【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
本発明はプレグナ−１，４，11(12)−トリエン−
３−オン−20−カルボン酸及びそのエステルに関
し、詳しくは一般式（）
（式中、Ｒは水素原子又は低級アルキル基を表
わす。）で示される化合物に関する。
本発明により提供される一般式（）で示され
る化合物は公知文献に未記載の新規化合物であ
り、プロゲステロン又はブレドニゾロン、ハイド
ロコーチゾンなどのコルチコイドの合成中間体と
して有用である。
一般式（）で示される化合物は次に示す方法
により12α−ヒドロキシプレグナ−１，４−ジエ
ン−３−オン−20−カルボン酸から誘導される。
（式中、R1及びR2は各々低級アルキル基を表
わし、点線…はヒドロキシル基又はR2SO2O基が
α−立体配置にあることを示す。）
すなわち、12α−ヒドロキシプレグナ−１，４
−ジエン−３−オン−20−カルボン酸と一般式
（）で示されるアルコールとを塩酸、硫酸、Ｐ
−トルエンスルホン酸などの酸触媒の存在下に約
65〜120℃の温度で加熱反応させることにより一
般式（）で示されるエステルが得られる。一般
式（）で示されるアルコールを12α−ヒドロキ
シプレグナ−１，４−ジエン−３−オン−20−カ
ルボン酸に対して約３〜20倍量（重量）用いるこ
とにより、該アルコールに反応溶媒を兼ねさせる
のが好ましい。反応後、反応混合物を水にあけ、
塩化メチレンなどで抽出し、抽出液を水、希塩酸
水などで洗滌し、乾燥したのち、これより低沸点
物を留去することにより一般式（）で示される
エステルの粗生成物が得られる。この粗生成物を
例えば酢酸エチルなどから再結晶することにより
高純度の一般式（）で示されるエステルを得る
ことができる。
一般式（）で示されるエステルをスルホネー
ト化反応に付することにより一般式（）で示さ
れるスルホネートが得られる。例えば、このスル
ホネート化反応は、一般式（）で示されるエス
テルをピリジン、ピコリン又はこれらとベンゼ
ン、トルエンなどとの混合溶媒に溶解し、この溶
液に一般式（）
R2SO2Cl …（）
（式中、R2は低級アルキル基を表わす。）で示
されるスルホン酸クロリドを該エステルに対し等
モル〜２倍モル量加え、室温ないしは必要に応じ
て約80℃までの加温下に行なわれる。反応後、反
応混合物を希塩酸水などにあけ、塩化メチレンな
どで抽出し、抽出液を希塩酸水、重曹水、水など
で洗滌し、乾燥したのち、これより低沸点物を留
去することにより一般式（）で示されるスルホ
ネートの粗生成物が得られる。この粗生成物を例
えば酢酸エチルなどから再結晶することにより高
純度の一般式（）で示されるスルホネートを得
ることができる。
一般式（）で示されるスルホネートを脱スル
ホン酸反応に付することにより、目的とする一般
式（−ａ）で示されるプレグナ−１，４，11(12)
−トリエン−３−オン−20−カルボン酸エステル
が得られる。この脱スルホン酸反応は通常、酢酸
カリウム、塩化リチウム、コリジン、カリウム
tert−ブトキシドなどの反応助剤（スルホン酸を
捕捉することができる化合物）の存在下に行なわ
れる。反応助剤の使用量は一般式（）で示され
るスルホネートに対して等モル〜20倍モル量であ
る。この反応はヘキサメチルホスホルトリアミ
ド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドなどの溶媒中
で行なうのが好ましく、通常約80〜160℃の温度
下に加熱して行なわれる。反応後、反応混合物を
水、希塩酸水などにあけ、塩化メチレンなどで抽
出し、抽出液を希塩酸水、重曹水、水などで洗滌
し、乾燥したのち、これより低沸点物を留去する
ことにより一般式（−ａ）で示されるプレグナ
−１，４，11(12)−トリエン−３−オン−20−カル
ボン酸エステルの粗生成物が得られる。この粗生
成物を例えば酢酸エチル又はメタノール、エタノ
ールなどのアルコールから再結晶することにより
高純度の一般式（−ａ）で示されるプレグナ−
１，４，11(12)−トリエン−３−オン−20−カルボ
ン酸エステルを得ることができる。
一般式（−ａ）で示されるプレグナ−１，
４，11(12)−トリエン−３−オン−20−カルボン酸
エステルを加水分解することにより式（−ｂ）
で示されるプレグナ−１，４，11(12)−トリエン−
３−オン−20−カルボン酸とすることができる。
この加水分解反応はメタノール、エタノール、プ
ロパノールなどのアルコール溶媒中で水酸化ナト
リウム水溶液又は水酸化カリウム水溶液の存在下
に行なう。室温下では反応速度が遅いため、溶媒
の還流温度下に反応を行なうのが好ましい。反応
完了後、反応混合物からアルコール溶媒を留去さ
せ、その残渣に水を加えて均一溶液とし、この溶
液に系が酸性を呈するまで塩酸、硫酸などの酸を
加える。析出した沈澱をロ別し、アセトンなどか
らら再結晶することにより高純度のプレグナ−
１，４，11(12)−トリエン−３−オン−20−カルボ
ン酸を得ることができる。
原料化合物である12α−ヒドロキシプレグナ−
１，４−ジエン−３−オン−20−カルボン酸は公
知化合物であるが、本発明者らのうち数人が先に
見出した方法によれば、デオキシコール酸及び／
又はその塩を基質として12α−ヒドロキシプレグ
ナ−１，４−ジエン−３−オン−20−カルボン酸
及び／又はその塩を生産するアルカリゲネス属に
属する細菌を、デオキシコール酸及び／又はその
塩を含む培地に培養することにより得ることがで
きる。
上記のアルカリゲネス属に属する細菌として
は、土壌中から採取したアルカリゲネス・フエカ
リスD4020（Alcaligenes faecalisD4020）菌株
（微工研条寄第182号）がある。この菌株の菌学的
性質を列挙すると次表のとおりである。
The present invention provides pregna-1,4,11(12)-triene-
