JPH03503360A - ribosome binding site - Google Patents
ribosome binding siteInfo
- Publication number
- JPH03503360A JPH03503360A JP50365989A JP50365989A JPH03503360A JP H03503360 A JPH03503360 A JP H03503360A JP 50365989 A JP50365989 A JP 50365989A JP 50365989 A JP50365989 A JP 50365989A JP H03503360 A JPH03503360 A JP H03503360A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- binding site
- sequence
- expression
- ribosome binding
- ptrp
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 claims description 28
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 12
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 12
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 11
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 7
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 claims description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 7
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 5
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 claims description 5
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 claims description 4
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 claims description 4
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 claims description 3
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 claims 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 53
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 41
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 35
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 25
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 description 14
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 14
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 12
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 11
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 11
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 9
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 8
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 8
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 108700012920 TNF Proteins 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 5
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 101150108727 trpl gene Proteins 0.000 description 5
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 4
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 4
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 3
- -1 casein amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000004936 Bromus mango Nutrition 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 2
- 240000007228 Mangifera indica Species 0.000 description 2
- 235000014826 Mangifera indica Nutrition 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 2
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 2
- 235000009184 Spondias indica Nutrition 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- PLVPPLCLBIEYEA-WAYWQWQTSA-N (z)-3-(1h-indol-3-yl)prop-2-enoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(\C=C/C(=O)O)=CNC2=C1 PLVPPLCLBIEYEA-WAYWQWQTSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 241000726103 Atta Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- OOFLZRMKTMLSMH-UHFFFAOYSA-N H4atta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CC1=CC=CC(C=2N=C(C=C(C=2)C=2C3=CC=CC=C3C=C3C=CC=CC3=2)C=2N=C(CN(CC(O)=O)CC(O)=O)C=CC=2)=N1 OOFLZRMKTMLSMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 1
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102100026933 Myelin-associated neurite-outgrowth inhibitor Human genes 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 101100492653 Oryza sativa subsp. japonica AT15 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000364057 Peoria Species 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 240000004922 Vigna radiata Species 0.000 description 1
- 235000010721 Vigna radiata var radiata Nutrition 0.000 description 1
- 235000011469 Vigna radiata var sublobata Nutrition 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 235000021438 curry Nutrition 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 229940023064 escherichia coli Drugs 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 102000057041 human TNF Human genes 0.000 description 1
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- PLVPPLCLBIEYEA-UHFFFAOYSA-N indoleacrylic acid Natural products C1=CC=C2C(C=CC(=O)O)=CNC2=C1 PLVPPLCLBIEYEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 1
- 238000013493 large scale plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008176 mammary development Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 101150002764 purA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.
Description
【発明の詳細な説明】 リポソーム結合部位 発明の技術分野 本発明は、異種ポリペプチドの発現を増強する方法に関する。さらに詳細には、 本発明は、そこに有効に結合したリポソーム結合部位を変えることによる異種ポ リペプチドの発現の増強に関する。[Detailed description of the invention] liposome binding site Technical field of invention The present invention relates to methods of enhancing expression of heterologous polypeptides. In more detail, The present invention is directed to the production of heterologous molecules by changing the binding site of liposomes that are effectively bound to the liposomes. Concerning enhancement of expression of lipeptides.
発明の背景 ウシソマトトロピン(BSt)を含むある種の異種ポリペプチドは、はとんどの イー・コリ(E、coli)発現系中で発現するのが困難である。BSt構造遺 伝子をコードしているcDNAの最初の4つのコドン内での修飾によって、これ らの修飾されたcDNAをpBR322−関連ベクター中で発現すると、BSL 発現のレベルが増大する。Background of the invention Certain heterologous polypeptides, including bovine somatotropin (BSt), It is difficult to express in the E. coli expression system. BSt structural remains This is achieved by modification within the first four codons of the cDNA encoding the gene. When expressing their modified cDNA in a pBR322-related vector, BSL The level of expression increases.
これらの修飾されたcDNAは、ランナウェイ発現ベクター中におかれる場合に はさらに高いレベルで発現される(米国特許出願S、N。These modified cDNAs, when placed in a runaway expression vector, is expressed at even higher levels (US Patent Application S,N.
016.294.1987年2月19日出願一本明細書に資料として引用する) 。016.294. Filed on February 19, 1987 (cited herein as a document) .
本発明の修飾されたリポソーム結合部位は、ランチウェイ・ベクターによって達 成されるものに相当する、非ランナウェイ・ベクター、例えば、pBR322の 誘導体による異種ポリペプチドの発現を生じる。The modified liposome binding sites of the invention can be achieved by launchway vectors. A non-runaway vector, such as pBR322, corresponding to that produced by resulting in the expression of a heterologous polypeptide by the derivative.
一般的に、形質転換された宿主において異種ポリペプチドをクローニングおよび 発現する方法は、当業者には周知である。このような異種ポリペプチドとしては 、例えば、ヒトインシュリン、成長ホルモン、インターフェロンおよび因子■、 ウィルス抗体、および他の動物ホルモンが挙げられる。Typically, a heterologous polypeptide is cloned and transformed in a transformed host. Methods of expression are well known to those skilled in the art. As such a heterologous polypeptide , such as human insulin, growth hormone, interferon and factors ■, These include viral antibodies, and other animal hormones.
リポソーム結合部位は、このような発現において含まれる素子の1つである。こ れは、開始コドンの両側に領域約20ずつのヌクレオチドを包含し、開始コドン から上流にシャインーダルガーノ配列(Shine−Dalgarno 5eq uence)通常6−1’ Oのヌクレオチドを含む。A liposome binding site is one of the elements involved in such expression. child It includes a region of approximately 20 nucleotides on each side of the start codon, Shine-Dalgarno sequence (Shine-Dalgarno 5eq) upstream from nucleotide) usually contains 6-1'O nucleotides.
開始コドンの後方の20ヌクレオチドは、発現用の挿入された遺伝子配列の始め の部分を含んでおり、該遺伝子のアミノ酸配列を変えずに修飾させることができ ない。したがって、実質的な意味において、リポソーム結合部位の操作は、開始 コドンから上流の領域のみで行うことができる。リポソーム結合部位は、ある塩 基を含有する場合に最も良く機能することが知られているが、シャインーダルガ ーノ配列が一般的にプリンリッチであること以外は、特定の部位における特定の 塩基に関して公知の条件はない。種々の公知のリポソーム結合部位配列の間の微 妙な差は、それが関連する場合に遺伝子が非常に発現するかあまり発現しないか を予想するための明確な比較を与えない。本発明の好ましい態様は、AおよびT ヌクレオチドが豊富である配列を用いて、シャインーダルガーノ配列を7ランク し、これによって、天然のリポソーム結合部位と比較して増加したアデニンおよ びチミジン残基を有する該天然リポソーム部位から誘導されるリポソーム結合部 位を作製することである。The 20 nucleotides after the start codon mark the beginning of the inserted gene sequence for expression. It contains a portion of the gene that can be modified without changing the amino acid sequence of the gene. do not have. Therefore, in a practical sense, manipulation of the liposome binding site This can be done only in the region upstream from the codon. The liposome binding site is a salt It is known that Shine-Dalga functions best when containing groups. Except that the sequence is generally purine-rich, specific There are no known conditions regarding the base. The differences between the various known liposome binding site sequences The strange difference is whether a gene is highly or poorly expressed when it is related. does not give a clear comparison to predict. A preferred embodiment of the present invention is that A and T Shine-Dalgarno sequence ranked 7 using nucleotide-rich sequences This results in increased adenine and Liposome binding site derived from the natural liposome site having a thymidine residue It is to create a position.
