JPH0358713B2 - - Google Patents
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Description
〔産業上の利用分野〕
本発明はイソプロピルアルコール（以下
「IPA」と略称する）の製造法に関し、更に詳細
には有機化学工業有用なIPAを微生物を用いる発
酵法で製造する方法に関する。
〔従来の技術〕
IPAは現在では専ら石油化学により生産されて
いるが、石油資源の減少、入手難に備え、他の資
源からの効率的生産法を用意することは有意義な
ことである。
従来、IPAをよく生成する微生物としては、バ
チルス・サツカロブチリクム・ベータ（Bacillus
saccharobutylicum−beta）、クロストリジウ
ム・トアナム（Clostridium toanum）、クロスト
リジウム・ヴイスシフアシエンス（Cl.
viscifaciens）、クロストリジウム・アミロサツカ
ロブチルプロピリクム（Cl.amylo
saccharobutylpropylicum）等が報告されている
（「微生物工業」p.299（昭31）朝倉書店）。しかし、
これらはいずれも生成するIPAの量が全発酵生成
物中30％程度ないしそれ以下であつて未だ十分に
満足のゆくものではなかつた。
〔発明が解決しようとする問題点〕
したがつて、更に効率良くIPAを生産する菌株
の検索及びこれを利用したIPAの効率の良い製造
法の開発が求められていた。
〔問題点を解決するための手段〕
発明者らは、アセトン・ブタノール発酵の研究
過程において、茨城県西茨城郡及び静岡県賀茂郡
の土壌中より新たに分離した二種の微生物が、異
常に高いIPAの生産能を示すことを知り、これに
基いて研究を重ねた結果、本発明を完成するに到
つた。
すなわち、本発明はクロストリデイウム
（clostridium）・sp.172CY−02又はクロストリデ
イウム・sp.64CY−05を培地中で培養し、該培養
液中からイソプロピルアルコールを分離すること
特徴とするイソプロピルアルコールの製造法を提
供するものである。
本発明で使用する微生物、クロストリデイウ
ム・sp.172CY−02及びクロストリデイウム・
sp.64CY−05はいずれも本発明者らによつて初め
て分離されたものである。このうちクロストリデ
イウム・sp.172CY−02の特徴を挙げれば次の通
りである。
(1) 形態的性質
グルコース・ブイヨン培地（以下GB培地と
略記、グルコース1.0％、肉エキス1.0％、ペプ
トン1.0％塩化ナトリウム0.5％、PH7.0の組成）
及びトウモロコシ培地を用い、ガス置換型嫌気
培養器フオーマ製モデル1024型（N2、Cl2使
用）により、35℃で嫌気培養を行つた。その結
果は次のとおりであつた。
栄養細胞（24時間培養）：端部に、円味のあ
る桿状で、多くは単独であるが、２個あるいは
数個連結するものもある。大きさは0.6〜1.0μ
×3.0〜4.5μである。
胞子嚢細胞：24時間を過ぎる頃から紡錘状ま
たは棍棒状に変つた細胞が出現する。
胞子（120時間培養）：楕円形で、大きさは
1.0〜1.6μ×1.3〜2.4μである。
染色性：グラム陽性
運動性：若い栄養細胞は活発に運動する。
(2) 培養的性質
ａ） 平面培養
35℃で、フオーマ製モデル1024型嫌気培養
器により培養した結果は以下のとおりであ
る。
麹汁寒天培地およびグルコース寒天培地：
７日間で全く繁殖をみとめない。
ポテトグルコース寒天培地：光沢のある粘
性を伴つた乳白色円形聚落を作る。
加糖ブイヨン寒天培地：１日で深部に乳白
色円形聚落を作り、２日で聚落は拡大し、ガ
スを発生して周囲は羽毛状になる。３日に到
り、ガスのため亀裂を生じ、ペトリ皿一面に
繁殖する。
トウモロコシ寒天培地：わずかに生育し、
ブタノール臭を発し、ガスの発生も伴う。
ｂ） 画線培養
ａ）と同一の方法により嫌気培養した。
麹汁寒天培地およびグルコース寒天培地：
ともに７日間培養で繁殖を認めない。
ポテト・グルコース寒天培地：１日目で生
育し、３日目では菌の表面に多量の粘質物を
形成する。
ｃ） 穿刺培養
嫌気培養装置による培養は行わず通常の培
養方法により行つた。
麹汁寒天培地、ブイヨン寒天培地およびグ
ルコース寒天培地：いずれも７日間で肉眼で
みとめられる程の繁殖はない。
ペプトン添加麹汁寒天培地：２日間で穿刺
線に沿つて繁殖して乳白色の聚落を生じ、３
日間でガス圧のため亀裂を生じ、一面に繁殖
する。
グルコース添加ブイヨン寒天培地：２日で
穿刺溝全部にわたつて乳白色の聚落が、おび
ただしく繁殖し、３日でガス発生によつて亀
裂を各所に発生し、その間隙に沿つて繁殖す
る。
ｄ） 液体培養
トウモロコシ汁培地：僅かづつガスを発生
し、３日間で、ほゞ発酵を終了する。その発
酵の程度は非常に微弱である。
麹汁培地、ブイヨン培地およびグルコース
液培地：いずれも７日間で全く繁殖が見られ
ない。
グルコース添加ブイヨン汁培地：１日で湧
きつき盛んにガスを発生して対流し、やゝ濁
り、３日で菌体は沈降し、４日で発酵を終了
する。
牛乳培地：１日で湧きつくが、泡は僅か
で、リトマス牛乳はやゝ桃色になるが、カゼ
インは凝固しない。15日目でPH5.05となる。
ｅ） ゼラチン培地
培養温度を20℃とした。
麹汁ゼラチン培地、ペプトン添加麹汁ゼラ
チン培地およびグルコースゼラチン培地：い
づれも10日間で溶膠しない。
