【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
(a) 産業上の利用分野
本発明は動物細胞の培養方法に関するものであ
る。更に詳しくは、有用物質を産生する動物細胞
を、高密度で培養する方法に関するものである。
(b) 従来技術
大規模による細胞大量培養は、例えばウイル
ス、ワクチン、インターフエロンなどの抗ウイル
ス剤、あるいはホルモンなどの生物薬品の製造に
必須である。殊に近年特定タンパク質などを標的
とするモノクローナル抗体の生産は、抗体産生細
胞とミエローマによるハイブリドーマ大量培養に
よるものであり、その技術の解決は工業的に重要
なテーマである。
従来、細胞の大量培養法及びそのための装置と
していくつかの提案がなされている。しかし、こ
れらの方法では、特に無血清培地での培養におい
て工業的に十分なほど高密度には増殖していな
い。
(c) 発明の目的
そこで、本発明者らは従来、サスペンジヨン培
養において106〜５×106cells／ml程度にしか増殖
できなかつた方法を、更に大量且つ高密度で増殖
させることを目的として研究を進めた結果、本発
明に到達した。
(d) 発明の構成及び効果
すなわち、本発明は、動物細胞を培養槽中に
て、サスペンジヨン状態で且つ、新しい培養液を
該培養槽中へ供給すると共に、古い培養液を該培
養槽外へ排出して、高密度で培養する方法におい
て、該培養をサスペンジヨン培養液中にポリグリ
コールを存在せしめて行うことを特徴とする動物
細胞の培養方法である。
かかる本発明により、動物細胞を効果的に増殖
させることができ、また高密度で生育することが
可能となる。
以下、本発明について更に詳細に説明する。
本発明の細胞培養方法はサスペンジヨン状態で
培養する方法に適用されるが、サスペンジヨン状
態とは、水性媒体中で細胞それ自体が浮遊しなが
ら、或いは細胞を微小担体（マイクロキヤリア
ー）に担持して浮遊しながらまたマイクロカプセ
ル中で細胞が生育されるような種々の浮遊培養を
いう。殊に本発明は、細胞自体を浮遊させながら
培養する方式に有利に用いられる。
本発明の培養方法において、培養する動物細胞
としては、サスペンジヨン状態にて増殖可能なも
のであればよく、天然の動物細胞のみならず、人
為的或いは遺伝子操作により変性された細胞例え
ばハイブリドーマであつてもよい。
また細胞としてIL−２の如きリンホカインを
産生するリンパ球由来の細胞であつてもよく、イ
ンターフエロン（IFN）の如き有用な生理活性物
質を産生する２倍体細胞であつてもよい。さらに
種々のモノクローナル抗体を産生する細胞であつ
てもよく、本発明はかかるモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマの培養に対してモノクロ
ーナル抗体を高い濃度で得る目的のために特に適
している。
本発明における細胞培養は、パーヒユージヨン
方式で行われる。ここで、パーヒユージヨン方式
とは、一般に新しい培養液を培養槽中へ供給しつ
つ、生育阻害物質を含んだ古い培養液を培養槽外
へ排出しながら培養する方式である。この方式を
用いて培養するにヨつて重要なことの１つは、サ
スペンジヨン液中の生細胞と前記古い培養液とを
効率よく分離し、古い培養液を培養槽外へ取り出
し、培養槽内の細胞の生育環境を最適条件下に維
持することである。また、ここでサスペンジヨン
液中から分離され、培養槽外へ取り出された古い
培養液は、膜による分離法、或いは吸着による分
離法などにより、その中に含まれる生育阻害物質
を除去し、更に必要により産生された有用物質を
分画された後、培養に必要な添加成分を新たに加
えることにより、新しい培養液として再使用する
ことができる。
本発明におけるサスペンジヨン状態の細胞培養
において培養槽中においては、培養しようとする
細胞が培養液中に浮遊した状態で培養される。培
養液は実質的に水よりなる水性媒体に、種々の無
機塩、ビタミン類、捕酵素、ブドウ糖、アミノ
酸、抗生物質などの通常細胞培養に使用される添
加成分、及びポリグリコールが加えられている。
また培養液には血清を加えることもできるし、血
清を用いない所謂無血清培地を培養液として使用
することも出来るが、本発明は特に無血清培地に
おいて優れた効果を示す。
ここでポリグリコールとは、下記式(1)及び(2)
〔−（CH2）nＯ〕− ……(1)
〔−（CH2）oＯ〕− ……(2)
〔但し、ｎ又はｍはそれぞれ独立に２〜４の整数
である。〕
の繰り返し単位より成る化合物であり、ポリグリ
コールは、これら単位が４〜400個繰返されたも
のが使用される。
このポリグリコールはホモポリマーであつても
コポリマーであつてもよく、更にランダムコポリ
マーであつても、ブロツクコポリマーであつても
よい。また、本発明で用いられるポリグリコール
は水に可溶であり、その分子量は200〜20000、好
ましくは1000〜14000である。サスペンジヨン液
中への添加量は0.001〜0.5ｇ／、好ましくは
0.01〜0.1ｇ／加えるのが有利である。
本発明の培養方法において、サスペンジヨン液
中の酸素濃度を一定に維持するために、酸素を供
給する方法としては、サスペンジヨン液中へ酸素
または酸素含有ガスを直接供給してもよい。また
他の供給手段によつてもよいが、本発明において
は特に、サスペンジヨン液中への酸素または酸素
含有ガスの直接供給に有効である。他の供給手段
としては、例えば酸素キヤリアーを用いる方法が
ある。
酸素キヤリアーとしては、水と実質的に混合し
ないで酸素を溶解し得る液状の化合物が使用さ
れ、その例としては、人工血液の素材として使用
されるような種々のフルオロカーボンが挙げられ
る。かようなフルオロカーボンを酸素供給手段と
して使用する場合には、酸素を溶解させたフルオ
ロカーボンをサスペンジヨン液中の上部から液滴
状または薄膜状で添加すればよい。
かくして、本発明方法によれば、パーヒユージ
ヨン方式におけるサスペンジヨン培養において、
生細胞率が上がり、106cells／ml以上、好適条件
下では５×106cells／ml以上の高密度で培養する
ことが可能となる。
以下、実施例を掲げて本発明を詳述する。
実施例
(1) 培養装置
添付第１図に示す培養システムを使用した。
培養槽（AP−１）は図のように外壁の内側に
隔壁によつて仕切られたセトリングゾーンがも
うけられ、その上部には培養液の排出口を有し
ており、正味培養容積は約200mlである。図の
AP−２はプレートアンドフレーム型限外過