天然のBStは、異種タンパクの混合物であり、そのアミノ酸配列は公知である [バラディニ(Paladini、A、C,)ら、モレキュラー・バイオロジイ ・オブ・グロウス・ホルモン(Molecular Biology ofGr owth Hormone)、シーアールシー・リビューズ・イン・バイオケミ ストリ4 (CRCReviews in Biochem、)、15(1): 25−56 (1983)]。天然の混合物は、ウシの下垂体から精製されてい る。成長および乳汁分泌を促進するためにBStを用いることについての商業的 な可能性は、よく認識されており、乳牛および肉牛の両方の生物学的研究によっ て立証されている[エラバード(Eppard、P、J)およびバウマン(Ba uman、D、E、)、ジ・エフェクト・オン・ロングーターム・アトミニスト レージ1ン・オン・グロウス・ホルモン・オン・パフォーマンス、オン・ラフチ ーティング・デアリー・カウズ(The Effect ofLong−Ter m Administration of Growth Hormone o n Psrformancs ofLacLating Dairy Cows ) ;およびノ3ウマン(Bauman、D、E、)、エフェクト・オン・グロ ウス・ホルモン・オン・グロウス・レイン・アンド・マンマリイ・ディベロープ メント・オン・ルミナンツ(Effectof Growth Hormone on Growth Rates and IJammary Develo pment ofRuminants)、 Proc、 1984コーネル・ニ ュートリジョン・フン7アレンス・フォー・フィード・マニュファクチャラース (CornellNutrition Conference for Fee d Manufacturers)+ pp、 5−17. = ニーヨーク、 イタ力のコー不ル・ユニバーシティ(Cornell University) によって発行]。Natural BSt is a mixture of heterologous proteins, and its amino acid sequence is known. [Paladini, A, C, et al., Molecular Biology ・Molecular Biology of Growth Hormone owth Hormone), CRC Reviews in Biochemistry Story 4 (CRCReviews in Biochem,), 15(1): 25-56 (1983)]. The natural mixture is purified from the bovine pituitary gland. Ru. Commercial studies on using BSt to promote growth and lactation The potential for [Eppard, P. J. and Ba. uman, D, E,), The Effect on Long-Term Atomist Rage 1 on Growth Hormone on Performance, On Roughness The Effect of Long-Ter m Administration of Growth Hormone o n Psrformans ofLacLating Dairy Cows ); and Bauman, D.E., Effect on Gro. Us Hormones on Growth Rain and Mammary Development Effect of Growth Hormone on Growth Rates and I Jammary Develo pment of Ruminants), Proc, 1984 Cornell Ni. 7 Allens for Feed Manufacturers (CornellNutrition Conference for Fee d Manufacturers) + pp, 5-17. = Knee York, Ita Power's Cornell University Published by ].
組換えウシソマトトロピン(rBst)は、種々の組換え遺伝的プラスミドを用 いて、形質転換された微生物中で産生ずることができる[シーバーブ(Seeb urg、P、H,)ら、“エフィシャント・バクチリアル・イクスプレッション ・オン・ボビン・アンド・ボーシン・グロウス・ホルモンズ(Efficien t Bacierial Expression of Bovine and ForcineGrowth Hormones)”、 DNA、 2:37− 45 (1983) ;欧州特許出顯第47600号;英国特許出願CB 20 7324SA号;ショナー(Schoner、B、E、)ら、ロール・オン・m RNA・トランスレージ貯ナル・エフィシャンシー・イン・ボビン・グロウス拳 ホルモン・イクスプレッシ璽ン愉イン・エシェリキア・コリ(Role of mRNA Translational Efficiencyin Bovi ne Growth Hormone Expression in Esch erichia coli)。Recombinant bovine somatotropin (rBst) is produced using various recombinant genetic plasmids. and can be produced in transformed microorganisms [Seeb urg, P. H.) et al., “Efficient Bacterial Expression. ・On Bobbin and Boshin Growth Hormones (Efficien) t Bacierial Expression of Bovine and Forcine Growth Hormones)”, DNA, 2:37- 45 (1983); European Patent Publication No. 47600; British Patent Application CB 20 No. 7324SA; Schoner, B.E., et al., Roll on m. RNA Transrage Efficiency in Bobbin Growth Fist Hormone Expression in Escherichia Cori (Role of mRNA Translational Efficiency Bovi ne Growth Hormone Expression in Esch erichia coli).
PNAS US^、 81:5403−5407 (1984) ;欧州特許出 順算103395号;および欧州特許出順算111,814号参照]、これらの 文献は、天然のポリペプチドとは異なるタンパクを産生ずるBSL遺伝子の5″ 末端の塩基の挿入もしくは欠失、または好ましいコドンを最大にしかつmRNA において第2構築を減少するためのBStcDNAにおける変化、あるいは発現 を増強するためのランナウェイ・プラスミドの使用に関するものである。他方、 本発明は、異種ポリペプチド、特に高いレベルのBStを産生ずるためのAT− リッチリポソーム結合部位の使用を教示するものである。PNAS US^, 81:5403-5407 (1984); European patent application Junsan No. 103395; and European Patent No. 111,814], these The literature suggests that the 5″ of the BSL gene produces a protein different from the natural polypeptide. Insertions or deletions of terminal bases, or maximizing preferred codons and mRNA Changes in or expression of BSt cDNA to reduce the second construct in Concerning the use of runaway plasmids to enhance On the other hand, The present invention provides heterologous polypeptides, particularly AT- It teaches the use of rich liposome binding sites.
BStを発現する形質転換された微生物を培養および発酵する方法は、前記文献 にも引用されている。Methods for culturing and fermenting transformed microorganisms expressing BSt are described in the aforementioned document. It is also quoted in
形質転換された細胞から生物学的に活性なrBstの精製も、既に開示されてい る[米国特許第4,511.502号、第4,511.503号、第4,512 ゜922号および第4.518.526号;欧州特許出順算131843号;な らびにンヨナー(Schoner、R,G、)ら、′アイソレーション・アンド ・ピューリフィケーシコン・オン・プロティン・グラニュールス・70ム・イー ・コリ・セルズ・オーバープロデューシング・B S t(Isolation and Purification of Protein Granules from E、coli CellsOverproducing BSt) ”、バイオ−テクノロジー(Bio−Tech、)、 3:151−154 ( 1985)参照]。Purification of biologically active rBst from transformed cells has also been previously disclosed. [U.S. Pat. Nos. 4,511.502, 4,511.503, 4,512] No. 922 and No. 4.518.526; European Patent No. 131843; Schoner, R.G., et al., 'Isolation and ・Purificecon on Protein Granules 70ml ・Cori Sells Overproducing ・BST (Isolation) and Purification of Protein Granules from E, coli Cells Overproducing BSt) ”, Bio-Tech, 3:151-154 ( 1985)].