(3) 生理的性質
ａ） 最適生育条件：PH7.0、温度30℃、嫌気
性
ｂ） 生育しうる条件：PH7.0において、温度
15〜45℃
ｃ） グラム染色：陽性
ｄ） 抗酸性：なし
ｅ） メチルレツド試験：陽性
ｆ） フオーゲス・プロスカウエル反応：陰性
ｇ） インドール生成：陰性
ｈ） 硫化水素生成：陽性
ｉ） 硝酸塩の還元性：なし
ｊ） カタラーゼ生成：陰性
ｋ） 澱粉の加水分解：陽性
ｌ） クエン酸の利用性：なし
ｍ） 牛乳の凝固性：なし
ｎ） アンモニウム塩の利用性：有
ｏ） 硝酸塩の利用性：有
ｐ） グルタミン酸の利用性：有
ｑ） 溶血性：なし
(4) 炭素源の利用性
スピークマン塩類（J.Biol.Chem.58，395
（1923））にペプトン0.5％添加したものに、そ
れぞれの炭素源を添加して利用性を検討した。
結果は第１表のとおりである。
[Industrial Application Field] The present invention relates to a method for producing isopropyl alcohol (hereinafter abbreviated as "IPA"), and more particularly to a method for producing IPA useful in the organic chemical industry by a fermentation method using microorganisms. [Prior Art] Currently, IPA is produced exclusively through petrochemistry, but in preparation for the decrease in petroleum resources and the difficulty in obtaining them, it is meaningful to prepare efficient production methods from other resources. Conventionally, the microorganism that often produces IPA is Bacillus satucarbutyricum beta.
saccharobutylicum-beta), Clostridium toanum, Clostridium viscifuaciens (Cl.
viscifaciens), Clostridium amylosatucarbutylpropylicum (Cl.amylo
saccharobutylpropylicum) etc. ("Microorganism Industry" p. 299 (Showa 31) Asakura Shoten). but,
In all of these, the amount of IPA produced was about 30% or less of the total fermentation product, and was still not fully satisfactory. [Problems to be Solved by the Invention] Therefore, there has been a need to search for a bacterial strain that more efficiently produces IPA and to develop a method for efficiently producing IPA using this strain. [Means for solving the problem] In the course of research on acetone-butanol fermentation, the inventors discovered that two types of microorganisms newly isolated from soil in Nishi-Ibaraki District, Ibaraki Prefecture and Kamo District, Shizuoka Prefecture had abnormally high concentrations. After learning that this shows the production ability of IPA and conducting repeated research based on this knowledge, the present invention was completed. That is, the present invention is characterized by culturing Clostridium sp. 172CY-02 or Clostridium sp. 64CY-05 in a medium and separating isopropyl alcohol from the culture solution. A method for producing isopropyl alcohol is provided. Microorganisms used in the present invention, Clostridium sp.172CY-02 and Clostridium sp.