Regarding 3-one-20-carboxylic acid and its ester, for details, refer to the general formula () (In the formula, R represents a hydrogen atom or a lower alkyl group.) The compound represented by the general formula () provided by the present invention is a novel compound that has not been described in any known literature, and is useful as a synthetic intermediate for progesterone or corticoids such as brednisolone and hydrocortisone. The compound represented by the general formula () is derived from 12α-hydroxypregna-1,4-dien-3-one-20-carboxylic acid by the method shown below. (In the formula, R 1 and R 2 each represent a lower alkyl group, and the dotted line indicates that the hydroxyl group or R 2 SO 2 O group is in the α-configuration.) That is, 12α-hydroxypregna-1 ,4
- Dien-3-one-20-carboxylic acid and the alcohol represented by the general formula () are combined with hydrochloric acid, sulfuric acid, P
- in the presence of an acid catalyst such as toluenesulfonic acid
By carrying out a heating reaction at a temperature of 65 to 120°C, an ester represented by the general formula () can be obtained. By using the alcohol represented by the general formula () in an amount (by weight) about 3 to 20 times that of 12α-hydroxypregna-1,4-dien-3-one-20-carboxylic acid, the alcohol can be used as a reaction solvent. It is preferable to have the same function. After the reaction, pour the reaction mixture into water,
After extraction with methylene chloride or the like, washing the extract with water, diluted hydrochloric acid, etc., drying, and distilling off low-boiling substances, a crude product of the ester represented by the general formula () is obtained. By recrystallizing this crude product from, for example, ethyl acetate, a highly pure ester represented by the general formula () can be obtained. A sulfonate represented by the general formula () can be obtained by subjecting the ester represented by the general formula () to a sulfonation reaction. For example, in this sulfonation reaction, the ester represented by the general formula () is dissolved in pyridine, picoline, or a mixed solvent of these and benzene, toluene, etc., and the general formula () R 2 SO 2 Cl ... () is added to this solution. (In the formula, R 2 represents a lower alkyl group.) A sulfonic acid chloride represented by the formula (R 2 represents a lower alkyl group) is added in an equimolar to twice molar amount to the ester, and the mixture is heated at room temperature or up to about 80°C as necessary. It will be done. After the reaction, the reaction mixture is poured into diluted hydrochloric acid, etc., extracted with methylene chloride, etc., the extract is washed with diluted hydrochloric acid, sodium bicarbonate, water, etc., dried, and then lower boiling point substances are distilled off. A crude sulfonate of formula () is obtained. A highly pure sulfonate represented by the general formula () can be obtained by recrystallizing this crude product from, for example, ethyl acetate. By subjecting the sulfonate represented by the general formula () to a desulfonic acid reaction, the desired pregnane-1,4,11(12) represented by the general formula (-a) is obtained.