発明の概要 本発明は、アデニンおよびチミジンが豊富なリポソーム結合部位に関する。Summary of the invention The present invention relates to liposome binding sites rich in adenine and thymidine.
さらに詳細には、本発明は、異種ポリペプチドをコードしているデオキシリボヌ クレオチドの配列およびそれに有効に結合したリポソーム結合部位からなる組換 えDNA分子であって、該リポソーム結合部位が、これを誘導するかまt;はこ れが関係している天然のリポソーム結合部位と比較して増加したアデニン(A) およびチミジン(T)残基を有することを特徴とする組換えDNA分子を提供す るものである。More particularly, the present invention provides deoxyribonucleans encoding heterologous polypeptides. A recombinant consisting of a cleotide sequence and a liposome binding site operatively linked to it. a DNA molecule, in which the liposome binding site is a molecule that induces the liposome binding site; increased adenine (A) compared to the natural liposome binding site in which it is associated. and a thymidine (T) residue. It is something that
さらに詳細には、異種ポリペプチドは、好ましくはブタ、ヒツジさらに詳細には 、該組換えDNA分子リポソーム結合部位デオキシリボヌクレオチド配列は、A AGTTCACGTTATTAA AA ATTA A AGAGGTA T ATATTAATGまたはAAGTTCACGTTATTAAAAATTAAG GAGGTATATCGATAATGであり、好ましくはウシソマトト口ピンに 関するAAGTTCACGTTATTAAAAATTAAAGAGGTATAT ATTAATGGCCTTCCCACCTまプこはAAGTTCACGTTAT TAAAAATTAAGGAGGTATATCGATAATGGCCTTCCC AGCTである。More particularly, the heterologous polypeptide is preferably porcine, ovine and more particularly , the recombinant DNA molecule liposome binding site deoxyribonucleotide sequence is A AGTTCACGTTATTAA AA ATTA A AGAGGTA T ATATTAATG or AAGTTCACGTTATTAAAATTAAG GAGGTATATCGATAATG, preferably bovine somatotopin AAGTTCACGTTATTAAAAAAATTAAAGAGGTATAT ATTAATGGCCTTCCCACCT MapukohaAAGTTCACGTTAT TAAAAATTAAGGAGGTATATCGATAATGGCCCTTCCC It is AGCT.
まt;、本発明は、AAGTTCACGTTATTAAAAATTAAAGAG GTATATATTAATGGCCTTCCCAGCT%AAGTTCACGT TATTAAAAA TTA AGGAGGTATATCGATAATGGCC TTCCCAGCT1AAGTTCACGTTATTAAAAATTAAAGA GGTATATATTAATGおよびAAGTTCACGTTATTAAAAA TTAAGGAGGTATATCGATAATGから選択されるデオキシリポヌ クレオチドの配列からなるDNA分子を提供するものである。The present invention is directed to AAGTTCACGTTATTAAAAAAATTAAAGAG GTATATATTAATGGCCTTCCCAGCT%AAGTTCACGT TATTAAAAAA TTA AGGAGGTATATCGATAATGGCC TTCCCAGCT1AAGTTCACGTTATTAAAATTAAAGA GGTATATATTAATG and AAGTTCACGTTATTAAAAAA Deoxyliponu selected from TTAAGGAGGTATATCGATAATG It provides a DNA molecule consisting of a nucleotide sequence.
また、本発明は、天然のリポソーム結合部位と比較して増加したAおよびT残基 を有しかつ該天然のリポソーム結合部位から誘導されるかまたはこれと関係して いるリポソーム結合部位を提供するものでもある。The present invention also provides increased A and T residues compared to natural liposome binding sites. and derived from or associated with the natural liposome binding site. It also provides a liposome binding site.
発明の詳細な記載 一般に、本発明において用いられる一般的な研究室方法の学術用語および説明の 定義は、マニアナイス(Maniatis,T)らのモレキュラー・クローニン グ,ア・ラボラトリー・マニュアル(MolecularCloning, A Laboratory Manual)[コールド・スプリング+/一一バー ・ラボラトリー(Cold Spring l{arbor Laborato ry).コールド・スプリング・ハーバー,ニューヨーク. 1982]におい て見られるものである。該マニュアルを本明細書では“マニアテイス(Mani atis)”と記し、本明細書中に資料として引用する。Detailed description of the invention Generally, the terminology and descriptions of common laboratory methods used in the present invention are The definition is Molecular Cronin by Maniatis, T. Molecular Cloning, A Laboratory Manual Laboratory Manual) [Cold Spring +/11 Bar ・Laboratory (Cold Spring l{arbor Laboratory) ry). Cold Spring Harbor, New York. 1982] Smell This is something that can be seen. The manual is herein referred to as “Mani atis)" and is cited herein as a document.
全てのイー・コリ(E.col i)菌株を、ルリア(Luria)ブロス(L B)、0.2%グルコースを含有するLB,ディフコ抗生物質培地(Dirco ’s Antibiotic Mediu+n) # 2、または0.2%グル コースおよび0.05〜0.1%酸一加水分解カゼインアミノ酸を補足したM9 培地上で増殖する。抗生物質に対して耐性の菌株を、マニアティスニ記載の薬物 濃度に維持する。モリソン(Morrison,D.A.)[(1977),ジ ャーナル・オプ・バクテリオロジ−(J. of Bact.). 132:3 49−3511によって開示された方法に従って、形質転換を行った。All E. coli strains were grown in Luria broth (L B), LB containing 0.2% glucose, Dirco antibiotic medium (Dirco 's Antibiotic Mediu+n) #2 or 0.2% Glue M9 supplemented with course and 0.05-0.1% acid monohydrolyzed casein amino acids Grow on medium. Maniatis, a drug that treats strains resistant to antibiotics. maintain concentration. Morrison, D.A. [(1977), Journal of Bact. 132:3 Transformation was performed according to the method disclosed by No. 49-3511.
全ての制限エンドヌクレアーゼおよび他のDNA修飾酵素は、市販品として入手 可能であり、製造者の指示に従って使用する。All restriction endonucleases and other DNA modifying enzymes are commercially available. available and used according to the manufacturer's instructions.
制@7ラグメントは、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動によっ て分離され、電気溶離(electroelution)によって単離される( マニアティス)。Control@7 fragments were determined by agarose or polyacrylamide gel electrophoresis. separated by electroelution and isolated by electroelution ( Maniatis).
大規模で迅速なプラスミド単離は、マニアティスの記載に従って行われる。Large scale rapid plasmid isolation is performed as described by Maniatis.