Both sp.64CY-05 were isolated for the first time by the present inventors. Among these, the characteristics of Clostridium sp.172CY-02 are as follows. (1) Morphological properties Glucose broth medium (hereinafter abbreviated as GB medium, composition of glucose 1.0%, meat extract 1.0%, peptone 1.0%, sodium chloride 0.5%, PH7.0)
Anaerobic culture was performed at 35° C. using a gas-substituted anaerobic incubator Model 1024 manufactured by Forma (using N 2 and Cl 2 ). The results were as follows. Vegetative cells (24-hour culture): They have a rounded, rod-like shape at the end, and most are singly, but sometimes two or several cells are connected. The size is 0.6~1.0μ
×3.0 to 4.5μ. Sporangium cells: After 24 hours, spindle-shaped or club-shaped cells appear. Spores (cultivated for 120 hours): oval in shape and size
It is 1.0~1.6μ×1.3~2.4μ. Staining: Gram positive Motility: Young vegetative cells are actively motile. (2) Culture properties a) Planar culture The results of culturing at 35°C in an anaerobic incubator model 1024 made by Forma are as follows. Koji juice agar medium and glucose agar medium:
No breeding was observed within 7 days. Potato glucose agar medium: Produces a milky-white circular lobule with a glossy viscosity. Sweetened bouillon agar medium: Milky-white circular lobes are formed deep within 1 day, and within 2 days, the lobes expand, generate gas, and the surrounding area becomes feather-like. On the 3rd day, cracks appear due to the gas and the seeds grow all over the Petri dish. Corn agar: Slight growth;
It emits a butanol odor and is accompanied by the evolution of gas. b) Streaking culture Anaerobic culture was performed using the same method as in a). Koji juice agar medium and glucose agar medium:
No reproduction was observed in either case after 7 days of culture. Potato glucose agar medium: Growth occurs on the first day, and a large amount of mucilage is formed on the surface of the bacteria on the third day. c) Puncture culture Culture was performed using a normal culture method without using an anaerobic culture device. Koji juice agar medium, bouillon agar medium, and glucose agar medium: There was no visible growth in any of them within 7 days. Peptone-added koji juice agar medium: Propagates along the puncture line in 2 days, producing milky white lobes;
Over the course of a few days, cracks form due to gas pressure and they spread all over the place. Glucose-added bouillon agar medium: In 2 days, milky white lumps proliferate over the entire puncture groove, and in 3 days, cracks are generated in various places due to gas generation, and propagation occurs along the gaps. d) Liquid culture Corn juice medium: Gas is generated little by little and fermentation is almost completed in 3 days. The degree of fermentation is very weak. Koji juice medium, bouillon medium, and glucose liquid medium: No growth was observed at all within 7 days. Glucose-added bouillon juice medium: It rises in one day, generates a lot of gas, causes convection, becomes slightly cloudy, the bacterial cells settle in three days, and fermentation ends in four days. Milk culture medium: It bubbles up in one day, but there are only a few bubbles, and the litmus milk becomes slightly pink, but the casein does not coagulate. On the 15th day, the pH becomes 5.05. e) Gelatin medium The culture temperature was 20°C. Koji juice gelatin medium, peptone-added koji juice gelatin medium, and glucose gelatin medium: None of them become lysed in 10 days. (3) Physiological properties a) Optimal growth conditions: PH7.0, temperature 30℃, anaerobic b) Conditions for growth: PH7.0, temperature
15-45℃ c) Gram staining: Positive d) Acid-fastness: None e) Methyl Red test: Positive f) Fouges-Proskauer reaction: Negative g) Indole production: Negative h) Hydrogen sulfide production: Positive i) Reducibility of nitrate : None j) Catalase production: Negative k) Starch hydrolysis: Positive l) Citric acid availability: None m) Milk coagulability: None n) Ammonium salt availability: Yes o) Nitrate availability: Yes p) Utilization of glutamic acid: Yes q) Hemolytic property: None (4) Utilization of carbon source Speakman salts (J.Biol.Chem. 58 , 395
(1923)) with 0.5% peptone added, and each carbon source was added to examine the usability.
The results are shown in Table 1.
【表】【table】
【表】
また、クロストリデイウム・sp.64CY−50の特
徴は大部分クロストリデイウム・sp.172CY−02
のそれと同一であるが、特徴の異なる部分を挙げ
れば次の通りである。
１ 胞子の大きさ
0.7〜1.0μ×1.3〜2.4μ
２ 糖の資化性[Table] Also, most of the characteristics of Clostridium sp.64CY-50 are Clostridium sp.172CY-02.