装置である。限外過膜はミリポア社製ペリマ
ンラボカセツト用限外過膜を使用した。使用
した膜の公称分画分子量は実験データの項に記
する。
(2) 培養液
基礎培地として、RPMI 1640培地、ハム−
12培地及びダルベツコ変法イーグル培地を２：
１：１で混合したもの（以下RDFと称する）
を用い増殖因子としてインスリン、トランスフ
エリン、エタノールアミン、亜セレン酸を加え
た。エタノールアミンの添加量は、20μｇ／
ml、亜セレン酸は２×10-8mole／であり、
インスリン及びトランスフエリンについては培
地αにおいてはインスリン9μｇ／ml、トラン
スフエリン10μｇ／mlであり培地βにおいては
インスリン0.5μｇ／ml、トランスフエリン0.5μ
ｇ／mlである。
(3) 培養方法及び結果
あらかじめオートクレーブ減菌した前記培養
槽に正味培養容積が約200mlになるように培養
液αを送入し、これをマウスミエローマ細胞
P3U1株を親株とするマウス×ヒト ハイブリ
ドーマH2株を6.6×105個／mlとなるように播
種した。この細胞はIgG産生株である。培養槽
では炭酸ガス５％を含む酸素ガスが（溶存酸素
が3ppmとなるように）吹込みノズルを通し
て自動的にコントロールされて送入されてい
る。培養槽中の培養液は37℃に保持されてい
る。培養槽中にはマリン型撹拌翼が取付けられ
ており撹拌速度は60rpmであつた。
播種後１日間は回分培養を行い、この後パー
ヒユージヨンを開始した。パーヒユージヨンの
尺度として正味培養容積の１日当りの置換率と
して表わし実験結果を併記する。すなわち、ポ
ンプＰ−１を駆動しバルブＸを開、バルブＹを
閉として、培養槽内で細胞と分離された培養液
をラインから抜きとり、その量と同じ量の新
培地αをラインから連続的に送入した。時間
の経過とともに細胞密度が上昇し、６日には
6.6×106個／mlに達した。この後、細胞増殖
は、定常状態となつたので９日目に図において
バルブＸを閉じバルブＹを開き限外過膜を通
過しなかつた液は培養槽に循環した。同時にラ
インから送入する培地をαからポリグリコー
ルを添加し、インスリン、トランスフエリン濃
度を低下させたβに変更した。限外過装置
AP−２には分子量分画1000の限外過膜がセ
ツトされており、ラインからは膜を通過した
液を、またラインからは膜を通過しなかつた
液を系外に取出した。
以上の培養操作を26日間継続した。その結果を
第１表に示す。
(a) Industrial Application Field The present invention relates to a method for culturing animal cells. More specifically, the present invention relates to a method for culturing animal cells producing useful substances at high density. (b) Prior Art Large-scale cell culture is essential for the production of, for example, viruses, vaccines, antiviral agents such as interferon, or biological drugs such as hormones. Particularly in recent years, the production of monoclonal antibodies targeting specific proteins has been based on mass culture of hybridomas using antibody-producing cells and myeloma, and solving this technology is an industrially important theme. Conventionally, several proposals have been made as methods for mass culturing cells and devices for the same. However, these methods do not allow the cells to proliferate at a high enough density for industrial use, especially when cultured in serum-free medium. (c) Purpose of the Invention Therefore, the inventors of the present invention aimed to use a method that conventionally allowed cells to grow in suspension culture at only about 10 6 to 5 × 10 6 cells/ml, but to grow them in even larger quantities and at higher density. As a result of research, we have arrived at the present invention. (d) Structure and Effects of the Invention In other words, the present invention provides animal cells in a culture tank in a suspended state, a new culture solution being supplied into the culture tank, and an old culture solution being removed from the culture tank. This is a method for culturing animal cells, characterized in that the culture is carried out in the presence of polyglycol in a suspension culture medium. According to the present invention, animal cells can be effectively