タンパク濃度は、クマシーブルー染色(Coomassie Blue sta ining)に基づいて、バイオランド(BioRad)タンパク検査キットを 用いて測定する。Protein concentration was determined by Coomassie Blue staining (Coomassie Blue staining). BioRad protein test kit based on Measure using
タンパク分析に関するSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動は、モース(Mo rse,L.)らの1978.ジャーナル・オブ・パイ口ロジー(J.Viro l.). 26:389−410の記載に従って行う。SDS polyacrylamide gel electrophoresis for protein analysis was performed using Mohs rse, L. ) et al. 1978. Journal of Pyostology (J.Viro) l. ). 26:389-410.
ウエスタン・イムノブロツティング分析は、トウビン(Towbin.H.)ら の1979,プロシーデインダス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ エンス(Proc.Natl.Acad.Sci.). USA, 76:43 50−4354の記載に従って行う。Western immunoblotting analysis was performed by Towbin.H. et al. 1979, Proceedings of the National Academy of Sci. (Proc. Natl. Acad. Sci.). USA, 76:43 50-4354.
コロニーハイブリッド法は、グルンスタイン(Grunstein,M)らのプ ロシーデインダス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Pro c.Natl Acad.Sci.), 72:3961−5(1975)の一 般的な記載に従って行う。The colony hybrid method was developed by Grunstein, M. et al. Rossi Deindus of National Academy of Sciences (Pro c. Natl Acad. Sci. ), 72:3961-5 (1975) Follow the general instructions.
オリゴヌクレオチドブローブに関するハイブリダイゼーション条件は、ゲデル( Goeddel ,D.V.)らのネイチャ−(Nature). 290=2 0−26(1981)によって先に開示されたものである。Hybridization conditions for oligonucleotide probes were described by Guedel ( Goeddel, D. V. ) et al.'s Nature. 290=2 0-26 (1981).
形質転換株を分析するための制限エンドヌクレアーゼ消化に関して、プラスミド DNAのミニリゼイトは、ホームズ(Holmes,D.S.)ら[アナリティ カルーバイオケミストリー(Analyt.Biochem−), 114:1 93 (1981)]の方法またはマニアティスに記載のアルカリ細胞溶解法に 従って調製される。大規模なプラスミド調製は、マニアティスに記載の方法に従 って、CsCQ沈降法によって行う。Plasmids for restriction endonuclease digestion to analyze transformed strains. DNA mini-lysate was developed by Holmes, D.S. et al. Karoo Biochemistry (Analyt.Biochem-), 114:1 93 (1981)] or the alkaline cell lysis method described in Maniatis. thus prepared. Large-scale plasmid preparation follows the method described by Maniatis. This is carried out by the CsCQ precipitation method.
プラスミド配列決定は、ワレイス(Wallace,R.B.)ら[ジーン(G ene). 16:21−26 (1981)]のジデオキシ鎖成長停止及応法 、またはマキサム(Maxam,A.M.)およびギルパート(Gilbert ,W.)[メソッズ・イン・エンザイモロジ−(Methods in Enz ymology). 65:499−560(1980)]の化学分解法に従っ て行う。Plasmid sequencing was performed by Wallace, R.B. et al. ene). 16:21-26 (1981)] dideoxy chain growth termination and adaptation method. , or Maxam, A.M. and Gilbert ,W. ) [Methods in Enzymology ymology). 65:499-560 (1980)] according to the chemical decomposition method. I will do it.
オリゴヌクレオチドは、ニーダム−ファンデフアンター(Needham−Va nDevanter、D、R,)らのヌクレイツク・アシッズ・リサーチ(Nu cleicAcids Res、)、 12:6159−6168 (1984 )に記載の自動合成器を用いて、同相ホスホルアミダイトトリエステル法[ビュ ーケージ(Beaucage、S。Oligonucleotides were obtained from Needham-Van de Juanter. Nuclear Acids Research (NuDevanter, D.R.) et al. cleic Acids Res, ), 12:6159-6168 (1984 ), the in-phase phosphoramidite triester method [view -Beaucage, S.
L、)およびカルーザーズ(Caruthers、M、H,)、テトラヘドロン ・レターズ(Tetrahedron Letts、)、 22(20):18 59−1862 (1981)]に従って、化学的に合成する。オリゴヌクレオ チドは、7M尿素を含有する12〜20%ポリアクリルアミドを用いて、調製用 ゲル電気泳動によって精製される。37″で0.54M酢酸アンモニウム中、ゲ ル薄片をインキュベートすることによって、該ゲルから適当なバンドを溶離する 。ウォーターズ(Waters) 5ep−Pak C18カラム上でオリゴヌ クレオチドを吸収し、アセトニトリル:HzO(40:60V:V)で溶離する ことによって、該塩を除去する。L, ) and Caruthers, M, H, Tetrahedron ・Letts (Tetrahedron Letts,), 22(20):18 59-1862 (1981)]. oligonucleo Tido was prepared using 12-20% polyacrylamide containing 7M urea. Purified by gel electrophoresis. 37" in 0.54 M ammonium acetate. Elute the appropriate bands from the gel by incubating the gel slices. . Oligonucleate on a Waters 5ep-Pak C18 column Absorb cleotide and elute with acetonitrile:HzO (40:60V:V) The salt is removed by this.
原核生物系における所望のクローン遺伝子の高レベルの発現に関して、最小限度 の、mRNA転写を方向付けるための強いプロモーター、翻訳開始に関するリポ ソーム結合部位、および全てが所望の遺伝子と有効に結合する転写終了暗号(総 体的に、「発現調節配列」)を含む発現ベクターを構築することが必須である。For high level expression of desired cloned genes in prokaryotic systems, minimal , a strong promoter to direct mRNA transcription, and a liposome for translation initiation. some binding sites, and a transcription termination code (total Specifically, it is essential to construct an expression vector containing an "expression control sequence".
