JPH03504494A - IGF-binding protein, a DNA construct encoding the IGF-binding protein, and a vector containing this DNA construct - Google Patents
IGF-binding protein, a DNA construct encoding the IGF-binding protein, and a vector containing this DNA constructInfo
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- JPH03504494A JPH03504494A JP1503492A JP50349289A JPH03504494A JP H03504494 A JPH03504494 A JP H03504494A JP 1503492 A JP1503492 A JP 1503492A JP 50349289 A JP50349289 A JP 50349289A JP H03504494 A JPH03504494 A JP H03504494A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.
Description
【発明の詳細な説明】 ＩＧＦ結合結合タンパクコＧＦ結合結合タンパクコードするＤＮＡ構造体及びこ のＤＮＡ構造体を含有したベクタ一 本発明はヒト胎盤／子宮内膜に由来した分子量約２８ｋＤを有するインシュリン 様成長因子結合タンパク質ＩＢＰ−１及びその同等修飾体に関する。[Detailed description of the invention] IGF-binding binding protein; DNA structure encoding GF-binding binding protein; A vector containing a DNA structure of The present invention provides insulin with a molecular weight of approximately 28 kD derived from human placenta/endometrium. The present invention relates to a similar growth factor binding protein IBP-1 and its equivalent modifications.
更に、本発明はＩＢＰ−１をコードするＤＮＡ構造体、このＤＮＡ構造体を含有 した発現ベクター及びかかるベクターを含んだ原核細胞又は真核細胞に関する。Furthermore, the present invention provides a DNA structure encoding IBP-1, a DNA structure containing this DNA structure. expression vectors and prokaryotic or eukaryotic cells containing such vectors.
更に、本発明はＩＢＰ−１を含んだ医薬製剤にも関する。Furthermore, the present invention also relates to pharmaceutical formulations containing IBP-1.
ＩＧＦ又はインシュリン様成長因子はソマトメジンと同義である。ソマトメジン 群はインシュリン遺伝子から得られるポリペプチド群の１つである。遺伝子産物 としてはインシュリン、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）■及び■、レラキシ ン並びに神経成長因子（ＮＧＦ）のＢユニットがある（Ｒｌｎｄｅｒｋｎｅｃｈ ｔ及びＨｕｌｌｂｅｌ 、 １９７８ａ；Ｒｉｎｄｅｒｋｎｅｃｈｔ及びＨｕｍ ｂｅｌ、１９７８ｂ；Ｂｒａｄｓｈａｖ １９７８；１ｓａａｃｓら、１９７８ ）。ＩＧＦはインシュリンのすべての標的組織に対して伝統的なインシュリン効 果を発揮し、即ちＩＧＦは脂肪組織のグルコース代謝を速め、かつ、脂質、グリ コーゲン及びタンパク質の合成を促進する。ＩＧＦはある細胞類型においてＤＮ Ａ合成も促進する。この特徴はインビボで細胞増殖を誘導しかつ器官成長を促進 しうるＩＧＦの能力を反映している。更に、ＩＧＦは間葉細胞の分化にも作用す る（ｐｒ□ｅｓｃｈら、１９８５）。IGF or insulin-like growth factor is synonymous with somatomedin. somatomedin The group is one of a group of polypeptides derived from the insulin gene. gene product Examples include insulin, insulin-like growth factor (IGF) ■ and ■, and relaxi and the B unit of nerve growth factor (NGF). T and Hullbell, 1978a; Rinderknecht and Hum bel, 1978b; Bradshav 1978; 1saacs et al., 1978 ). IGF has a traditional insulin effect on all target tissues of insulin. In other words, IGF accelerates glucose metabolism in adipose tissue, and Promotes cogen and protein synthesis. IGFs are DN in certain cell types. It also promotes A synthesis. This feature induces cell proliferation and promotes organ growth in vivo. This reflects the IGF's ability to Furthermore, IGF also acts on mesenchymal cell differentiation. (pr□esch et al., 1985).
ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−ＩＩは、それらが血漿中の特定の結合タンパク質と複合 化される点で独特である（Ｓｉｊｔｈ、１９８４）。少なくとも２種の異なる結 合タンパク質が成人血清中で確認された。即ち（１）はとんどの内在ＩＧＦペプ チドを運搬する１５０ｋＤ複合体に由来すると考えられる、ＧＨ依依存性結合タ ンパ資質る結合タンパク質５３ （ＢＰ−５３）及び（２）子宮内膜及び肝臓で 特異的に発現される組織でありかつ血漿中におけるほとんどの不飽和結合部位の 原因でもある約３０〜４０ｋＤのＩＧＦ結合結合タンパクコＩＢＰ−１である。IGF-1 and IGF-II are complexed with specific binding proteins in plasma. (Sijth, 1984). At least two different outcomes Synthetic proteins were identified in adult serum. That is, (1) is the most endogenous IGF pep A GH-dependent binding protein thought to be derived from a 150 kD complex that transports binding protein 53 (BP-53) and (2) in the endometrium and liver. It is a tissue specifically expressed and contains most of the unsaturated binding sites in plasma. The causative agent is IBP-1, an approximately 30-40 kD IGF-binding protein.
５３ｋＤ結合タンパク質はＧＨコントロール下にあるが、３０〜４０ｋＤ種はＧ Ｈ非依存的に発現されるらしい。The 53kD binding protein is under GH control, while the 30-40kD species is under GH control. It seems to be expressed in an H-independent manner.
低分子量結合タンパク質は最初ヒト羊水で確認され、精製かつ特徴付けられた（ Ｃｈｏｅｈｌｎｏｖら、１９７７；Ｄｒｏｐら。Low molecular weight binding proteins were first identified in human amniotic fluid, purified and characterized ( Choehlnov et al., 1977; Drop et al.
１９７９；Ｄｒｏｐら、１９８２）。この３０〜４０ｋＤのＩＧＦ結合結合タン パクコヒト血清及びヒトへバトーマ細胞系ＨＥＰＧ２から精製された結合タンパ ク質と同一であるらしい （Ｄｒｏｐら、１９８４ａＨＰｏｖｏａら、１９８４ ； Ｐｏｖｏａら、１９１１５）。1979; Drop et al., 1982). This 30-40 kD IGF-binding protein Binding protein purified from Paco human serum and human hebatoma cell line HEPG2 It seems to be the same as the proteinaceous substance (Drop et al., 1984aHPovoa et al., 1984 ; Povoa et al., 19115).
Ｐｏｖｏａらは、羊水及びＨＥＰＧ２細胞系に存在する結合タンパク質のＮ Ｈ ２末端アミノ酸配列が類似していることを示した（Ｐｏｖｏａら、 １９８５） 。Povoa et al. reported that N H of the binding protein present in amniotic fluid and HEPG2 cell line. The two terminal amino acid sequences were shown to be similar (Povoa et al., 1985). .
最初にヒト胎盤から単離されたタンパク質たる胎盤タンパク質ｐｐ１２は、ＩＧ Ｆと結合しかつ同一のＮＨ２Ｈ端アミノ酸配列を有することがわかった（Ｋｏｆ ｓｔｉｎｅｎら。Placental protein pp12, the protein first isolated from human placenta, is an IG It was found that it binds to F and has the same NH2H terminal amino acid sequence (Kof Stinen et al.
１９８Ｂ）。198B).
ＩＧＦ結合結合タンパクコ物学的機能に関しては、促進及び阻害双方の効果につ いて記載されている。Regarding the physical function of IGF-binding proteins, both promoting and inhibiting effects are known. It is listed as follows.
ＩＧＦ結合結合タンパクコ進効果は少なくとも２つの例が示されている。クレモ ンス（Ｏｌｅ＋ｕｏｎｓ）ら（１９８６年）は、その結合タンパク質と複合化し て、繊維芽細胞及び平滑筋細胞の表面ＩＧＦレセプターとの結合性を高めること を示した。At least two examples of IGF binding binding protein co-stimulatory effects have been shown. Cremo Ole + uons et al. (1986) demonstrated that to increase binding to surface IGF receptors of fibroblasts and smooth muscle cells. showed that.
脂肪細胞によるグルコース輸送、軟骨細胞による硫酸取込み及び繊維芽細胞中へ のチミジン取込みの促進を含めた、インビトロにおける様々なＩＧＦ作用に関す るＩＧＦ結合結合タンパクコ害効果についても記載されている（Ｚａｐｔら、 １９７９；Ｄｒｏｐら、１９７９； Ｏｏｉら、１９８Ｂ）。加えて、正常細胞 における成長因子媒介分裂促進活性に関したＩＧＦ結合結合タンパクコ害効果も 記載された〔軟骨アッセイ（ｃａｒｔｉｌａｇｅ ａｓｓａｙ）、Ｄｒｏｐ、学 位論文、１９８３ ）。Glucose transport by adipocytes, sulfuric acid uptake by chondrocytes and into fibroblasts on various IGF actions in vitro, including promotion of thymidine uptake in The harmful effects of IGF-binding proteins have also been described (Zapt et al. 1979; Drop et al., 1979; Ooi et al., 198B). In addition, normal cells IGF-binding binding proteins have also been shown to have a detrimental effect on growth factor-mediated mitogenic activity in Described [cartilage assay, Drop, dissertation, 1983).