proliferated and grown at high density. The present invention will be explained in more detail below. The cell culture method of the present invention is applied to a method of culturing in a suspension state, and a suspension state is a state in which the cells themselves are suspended in an aqueous medium or are supported on microcarriers. It refers to various types of suspension culture in which cells are grown in microcapsules while floating. In particular, the present invention is advantageously used in a system in which the cells themselves are cultured while being suspended. In the culture method of the present invention, the animal cells to be cultured may be of any type as long as they can proliferate in suspension, and include not only natural animal cells but also cells that have been modified artificially or by genetic manipulation, such as hybridomas. It's okay. Further, the cells may be cells derived from lymphocytes that produce lymphokines such as IL-2, or diploid cells that produce useful physiologically active substances such as interferon (IFN). Furthermore, cells that produce various monoclonal antibodies may be used, and the present invention is particularly suitable for culturing hybridomas that produce such monoclonal antibodies for the purpose of obtaining monoclonal antibodies at high concentrations. Cell culture in the present invention is performed by perfusion method. Here, the perfusion method is generally a method of culturing while supplying a new culture solution into a culture tank and discharging an old culture solution containing growth-inhibiting substances to the outside of the culture tank. One of the important things when culturing using this method is to efficiently separate the living cells in the suspension solution from the old culture solution, take out the old culture solution out of the culture tank, and place it inside the culture tank. The goal is to maintain the cell growth environment under optimal conditions. In addition, the old culture solution that is separated from the suspension solution and taken out of the culture tank is removed the growth-inhibiting substances contained therein by a separation method using a membrane or a separation method by adsorption, and then After the useful substances produced as necessary are fractionated, they can be reused as a new culture solution by newly adding additional components necessary for culture. In cell culture in suspension according to the present invention, cells to be cultured are cultured in a state suspended in a culture solution in a culture tank. The culture solution is an aqueous medium consisting essentially of water, to which are added various inorganic salts, vitamins, enzyme traps, glucose, amino acids, antibiotics, and other additives commonly used in cell culture, as well as polyglycols. .