「有効に結合する」という用語は、所望の生成物をコードしている遺伝子の前に 適当な出発シグナルを有していること、ならびに発現調節配列の調節下での挿入 された遺伝子の発現および遺伝子によってコードされた所望の生成物の合成を可 能にするt;めに正しい読取り枠を維持することを含んでいる。大量の遺伝子生 成物の堆積が細胞増殖を抑制し、しばしば細胞死を引き起こすので、生成物の合 成を方向付けるために選択されたプロモーターを、プロモーターが導入される前 に、細胞増殖が高濃度に達し得る方法で調節するべきである。このために適切な 調節領域の例は、イー・コリ(E、col t) トリプトファン生合成経路の プロモーターおよびオペレーター領域Qrpプロモーター)ならびにファージラ ムダの左手プロモーター(PL)である。trpプロモーターは、トリプトファ ンの存在下で抑制され、トリプトファン飢餓(starvation)または誘 発物買インドールアクリル酸の添加によって誘発され得る[ヤノフスキー(Ya nofsky、C,)ら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジ−(J、Bact eriol、)、 158:1018−1024 (1984)]。プロモータ ーP、は、リプレッサーclによって調節される。el遺伝子、例えば、c18 57における温度感受性突然変異について、Ptは、38℃以上の温度で誘発さ れ得る[)\−スコヴイ・ノツ(Herskowitz、 I)およびハーゲン ()lagan、D、)、 1980. Ann、Rev、C+enet、+ 14:399−445]。The term "effectively binds" refers to Having appropriate starting signals and insertion under the control of expression control sequences. allows expression of the encoded gene and synthesis of the desired product encoded by the gene. This includes maintaining the correct reading frame for the purpose of making the readings possible. large amount of genetic material Product synthesis inhibits cell proliferation and often causes cell death. Before the promoter is introduced, the selected promoter is In addition, cell proliferation should be regulated in such a way that high concentrations can be reached. suitable for this An example of a regulatory region is the E. coli (E, col) tryptophan biosynthetic pathway. Promoter and operator region Qrp promoter) and Phagela It is a wasteful left hand promoter (PL). The trp promoter is tryptopha tryptophan starvation or induction. It can be induced by the addition of indole acrylic acid [Yanofsky (Ya. nofsky, C.) et al., Journal of Bacteriology (J. Bact. Eriol, ), 158:1018-1024 (1984)]. promoter -P, is regulated by the repressor cl. el gene, e.g. c18 For temperature-sensitive mutations in 57, Pt was induced at temperatures above 38°C. [)\-Skovjnots (Herskowitz, I) and Hagen ()lagan, D.), 1980. Ann, Rev, C+enet, + 14:399-445].
最も好ましくは、遺伝子の挿入のための制限酵素部位を有する発現ベクターがシ ャインーダルガーノ配列から適当な距離で発現されることである。Most preferably, the expression vector has restriction enzyme sites for insertion of the gene. It is expressed at an appropriate distance from the Yine-Dalgarno sequence.
゛ イー・コリ(E、coli)において、開始コドン、通常ATGは、遺伝子 の効果的な発現のために適当なリポソーム結合部位配列と結合し1て配置される べきである[ゴールド(Gold、L、)ら、 1981. Ann、Rev。゛ In E. coli, the start codon, usually ATG, is the gene is placed in conjunction with an appropriate liposome binding site sequence for effective expression of [Gold, L. et al., 1981. Ann, Rev.
Microbiol、、 35:365−403 ;シャーシ−(Schere r、’G、F、E、)ら、 1980゜ヌクレイツク・アシツズ・リサーチ(N ucleic Ac1ds Res、)、 17:3895−39061゜ イー・コリ(E、coli)および他の原核生物においてcDNA配列由米の原 核生物遺伝子によってコードされたタンパクを細胞内で合成するために、5′未 翻訳領域およびシグナルペプチドをコードしている配列を除去し、成熟タンパク をコードしている配列の翻訳開始のt;めに開始コドンを供給するのが好都合で ある。成熟タンパクに関する暗号配列のいくつかを化学的に合成されたオリゴヌ クレオチドと交換して、翻訳効力を最大にすることも必要である。本発明の好ま しいDNA暗号配列は、GCCをGCTに変えることによって4番目のコドンで 修飾されたBStcDNA配列である。本発明の好ましいベクターは、非常に高 レベルの修飾されたウシソマトトロピンを発現するpBR32’2 レプリコ ンからなる。pBR322誘導されたプラスミド以外のベクターを用いることも できる。pBR322は、Co1El レプリコンを有する。Co1El レプリコンを含有する他の有用なプラスミドとしては、pKC71,)AT15 3およびpBR325が挙げられる。これらは、その薬物耐性メーカーpACY C184(pl 5A レプリコン)、pNo 1523(pMB 1レプリコ ン)、I)LG338(+)SCIOI L、プリコン)、オヨヒpBEU5 0(R1レプリコン)が挙げられる[マニアティス;ボウベルズ(Pouvel s、P、H,)ら、クローニング・ベクターズ(CloningVectors )、エルスバイヤー、ニューヨーク1985コ。また、pURA(R1およびC oIEl レプリコン;米国特許出1i1S、N、016.294号)、pUc 19[ヤニシューバーロン(Yanisch−Perron、C,)ら、ジーン (Gene)、 33:103−11919851およびpHc314[ポロズ (Boros 、 I 、 )ら。Microbiol, 35:365-403; Chassis (Schere r, 'G, F, E,) et al., 1980 ucleic Ac1ds Res, ), 17:3895-39061゜ The origin of cDNA sequences in E. coli and other prokaryotes. In order to synthesize proteins encoded by karyotic genes within cells, the 5' The translated region and the signal peptide-encoding sequence are removed to produce the mature protein. It is convenient to provide an initiation codon for the initiation of translation of a sequence encoding be. A chemically synthesized oligonucleotide containing some of the coding sequences for the mature protein. It is also necessary to exchange cleotides to maximize translation efficacy. Preferences of the present invention A new DNA coding sequence can be created at the fourth codon by changing GCC to GCT. Modified BSt cDNA sequence. Preferred vectors of the invention have very high pBR32'2 replica expressing modified levels of bovine somatotropin Consists of Vectors other than pBR322-derived plasmids may also be used. can. pBR322 has the Co1El replicon. Co1El Other useful plasmids containing replicons include pKC71,) AT15 3 and pBR325. These are the drug resistance manufacturers pACY C184 (pl 5A replicon), pNo. 1523 (pMB 1 replicon) I) LG338 (+) SCIOI L, precon), Oyohi pBEU5 0 (R1 replicon) [Maniatis; Pouvel Cloning Vectors ), Elsbayer, New York 1985. In addition, pURA (R1 and C oIEl replicon; U.S. Patent No. 1i1S,N, 016.294), pUc 19 [Yanisch-Perron, C. et al., Gene (Gene), 33:103-11919851 and pHc314 [Poros (Boros, I,) et al.
ジーン(Gene) 30:257−2601984コも有用である。Gene 30:257-2601984 is also useful.
前記のとおり、組換え微生物から哺乳動物のソマトトロピンの単離および精製は 、公知である[例えば、米国特許第4,511.502号、第4.512.92 2号および第4.518.526号:欧州特許出願第131.843号;ならび にショナー(Schoner、R,G、)ら、アイソレーション・アンド・ピュ ーリフィヶーション・オプ・プロティン・グラニュールズ・70ム・イー・フリ ・セルズ・オーバープロデューシング・B G H(Isolationand purification of protein granules fr om E、coli cellsoverproducing BGFI)、バ イオ−テクノロジー(Bio−Technology)、 3:151−154 参照]。概して、該方法は、組換え微生物を溶解すること、選択的な遠心分離、 非天然ジスルフィド結合から天然構造への転換(reshuffling)およ びカラムクロマトグラフィーを含む。As mentioned above, isolation and purification of mammalian somatotropin from recombinant microorganisms , are known [e.g., U.S. Pat. No. 4,511.502; 2 and 4.518.526: European Patent Application No. 131.843; and Schoner, R.G., et al., Isolation and Pure -Refinement of Protein Granules 70ml ・Cells Over Producing ・BGH (Isolation and Purification of protein granules fr om E, coli cellsover producing BGFI), Bio-Technology, 3:151-154 reference]. Generally, the method involves lysing the recombinant microorganism, selective centrifugation, Reshuffling and reshuffling of non-natural disulfide bonds to natural structures and column chromatography.