-trien-3-one-20-carboxylic acid ester is obtained. This desulfonic acid reaction is typically performed using potassium acetate, lithium chloride, collidine, potassium
It is carried out in the presence of a reaction aid (a compound capable of scavenging sulfonic acid) such as tert-butoxide. The amount of the reaction aid to be used is equimolar to 20 times the molar amount of the sulfonate represented by the general formula (). This reaction is preferably carried out in a solvent such as hexamethylphosphortriamide or N,N-dimethylformamide, and is usually carried out by heating at a temperature of about 80 to 160°C. After the reaction, pour the reaction mixture into water, diluted hydrochloric acid, etc., extract with methylene chloride, etc., wash the extract with diluted hydrochloric acid, sodium bicarbonate, water, etc., dry, and then distill off the lower boiling point substances. A crude product of pregna-1,4,11(12)-trien-3-one-20-carboxylic acid ester represented by the general formula (-a) is obtained. This crude product is recrystallized from ethyl acetate or an alcohol such as methanol or ethanol to obtain highly pure pregnathyl alcohol represented by the general formula (-a).
1,4,11(12)-trien-3-one-20-carboxylic acid ester can be obtained. Pregna-1 represented by general formula (-a),
By hydrolyzing 4,11(12)-trien-3-one-20-carboxylic acid ester, formula (-b)
Pregna-1,4,11(12)-triene-
It can be 3-one-20-carboxylic acid.
This hydrolysis reaction is carried out in an alcoholic solvent such as methanol, ethanol or propanol in the presence of an aqueous sodium hydroxide solution or an aqueous potassium hydroxide solution. Since the reaction rate is slow at room temperature, it is preferable to carry out the reaction at the reflux temperature of the solvent. After the reaction is completed, the alcohol solvent is distilled off from the reaction mixture, water is added to the residue to form a homogeneous solution, and an acid such as hydrochloric acid or sulfuric acid is added to this solution until the system becomes acidic. The precipitate is filtered and recrystallized from acetone to produce high-purity pregnan.
1,4,11(12)-trien-3-one-20-carboxylic acid can be obtained. 12α-hydroxypregna, the raw material compound
1,4-dien-3-one-20-carboxylic acid is a known compound, but according to a method previously discovered by some of the present inventors, deoxycholic acid and/or
Bacteria belonging to the genus Alcaligenes that produce 12α-hydroxypregna-1,4-dien-3-one-20-carboxylic acid and/or its salts using deoxycholic acid and/or its salts as substrates were treated with deoxycholic acid and/or its salts. It can be obtained by culturing in a medium containing As the above-mentioned bacteria belonging to the genus Alcaligenes, there is the Alcaligenes faecalis D4020 strain (Feikoken Joyori No. 182) collected from soil. The following table lists the mycological properties of this strain.
【表】【table】
【表】
上記の表に示した菌学的性質に基づき、アルカ
リゲネス・フエカリスD4020菌株の同定を行なつ
た。アルカリゲネス・フエカリスD4020菌株は、
桿菌であること、周鞭毛を有していること、グラ
ム染色が陰性であることなどの顕微鏡的所見並び
にオキシダーゼ反応及びカタラーゼ反応がともに
陽性であること、好気性であること、Ｏ−Ｆテス
トの結果が酸化的（Oxidative）であることなど
の生理学的性質からバージエイズ・マニユアル・
オブ・デイターミネイテイブ・バクテリオロジー
第７版及び第８版に基づき、アルカリゲネス属に
属する細菌であると同定した。さらにアルカリゲ
ネス・フエカリスD4020菌株は、ゼラチンを液化
しない点、ミルクがアルカリ性となる以外に変化
しない点及び脱窒反応がない点から、アルカリゲ
ネス属のフエカリス種に属する細菌であると同定
した。
上記の微生物を利用した12α−ヒドロキシプレ
グナ−１，４−ジエン−３−オン−20−カルボン
酸及び／又はその塩の製造方法では、デオキシコ