Further, serum can be added to the culture solution, or a so-called serum-free medium that does not use serum can be used as the culture solution, but the present invention shows particularly excellent effects in a serum-free medium. Here, polyglycol has the following formulas (1) and (2) [-(CH 2 ) n O]-...(1) [-(CH 2 ) o O]-...(2) [However, n Or m is each independently an integer of 2 to 4. ] It is a compound consisting of repeating units, and the polyglycol used is one in which 4 to 400 of these units are repeated. This polyglycol may be a homopolymer or a copolymer, and further may be a random copolymer or a block copolymer. Further, the polyglycol used in the present invention is soluble in water and has a molecular weight of 200 to 20,000, preferably 1,000 to 14,000. The amount added to the suspension liquid is 0.001-0.5g/, preferably
It is advantageous to add from 0.01 to 0.1 g/g. In the culture method of the present invention, oxygen or an oxygen-containing gas may be directly supplied into the suspension solution in order to maintain a constant oxygen concentration in the suspension solution. Although other supply means may be used, the present invention is particularly effective in directly supplying oxygen or oxygen-containing gas to the suspension liquid. Other supply means include, for example, a method using an oxygen carrier. As the oxygen carrier, a liquid compound capable of dissolving oxygen without substantially mixing with water is used, examples of which include various fluorocarbons used as materials for artificial blood. When such a fluorocarbon is used as an oxygen supply means, the fluorocarbon in which oxygen is dissolved may be added in the form of droplets or a thin film from the top of the suspension liquid. Thus, according to the method of the present invention, in suspension culture in the perfusion method,
The viable cell rate increases, and it becomes possible to culture at a high density of 10 6 cells/ml or more, and under suitable conditions, 5×10 6 cells/ml or more. The present invention will be described in detail below with reference to Examples. Example (1) Culture device A culture system shown in the attached FIG. 1 was used.
As shown in the figure, the culture tank (AP-1) has a settling zone partitioned by a partition wall on the inside of the outer wall, and has a culture solution outlet at the top, and the net culture volume is approximately 200ml. It is. figure
AP-2 is a plate and frame type ultraviolet device. The ultrafiltration membrane used was an ultrafiltration membrane for Perriman Lab cassettes manufactured by Millipore. The nominal molecular weight cutoff of the membrane used is given in the experimental data section. (2) Culture medium As the basal medium, RPMI 1640 medium, Ham-
12 medium and Dulbecco's modified Eagle medium 2:
1:1 mixture (hereinafter referred to as RDF)
Insulin, transferrin, ethanolamine, and selenite were added as growth factors. The amount of ethanolamine added is 20μg/
ml, selenite is 2×10 -8 mole/,
Concerning insulin and transferrin, medium α contains insulin 9 μg/ml and transferrin 10 μg/ml, and medium β contains insulin 0.5 μg/ml and transferrin 0.5 μg.
g/ml. (3) Culture method and results Culture medium α was introduced into the culture tank, which had been sterilized by autoclaving in advance, so that the net culture volume was about 200 ml, and this was added to mouse myeloma cells.
Mouse x human hybridoma H2 strain whose parent strain was P3U1 strain was seeded at 6.6 x 10 5 cells/ml. This cell is an IgG producing strain. Oxygen gas containing 5% carbon dioxide (so that dissolved oxygen is 3 ppm) is automatically controlled and fed into the culture tank through a blowing nozzle. The culture solution in the culture tank is maintained at 37°C. A marine-type stirring blade was installed in the culture tank, and the stirring speed was 60 rpm. Batch culture was carried out for one day after seeding, and then perfusion was started. The experimental results are expressed as a daily replacement rate of the net culture volume as a measure of perfusion. That is, drive pump P-1, open valve It was sent to The cell density increases over time, and on the 6th day
It reached 6.6×10 6 cells/ml. Thereafter, cell proliferation reached a steady state, so on the 9th day, valve X was closed and valve Y was opened to circulate the liquid that did not pass through the ultrafiltration membrane to the culture tank. At the same time, the culture medium fed through the line was changed from α to β, which added polyglycol and lowered the insulin and transferrin concentrations. ultraviolet device
AP-2 was equipped with an ultrafiltration membrane with a molecular weight fraction of 1000, and the liquid that passed through the membrane was taken out of the line, and the liquid that did not pass through the membrane was taken out of the system from the line. The above culture operation was continued for 26 days. The results are shown in Table 1.
【表】【table】
【表】
比較例
培養装置は実施例と同じものを用いた。
培養液は培地βにおいてポリグリコールを含ま
なかつた以外は実施例と同様に行つた。実験方法
は全て実施例と同様に行つた。[Table] Comparative Example The same culture device as in the Example was used. The culture solution was carried out in the same manner as in the example except that the culture medium β did not contain polyglycol. All experimental methods were conducted in the same manner as in the examples.
【表】【table】
【図面の簡単な説明】[Brief explanation of drawings]
添付図面は、本発明の培養方法を実施する工程
の概略図の１例を示したものである。
The accompanying drawings show an example of a schematic diagram of the steps for carrying out the culture method of the present invention.