チャート1〜4においてプラスミドおよび7ラグメントを表すのに用いられる慣 例は以下のとおりである。単一線は、円形および線形の二重鎖DNAを表し、翻 訳開始または転写は、プロモーターまたは構造遺伝子の下に示された矢印の方向 に生じる。星印(”)は、プラスミドの円形を完成するだめのヌクレオチドの架 橋を表す。フラグメントは、二重鎖DNAの線形片であるので、星印を有してい ない。エンドヌクレアーゼ制限部位は、線の上に示す。遺伝子は、線の下に示す 。これらの成分間の位置関係は、実際の距離ではないが、記載されたDNA配列 上での相対位置を示すことだけを意味しからC,CTに修飾したcDNAを含ん でいるプラスミドpTrp−BSt102およびpTrp −B S tm4の 構築は、米国特許出願S、N、016.294号に詳しく開示されている。概し て、発現ベクターpTrplは、pSK4から誘導される[カイテス(Kayt es、P、S、)ら、 1986.ジャーナル−オプ・バイオテクノロジー(J 、 of Biotechnology)、 4:205−218)。pTrp lは、イー・コリ(E、coli)のトリプトファン生合成経路のプロモーター およびオペレーター配列(trpプロモーター)、trpL遺伝子のシャインー ダルカーノ配列、pBR322由来複製起源、およびアンピシリン耐性に関する 遺伝子を含んでいる。pTrplは、trpLシャインーダル力−ノ配列の後に 唯一のClaI部位、および開始コドンATGの直後に唯一のKpn I / Asp718部位を有している。pT rp lのClal部位で挿入される開 始コドンを有している遺伝子は、外米アミノ酸では発現されない。Conventions used to represent plasmids and 7 fragments in charts 1-4 Examples are as follows. Single lines represent circular and linear double-stranded DNA; Translation initiation or transcription is in the direction of the arrow shown below the promoter or structural gene. occurs in The asterisk (”) indicates the missing nucleotide bridge that completes the plasmid circle. Represents a bridge. Fragments have an asterisk because they are linear pieces of double-stranded DNA. do not have. Endonuclease restriction sites are indicated above the line. Genes are shown below the line . The positional relationship between these components is not the actual distance, but is based on the described DNA sequence. It is only meant to indicate the relative position above, and does not include cDNAs modified with C or CT. plasmids pTrp-BSt102 and pTrp-BStm4. The construction is disclosed in detail in US Patent Application No. S, N, 016.294. Generally speaking The expression vector pTrpl is derived from pSK4 [Kayt. es, P, S, et al., 1986. Journal of Biotechnology (J , of Biotechnology), 4:205-218). pTrp l is the promoter of the tryptophan biosynthesis pathway of E. coli and operator sequence (trp promoter), trpL gene shiner Dulcano sequence, pBR322-derived origin of replication, and ampicillin resistance Contains genes. pTrpl follows the trpL Scheindal force-no sequence. Only one ClaI site, and only one KpnI/ immediately after the start codon ATG It has an Asp718 site. The open cell inserted at the ClaI site of pTrpl Genes with start codons are not expressed with foreign amino acids.
BStのアミノ酸残基24〜188をコードしているcDNA配列を含有する4 94bp Pvunフラグメントは、pLG23[アメリカ合衆国イリノイ、 ペオリアのノーザン・サージ1ナル・リサーチ・ラボラトリ−(Norther n Regional Re5earch Laboratory)に、受託番 号NRRL B12436の下、寄託されている1から単離され、pT rp lの平滑末端KpnI部位に挿入して、最初の22アミノ酸残基に対するコドン を欠失しているBStcDNA配列を作成する。4 containing the cDNA sequence encoding amino acid residues 24 to 188 of BSt. The 94 bp Pvun fragment was derived from pLG23 [Illinois, USA; Northern Surgical Research Laboratory in Peoria n Regional Research Laboratory), the accession number pTrp isolated from 1, which has been deposited under No. NRRL B12436. codons for the first 22 amino acid residues. Create a BSt cDNA sequence that is deleted.
得られたプラスミドは、pTrp −B S Lll 1と記す。不完全なりS t配列の各操作について、アミノ酸残基188に対するコドンのPvuI[部位 は、MstIIおよびBamH1部位間のBSt3″末端を適当なオリゴヌクレ オチドと交換することによって除去される。得られたプラスミドは、pTrp− B Stml bと記す。5°末端でBSt配列を消失させるために、C1al からPvunまでの小さい領域を適当なオリゴヌクレオチドと交換する。得られ たプラスミド、すなわち、pTrp−BStl O2およびpTrp−BStm 4は、trpプロモーターから下流にBSt配列およびtrpLリポソーム結合 部位を有している。プラスミドpTrp−BStl O2は、BSt暗号配列の 始めの部分において変化を有しないが、pTrp −B S tm4は、GCC からGCTに変化したアラニンに対する4番目のコドンを有する。これらのプラ スミドをチャート1に示す。The obtained plasmid is designated as pTrp-BSLll1. incomplete S For each manipulation of the t sequence, the codon for amino acid residue 188 was Connect the BSt 3″ end between the MstII and BamH1 sites with a suitable oligonucleotide. Removed by replacing it with Otide. The obtained plasmid was pTrp- It is written as B Stml b. To eliminate the BSt sequence at the 5° end, C1al Replace the small region from to Pvun with the appropriate oligonucleotide. obtained plasmids, namely pTrp-BStlO2 and pTrp-BStm 4 has a BSt sequence and trpL liposome binding downstream from the trp promoter. It has parts. Plasmid pTrp-BStl O2 contains the BSt coding sequence. Although there is no change in the initial part, pTrp-BSS tm4 has GCC It has the fourth codon for alanine changed from to GCT. These plastics Sumido is shown in Chart 1.
寅施例1:AT−リッチリポソーム結合部位を有するBSt発現用プラスミドの 構築 出発リポソーム結合部位と比較して増加したAおよびT残基を有するリポソーム 結合部位を有するBStを発現するためのにプラスミドを構築するために、2つ のオリゴヌクレオチドを用いて、pTrp −B S tm4中のHpalから C1aIの領域を置き換える。Example 1: BSt expression plasmid with AT-rich liposome binding site construction Liposomes with increased A and T residues compared to the starting liposome binding site To construct a plasmid to express BSt with binding sites, two from Hpal in pTrp-BS tm4 using the oligonucleotide of Replace the C1aI region.