本発明によるＩＧＦ結合結合タンパクコ記アミノ酸配列を有する： 八１ａ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｇ１ｎ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−５ｅｒ− Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ− Ｖａ １−５ｅ ｒ−Ａ １ ａ−５ｅｒ−Ｃｙｓ−５ｅ ｒ−Ｇｌ ｕ−Ｖａ １−Ｔｈｒ−Ａｘ：５ｅｒ−Ａ １ ａ−Ｇ １ ｙ−Ｃｙｓ −Ｇ １ ｙ −Ｃｙｓ −Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ −Ａ ｌ ａ −Ｌｅｕ−Ｐｒ ｏ|Ｌｅｕ− Ｇｌ ｙ−Ａ １ａ−Ａｌ ａ −Ｃｙｓ −Ｇ １ ｙ−Ｖａ １−Ａ １ ａ−Ｔｈｒ−Ａ １ ａ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ −Ａ ｌａ−Ａ窒■|Ｇ １ ｙ− Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ｃｙｓ −Ａｒｇ−Ａ １ ａ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇ ｌ ｙ −Ｇ ｌ ｕ−Ｇ １ ｎ−Ｇ Ｌ ｎ−Ｐ ｒｏ−Ｌｅｕ|Ｈｉ ｓ − Ａ １ ａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇ １ ｙ−Ｇ １ ｎ−Ｇ １ ｙ− Ａｌ ａ−Ｃｙｓ −Ｖａ １−Ｇ １ ｎ−Ｇ １ ｕ−Tｅｒ−Ａｓ ｐ− Ａ ｌ ａ−５ｅｔ−Ａ １ａ−Ｐｒｏ−Ｈｉ ５−Ａｌａ−Ａｌａ −Ｇ １ ｕ −Ａ １ ａ−Ｇ １ ｙ−５ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇ ｌ@ｕ−５ｅｒ − Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−工１ｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ− Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｈｉ ｓ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ −Ａ １ ａ −Ｐ ｒｏ−５ｅｒ−Ｇ ｌ ｕ−Ｇ １ ｕ−Ａｓ ｐ−Ｈｉ ５−５ｅｒ−工１ｅ−kａｕ− Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−工１ ｅ−Ｓ ｅ ｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｓ ｐ− Ｇ １ ｙ−５ｅｒ−Ｌｙｓ−ｋｉａ−Ｌｅｕ−Ｈｉ ｓ | Ｖａ １−Ｔｈｒ−Ａｓ ｎ −Ｉ １ ｅ−Ｌｙｓ −Ｌｙｓ −Ｔｒｐ−Ｌ ｙｓ −Ｇ ｌ ｕ−Ｐｒｏ７Ｃｙｓ−Ａｒｇ−工１ｅ−Ｇ撃普| Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｖａ １−Ｖａ ｌ −Ｇｌ ｕ−５ｅ ｒ−Ｌｅｕ −Ａｌａ −Ｌｙｓ −Ａｌ ａ −Ｇ １ ｎ−Ｇ １ 普|Ｔｈｒ − ５ｅｒ−Ｇｌ ｙ−Ｇ １ ｕ−Ｇｌｕ−Ｉ １ ｅ−５ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ −Ｔｙｒ−Ｌｅｕ −Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｙ ｓ −Ａｓ ｎ −Ｇ １ ｙ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｈｉ ｓ −５ｅｒ−Ａｒｇ−Ｇ １ ｎ−Ｃ ｙｓ −Ｇ ｌ ｕ−Ｔｈｒ−５ｅｒ|Ｍｅｔ− Ａｓ ｐ−Ｇ １ ｙ −Ｇ ｌ ｕ−Ａ １ ａ −Ｇ １ ｙ−Ｌｅｕ−Ｃ ｙｓ −Ｔｒｐ−Ｃｙｓ −Ｖａ １−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｔ窒吹|Ａｓ ｎ− Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（ｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−工 １ｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｔ ｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ対応ｃＤＮＡ配列の完全ヌクレ オチド配列は、請求の範囲第５項に記載された構造を有することが示された。The IGF-binding protein according to the present invention has the following amino acid sequence: 81a-Pro-Trp-G1n-Cys-Ala-Pro-Cys-5er- Ala-Glu-Lys-Leu-Ala-Leu-Cys-Pro-Pro- Va 1-5e r-A 1 a-5er-Cys-5e r-Gl u-Va 1-Thr-Ax:5er-A 1 a-G 1 y-Cys-G 1 y -Cys -Cys-Pro-Met-Cys -A l a -Leu-Pr o|Leu- Gl y-A 1a-Al a-Cys-G 1 y-Va 1-A 1 a-Thr-A 1 a-Arg-Cys -A la-A nit■|G 1 y- Leu-5er-Cys-Arg-A 1 a-Leu-Pro-G l y -G u-G 1 n-G n-P ro-Leu|His - A 1 a-Leu-Thr-Arg-G 1 y-G 1 n-G 1 y- Al a-Cys -Va 1-G 1 n-G 1 u-Ter-As p- A l a-5et-A 1a-Pro-Hi 5-Ala-Ala-G 1 u -A 1 a-G 1 y-5er-Pro-G l@u-5er - Pro-Glu-5er-Thr-Glu-Engineering 1e-Thr-Glu-Glu- Glu-Leu-Leu-Asp-Asn-Phe-His-Leu-Met -A 1 a -P ro-5er-G l u-G 1 u-As p-Hi 5-5er-Eng 1e-kau- Trp-Asp-Ala-Engineering 1 e-S e r-Thr-Tyr-As p- G1 y-5er-Lys-kia-Leu-His | Va -Thr-As -I e-Lys -Lys -Trp-L ys-Gl u-Pro7Cys-Arg-工1e-G发pus| Leu-Tyr-Arg-Va 1-Va l-Gl u-5e r-Leu -Ala -Lys -Al a -G 1 n-G 1 Thr - 5er-Gl y-G 1 u-Glu-I 1 e-5er-Lys-Phe -Tyr-Leu -Pro-Asn-Cys-Asn-Lys -Asn -G 1 y-Phe-Tyr-His -5er-Arg-G 1 n-C ys-Gl u-Thr-5er|Met- As p-G 1 y-G l u-A 1 a-G 1 y-Leu-C ys-Trp-Cys-Va 1-Tyr-Phe-TNitsubuki|As n- Gly-Lys-Arg(le-Pro-Gly-5er-Pro-Glu- 1e-Arg-Gly-Asp-Pro-Asn-Cys-Gln-Met-T Complete nucleotide sequence of cDNA corresponding to yr-Phe-Asn-Val-Gln-Asn The otide sequence was shown to have the structure set forth in claim 5.
本発明のタンパク質はソマトメジンの機能化に関する効果的なボテンシェークー として用いることができる。The protein of the present invention is an effective protein for the functionalization of somatomedin. It can be used as
その効果は、生理学的条件下におけるソマトメジンとそれらの結合タンパク質と の堅固な結合を介して媒介することができる。このように複合化されたソマトメ ジンはそれらの結合タンパク質と一緒になって過度のタンパク質分解から保護さ れ、ソマトメジンの生物学的半減期を存意に増加させる。更に、このＩＧＦ結合 タンパク質又はその修飾体はＩＧＦのその局所作用部位への有効なキ特表平３− ５０４４９４ （３） ヤリアとして機能するであろう。The effect is similar to that of somatomedins and their binding proteins under physiological conditions. can be mediated through the tight binding of Somatome compounded in this way Together with their binding proteins, gins are protected from excessive proteolysis. This significantly increases the biological half-life of somatomedin. Furthermore, this IGF binding The protein or its modified form is an effective key to the local action site of IGF. 504494 (3) It will function as a yaria.
クレモンスの研究（１９８６年）は、組織修復に際した結合組織及び筋肉細胞の 増殖強化及び受精に関する、このＩＧＦ−１結合タンパク質又はその修飾体の潜 在的な有用性について立証している。Clemons's research (1986) showed that connective tissue and muscle cells are important for tissue repair. The potential of this IGF-1 binding protein or its modifications for enhanced proliferation and fertilization. The current usefulness of this method has been demonstrated.
アルファＩＰＥＧのようなＩＧＦ結合タンパク質又はその修飾体は子宮内膜にお ける脱落膜細胞の主分泌可溶性タンパク質であるため、ＩＢＰ−１は胎盤発育中 における子宮内膜への栄養芽層侵入を制限する上で重要な機能を有する。更に、 細胞増殖アッセイにおけるＩＢＰ−１の阻害機能及びある癌細胞のエストローゲ ン応答性に関するＩＢＰ−１の予想外の直接的阻害効果は、ＩＢＰ−１又はその 修飾体を局所増殖阻害効果によって可能性ある抗癌剤とさせる。IGF-binding proteins such as alpha-IPEG or modified versions thereof can be IBP-1 is the main secreted soluble protein of decidual cells during placental development. It has an important function in restricting trophoblast invasion into the endometrium. Furthermore, Inhibitory function of IBP-1 in cell proliferation assay and estrogen in certain cancer cells The unexpected direct inhibitory effect of IBP-1 on responsiveness to IBP-1 or its The local growth inhibition effect makes the modified form a potential anticancer agent.
本発明は図面を参考にして以下の記載から更に詳細に説明される。The invention will be explained in more detail in the following description with reference to the drawings.
第１図は、ヒト２８ｋＤＩＧＦ結合タンパク質ｃ ＤＮＡクローンに関する制限 地図及び配列について示している。Figure 1 shows the restrictions regarding the human 28kDIGF binding protein c DNA clone. The map and arrangement are shown.
第２図は、胎盤ｃＤＮＡ配列と肝臓ｃＤＮＡ配列との差異が括弧で示されたヒト 羊水結合タンパク質のヌクレオチド及び推定アミノ酸配列について示している。Figure 2 shows human human cDNA sequences with differences between placental and liver cDNA sequences indicated in parentheses. The nucleotide and deduced amino acid sequences of amniotic fluid binding protein are shown.
第３図は、ｐＳＶ１９、ｐＳＶ４、ｐＳＶ４Ｉｎｖでトランスフェクト（ｔｒａ ｎｓｆｅｃｔ）されたＣＯ５−１細胞及び非トランスフェクトＣＯ５−１細胞の 培地のＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析について示している。Figure 3 shows transfection (tra) with pSV19, pSV4, and pSV4Inv. nsfect) and non-transfected CO5-1 cells. Shown is SDS/PAGE analysis of the culture medium.
ＩＧＦ−ＢＰをコードするｃＤＮＡは、ヒト羊水結合タンパク質に対するポリク ローナル抗体でヒト胎盤及びヒトヘバトー７ （ＨＥＰＧ−２）ｃＤＮＡ発現ラ イブラリーをスクリーニングすることにより得られた（Ｄｒｏｐら。The cDNA encoding IGF-BP is a polynucleotide for human amniotic fluid-binding protein. Human placenta and human Hebatou 7 (HEPG-2) cDNA expression assay using local antibodies. (Drop et al.
１９８４ａ ）。1984a).
制限分析では、胎盤ライブラリーから単離されたクローン及びＨＥＰＧ２ライブ ラリーから単離されたクローンが共直線性であって（第１図）、それらの候補を ＩＧＦ結合結合タンパクロクローンて支持することを示した。複合制限地図は第 １図の最上部に示されている。In restriction analysis, clones isolated from placental library and HEPG2 live The clones isolated from the library were colinear (Figure 1), making these candidates It was shown that IGF-binding binding protein clones support IGF binding. Composite restriction map is 1 is shown at the top of Figure 1.