It is the same as that of , but the different features are as follows. 1 Spore size 0.7-1.0μ x 1.3-2.4μ 2 Sugar assimilation ability
【表】【table】
【表】【table】
【表】
これらの特徴を、「バージエイズ・マニユア
ル・オブ・デイターミネイテイブ・バクテリオロ
ジイ第７版及び第８版」、日本農芸化学会誌、第
18巻339頁（1942）及び同第19巻191頁（1943）に
記載された近似する菌株の性質と対比すると、第
３表のとおりである。[Table] These characteristics are described in "Verges Manual of Determinative Bacteriology, 7th and 8th Edition", Journal of the Japanese Society of Agricultural Chemistry, Vol.
Table 3 shows the characteristics of similar strains described in Vol. 18, p. 339 (1942) and Vol. 19, p. 191 (1943).
【表】【table】
次にIPA生産菌として知られているクロストリ
ジウム・イソプロピリクムの３菌株
（IAM19101，IAM19102及びIAM19239）と本発
明で用いるクロストリジウムsp.172CY−02及び
sp.64CY−05について生成するソルベント量を比
較した結果を第４表に示す。
Next, three strains of Clostridium isopropylicum (IAM19101, IAM19102 and IAM19239), known as IPA-producing bacteria, and Clostridium sp.172CY-02 and Clostridium sp.172CY-02 used in the present invention.
Table 4 shows the results of comparing the amount of solvent produced for sp.64CY-05.
【表】【table】
次に実施例を挙げ、本発明を詳細に説明する。
実施例 １
液化トウモロコシ（ぶどう糖として６％；スピ
ターゼ0.01％添加、温度80℃で１時間液化）7.5
％（ブドウ糖として６％）、ポリペプトン0.5％、
硫酸アンモニウム0.1％及び炭酸カルシウム0.5％
（PH無調整）を含む培地にクロストリジウム・
sp.172CY−02を接種し、35℃で72時間培養した。
培養液をガスクロマトグラフイーにて分析し
たところ、ブタノール8.7ｇ／、IPA6.3ｇ／、
アセトン0.2ｇ／、エタノール0.1ｇ／で、全
ソルベントに対するIPAの比率は41.1％であつ
た。
実施例 ２
液化トウモロコシ（ぶどう糖として11.75％；
スピターゼ0.01％添加、温度80℃で１時間液化）
13.99％、ポリペプトン0.5％、硫酸アンモニウム
0.1％及び炭酸カルシウム0.5％（PH無調整）を含
む培地にクロストリジウム・sp.172CY−02株を
接種し、35℃で72時間培養した。実施例１と同様
に分析し、第４表にタイプカルチユアと比較した
ソルベント生産量を示した。
本菌のブタノール生成量は9.9ｇ／、IPAは
7.2ｇ／、全ソルベント生成量は17.9ｇ／で、
IPAの生成比率は40.2％であつた。
Next, the present invention will be explained in detail with reference to Examples. Example 1 Liquefied corn (6% glucose; 0.01% Spitase added, liquefied at 80°C for 1 hour) 7.5
% (6% as glucose), polypeptone 0.5%,
Ammonium sulfate 0.1% and calcium carbonate 0.5%
(PH not adjusted) in a medium containing Clostridium
sp.172CY-02 was inoculated and cultured at 35°C for 72 hours. When the culture solution was analyzed by gas chromatography, butanol 8.7g/, IPA 6.3g/,
At 0.2 g/acetone/0.1 g/ethanol, the ratio of IPA to total solvent was 41.1%. Example 2 Liquefied corn (11.75% as glucose;
Spitase 0.01% added, liquefied at a temperature of 80℃ for 1 hour)
13.99%, polypeptone 0.5%, ammonium sulfate
Clostridium sp.172CY-02 strain was inoculated into a medium containing 0.1% calcium carbonate and 0.5% calcium carbonate (without PH adjustment), and cultured at 35°C for 72 hours. The analysis was carried out in the same manner as in Example 1, and Table 4 shows the amount of solvent produced in comparison with the type culture. The amount of butanol produced by this bacterium is 9.9g/, and IPA is
7.2g/, total solvent production amount is 17.9g/,
The production ratio of IPA was 40.2%.