チャート2に関して、pTrp −B S tm4をHpaIおよびC1alで 処理する。HpaT開裂部゛位をtrpプロモーター配列中に配置し、C1al 開裂部位を開始コドンATGのすぐ上流に配置する。シャインーダルガーノ配列 以外においてリポソーム結合部位におけるグアニジン(G)およびシトシン(C )の全てを除去するために、C1al消化によって生成されたCGオーバーハン グ(overhang)を、マングービーン(mung−bean)ヌクレアー ゼによって除去する。次いで、このようにして生成された7ラグメント(フラグ メント1)を、上記のように化学的に合成された2つの相補的オリゴヌクレオチ ドからなるフラグメント2にライゲートする(チャート2)。フラグメント2は 、2つの方向でフラグメントlにライゲートすることができるので、開始コドン ATGに近いシャインーダルガーノ配列(GAGG)に関連する所望の方向は、 配列決定によって同定される。得られl;プラスミドは、pAT−831m4と 記す。同様の方法で、pTrp−BSt102は、Hpal、Cla Iおよび マングービーンヌクレアーゼで処理し、7ラグメント2にライゲートして、pA T−102を生じる。Regarding chart 2, pTrp-BS tm4 with HpaI and C1al Process. Place the HpaT cleavage site in the trp promoter sequence and The cleavage site is placed immediately upstream of the start codon ATG. Shine-Dalgarno arrangement Except for guanidine (G) and cytosine (C) in the liposome binding site. ) generated by C1al digestion. mung-bean overhang Remove by ze. Then, the 7 fragments (flags) generated in this way 1) with two complementary oligonucleotides chemically synthesized as described above. (Chart 2). Fragment 2 is , can be ligated to fragment l in two directions, so the start codon The desired orientation associated with the Shine-Dalgarno sequence (GAGG) close to ATG is Identified by sequencing. The plasmids were pAT-831m4 and write down In a similar manner, pTrp-BSt102 was isolated from Hpal, Cla I and Treated with mango bean nuclease, ligated to 7 fragment 2, yielding T-102.
pTrp−BStl O2、pAT−BStl 02、p7 rp −B S tm4およびpAT−831m4にお)するBStの4番目のコドンとmRNA の+1塩基との間の出発配列および得られた配列をチャート3に示す。pTrp-BStl O2, pAT-BStl 02, p7 rp -B S The fourth codon and mRNA of BSt in tm4 and pAT-831m4 The starting sequence between base +1 and the resulting sequence are shown in Chart 3.
実施例2: A T−リッチリポソーム結合部位を有するプラスミドを用いるB St発現 実施例1の発現プラスミドを用いるBSt発現について試験するために、プラス ミドをコンピテントなイー・コリ(E、coli)菌株、K 12(ATCC# e23716)およびD112(米国特許出願S、N。Example 2: A B using a plasmid with a T-rich liposome binding site St expression To test for BSt expression using the expression plasmid of Example 1, plus Mid-competent E. coli strain, K12 (ATCC# e23716) and D112 (U.S. Patent Application S, N.
016.294号)に転換した。培養物を、0.2%グルコース、100μ9/ 罰アンピシリンおよび100μg/mQトリプトファンを含有するLB培地中で 一晩増殖させた。−晩培養物を、0.2%グルコース、0.05%酸加水分解オ ートクレーブカゼインアミノ酸および100μg/mQアンピシリンを含有する M9培地中で50〜100倍に希釈し、550nmでのODが0.3〜0.4に なるまで曝気しながら30″または37″で増殖させた。016.294). Cultures were grown in 0.2% glucose, 100μ9/ in LB medium containing ampicillin and 100 μg/mQ tryptophan. Grown overnight. - The late culture was grown in 0.2% glucose, 0.05% acid hydrolysis solution. Contains tococlaved casein amino acids and 100μg/mQ ampicillin Diluted 50-100 times in M9 medium to an OD of 0.3-0.4 at 550 nm. Grow at 30'' or 37'' with aeration until
誘発培養物から試料を取り、この試料を5DS−ポリアクリルアミドゲル電気泳 動によって分析した。該ゲルはクマシーブルーで染色され、スキャンして、目視 できるBStの量を測定した。該ゲルはウェスタンイムノブロッティング分析の ためにも用いた。結果を第1表に示す。低いレベルの発現の値は、イムノブロッ ティング分析によるものであり、高いレベルの発現は、5DS−PAGEによる ものである。A sample was taken from the induced culture and subjected to 5DS-polyacrylamide gel electrophoresis. It was analyzed by the movement. The gel was stained with Coomassie blue and scanned for visual inspection. The amount of BSt produced was measured. The gel was used for Western immunoblotting analysis. It was also used for The results are shown in Table 1. Values for low levels of expression are The high level of expression was determined by 5DS-PAGE. It is something.
ブタおよびヒツジのソマトトロピンは、同様の方法で行うことができる。Porcine and ovine somatotropin can be produced in a similar manner.
実施fi3:AT−’Jッチリポソーム結合部位を有するBSt発現のための第 2プラスミドの構築 用いた2つの相補的オリゴヌクレオチドがC1alの粘着末端を有しており、し たがって、これらがHpalおよびC1alで処理されたpTrp −B S tm4にクローンされること以外は、pA、T−831m4(*施例1)と同様 に、プラスミドpTrp2−B S tm4を構築する。pTrp2−831m 4とp、AT−831m4との差は、pTrp2− B S tm4におけるリ ポソーム結合部位がpAT−831m4におけるリポソーム結合部位よりもA− Tリッチではない点である(チャート5参照)。Implementation fi3: First step for BSt expression with AT-'J liposome binding site. Construction of 2 plasmids The two complementary oligonucleotides used had C1al sticky ends and Therefore, these are pTrp-BS treated with Hpal and C1al. Same as pA, T-831m4 (*Example 1) except that it is cloned into tm4 Then, construct plasmid pTrp2-BStm4. pTrp2-831m 4 and p, AT-831m4 is the difference between pTrp2- B S tm4. The liposome binding site is more A- than the liposome binding site in pAT-831m4. It is not T-rich (see chart 5).
実施例4:AT−リッチリポソーム結合部位を有する第2プラスミドを用いるB St発現 実施例2の記載に本質的に従って、プラスミドpT rp2−B S tm4を イー・コリ(E、coli)菌株に12およびD112に形質転換し、誘発し、 発現について分析した。結果を第1表に示す。Example 4: B using a second plasmid with an AT-rich liposome binding site St expression Plasmid pTrp2-BStm4 was created essentially as described in Example 2. E. coli strains 12 and D112 were transformed and induced, Expression was analyzed. The results are shown in Table 1.