推定リーダー配列は翻訳領域を表すオーブンボックスの前に示されている。各矢 印はチェインターミネータ−法による配列決定の方向及び範囲について示してい る。４種の異なるクローンが並べられている。ｐ４及びｐ１９は胎盤ｃＤＮＡラ イブラリーに由来し、一方Ｗ６１及びＷＳ２はＨＥＰＧ２ ｃＤＮＡライブラ リーに由来する（Ｅ−ＥｃｏＲＩｓ Ｐ−Ｐｓ ｔ Ｉ、Ｂ−ＢａｍＨＩ、Ｈ− Ｈｉｎｄ■、Ｓ−５ｓｔＩ、Ｘ−Ｘｂａｌ、Ｎ−Ｎｃｏｌ）。The putative leader sequence is shown in front of the oven box representing the translated region. each arrow The marks indicate the direction and range of sequencing using the chain terminator method. Ru. Four different clones are lined up. p4 and p19 are placental cDNA W61 and WS2 are derived from the HEPG2 cDNA library, while W61 and WS2 are derived from the HEPG2 cDNA library. (E-EcoRIs P-Ps tI, B-BamHI, H- Hind■, S-5stI, X-Xbal, N-Ncol).
単離されたクローンの１つ（ｐ １９）のｃＤＮＡインサートの完全ヌクレオチ ド配列が決定された。第２図で示された１４２１ヌクレオチド配列は、５２ヌク レオチドの５′非翻訳領域、しかる後ＡＴＧコドン及び７７６ヌクレオチドのオ ーブン読取り枠を含んでいる。潜在的な開始コドンは、開始コドンに関するコザ ックの基準に適合した５′配列に隣接されている（Ｋｏｚａｋ、 １９８Ｂ）。Complete nucleotide of the cDNA insert of one of the isolated clones (p19) The code sequence was determined. The 1421 nucleotide sequence shown in Figure 2 consists of 52 nucleotides. the 5' untranslated region of leotide, followed by the ATG codon and the 776 nucleotide oligonucleotide. Contains an open reading frame. Potential start codons are It is flanked by a 5' sequence that meets the criteria of a block (Kozak, 198B).
３′末端において、オーブン読取り枠は翻訳終結コドン（ＴＧＡ）及び５６９ヌ クレオチド鎖長の３′非翻訳配列に隣接されている。At the 3' end, the open reading frame includes a translation termination codon (TGA) and a 569-nucleotide It is flanked by 3' untranslated sequences of cleotide length.
ｃＤＮＡクローンｐ１９におけるオーブン読取り枠は、第２図でも（−文字コー ドで）示される計算Ｍｙ２８．１７２ダルトンの２５９残基のタンパク質をコー ドする能力を有している。開始メチオニンは、小胞体膜への形成期ポリペプチド 配列の移行に必要な推定シグナル配列を表す２４残基高疎水性ペプチド配列（下 線部分）の最初のアミノ酸である。好ましいシグナルペプチダーゼ開裂部位（ａ １ ａ −ｇ １ ｙ）はｐｏｓ＋１のアラニン残基のずぐＮ末端側に存在す る（ｗｏｎ Ｈｅ１ｊｎｅ、１９８７） 、予想された成熟タンパク質のＮＨ２ 末端は、羊水（Ｐｏｖｏａら。The open reading frame for cDNA clone p19 is also shown in Figure 2 (- character code). The calculated My28.172 Dalton 259-residue protein shown in It has the ability to The initiating methionine is a nascent polypeptide that enters the endoplasmic reticulum membrane. A 24-residue highly hydrophobic peptide sequence representing the putative signal sequence required for sequence migration (see below) It is the first amino acid of the line part). Preferred signal peptidase cleavage site (a 1a-g1y) is present immediately on the N-terminal side of the alanine residue of pos+1. (won Heljne, 1987), the predicted mature protein NH2 The terminus is amniotic fluid (Povoa et al.
１９ｇ４） 、ＨＥＰＧ２細胞系（Ｐｏｖｏａら、１９８５）及び血清（Ｂａｘ ｔｅｒら、１９８７）から単離されるＩＧＦ結合タンパク質に関して記載された 化学的決定ＮＨ２末端と同一である。19g4), HEPG2 cell line (Povoa et al., 1985) and serum (Bax ter et al., 1987) described for the IGF-binding protein isolated from Identical to the chemically determined NH2 terminus.
シグナルペプチド配列を除いた場合、この遺伝子産物のＭｒは２３５０ダルトン と予想される。血清ＩＧＦ結合タンパク質のＭｒは約２８．０００ダルトンであ る（Ｂａｘｔｅｒら、１９８７）。差異はＩＧＦ結合タンパク質のグリコジル化 に起因すると考えられる（Ｂｏｈｎら、１９８０；Ｋｏｌｓｔｉｎｅｎら、１９ ８Ｂ）。If the signal peptide sequence is excluded, the Mr of this gene product is 2350 daltons. It is expected to be. Mr of serum IGF binding protein is approximately 28,000 daltons. (Baxter et al., 1987). The difference is glycosylation of IGF-binding proteins (Bohn et al., 1980; Kolstinen et al., 1999). 8B).
そのアミノ酸配列ではＮ結合グリコジル化部位（Ｎ−ＴＳＮ−Ｓ）について開示 していなかった。しかしながら、少なくとも５つの潜在的な０結合グリコジル化 部位が分子のＮ Ｈ２末端でみられた。ＩＢＰ−１タンパク質のＣ０ＯＨ末端部 分にＲＧＤ配列がみられた。このような短鎖配列は、インシュリン群のレセプタ ーに対するフィブロネクチン、ビトロネクチン及びフォンビルプラント因子のよ うなマトリックスタンパク質の細胞付着にとって重要であると考えられる。Its amino acid sequence discloses an N-linked glycosylation site (N-TSN-S) I hadn't. However, at least five potential 0-linked glycosylation A site was found at the NH2 terminus of the molecule. C0OH terminal of IBP-1 protein An RGD sequence was observed in . Such short sequences act as receptors for the insulin group. - such as fibronectin, vitronectin and von Willeplant factor. It is thought that this matrix protein is important for cell attachment.
他の公知タンパク質及びペプチドとのアミノ酸相同性はＮＦＢＲデータベースバ ージョン１２．０及び２６．０をサーチすることにより調べた。ＩＧＦ−ＢＰタ ンパク質はいかなる有意のタンパク質相同性も示さず、ＩＧＦ−ＢＰが独特なタ ンパク質であることを示している。特に、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−ＩＩ、インシュ リン、Ｉ型ＩＧＦレセプター及び■型ＩＧＦレセプターアミノ酸配列のアミノ酸 配列比較では相同的なドメインのないことを示した。加えて、高分子量ＩＧＦ結 合タンパク質に関して報告されたＮＨ２末端アミノ酸配列との相同性もみられな かった（Ｂａｘｔｅｒら、１９８Ｂ）。Amino acid homology with other known proteins and peptides can be found in the NFBR database. This was determined by searching for versions 12.0 and 26.0. IGF-BP The proteins do not show any significant protein homology and IGF-BP is a unique protein. This indicates that it is a protein. In particular, IGF-1, IGF-II, insulin phosphorus, type I IGF receptor and type I IGF receptor amino acid sequences Sequence comparison showed no homologous domains. In addition, high molecular weight IGF binding There is also no homology with the NH2-terminal amino acid sequence reported for the combined protein. (Baxter et al., 198B).
更に、唾乳動物細胞でＩＢＰ−１を発現させることができた。発現ベクターｐｓ Ｖ１９、ｐＳＶ４及びｐＳＶ４１ｎｖは発現ベクターｐＳＶ３２８に全鎖長クロ ーンｐ４及びｐ１９を挿入することにより組み立てられた。Furthermore, we were able to express IBP-1 in mammalian cells. expression vector ps V19, pSV4 and pSV41nv were cloned into the expression vector pSV328. It was assembled by inserting the genes p4 and p19.
ｃＤＮＡインサートが３゛−５−向きであるベクターｐＳＶ４、ｐｓＶ１９及び ｐＳＶ４ＩｎｖはＣＯ５−１細胞にトランスフェクトされた。ＳＤＳ／ＰＡＧＥ 分析の適用により、ｐｓＶ１９（Ａ列） 、ｐＳＶ４ （Ｂ列）及び羊水（０列 ）でトランスフェクトされたＣＯＳ −１細胞の細胞培地が分析された。ＩＧＦ 結合結合タンパ音質ＤＮＡライブラリーのスクリーニングに関して記載されるよ うに免疫染色によって可視化された。遺伝子が正しい向きであるｐＳＶ４及びｐ Ｓｖ１９トランスフエク１−ＣＯ３−１細胞の培地において、羊水（第３図）か らのＩＧＦ結合結合タンパ音質免疫学的に区別される３２ｋＤのタンパク質が検 出された。すべての培地において、３５ｋＤＳＭＢＰ抗体と反応するバンドがみ えるが、但しこれは非トランスフェクトＣＯＳ −１細胞の培地には存在しなか った。Vectors pSV4, psV19 and psV19 with cDNA inserts in 3'-5-orientation pSV4Inv was transfected into CO5-1 cells. SDS/PAGE Application of the analysis revealed psV19 (column A), pSV4 (column B) and amniotic fluid (column 0). ) was analyzed. IGF The screening of conjugated protein-sound DNA libraries is described. The sea urchin was visualized by immunostaining. pSV4 and pSV4 with the gene in the correct orientation In the culture medium of Sv19 transfected 1-CO3-1 cells, amniotic fluid (Fig. 3) A 32 kD protein that is immunologically distinct from IGF-binding proteins was detected. Served. A band reactive with the 35kDSMBP antibody was observed in all media. However, this is not present in the culture medium of non-transfected COS-1 cells. It was.
ＩＢＰ−１はＣＯＳ −１細胞でうまく発現されたが、推定タンパク質において Ｎ結合グリコジル化部位が欠如していても、様々な治療組成物で用いられるＩＢ Ｐ−１の産生を高める上では、酵母及び細菌における発現にとり好ましい。IBP-1 was successfully expressed in COS-1 cells, but the putative protein Despite the lack of N-linked glycosylation sites, IBs used in various therapeutic compositions Expression in yeast and bacteria is preferred for increasing P-1 production.