【表】
実施例 ３
液化トウモロコシ（ぶどう糖として５％）6.58
％、ポリペプトン0.5％及び硫酸アンモニウム0.1
％を含む培地を用い、更にこれに炭酸カルシウム
を添加（0.1％）した培地と無添加の培地を調製
し、172CY−02株を使用して発酵試験を行つた。
結果を第６表に示す。[Table] Example 3 Liquefied corn (5% as glucose) 6.58
%, polypeptone 0.5% and ammonium sulfate 0.1
A fermentation test was conducted using the 172CY-02 strain, using a medium containing 172CY-02 strain, and preparing a medium containing calcium carbonate (0.1%) and a medium without calcium carbonate (0.1%).
The results are shown in Table 6.
【表】
なお、培養条件は35℃、72時間培養である。炭
酸カルシウムの添加により生成するソルベント量
が増加し、かつIPA比率が増大した。
実施例 ４
クロストリジウム・sp.172CY−02をクロスト
リジウム・sp.64CY−05に換える以外は実施例１
と同様に培養をおこなつた。培養液中の生成分
をガスクロマトグラフイーで分析した結果、ブタ
ノール8.2ｇ／、IPA5.8ｇ／、アセトン0.1
ｇ／、エタノール0.1ｇ／で、全ソルベント
に対するIPAの比率は40.8％であつた。
実施例 ５
クロストリジウム・sp.172CY−02をクロスト
リジウム・sp.64CY−05に換える以外は実施例２
と同様に培養をおこなつた。培養液中の生成分
をガスクロマトグラフイーで分析した結果、ブタ
ノール9.8ｇ／、IPA6.9ｇ／、アセトン0.2
ｇ／、エタノール0.3ｇ／、全ソルベントに
対するIPAの比率は40.1％であつた。
実施例 ６
クロストリジウム・sp.64CY−05について、実
施例３と同様にして発酵試験をおこなつた。この
結果は第７表の通りである。[Table] The culture conditions were 35°C and 72 hours. Addition of calcium carbonate increased the amount of solvent produced and the IPA ratio. Example 4 Example 1 except that Clostridium sp. 172CY-02 was replaced with Clostridium sp. 64CY-05.
Cultures were carried out in the same manner. As a result of gas chromatography analysis of the products in the culture solution, butanol 8.2g/, IPA 5.8g/, acetone 0.1
g/, 0.1 g/ethanol, and the ratio of IPA to total solvent was 40.8%. Example 5 Example 2 except that Clostridium sp. 172CY-02 was replaced with Clostridium sp. 64CY-05.
Cultures were carried out in the same manner. As a result of gas chromatography analysis of the products in the culture solution, butanol 9.8g/, IPA 6.9g/, acetone 0.2
g/, ethanol 0.3 g/, and the ratio of IPA to total solvent was 40.1%. Example 6 A fermentation test was conducted on Clostridium sp.64CY-05 in the same manner as in Example 3. The results are shown in Table 7.
Claims (1)
sp.172CY−02又はクロストリデイウム・
sp.64CY−05を培地中で培養し、該培養液中から
イソプロピルアルコールを分離することを特徴と
するイソプロピルアルコールの製造法。 ２ 培地が炭素源としての炭水化物、窒素源とし
ての有機又は無機の窒素化合物並びに栄養源とし
ての無機塩類及びビタミンを含有するものである
特許請求の範囲第１項記載のイソプロピルアルコ
ールの製造法。 ３ 培地がトウモロコシ及び蛋白消化物を含むも
のである特許請求の範囲第１項記載のイソプロピ
ルアルコールの製造法。[Claims] 1. Clostridium
sp.172CY-02 or Clostridium
A method for producing isopropyl alcohol, which comprises culturing sp.64CY-05 in a medium and separating isopropyl alcohol from the culture solution. 2. The method for producing isopropyl alcohol according to claim 1, wherein the medium contains a carbohydrate as a carbon source, an organic or inorganic nitrogen compound as a nitrogen source, and inorganic salts and vitamins as a nutrient source. 3. The method for producing isopropyl alcohol according to claim 1, wherein the medium contains corn and a protein digest.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18916384A JPS6167493A (en) | 1984-09-10 | 1984-09-10 | Production of isopropyl alcohol |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18916384A JPS6167493A (en) | 1984-09-10 | 1984-09-10 | Production of isopropyl alcohol |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6167493A JPS6167493A (en) | 1986-04-07 |
| JPH0358713B2 true JPH0358713B2 (en) | 1991-09-06 |
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ID=16236509
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
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1984
- 1984-09-10 JP JP18916384A patent/JPS6167493A/en active Granted
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6167493A (en) | 1986-04-07 |
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