ール酸及び／又はその塩を基質として用いる。デ
オキシコール酸の塩としては具体的にはデオキシ
コール酸のナトリウム、カリウムなどのアルカリ
金属の塩又はカルシウム、マグネシウムなどのア
ルカリ土類金属の塩である。デオキシコール酸及
び／又はその塩の濃度は通常約１〜200ｇ／の
範囲でよいが、生産される12α−ヒドロキシプレ
グナ−１，４−ジエン−３−オン−20−カルボン
酸及び／又はその塩の収量、培養条件及び操作性
などの経済的観点から約10〜100ｇ／の範囲が
好ましい。培養方法は原則的には一般微生物の好
気培養で採用される方法と同じであるが、通常は
液体培地による振盪培養法又は通気撹拌培養法が
用いられる。培地は上記のデオキシコール酸及
び／又はその塩を基質として12α−ヒドロキシプ
レグナ−１，４−ジエン−３−オン−20−カルボ
ン酸及び／又はその塩を生産するアルカリゲネス
属に属する細菌が資化利用できる栄養源を含有す
るものであればよい。炭素源としてはデオキシコ
ール酸及び／又はその塩を単一素源としてもよ
く、或いはデオキシコール酸及び／又はその塩に
グルコース、グリセリン、ペプトン、肉エキス、
酵母エキスなどを併用してもよい。また窒素源と
しては、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニ
ウム、燐酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝
酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの無機窒素源、
又はポリペプトン、ペプトン、肉エキスなどの有
機窒素源が用いられる。また、この他に燐酸水素
２カリウム、燐酸２水素カリウム、硫酸マグネシ
ウムなどの無機塩類が添加される。培養条件に特
徴はないが、通常25〜35℃で10時間〜７日間振盪
培養又は通気撹拌培養を行なう。
このようにして培養液中に蓄積された12α−ヒ
ドロキシプレグナ−１，４−ジエン−３−オン−
20−カルボン酸及び／又はその塩は、既知の方法
により分離採取することができる。例えば、培養
液中の菌体その他の不溶成分を濾過又は遠心分離
などにより分離除去して得られた培養濾液又は上
清に、塩酸、硫酸などの酸を加えて酸性としたの
ち、上記カルボン酸を溶解しかつ水と相分離する
有機溶媒、例えば酢酸エチル、クロロホルム、ク
ロロホルムとメタノールの混合液などを用いて抽
出する。得られた抽出液を集め、これより溶媒を
溜去することによつて目的とする12α−ヒドロキ
シプレグナ−１，４−ジエン−３−オン−20−カ
ルボン酸を回収することができる。この有機溶媒
による抽出操作は培養濾液又は上清についてのみ
でなく、培養液そのものについて行なうことがで
き、またこれらの培養液、培養濾液又は上清に予
め酸を加えることなしに行なうこともできる。上
記において培養濾液又は上清を酸性とした場合に
は12α−ヒドロキシプレグナ−１，４−ジエン−
３−オン−20−カルボン酸が沈澱物として得られ
るため、これをそのまま濾過又は遠心分離などに
より回収することもできる。上記の方法で得られ
た抽出物又は沈澱物中には12α−ヒドロキシプレ
グナ−１，４−ジエン−３−オン−20−カルボン
酸の他に残存基質のデオキシコール酸及び／又は
その塩並びに副生物がほとんど含まれておらず、
例えば水／メタノールからの再結晶により容易に
高純度の12α−ヒドロキシプレグナ−１，４−ジ
エン−３−オン−20−カルボン酸を取得すること
ができる。
本発明により提供されるプレグナ−１，４，11
(12)−トリエン−３−オン−20−カルボン酸又はそ
のエステルは、(i)これを常法により側鎖の20位の
ケトン化を行なうことにより、ブレドニゾロン、
ハイドロコーチゾンなどのコルチコイドの合成中
間体となる公知化合物のプレグナ−１，４，11(12)
−トリエン−３，20−ジオンに誘導することがで
き、また(ii)プレグナ−１，４，11(12)−トリエン−
３−オン−20−カルボン酸又はそのエステルを部
分水素添加反応に付したのち、必要に応じて３位
のケトン部分の保護を行ない、ついで常法法によ
り側鎖の20位のケトン化を行なうことによりプロ
ゲステロンに誘導することができる。
以下に、本発明を実施例及び参考例により具体
的に説明する。
参考例 １
アルカリゲネス・フエカリスD4020菌株（微工
研条寄第182号）を次に示す方法で培養した。デ
オキシコール酸2.0ｇ、硝酸アンモニウム0.2ｇ、
燐酸２水素カリウム0.12ｇ、燐酸水素２カリウム
0.61ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物0.02ｇ、酵
母エキス0.02ｇ及び水酸化ナトリウム0.2ｇに水
道水を加えて容量を100ml（PH：8.4）に調整し、
これを培地とした。この培地を500ml容坂口フラ
スコに入れ、120℃で15分間、蒸気殺菌を行なつ
た。予め上記の培地と同じ培地で試験管振盪機に
て１日間増殖させた種菌10mlを上記の500ml容坂
口フラスコに添加し、30℃で３日間振盪培養し
た。培養後、この培養液を集め、遠心分離機で菌
体を除去後、得られた培養液上清に塩酸を加える
ことにより、この培養液上清のPHを３とした。生
じた沈澱を濾過し、充分水洗後、乾燥させること
により、12α−ヒドロキシプレグナ−１，４−ジ
エン−３−オン−20−カルボン酸を950mg得た。
得られた12α−ヒドロキシプレグナ−１，４−
ジエン−３−オン−20−カルボン酸の一部を取
り、これにメタノールを加えて１％溶液とし、こ
の溶液10μをミクロボンダパツクＣ−18カラム
を備えた高速液体クロマトグラフイー（米国ウオ
ーターズ社製、HLC−GPC−244型）に注入し
た。移動相としてPH4.0に調整した水／メタノー
ルの25／75容量比の混合液を流速１ml／分で流
し、検出を屈折率方式で行なつた。得られた液体
クロマトグラフにおける各ピークの面積比を積分
計（島津製作所製、島津クロマトパツクＣ−
R1A）で求め、この面積比から上記の12α−ヒド
ロキシプレグナ−１，４−ジエン−３−オン−20
−カルボン酸の純度を求めたところ、93％であつ
た。
また、液体クロマトグラフのメインピークに相
当する物質を薄層クロマトグラフイーにより分取
し、下記の方法で12α−ヒドロキシプレグナ−
１，４−ジエン−３−オン−20−カルボン酸と同
定した。
マススペクトルｍ／ｚ：358〔Ｍ〕+ [Table] Based on the mycological properties shown in the table above, Alcaligenes fuecalis strain D4020 was identified. Alcaligenes fuecalis D4020 strain is
Microscopic findings such as being a bacillus, having periflagella, negative Gram staining, positive oxidase reaction and catalase reaction, being aerobic, and O-F test. Because of its physiological properties, such as its oxidative nature, the