本発明はＩＢＰ−１又はその誘導体及び薬理学的に許容される賦形剤を含んだ治 療組成物を提供する。本発明のｒＧＦ結合タンパク質又はその誘導体を含んだこ のような組成物は、ソマトメジンの生理学的機能に関連した多くの治療用途を有 している。The present invention provides a therapeutic method comprising IBP-1 or a derivative thereof and a pharmacologically acceptable excipient. therapeutic compositions. A product containing the rGF binding protein of the present invention or a derivative thereof. Such compositions have many therapeutic uses related to the physiological functions of somatomedin. are doing.
本発明のＩＧＦ結合結合タンパ音質通常の賦形剤と共にＩＧＦ結合結合タンパ音 質んだ医薬製剤として処方してもよい。本発明の医薬製剤は、非経口投与、例え ば１、 ■、 、Ｓ、 Ｃ，％ １． ｍ、 ｓ植込み、皮下もしくは静脈 内投与、粘膜、例えば経口、経鼻、経口腔、舌下もしくは経直腸投与を介する投 与又は経皮投与用の懸濁液でも又は溶液の形であってもよい。IGF-binding proteins of the present invention together with conventional excipients. It may also be formulated as a regular pharmaceutical preparation. The pharmaceutical formulation of the invention can be administered parenterally, e.g. Ba1, ■, , S, C,% 1. m, s implantation, subcutaneous or intravenous Administration via mucous membranes, e.g. oral, nasal, buccal, sublingual or rectal administration. It may be in the form of a suspension or solution for intravenous or transdermal administration.
例えば、ソマトメジンの生理学的半減期が本発明で記載されたＩＢＰ−１をＩＧ Ｆ−１及びＩＧＦ−２と複合化させることで長（なるようにして、ソマトメジン が特定標的組織に輸送されねばならない場合がある。本発明によれば、このよう な複合体からのＩＧＦ−１又は２の徐放性は、この投与法によって局所的又は全 身的に一定レベルのソマトメジンを確実なものにする。これによって、本発明で 記載されたＩＢＰ−１は、高用量で、即ち静脈内から投与された場合であっても 繊維芽細胞、筋肉細胞及び内皮細胞のような様々な細胞で望ましくない局所細胞 増殖を引き起こすソマトメジンの強い分裂促進効果を消失させる。For example, IBP-1, which has a physiological half-life of somatomedin as described in the present invention, By complexing with F-1 and IGF-2, somatomedin may need to be delivered to specific target tissues. According to the present invention, such The sustained release of IGF-1 or 2 from the complex is achieved by this method of administration, either locally or globally. Physically ensure a certain level of somatomedin. This allows the present invention to The IBP-1 described is effective even when administered in high doses, i.e. intravenously. Undesirable local cells such as fibroblasts, muscle cells and endothelial cells Eliminates the strong mitogenic effect of somatomedin, which causes proliferation.
しかしながら、本発明で記載されたＩＢＦ−１は、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２及び 他の成長因子と共に投与されるか又は創傷の治癒、骨粗髭症の治療及び骨の治癒 に用いられる治療装置で適用される（ＰＤＧＦ、ＥＧＦ。However, IBF-1 described in the present invention is limited to IGF-1, IGF-2 and Administered with other growth factors or for wound healing, osteoporosis treatment and bone healing (PDGF, EGF.
ＦＧＦＳＴＧＦアルファ又はＴＧＦベータのような）局所用の通常製剤として処 方される場合であっても、このような治療装置によるソマトメジンの定常的なコ ントロールされた放出のため価値があろう。(such as FGFSTGF alpha or TGF beta). Even when treatment is performed, the constant supply of somatomedin by such treatment devices would be valuable because of controlled emissions.
このような製剤は、例えばＩＢＰ−１及びＩＧＦ−１、ＩＢＰ−１及びＩＧＦ− ２又はＩＢＰ−１、ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２を含んだ組合せ製剤の形で場合に より投与される。Such formulations include, for example, IBP-1 and IGF-1, IBP-1 and IGF-1. 2 or in the form of a combination preparation containing IBP-1, IGF-1 and IGF-2. more administered.
一般に、本発明のＩＢＰ−１は高いＩＧＦ−１及び／又はＩＧＦ−２レベルを要 する障害又は他の機能不全の将来の治療においてＩＧＦ−１及び／又はＩＧＦ− ２の放出に関し強い調節機能を示すようになるであろう。Generally, the IBP-1 of the invention requires high IGF-1 and/or IGF-2 levels. IGF-1 and/or IGF-1 in the future treatment of disorders or other dysfunctions It will show a strong regulatory function regarding the release of 2.
他方、本発明のＩＢＰ−１又はその誘導体は多量のソマトメジン産生で特徴付け られるある癌の増殖の治療に有用であり、したがって軟骨肉腫、繊維肉腫及び乳 癌のような癌における望ましくない細胞増殖のオートラリン／バラクリン生理学 的促進を阻害する。On the other hand, IBP-1 or its derivatives of the present invention are characterized by the production of large amounts of somatomedin. It is useful in the treatment of certain cancerous growths such as chondrosarcoma, fibrosarcoma and breast cancer. Autoralin/Baracrine Physiology of Undesirable Cell Growth in Cancer-like Cancers hinders the promotion of
更に、本発明で記載されたＩＢＰ−１又はその誘導体は抗体の産生にも有用であ る。このようなモノ又はポリクローナル抗体は、組織内におけるＩＢＰ−１の免 疫組織化学的分析のような免疫学的方法を開発する上で及びＩＢＰ−１定量のた めのＥＬ Ｉ ＳＡを開発する上で適している−このようなＥＬＩ ＳＡは様々 なＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２レベルの患者においてＩＢＰ−ルベルを早期にスク リーニングするために有益であろう。Furthermore, IBP-1 or its derivatives described in the present invention are also useful for producing antibodies. Ru. Such mono- or polyclonal antibodies can inhibit IBP-1 immunity within tissues. In developing immunological methods such as epithelial histochemical analysis and for IBP-1 quantification. Suitable for developing a new ELI SA - such an ELI SA can be early screening of IBP-Lubel in patients with moderate IGF-1 and IGF-2 levels. It would be beneficial for leaning.
ｓ、 ｃ、及びｉ、ｍ、投与用の本発明の医薬製剤は下記成分を混合すること により製造できる： ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２及び他の成長因子と共にＩＢＰ− １及びその誘導体、等張剤、緩衝剤、保存剤及び水。混合後、製剤のｐＨ値は必 要であればｐＨ−７，３に調整される。The pharmaceutical formulation of the present invention for administration of s, c, and i, m can be prepared by mixing the following ingredients: Can be produced by: IBP-1 along with IGF-1, IGF-2 and other growth factors. 1 and its derivatives, isotonic agents, buffering agents, preservatives and water. After mixing, the pH value of the formulation must be If necessary, the pH is adjusted to -7.3.
保存剤の例：フェノール及びｍ−クレゾール。等張剤の例：塩化ナトリウム及び グリセロール。緩衝剤の例はリン酸ナトリウムである。Examples of preservatives: phenol and m-cresol. Examples of isotonic agents: sodium chloride and Glycerol. An example of a buffering agent is sodium phosphate.
経粘膜投与用の本発明の医薬製剤は下記成分を混合することにより製造できる： ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２及び他の成長因子と共にＩＢＰ−１及びその誘導体、 緩衝剤、等張剤、保存剤、吸収促進剤並びにビヒクル、例えば水、セルロース、 水溶性セルロースアルキルエーテル、結晶セルロース、水溶性ポリアクリレート 又はそれらの混合物。Pharmaceutical formulations of the invention for transmucosal administration can be prepared by mixing the following ingredients: IBP-1 and its derivatives together with IGF-1, IGF-2 and other growth factors, Buffers, isotonic agents, preservatives, absorption enhancers and vehicles such as water, cellulose, Water-soluble cellulose alkyl ether, crystalline cellulose, water-soluble polyacrylate or a mixture thereof.
経皮投与用の本発明の医薬製剤は下記成分を混合することにより製造できる：Ｉ ＧＦ−１、ＩＧＦ−２及び他の成長因子と共にＩＢＰ−１及びその誘導体、等張 剤、保存剤並びにビヒクル、例えば水溶性セルロースアルキルエーテルの親水性 ゲル。Pharmaceutical formulations of the invention for transdermal administration can be prepared by mixing the following ingredients: I IBP-1 and its derivatives, along with GF-1, IGF-2 and other growth factors, isotonic Hydrophilicity of agents, preservatives and vehicles such as water-soluble cellulose alkyl ethers gel.
本発明はＩＢＰ−１の単離及びキャラクタライゼイションについて記載する下記 実施例で更に説明される。The present invention describes the isolation and characterization of IBP-1 below. This is further explained in the Examples.
