1 mg of gelatin was added and reacted at 25°C for 1 hour. 40% polyethylene glycol 6000 after reaction
1 ml of the solution was added to each tube, stirred vigorously, and centrifuged at 2260 x g for 60 minutes at 4°C. The precipitated tube was cut with a cutter knife, placed in a liquid scintillation vial, 8 ml of dioxane scintillator was added, and radioactivity was measured using a liquid scintillation counter. The results are shown in Table 1. As is clear from Table 1, [ 3H ]1α,25-(OH) 2D3 bound to the 1α,25-(OH) 2D3 -receptor in the cytoplasm of the small intestinal mucosa
The ability to substitute 1α,23(R)25(R)26−
(OH) 4 D 3 is the strongest followed by 1α, 23 (S) 25 (S)
26−(OH) 4 D 3 ,1α,23(S)25(R)26−
(OH) 4 D 3 , and 1α, 23(R) 25(R) 26−
(OH) 4 D 3 becomes weaker in the order of 1α, 25−(OH) 2 D 3 , 1/10.5, 1/100.4, and 1/215.9, respectively.
and had a receptor binding affinity of 1/442.7. From this, 1α, 23 (R), 25 (R), 26
It is expected that -(OH) 4D3 has the strongest 1α,25-(OH) 2D3 - like activity.
【表】
実施例 ３
腸管のカルシウム吸収活性および血漿中のカル
シウム濃度（骨塩溶解活性）の測定
４週令のウイスター系の雄ラツトをビタミンＤ
欠乏飼料（Ca，0.0036％；Ｐ，0.3％）で６週間
飼育した。６週間の最後に、体重約100ｇの１群
５匹のラツトに500ngの1α，23，25，26−
（OH）4D3を0.2％Triton×−100溶液0.2mlを静脈
内投与した。投与後４，８，24及び48時間後にラ
ツトを殺し腸管のカルシウム吸収活性及び血漿中
のカルシウム濃度を測定した。
腸管のカルシウム吸収活性の測定は文献：アメ
リカン・ジヤーナル・オブ・フイジオロジー
（Am.J.Physiol.）216，1351〜1359（1969）に記載
された方法によつた。また血漿中のカルシウム濃
度は文献：アメリカン・ジヤーナル・オブ・クリ
ニカル・パソロジイー（Am.J.Clin.Pathol.）45，
290〜296（1966）に記載された方法、すなわち
OCPC法によつて測定した。
腸管カルシウム吸収活性の経時変化の結果を第
１図に示した。
各類縁体とも投与後８時間で最大活性を発現し
以後すみやかに活性が消失した。また血漿中カル
シウム濃度の上昇作用の経時変化を第２図に示し
た。各類縁体とも投与後８時間で最大活性を発現
しその活性はほぼ24時間持続しそれ以降すみやか
に活性が消失した。表２には各類縁体の最大活性
を示す投与後８時間での用量依存性を検討した結
果を示した。腸管カルシウム吸収活性および血漿
中カルシウム濃度上昇作用は1α，23（Ｒ）25（Ｒ）
26−（OH）4D3が最も強く1α，23（Ｓ）25（Ｓ）26
−（OH）4D3，1α，23（Ｓ）25（Ｒ）26−（OH）4D3
および1α，23（Ｒ）25（Ｓ）26−（OH）4D3の順に
活性が低下した。[Table] Example 3 Measurement of intestinal calcium absorption activity and plasma calcium concentration (bone mineral dissolution activity) Four-week-old Wistar male rats were treated with vitamin D.
The mice were fed with starved feed (Ca, 0.0036%; P, 0.3%) for 6 weeks. At the end of 6 weeks, 500 ng of 1α, 23, 25, 26-
(OH) 4 D 3 was administered intravenously with 0.2 ml of 0.2% Triton×-100 solution. Rats were killed 4, 8, 24, and 48 hours after administration, and intestinal calcium absorption activity and plasma calcium concentration were measured. Intestinal calcium absorption activity was measured by the method described in American Journal of Physiol. 216 , 1351-1359 (1969). Plasma calcium concentration is also determined by the literature: American Journal of Clinical Pathology (Am.J.Clin.Pathol.) 45 ,
290-296 (1966), i.e.
Measured by OCPC method. The results of changes over time in intestinal calcium absorption activity are shown in Figure 1. Each analog exhibited maximum activity 8 hours after administration, and the activity disappeared promptly thereafter. Furthermore, the time course of the effect of increasing plasma calcium concentration is shown in Figure 2. Each analog exhibited maximum activity 8 hours after administration, continued for approximately 24 hours, and then quickly disappeared. Table 2 shows the results of examining the dose dependence at 8 hours after administration, which indicates the maximum activity of each analogue. Intestinal calcium absorption activity and plasma calcium concentration increasing effect are 1α,23(R)25(R)
26−(OH) 4 D 3 is the strongest 1α, 23(S)25(S)26
−(OH) 4 D 3 ,1α,23(S)25(R)26−(OH) 4 D 3
The activity decreased in the order of 1α, 23(R)25(S)26-(OH) 4D3 .
【表】【table】
【図面の簡単な説明】[Brief explanation of drawings]
第１図は1α，23，25，26−（OH）4D3の腸管カ
ルシウム吸収性の経時変化、第２図は血漿中カル
シウム濃度の上昇作用の経時変化を示す。
Figure 1 shows the time course of the intestinal calcium absorption of 1α,23,25,26-(OH) 4D3 , and Figure 2 shows the time course of the effect of increasing plasma calcium concentration.