Based on Determinative Bacteriology, 7th and 8th editions, it was identified as a bacterium belonging to the genus Alcaligenes. Furthermore, Alcaligenes fuecalis strain D4020 was identified as a bacterium belonging to the Alcaligenes fuecalis species, because it does not liquefy gelatin, does not change the milk other than to become alkaline, and does not have a denitrification reaction. In the method for producing 12α-hydroxypregna-1,4-dien-3-one-20-carboxylic acid and/or its salt using the above-mentioned microorganism, deoxycholic acid and/or its salt is used as a substrate. Specifically, the salt of deoxycholic acid is a salt of an alkali metal such as sodium or potassium, or a salt of an alkaline earth metal such as calcium or magnesium. The concentration of deoxycholic acid and/or its salt may normally be in the range of about 1 to 200 g/, but the 12α-hydroxypregna-1,4-dien-3-one-20-carboxylic acid and/or its salt produced From economical viewpoints such as salt yield, culture conditions, and operability, the amount is preferably in the range of about 10 to 100 g/. The culture method is basically the same as that used for aerobic culture of general microorganisms, but usually a shaking culture method using a liquid medium or an aerated agitation culture method is used. The culture medium is enriched with bacteria belonging to the genus Alcaligenes that produce 12α-hydroxypregna-1,4-dien-3-one-20-carboxylic acid and/or its salt using the above deoxycholic acid and/or its salt as a substrate. It is sufficient that it contains a nutrient source that can be converted into nutrients. As a carbon source, deoxycholic acid and/or its salt may be used as a single source, or deoxycholic acid and/or its salt may be combined with glucose, glycerin, peptone, meat extract,
Yeast extract etc. may be used together. Examples of nitrogen sources include inorganic nitrogen sources such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium nitrate, sodium nitrate, and potassium nitrate;
Alternatively, organic nitrogen sources such as polypeptone, peptone, meat extract, etc. are used. In addition, inorganic salts such as dipotassium hydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, and magnesium sulfate are added. Although there are no specific culture conditions, shaking culture or aerated agitation culture is usually carried out at 25 to 35°C for 10 hours to 7 days. 12α-Hydroxypregna-1,4-dien-3-one- accumulated in the culture medium in this way
The 20-carboxylic acid and/or its salt can be separated and collected by known methods. For example, the culture filtrate or supernatant obtained by separating and removing bacterial cells and other insoluble components in the culture solution by filtration or centrifugation is acidified by adding an acid such as hydrochloric acid or sulfuric acid, and then Extraction is performed using an organic solvent that dissolves and phase separates from water, such as ethyl acetate, chloroform, or a mixture of chloroform and methanol. The target 12α-hydroxypregna-1,4-dien-3-one-20-carboxylic acid can be recovered by collecting the obtained extract and distilling off the solvent therefrom. This extraction operation using an organic solvent can be carried out not only on the culture filtrate or supernatant, but also on the culture solution itself, and can also be carried out without adding an acid to the culture solution, culture filtrate, or supernatant in advance. In the above, when the culture filtrate or supernatant is acidified, 12α-hydroxypregnana-1,4-diene-