例 （ラムダｇｔｌ１発現ライブラリーのスクリーニング）ラムダｇｔｌｌのヒト胎 盤ｃＤＮＡライブラリー及びヒトへパトーマ細胞系ＨＥＰＧ２のｃＤＮＡライブ ラリーを、ヤング及びデービスにより記載された操作（Ｙｏｕｎｇ及びＤａｖｉ ｓ、１９８２）に従い、ヒト羊水結合タンパク質に対するポリクローナル抗体で スクリーニングした。ヒト羊水から単離された３５ｋＤソマトメジン結合タンパ ク質ＳＭＢＰに対するウサギ抗体をドロップら、１９８４ａ年に記載されたよう に産生かつ精製した。抗体は、１０１イソプロピルβ−ｄ−チオガラクトピラノ シド（ＩＰＴＧ）で誘導された大腸菌Ｙ１０９０／ラムダｇｔｌｌの集密溶菌プ レートから引き上げられたニトロセルロースフィルターと共にインキュベートす ることにより、大腸菌Ｙ１０９０及びラムダｇｔｌｌに対して吸収させた。抗体 を更にニトロセルロースフィルター上に固定されたヒト血清アルブミンに対して 吸収させた。胎盤ライブラリーの約４×１０５クローン及びＨＰＥＧ２ライブラ リーの約０．５Ｘ１０５クローンをスクリーニングした。１５０關ベトリ皿当た り３〜５Ｘ１０４のプラーク形成単位をＹ１０９０細菌のローン（ｌａｗｎ）上 におき、インキュベートした。２時間のインキュベート後、プレートを１０ａＭ ＩＰＴＧで飽和されたニトロセルロースフィルター（ミリボア（Ｍ目１１ｐｏｒ ｅ） ＨＡ Ｔ Ｆ ）でカバーした。プレートを３７℃で２〜２．５時間イン キュベートシた。フィルターを取出し、室温でトリス緩衝液（ＴＢＳ ； １０ ｉＭ）リス／ＭＣＩ、ｐＨ７，５／１５０ａ＋ＭＮａｃｌ）により洗浄し、室温 で３０分間ＴＢＳ中３％ＢＳＡと共にインキュベートした。部分的に精製された １ ：１２５希釈ウサギポリクロ一ナル３５ｋＤＳＭＢＰ抗体を、ＴＢＳ中３％ ＢＳＡ＋０．０２％アジドに加え、フィルターを４℃で一夜インキユベートした 。フィルターを洗浄し、ＴＢＳ中３％ＢＳＡ中において１ ： ２００希釈され た西洋ワサビペルオキシダーゼ複合化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（タボ（Ｔａｇｏ）） と共に室温で６０分間インキュベートした。フィルターを洗浄し、室温でｐＨ９ ，２の０．２Ｍトリス／ ＨＣ１−１０ＩＩＭＭ ｇ ＣＩ ２中のアミドフェ ニル及びナフトールＡＳ−ＭＸホスフェートと共に放置した。example (Screening of lambda gtl1 expression library) Lambda gtll human embryo cDNA library and human hepatoma cell line HEPG2 cDNA live The rally was carried out using the procedure described by Young and Davis (Young and Davi s, 1982) with a polyclonal antibody against human amniotic fluid-binding protein. Screened. 35kD somatomedin-binding protein isolated from human amniotic fluid Rabbit antibodies against SMBP were as described by Drop et al., 1984a. was produced and purified. The antibody is 101 isopropyl β-d-thiogalactopyrano A confluent lytic plate of E. coli Y1090/lambda gtll induced with sid (IPTG) Incubate with a nitrocellulose filter pulled from the plate. By doing so, it was absorbed into E. coli Y1090 and lambda gtll. antibody for human serum albumin further immobilized on a nitrocellulose filter. I let it absorb. Approximately 4 x 105 clones of placenta library and HPEG2 library Approximately 0.5×105 clones of Lee were screened. 150 pieces per plate Place 3-5 x 104 plaque-forming units on a lawn of Y1090 bacteria. and incubated. After 2 hours incubation, plate at 10aM Nitrocellulose filter saturated with IPTG (millibore (M order 11por) e) Covered with HA TF). Incubate the plate at 37°C for 2-2.5 hours. Cubed. Remove the filter and add Tris buffer (TBS; 10 iM) Rhys/MCI, pH 7,5/150a+MNacl) and kept at room temperature. and 3% BSA in TBS for 30 minutes. partially refined 1:125 diluted rabbit polyclonal 35k DSMBP antibody at 3% in TBS. Added BSA + 0.02% azide and incubated the filters overnight at 4°C. . Filters were washed and diluted 1:200 in 3% BSA in TBS. horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (Tago) and incubated for 60 minutes at room temperature. Wash the filter and adjust it to pH 9 at room temperature. , 2 of 0.2M Tris/HC1-10IIMM g CI 2 and naphthol AS-MX phosphate.
陽性ファージを単離し、ＤＮＡを標準的方法で単離した（Ｍａｎｉａｔｉｓら、 １９ｇ２）。ポリクローナル抗体と強く交差反応するプラーク約３３を胎盤及び ＨＥＰＧ２ ｃＤＮＡライブラリーで確認した。再スクリーニング後、サイズ ０．９〜１．５ｋＤの様々なインサートを単離し、ファルマシア（Ｐｈａｒｓａ ｃｌａ）のベクターＰＴＺ１９に組込んでサブクローニングした。胎盤ライブラ リーからの１つのクローン及びＨＥＰＧ２ライブラリーからの５つの弱いハイブ リッド形成りローンを除き、すべての単離されたクローンはサザンプロットで交 差ハイブリッド形成を示した。Positive phages were isolated and DNA isolated using standard methods (Maniatis et al. 19g2). Approximately 33 plaques that strongly cross-reacted with polyclonal antibodies were collected from the placenta and Confirmed with HEPG2 cDNA library. After rescreening, size Various inserts of 0.9-1.5 kD were isolated and purchased from Pharmacia (Pharsa). cla) and subcloned into the vector PTZ19. placenta library 1 clone from Lee and 5 weak hives from HEPG2 library With the exception of lid-forming clones, all isolated clones were crossed on Southern blots. showed differential hybridization.
ＤＮＡを供給者の指示に従い様々な制限エンドヌクレアーゼ（ＢＲＬ、ＮＥＮ、 ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ））で切断し、０．８％アガロース中で電 気泳動に付し、サザンの方法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、 １９７５）に従いニトロセ ルロースフィルターに移動させた。ｍＲＮＡをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ ）及びグリオキサールで変性し、１％アガロース中で電気泳動に付し、ニトロセ ルロースフィルター（ミリボアＨＦＴＦ）に移動させた。The DNA was digested with various restriction endonucleases (BRL, NEN, Cut with a Boehringer and electrolyte in 0.8% agarose. nitroseparate according to Southern's method (Southern, 1975). Transferred to lurose filter. mRNA was extracted with dimethyl sulfoxide (DMSO). ) and glyoxal, electrophoresed in 1% agarose, and nitrose Transferred to a lurose filter (millibore HFTF).
制限断片をベクターＰＴ２１ｇ又はＰＴＺ１９ （ファルマシア）に組込んでサ ブクローニングし、チェインターミネータ−法（Ｓａｎｇｅｒら、１９７７）に 従い配列決定した。The restriction fragment was incorporated into the vector PT21g or PTZ19 (Pharmacia) for support. cloned and chain terminator method (Sanger et al., 1977). It was then sequenced.
好都合な制限部位を欠く領域の場合には、適切なりローンをＢａ１３１ヌクレア ーゼ切断で得た。In the case of regions lacking convenient restriction sites, a suitable clone can be added to the Ba131 nucleus. Obtained by enzyme cleavage.
（ＣＯ８−１細胞のトランスフェクション）全鎖長ｃＤＮＡクローンｐ４及びｐ １９を、サルウィルス４０ （ＳＶ４０）初期プロモーターを用いてクローン化 インサートを発現する、ｐＳＶ３２８（７）ＥＣＯＲＩに組込んでサブクローニ ングした（Ｖａｎ Ｈｅｕｖｅｌら、１９８６）。(Transfection of CO8-1 cells) Full length cDNA clones p4 and p 19 was cloned using the simian virus 40 (SV40) early promoter. Subcloned into pSV328(7)ECORI expressing the insert. (Van Heuvel et al., 1986).
ＤＥＡＥ−デキストラン操作（ＭｃＣｕｔｈｃｈａｎ ＆ Ｐａｇａｎｏ。DEAE-dextran manipulation (McCutchan & Pagano.
１９８６）後、ダルベツコＭＥＭ （ＤＭＥＭ）中での４時間の１００μＭクロ ロキンとの処理によって、Ｃ０８−１細胞をトランスフェクトした（Ｇｌｕｚｓ ａｎ、 １９８１）。この処理の後、細胞をＤＭＥＭ＋５％牛脂児血清で２４時 間増殖させた。培地を７２時間後に除去し、細胞をＤＭＥＭで徹底洗浄し、無血 清ＤＭＥＭで７２時間インキュベートした。培地中における３２ｋＤ結合タンパ ク質の産生は３５ｋＤＳＭＢＰ抗体を用いて調べた。(1986) followed by 100 μM cloning for 4 h in Dulbecco MEM (DMEM). C08-1 cells were transfected by treatment with Rokin (Gluzs an, 1981). After this treatment, the cells were incubated with DMEM + 5% tallow serum for 24 hours. It was grown for a while. The medium was removed after 72 hours and the cells were thoroughly washed with DMEM and blood-free. Incubated in clear DMEM for 72 hours. 32kD binding protein in the medium Protein production was examined using a 35kDSMBP antibody.
ＩＢＰ−１の精製 羊水又はならし培地からのタンパク質を最終濃度３５％の硫酸アンモニウムで沈 降させた。遠心後、上澄を５０％硫酸アンモニウムにした。ベレットを４５％硫 酸アンモニウムに溶解し、最終ペレットを更に精製及びキャラクタライゼイショ ンのためにｐＨ７，５の５０ｍＭトリスＨＣＩに溶解した。溶解された硫酸アン モニウム沈降物をＣ１８逆相クロマトグラフィーで更に精製した。Purification of IBP-1 Proteins from amniotic fluid or conditioned medium were precipitated with ammonium sulfate to a final concentration of 35%. It rained. After centrifugation, the supernatant was made into 50% ammonium sulfate. Beret with 45% sulfur The final pellet was dissolved in ammonium chloride for further purification and characterization. The solution was dissolved in 50mM Tris-HCI at pH 7.5 for analysis. dissolved ammonium sulfate The monium precipitate was further purified by C18 reverse phase chromatography.
ｐＨ７，５の５０ＩＩＭトリスＨＣＩ及び５０％メタノール中ｐＨ７，５のトリ スＨＣＩで洗浄後、純粋なＩＢＰ−１を６５％メタノール中ｐＨ７，５のトリス Ｉ（ＣＩでカラムから溶出させた。ＩＢＰ−１を７％トリクロロ酢酸溶液中で一 夜かけて沈降させた。沈降物をｐＨ７，５の２０ｓＭ）リスＨＣＩに溶解し、凍 結乾燥し、−２０℃で貯蔵した。50IIM Tris HCI at pH 7.5 and Tris at pH 7.5 in 50% methanol. After washing with HCl, pure IBP-1 was washed with Tris at pH 7.5 in 65% methanol. The column was eluted with IBP-1 (CI) in a 7% trichloroacetic acid solution. It was allowed to settle overnight. The sediment was dissolved in 20 sM (pH 7.5) Lis HCl and frozen. Dry and store at -20°C.
精製ＩＢＰ−１のキャラクタライゼイションＩＢＰ−１は、過剰の冷ＩＧＦ−１ 又はＩＧＦ−２存在下又は非存在下＋ １２５Ｉ Ｉ ＩＧＦ−１及び１１２ ５ＩＩＩＧＦ−２との結合アッセイで測定した場合にほぼ同様の特異性でＩＧＦ −１及びＩＧＦ−２の双方と結合する。Characterization of Purified IBP-1 IBP-1 is derived from excess cold IGF-1. or in the presence or absence of IGF-2 + 125I I IGF-1 and 112 5IIIGF-2 with approximately similar specificity as measured in a binding assay. -1 and IGF-2.
ＩＢＰ−１反応の特異性は、かかる競合アッセイを用いる同様のアッセイ、及び 、ＩＢＰ−１−ＩＧＦ結合がＩＢＰ−１に対する抗体の特異的反応を介して視覚 化されるアッセイで試験した。このようなアッセイにおいて、ＩＢＰ−１はＩＧ Ｆ−１及びＩＧＦ−２のみと反応したが、但しインシュリン、プロインシュリン 又はそれらの端部欠如体のような密接に関連した化合物とは反応しなかった。The specificity of the IBP-1 reaction was determined by similar assays using such competitive assays, and , IBP-1-IGF binding is mediated by the specific reaction of antibodies against IBP-1. tested in a standard assay. In such assays, IBP-1 is Reacted only with F-1 and IGF-2, but with the exception of insulin and proinsulin. or with closely related compounds such as their truncated forms.
ＩＢＰ−１の精製サンプルの生物学的効果についてはＭＣＦ−７乳癌細胞系中へ の３Ｈ−チミジン取込みを利用したインビトロ分裂促進試験で試験した。細胞増 殖に関するＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２双方の促進効果は用量依存的にＩＢＰ−１ で阻害された。ＩＧＦ−２依存細胞増殖に関するＩＢＰ−１の効果はＩＢＦ−１ の効果よりも顕著であった。Biological effects of purified samples of IBP-1 in MCF-7 breast cancer cell line was tested in an in vitro mitogenic assay utilizing 3H-thymidine incorporation. cell increase The promoting effects of both IGF-1 and IGF-2 on proliferation are dose dependent on IBP-1. was inhibited. The effect of IBP-1 on IGF-2-dependent cell proliferation is due to IBF-1 The effect was more significant than that of .
更に、軟骨中への＋３５Ｓ＋−メチオニン取込みを利用したアッセイにおいて、 ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２の促進効果は低ｎｇ範囲でＩＢＰにより消失した。Furthermore, in an assay using +35S+-methionine uptake into cartilage, The stimulatory effects of IGF-1 and IGF-2 were abolished by IBP in the low ng range.
２５ｎｇ ＩＢＰ−１ １０ｎｇ ＩＧＦ−１ ０，７％ＮａＣ１ １／７５Ｍリン酸ナトリウム 水 全量１ｍｌ 計算量のＩＢＰ−１及びＩＧＦ−１をＮａＣ１含有リン酸緩衝液に溶解し希釈し た。ｐＨを７．３〜７．４に調整した。25ng IBP-1 10ng IGF-1 0.7%NaCl 1/75M sodium phosphate Water total volume 1ml Calculated amounts of IBP-1 and IGF-1 were dissolved and diluted in phosphate buffer containing NaCl. Ta. The pH was adjusted to 7.3-7.4.
例２ ２５ｎｇ ＩＢＰ−１ １０ｎｇ ＩＧＦ−２ １，６％グリセリン １／７５Ｍリン酸ナトリウム ０．０１％塩化ベンザルコニウム ０．０５％エデト酸ナトリウム 水 全量１ｍｌ 計算量のＩＢＰ−１及びＩＧＦ−２をグリセリン、塩化ベンザルコニウム及びエ デト酸ナトリウム含有リン酸緩衝液に溶解し希釈した。ｐＨを７．４に調整した 。Example 2 25ng IBP-1 10ng IGF-2 1,6% glycerin 1/75M sodium phosphate 0.01% benzalkonium chloride 0.05% sodium edetate Water total volume 1ml Calculated amounts of IBP-1 and IGF-2 were added to glycerin, benzalkonium chloride and It was dissolved and diluted in a phosphate buffer containing sodium detate. pH was adjusted to 7.4 .
例３ ２５ｎｇ ＩＢＰ−１ １０ｎｇ ＩＧＦ−１ １０ｎｇ ＩＧＦ−２ ５％ヒドロキシエチルセルロース ０．９％ベンジルアルコール １／７５Ｍリン酸緩衝液 水 全量１ｍｌ ゲルはヒドロキシエチルセルロースをＩＢＰ−１、ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２含 有水相と混合することにより製造する。Example 3 25ng IBP-1 10ng IGF-1 10ng IGF-2 5% hydroxyethyl cellulose 0.9% benzyl alcohol 1/75M phosphate buffer Water total volume 1ml The gel contains hydroxyethyl cellulose containing IBP-1, IGF-1 and IGF-2. Produced by mixing with an aqueous phase.
文献： １、 Ｂａｘｔｅｒ Ｒ，Ｃ，、Ｍａｒｔｉｎ Ｊ、Ｌ、、Ｔｙｌｅｒ Ｍ、１ ．、Ｈｏｖｄｅｎ Ｍ。Literature: 1, Baxter R, C, Martin J, L, Tyler M, 1 ．． , Hovden M.
Ｅ、Ｈ，、ヒト血漿からの成長ホルモン依存性インシュリン様成長因子（ＩＧＦ ）結合タンパク質は他のヒトＩＧＦ結合タンパク質と異なる（Ｇｒｏｗｔｈ ｈ ｏｒｍｏｎｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｎｓｕｌｌｎ−１ｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆ’ａｃｔｏｒ（ＩＧＰ）ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｒｒｏｖＩ ｈｕｍ ａｎ ｐｌａｓｍａ ｄｉｆｆｅｒｓ ｒｒｏｙｒ ｏｔｈｅｒ ｈ ｕｍａｎ ＩＧＰｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｌｎｓ）、ａ、Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、Ｂｌｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎｕｎ。E, H, Growth hormone-dependent insulin-like growth factor (IGF) from human plasma. ) binding protein is different from other human IGF binding proteins (Growth ormone-dependentlnsulln-1ike growth f’actor (IGP) binding proteinrrovI hum an plasma differs rroyr other h uman IGP binding protelns), a, Bioche m, Blophys, Res, Commun.
１９８６：１３９：１２５Ｂ−１２８１゜２、 Ｂｏｈｎ Ｈ，、Ｋｒａｕｓ ｗ、、新規胎盤特異タンパク質の単離及び特徴化（Ｉｓｏｌｉｅｒｕｎｇ ｕｎ ｄ Ｃｈａｒａｋｔｅｒｉｓｌｅｒｕｎｇｅｉｎｅｓ ｎｅｕｅｎ ｐｌａｓｚ ｅｎｔａｓｐｅｚｉｆｉｓｃｈｅｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＰＰ１２））。1986:139:125B-1281゜2, Bohn H, Kraus Isolation and characterization of novel placenta-specific proteins (Isolierung un d Charakterislerungeines neuen plasz Entaspezifischen Proteins (PP12)).
Ａｒｃｈ、Ｇｙｎｅｃｏｌ 、１９８０：２２９−２７９゜３、 Ｂｒａｄｓｈ ａｖ Ｒ，Ａ、、神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ） 、 Ａｎｎｕ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｓ、 １９７８ ：４７ ：１９１−２１６ ゜４、 Ｃ１ｅ＋ｎｏｎｓ Ｄ、Ｒ，、Ｅｌｇｉｎ Ｒ，Ｇ、、Ｈａｎ Ｖ、に 、Ｍ、、Ｃａ５ｅｌｌａＳ、Ｊ、、Ｄ″Ｅｒｃｏｌｅ Ａ、Ｊ、、Ｖａｎ Ｖｙ ｋ Ｊ、Ｊ、、培養繊維芽細胞単層はソマトメジンＣ／インシュリン様成長因子 の細胞結合性を変えるタンパク質を分泌する（Ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｆｉｂｒｏｂ ｌａｓｔａｏｎｏｌａｙｅｒｓ ５ｅｃｒｅｔｅ ａ ｐｒｏｔｅｌｎ ｔｈａ ｔ ａｌｔｅｒｓ ｔｈｅｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｓｏｍａ ｔｏｍｅｄｌｎ Ｃ／１ｎｓｕｌｉｎ−１１ｋｅｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ） 、１．Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、１９８６：７７：１５４ｇ−１５５６゜５ ． Ｄｅ Ｖｒｏｅｄｅ Ｍ、Ａ、、Ｔｓｅｎｇ Ｌ、Ｙ、）１．、Ｋａｔｓｏ ｙａｎｎｉｓ Ｐ、Ｇ、。Arch, Gynecol, 1980:229-279°3, Bradsh av R, A, Nerve growth factor, Annu, Rev. Bioches, 1978:47:191-216 ゜4, C1e+nons D, R,, Elgin R, G,, Han V, ,M,,Ca5ellaS,J,,D″Ercole A,J,,Van Vy k J, J, Cultured fibroblast monolayers are somatomedin C/insulin-like growth factor secretes proteins that change the cell binding of cultured fibrob lastaonolayers 5ecrete a proteln tha t alters the cellular binding of soma tomedln C/1nsulin-11kegrowth factor) , 1. J, Cl1n, Invest, 1986:77:154g-1556°5 ．． De Vroede M, A,, Tseng L, Y,)1. , Katso yannis P,G.