Since 3-one-20-carboxylic acid is obtained as a precipitate, it can also be recovered as it is by filtration or centrifugation. The extract or precipitate obtained by the above method contains, in addition to 12α-hydroxypregna-1,4-dien-3-one-20-carboxylic acid, the remaining substrate deoxycholic acid and/or its salts. Contains almost no by-products,
For example, highly pure 12α-hydroxypregna-1,4-dien-3-one-20-carboxylic acid can be easily obtained by recrystallization from water/methanol. Pregnar-1, 4, 11 provided by the present invention
(12)-trien-3-one-20-carboxylic acid or its ester can be prepared by (i) ketonizing the 20-position of the side chain by a conventional method to obtain brednisolone,
Pregna-1,4,11(12) is a known compound that is a synthetic intermediate for corticoids such as hydrocortisone.
-triene-3,20-dione, and (ii) pregna-1,4,11(12)-triene-
After subjecting 3-one-20-carboxylic acid or its ester to a partial hydrogenation reaction, the ketone moiety at the 3-position is protected if necessary, and then the 20-position of the side chain is ketonized by a conventional method. This can induce progesterone. The present invention will be specifically explained below using Examples and Reference Examples. Reference Example 1 Alcaligenes fuecalis D4020 strain (Feikoken Jokyo No. 182) was cultured by the following method. Deoxycholic acid 2.0g, ammonium nitrate 0.2g,
Potassium dihydrogen phosphate 0.12g, dipotassium hydrogen phosphate
Add tap water to 0.61g, magnesium sulfate heptahydrate 0.02g, yeast extract 0.02g and sodium hydroxide 0.2g to adjust the volume to 100ml (PH: 8.4),
This was used as a culture medium. This medium was placed in a 500 ml Sakaguchi flask and steam sterilized at 120°C for 15 minutes. 10 ml of the inoculum grown in advance in the same medium as the above one in a test tube shaker for one day was added to the above 500 ml Sakaguchi flask and cultured with shaking at 30°C for 3 days. After culturing, the culture solution was collected and the bacterial cells were removed using a centrifuge, and the pH of the culture solution supernatant was adjusted to 3 by adding hydrochloric acid to the obtained culture solution supernatant. The resulting precipitate was filtered, thoroughly washed with water, and then dried to obtain 950 mg of 12α-hydroxypregna-1,4-dien-3-one-20-carboxylic acid. The obtained 12α-hydroxypregna-1,4-
Take a portion of dien-3-one-20-carboxylic acid, add methanol to it to make a 1% solution, and apply 10μ of this solution to a high-performance liquid chromatography system equipped with a Microbondapak C-18 column (Waters Inc., USA). (HLC-GPC-244). As a mobile phase, a mixed solution of water/methanol in a volume ratio of 25/75 adjusted to pH 4.0 was flowed at a flow rate of 1 ml/min, and detection was performed using a refractive index method. The area ratio of each peak in the obtained liquid chromatograph was measured using an integrator (Shimadzu Chromatopack C-
R 1 A), and from this area ratio, the above 12α-hydroxypregna-1,4-dien-3-one-20
- The purity of the carboxylic acid was determined to be 93%. In addition, the substance corresponding to the main peak of liquid chromatography was separated by thin layer chromatography, and 12α-hydroxy pregnathic acid was extracted by the following method.
It was identified as 1,4-dien-3-one-20-carboxylic acid. Mass spectrum m/z: 358 [M] +