Ｎ１５ｓｊｅｖ Ｓ、Ｐ、、Ｒｅｃｈｌｅｒ Ｍ、Ｍｌ、 インキュベート培地 に放出されたインシュリン様成長因子キャリアタンパク質によるヒト繊維芽細胞 単層へのインシュリン様成長因子Ｉ結合性の調節（Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏ「 Ｉｎ５ｕｌｉｎ−１ｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈｆａＱｔｏｒ Ｉ ｂｂ＋ｃｌｌ ｎｇ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｒｊｂｒｏｂｌａｓｔ ｍｏｎＯＩａＹｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｂｙ １ｎｓｕｌｉｎ−１ｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｃｔ ｏｒ ｅａｒｒｌｅｒｐｒｏｔｅｉｎｓ ｒｅｌｅａｓｅｄ ｔｏ ｔｈｅ １ ｎｃｕｂａｔｆｏｎ ｍｅｄｉａ）、Ｊ、Ｃｌ１ｎ。N15sjev S, P, Rechler M, Ml, incubation medium human fibroblasts by insulin-like growth factor carrier protein released into Modulation of insulin-like growth factor I binding to monolayers In5ulin-1ike growthfaQtor I bb+cll ng to human rjbroblast monOIaYer cultures by 1nsulin-1ike growth ract or earler proteins released to the 1 ncubatfon media), J, Cl1n.
１ｎｖｅｓｔ、１９８Ｂ＋７７：６０２−８１３゜６、 Ｄｒｏｐ Ｓ、Ｌ、Ｓ 、、Ｖａｌｌｑｕｅｔｔｅ Ｇ、、Ｇｕｙｄａ Ｈ，Ｊ、、ＣｏｒｖｏｌＭ、Ｔ 、、Ｐｏ５ｎｅｒ Ｂ、１．、ヒト羊水におけるインシュリン様活性（ＩＬＡ） に関する結合タンパク質の部分的精製及び特徴化：インシュリン様活性の可能な 阻害剤（Ｐａｒｔｉａｌｐｕｒｉ「１ｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃ ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｒ ａ ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒ １ｎｓｕＩｉｎ−１１ｋｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ（ＪＬＡｓ） ｉｎ ｈｕｔｓ ａｎａＩＩｎｌｏｔｌｃ ｒｌｕｌｄ：ａ ｐｏｓｓｉｂｌｅ １ｎｈｌｂｉｔ ｏｒ ｏｆ Ｉｎ５ｕｌｉｎ−１ｉｋｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ）、Ａｃｔａ、Ｅｎ ｄｏｃｒｉｎｏｌ、（Ｃｏｐｅｎｈ、）１９７９：９０：５０５−５１１８゜ ７、 Ｄｒｏｐ Ｓ、、Ｋｏｒｔｌｅｖｅ Ｄ、、Ｇｕｙｄａ Ｈ，、ヒト羊水 中のソマトメジン結合タンパク質の単離ニラジオイムノアッセイの開発（Ｉｓｏ ｌａｔｉｏｎ ｏｒａ ｓｏｓａｔｏｍｅｄｌｎ ｂｌｎｄｌｎｇｐｒｏｔｅｉ ｎ ｉｎ ｈｕＩｉａｎ ａＩｌｎｉｏｔｌｃ ｒｌｕｉｄ：ｄｅｖｅｌｏｐｅ ｍｅｎｔ ｏｒａｒａｄ ｉｏｌ＋ｕｕｎｏａｓｓａｙ） 、 Ｐｅｄ ｆａｔ ｒ、Ｒｅｓ、 １９８２ ：１６ ： ８９０−４９４ 。1nvest, 198B+77:602-813゜6, Drop S, L, S ,,Vallquette G,,Guyda H,J,,CorvolM,T ,, Po5ner B, 1. , insulin-like activity in human amniotic fluid (ILA) Partial purification and characterization of binding proteins related to: possible insulin-like activity Inhibitor (Partialpuri “1cation and charac terization or a binding protein for 1nsuIin-11ke activity (JLAs) in huts anaIInlotlc ruld:a possible 1nhlbit or of In5ulin-1ike activity), Acta, En docrinol, (Copenh,) 1979:90:505-5118° 7. Drop S, Kortleve D, Guyda H, human amniotic fluid Development of a radioimmunoassay for the isolation of somatomedin-binding proteins in ration ora sosatomedln blndlngprotei n in huIian aIlniotlc rluid: develop ment orarad iol + uunoassay), Ped fat r, Res, 1982:16:890-494.
８、 Ｄｒｏｐ Ｓ、Ｌ、Ｓ、、Ｋｏｒｔｌｅｖｅ Ｄ、Ｊ、、Ｇｕｙｄａ Ｈ ｊ、、期前羊水中のソマトメジン結合タンパク質の単離ニラジオイムノアッセイ の開発（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｏｍａｔｏｍｅｄｌｎｂｉｎｄｉｎ ｇ ｐｒｏｔｅｌｎ ｉｎ ｐｒｅｔｅｒａ ａｍｎｉｏｔｉｃ ｆ’１ｕｉｄ ：ｄｅｖｅｌｏｐｅｓｅｎｔ ｏｌ’ ａ ｒａｄｉｏｉａｉａｕｎｏａ ｓｓａｙ）Ｊ、Ｃｌ１ｎ。8, Drop S, L, S, Kortleve D, J, Guyda H j, Isolation of somatomedin-binding protein in preterm amniotic fluid Niradioimmunoassay Development of (Isolation of a somatomedlnbindin) g proteln in pretera amniotic f’1uid : developsent ol’ a radioiaianoa ssay) J, Cl1n.
Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、Ｍｅｔａｂ、１９８４ａ：５９：８９９−９０７゜９、 Ｅｌｇｆｎ Ｒ，Ｇ、、Ｂｕｓｂｙ Ｊｒ、ｖ、Ｈ，、ＣＩｅ＊＊ｏｎｓ ＤＪ 、、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）結合タンパク質はＩＧＦ−■に対する生 物学的応答を高める（Ａｎ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔ ｏｒ（ＩＧＦ） ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｔｎ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ＩＧＰ−１）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡＩ９８７：８４：３２５４−３２５８゜１０、 Ｐｒｏｅｓｃｈ Ｅ、Ｒ，，５ｃｈａｉｄ Ｃ，，５ｃｈｖａｎｄｅｒ Ｊ、、 Ｚａｐｆ」、、インシュリン様成長因子の作用（Ａｃｔｉｏｎｓ ｏｆｉｎｓｕ ｌｉｎ−１ｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｐｈｙｓ ｉｏｌ、１９８５：４７：４４３−４８７゜ １１、 Ｈｅ１ｊｎｅ Ｇ、、ｖｏｎ、、シグナル配列開裂部位を予想するため の新規方法（Ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｆ’ｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇｓｉ ｇｎａｌ ５ｅｑｕｅｎｃｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ５ｌｔｅｓ）、Ｎｕｃｌｅｉ ｃ、Ａｃ１ｄ。Endocrinol, Metab, 1984a:59:899-907°9, Elgfn R, G,, Busby Jr, v, H,, CIe**ons DJ ,, Insulin-like growth factor (IGF) binding protein has a biological effect on IGF-■. An insulin-like growth fact or(IGF) binding protectn enhancements the biological response to IGP-1), Proc, Nat l, Acad, Sci, USAI987:84:3254-3258゜10, Proesch E, R,,5chaid C,,5chvander J,, Actions of insulin-like growth factor lin-1ike growth factor), Ann, Rev, Phys iol, 1985:47:443-487゜ 11. He1jne G, von, To predict the signal sequence cleavage site A new method f’or predicting gnal 5equence cleavage 5ltes), Nuclei c, Ac1d.
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ １９８８二１４ニア１４−７２２゜１２、 １ｓａａｅｓ Ｎ、、Ｊａｍｅｓ Ｒ，、Ｎ１ａｌｌ Ｈ，ら、レラキシン及びインシュリン とのその構造相関関係（Ｒｅｌａｘｉｎ ａｎｄＩｔｓ ５ｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｔｏ １ｎｓｕｌｉｎ）、Ｎａｔｕｒｅ１９７８ ： ２７１：２７８−２８１゜１３、Ｋｏｉｓｔｌｎｅｎ Ｒ，、Ｋａｌｋｋ ｌｎｅｎ Ｎ、、Ｈｕｈｔａｌａ Ｍ、Ｌ、。Re5earch 1988 214 near 14-722゜12, 1 saaes N., James R., N1all H., et al. Relaxin and insulin Its structural relationship with relationship to 1nsulin), Nature1978 : 271:278-281゜13, Koistlnen R,, Kalkk lnen N,, Huhtala M, L.
５ｅｐｐａｌａ Ｍ、、Ｂｏｈｎ Ｈ，、Ｒｕｔａｎｅｎ Ｅ、Ｍ、、胎盤タン パク質１２はソマトメジンと結合しかつヒト羊水のソマトメジン結合タンパク質 と同一のＮ末端アミノ酸配列を有する脱落膜タンパク質である（Ｐｌａｃｅｎｔ ａｌ ｐｒｏｔｅｊｎ １２ Ｉｓ ａｄｅｃｉｄｕａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔ ｈａｔ ｂｉｎｄｓ ５ｏＩＩａｔｏｌｌｅｄｉｎ ａｎｄ ｈａｓ ａｎｉｄ ｅｎｔｉｃａｌ Ｎ−ｔｅｒｖｉｎａｌ ａｍＩｎｏ ａｃｉｄ ５ｅｑｕｅｎ ｃｅ ｗｉｔｈｓｏａａｔｏｓｅｄｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆ ｒｏｍ ｈｕｍａｎ ａｍｎｉｏｔｉｃｆｌｕｉｄ）、Ｅｎｄｏｃｒｌｎｏ１ｏ ｇｙ１９ｇ６：１１８：１３７５−１３７８゜１４、 Ｋｏｚａｋ Ｍ、、真核 細胞リポソームによる開始に関するｍＲＮＡ二次構造の影響（Ｉｎｆｌｕｅｎｃ ｅｓ ｏｒｍＲＮＡｓｅｃｏｎｄａｒｙ ５ｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｎ １ｎｌｔ ｌａｔｌｌＯｎ ｂｙ ｅｕｋａｒｙｏｔｌｃｒｉｂｏｓｏｍｅｓ）、、Ｐｒｏ ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ １９ｇ６：８３：２８５０−２８５ ４゜ １５、 Ｍａｎｉａｔｌｓ Ｔ、、Ｆｒ１ｔｓｃｈ Ｅ、Ｐ、、Ｓａｍｂｒｏｏ ｋ Ｊ、、ｅｄ、。5eppala M, Bohn H, Rutanen E, M, placenta tongue Protein 12 binds to somatomedin and is a somatomedin-binding protein in human amniotic fluid. It is a decidual protein that has the same N-terminal amino acid sequence as Placent. al protein 12 Is adecidual protein t hat binds 5oIIatolledin and has anid entical N-tervinal amIno acid 5equen ce with soaatosedin-binding protein f rom human amniotic fluid), Endocrlno1o gy19g6:118:1375-1378゜14, Kozak M,, eukaryotic Influence of mRNA secondary structure on initiation by cellular liposomes (Influenc. es ormRNA secondary 5structure on 1nlt latllOn by eukaryotlcribosomes),, Pro c, Natl, Acad, Sci, USA 19g6:83:2850-285 4゜ 15, Maniatls T, Fr1tsch E, P, Sambroo k J,, ed.
分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｔｏｎｉｎｇ ： ａ １ａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）、Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ１９８２゜ １６、 Ｐｏｖｏａ Ｇ、、Ｅｎｂｅｒｇ Ｇ、、Ｊｏｒｎｖａｌｌ Ｈ，、Ｈ ａｌｌ Ｋ、、中間期ヒト羊水からのソマトメジン結合タンパク質の単離及びキ ャラクタライゼイション＜ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚ ａｔｉｏｎ ｏｒ ａ ｓｏｉａｔｏｓｅｄｌｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅ ｉｎｆｒｏｍ ｓｌｄ−ｔｅｒｍ ｈｕＩＩａｎ ａｍｎｉｏｔｉｅ ｒｌｕｉ ｄ）、ａ、Ｅｕｒ、Ｊ。Molecular cloning: Experimental manual (Molecular atoning: a 1 laboratory manual), Co1d Spring Har bor Laboratory1982゜ 16, Povoa G, Enberg G, Jornvall H, H all K., Isolation and kit of somatomedin-binding protein from interphase human amniotic fluid. Characterization and characteriz ation or a soiatosedln-binding protect infrom sld-term huIIan amniotie rlui d), a, Eur, J.
Ｂｌｏｃｈｅｍ、１９８４：１４４：１９９−２０４゜１７、 Ｐｏｖｏａ Ｇ、、ｌ５ａｋｓｓｏｎ Ｍ、、Ｊｏｒｎｖａｌｌ Ｈ，、Ｈａｌｌ Ｋ、 。Blochem, 1984:144:199-204゜17, Povoa G,,l5aksson M,,Jornvall H,,Hall K, .
ヒトへパトーマ細胞系から単離されたソマトメジン結合タンパク質はヒト羊水か らソマトメジン結合タンパク質と同一である（Ｔｈｅ ｓｏｒＡａｔｏｍｅｄｉ ｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ａｈｕｍａ ｎ ｈｅｐａｔｏｍａ ｃｅｌｌ Ｉｊｎｅ ｌ５Ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｔｏ ｔｈｅ ｈｕｌａｎａｌｎｉｏｔｉｅ ｆｌｕｉｄ ＳＯＩａｔＯＩ ｅｄｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｂｉｏｃｈｅｗ、ＢＩｏｐｈ ｙｓ、Ｒｅｓ、ｃｏｓｎｕｎ、１９８５：１２８：１０７１−１０７８゜ １８、 Ｒｉｎｄｅｒｋｎｅｃｈｔ Ｅ、、ＨｕｌＩｂｅｌ Ｒ，Ｅ、、ヒトイ ンシュリン様成長因子Ｉのアミノ酸配列及びプロインシュリンとのその構造相同 性（Ｔｈｅ ａｌＩｉｎｏ ａｃｉｄ ５ｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｈｕｍａｎＩ ｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ Ｉ ａｎｄ ｉｔｓ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｈｏｍｏｌｏｇｙ ｗｉｔｈ ｐｒｏｌｎｓｕｌｌｎ ）、Ｊ、Ｂｌｏｌ、Ｃｈｅｍ、１９７８ａ：２５３：２７６９−２７７６゜ １９、 Ｒｌｎｄｅｒｋｎｅｃｈｔ Ｅ、、Ｈｕｓｂｅｌ Ｒ，Ｅ、、ヒトイン シュリン様成長因子Ｈの一次構造（Ｐｒｉｍａｒｙ ５ｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｒ ｈｕｍａｎ １ｎｓｕｌｉｎ−１ｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｎ ）、ＰＥＢ５ Ｌｅｔｔ、１９７８ｂ：８９：２８３−２８８゜ ２０、 Ｓａｎｇｅｒ Ｐ、、ＮＩｃｋｌａｎ Ａ、Ｒ，、Ｃｏｕｌｓｏｎ Ｊ 、、鎖終結阻害剤によるＤＮＡ配列決定（ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｗｉ ｔｈ ｃｈａｉｎ−ｔｅ「１ｎａｔｆｎｇ ｆｎｈｌｂｉｔｏｒ）、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ１９７７：７４：５４８３゜ ２１、 Ｓｍ１ｔｈ Ｇ、Ｌ、、ソマトメジンキャリアタンパク質（ＳｏＩＩａ ｔｏｓｅｄｌｎ ｃａｒｒｉｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、Ｍｏ１．（ＪＩｌ、Ｅ ｎｄｏｃｒｉｎａｌ１９８４：３４：８５−８９゜ ２２．５ｏｕｔｈｅｒｎ Ｅ、、ゲル電気泳動で分離されたＤＮＡ断片中におけ る特異的配列の検出（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ’５ｐｅｃｉｒｌｃ ５ｅｑｕ ｅｎｃｅｓ ａＬＯｏｎｇ ＤＮＡ ｒｒａｇｍｅｎｔｓ ５ｅｐａｒａｔｅｃ ｌｂｙ ｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｊｓ）、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｌｏｌ、１ ９７５：９８：５０３゜２３、 Ｙｏｕｎｇ Ｒ，Ａ、、Ｄａｖｉｓ Ｒ，Ｗ、 、抗体プローブを用いることによる遺伝子の効率釣車ｆｌｉｔ（Ｅｆｆｉｃｉｅ ｎｔ １ｓｏｌａｔｉｏｎｏｆ ｇｅｎｅｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ａｎｔｌｂｏ ｄｙ ｐｒｏｂｅｓ）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。Somatomedin-binding protein isolated from human hepatoma cell line is human amniotic fluid The somatomedin-binding protein is identical to the somatomedin binding protein. n-binding proteinisolated from ahuma n hepatoma cell Ijne l5Identical to the hulanalniotie fluid SOIatOI edin-binding protein), Biochew, BIoph ys, Res, cosnun, 1985:128:1071-1078゜ 18, Rinderknecht E, Huilbel R,E, Hitoi Amino acid sequence of insulin-like growth factor I and its structural homology with proinsulin Sex (The alIino acid 5 sequence of humanI nsulin-like growth factor I and its structural homology with ), J. Blol, Chem, 1978a:253:2769-2776° 19, Rlnderknecht E, Husbel R,E, Human In Primary structure of shrin-like growth factor H (Primary 5structure or human 1nsulin-1ike growth factorn ), PEB5 Lett, 1978b:89:283-288° 20, Sanger P, Nicklan A, R, Coulson J , DNA sequencing using chain termination inhibitors th chain-te "1 natfng fnhlbitor), Proc, Natl, Acad, Sci, USA1977:74:5483゜ 21, Sm1th G, L, somatomedin carrier protein (SoIIa tosedln carrier proteins), Mo1. (JIl,E ndocrinal1984:34:85-89゜ 22.5outhern E, in DNA fragments separated by gel electrophoresis Detection of specific sequences ences aLOong DNA rragments 5eparatec lby gelelectrophoresjs), J, Mo1. Blol, 1 975:98:503゜23, Young R, A,, Davis R, W, , Genetic Efficiency Flit (Efficie) by Using Antibody Probes nt 1solation of genes by using antlbo dy probes), Proc, Natl, Acad.
Ｓｃ１．ＵＳ＾１９８３：８０：１１９４−１１９１＋。Sc1. US^1983:80:1194-1191+.
２４、 Ｇｌｕｚｍａｎ Ｙ、、 Ｓ Ｖ４０形質転換サル細胞は初期５Ｖ４Ｑ 変異株の複製を支える（ＳＶ４０−ｔｒａｎｓｆｏｒｉｅｄｓｌｌｌｉａｎ ｃ ｅｌｌｓ ５ｕｐｐｏｒｔ ｔｈｅ ｒｅｐＨｃａｔｌｏｎ ｏｒ ｅａｒｌｙ ５Ｖ４０ｉｕｔａｎｔｓ）、Ｃａ１１．．２３（１）１７５−８２，１９Ｈ， ノａｎ／ＩＭＤ−８１０Ｒ，。24, Gluzman Y, S V40 transformed monkey cells are early 5V4Q Supports the replication of mutant strains (SV40-transformedsllian c ells 5upport the repHcatlon or early 5V40iutants), Ca11. ．． 23(1) 175-82, 19H, Noan/IMD-810R,.
２５、 ＭｃＣｕｔｃｈａｎ Ｊ、Ｈ，、Ｐａｇａｎｏ Ｊ、Ｓ、、ジエチルア ミノエチル−デキストランによるサルウィルス４ｏデオキシリボ核酸の感染力の 増強（Ｅｎｃｈａｎｃｅｉｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅＩｎｆｅｃｔｉｖｌｔｙ ｏｆ ｓｌｍｊａｎ ｖｉｒｕｓ ４０ ｄｅｏｘｙｒｊｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ ｖＨｈ ｄｌｅｔｌ’＋ｙｌａｆｆｊｎｏｅｉｈｙ１−ｄｅＸｔｒａｎ）、Ｊ 、Ｎａｔｌ、ＣａｎＣｅｒｌｎｓｔ、＋ ４］（２）３５１−７．Ａｕｇ、６ｇ ／ＩＭＤ−６８１０゜２６、 Ｖａｎ １ｌｅｕｖｅｌ Ｍ、、Ｂｏｓｖｅｌｄ １．Ｊ、、Ｍｏｏｒｅｎ Ａ、Ａ、。25, McCutchan J, H, Pagano J, S, diethyla Infectivity of simian virus 4o-deoxyribonucleic acid by minoethyl-dextran Enhancement of the Infectivity of slmjan virus 40 deoxyrjbonucleicacid vHh dletl'+ylaffjnoeihy1-deXtran), J , Natl, CanCerlnst, +4] (2) 351-7. Aug, 6g /IMD-6810゜26, Van 1leuvel M,, Bosveld 1. J., Mooren A.A.
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