第1表 pTrp−BSL102、trpLリポソーム結合部位、 <0.01 (0,013Stの始めの部分で変化なし pAT−BSt102、AT−リッチリポソーム結合部位、 <0.01 1 BStの始めの部分で変化なし pTrp−BStm4、trpLリポソーム結合部位、 <1 1G CCからGCTに変化しt:ala4pAT−BSt+n4、A−Tリッチリポ ソーム結合部位、 >10 >20GCCからOCTに変化しI:al a4pTrp2−BSLm4、AT−リッチリポソーム結合部位、25GCCか らOCTに変化したala4 第1表の結果は、特にD112宿主において、BStcDNA配列の非常に低い レベルの発現がAT−リッチリポソーム結合部位によって増大し得ることを示し ている。ala4コドンで修飾されたcDNA配列の低いレベルの発現はAT− リッチリポソーム結合部位によって全細胞タンパクの20%以上まで増強され得 る。Table 1 pTrp-BSL102, trpL liposome binding site, <0.01 (No change at the beginning of 0,013 St pAT-BSt102, AT-rich liposome binding site, <0.01 1 No change at the beginning of BSt pTrp-BStm4, trpL liposome binding site, <1 1G CC changes to GCT, t:ala4pAT-BSt+n4, A-T rich lipo Some binding site, >10 >20 changed from GCC to OCT and I:al a4pTrp2-BSLm4, AT-rich liposome binding site, 25GCC? ala4 changed to OCT The results in Table 1 show that the BSt cDNA sequence is very low, especially in the D112 host. We show that the level of expression can be increased by AT-rich liposome binding sites. ing. Low level expression of cDNA sequences modified with the ala4 codon indicates that AT- Rich liposome binding sites can enhance up to 20% of total cellular protein Ru.
実施例5: A T−リッチリポソーム結合部位を有するヒト腫瘍壊死ファクタ ーσ(TNF σ)の発現の増強A)AT−リッチリポソーム結合部位を含有 する発現ベクターの構築 AT−リッチリポソーム結合部位の後ろにクローン遺伝子を挿入するために、発 現ベクターpTrp2を構築する。pT rp −con S D[カーリ−( K 、A、Curry)およびトミッチ(C−S、C,Tomich)、“エフ ェクト・オン・リポソーム・パインディング・サイト・オン・ジーン・イクスプ レッション・イン・イー・コリ(Effect of Riboso+ne B indingSite on Gene Expression :n E、c oli)、 DNA、 3988印刷]におけるリポソーム結合部位領域を、A T−リッチ配列を含むオリゴヌクレオチドと交換する。チャート3に示すように 、pTrp−conSDにおけるリポソーム結合部位領域を、HpaIおよびC 1alによる処理によって除去する。得られたフラグメント3をHpalおよび C1ar末端を有する2つの相補的オリゴヌクレオチドにライゲートして、pT rp2を得る。pTrp−cons DおよびpT rp 2は、共に、イー・ コリ(E、coli)のトリプトファン生合成経路のプロモーターおよびオペレ ーター配列Qrpプロモーター)、シャインーダルガーノ配列としてGGAGG を有するリポソーム結合部位、シャインーダルガーノ配列の後の唯一のClal 部位、pB R322由来の複製起源ならびにアンピシリン耐性に関する遺伝子 を含有する。リポソーム結合部位配列は、pTrp−consDにおけるAAG TTCACGTAAGCAGGATATCGATAATGおよびpTrp2にお けるAAGTTCACGTTATTAAAAATTAACGAGGTATATC GATAATGである。これら2つの配列の差は、pTrp2におけるリポソー ム結合部位が、それを誘導するpTrp−consDにおけるリポソーム結合部 位よりもAT−リッチであるという点である。Example 5: Human tumor necrosis factor with A T-rich liposome binding site -Enhancement of expression of σ (TNF σ) A) Contains AT-rich liposome binding site Construction of expression vector To insert the cloned gene behind the AT-rich liposome binding site, Construct the current vector pTrp2. pT rp -con S D [Curly ( K, A, Curry) and C-S, C, Tomich, “F. ect on liposome binding site on gene expression Restion in E Cori (Effect of Riboso+ne B indingSite on Gene Expression: n E, c oli), DNA, 3988 printing], the liposome binding site region in A Replace with an oligonucleotide containing a T-rich sequence. As shown in chart 3 , the liposome binding site region in pTrp-conSD was expressed with HpaI and C It is removed by treatment with 1al. The obtained fragment 3 was subjected to Hpal and Ligate to two complementary oligonucleotides with C1ar ends to create pT Get rp2. pTrp-cons D and pTrp2 are both E. Promoters and operators of the tryptophan biosynthetic pathway in E. coli promoter sequence Qrp promoter), Shine-Dalgarno sequence GGAGG liposome binding site with a single Clal after the Shine-Dalgarno sequence site, origin of replication derived from pB R322, and genes related to ampicillin resistance Contains. The liposome binding site sequence is AAG in pTrp-consD. TTCACGTAAGCAGGATATCGATAATG and pTrp2. AAGTTCACGTTATTAAAAAAATTAACGAGGTATATC It is GATAATG. The difference between these two sequences is that the liposome in pTrp2 The liposome binding site in pTrp-consD that induces it The point is that it is more AT-rich than the rest of the world.
B)TNFaの発現に関するプラスミドの構築TNFaをコードしている遺伝子 を、ブリティッシュ・バイオ−テクノロジー・リミテッド(British B io−technology Lim1ted ;Brook House、 Watlington Road、 Cowley、 0xford、 0X4 5LY、 UK)から購入する。この遺伝子はいくつかの固有の制限エンドヌク レオチド部位を有している。この遺伝子から590bp 5naB I −Ba mHI7ラグメントを単離することができ、これは、最初の2つのコドンについ て平滑にされt;成熟TNFσ配列を含んでいる。この7ラグメントは、最初の 2つのコドンを供給するt;めの2つの相補的オリゴヌクレオチドと一緒に、発 現ベクターpT rp −con S DおよびpTrp2にクローンする。チ ャート4に示すように、pT rp−con S DおよびpTrp2をC1a lおよびBamHIで処理して、各々、7ラグメント5および6を得る。7ラグ メント5は、フラグメント7(平滑されたTNFσ遺伝子を含有する5naB I −BamHI 7ラグメント)およびフラグメント8 (T N Fα配列 の始めの部分を供給し、CJal#よび5naBI末端を有するオリゴヌクレオ チド)とライゲートして、pTrp−cans D−TN F aを得る。同様 に、フラグメント6と7ラグメント78よび8をライゲートして、pTrp2− TNFaを得る。B) Construction of plasmid for expression of TNFa Gene encoding TNFa British Biotechnology Limited (British B io-technology Limited ; Brook House, Watlington Road, Cowley, 0xford, 0x4 Purchase from 5LY, UK). This gene has several unique restriction endonucleotides. It has a leotide site. 590bp from this gene 5naB I-Ba The mHI7 fragment can be isolated, which consists of the first two codons. contains the mature TNFσ sequence. This 7-ragment is the first together with two complementary oligonucleotides supplying the two codons; Clone into the current vectors pTrp-con SD and pTrp2. blood As shown in chart 4, pTrp-conSD and pTrp2 were injected into C1a 1 and BamHI to yield seven fragments 5 and 6, respectively. 7 lugs Ment 5 is fragment 7 (5naB containing the blunted TNFσ gene). I-BamHI 7 fragment) and fragment 8 (TN Fα sequence oligonucleosomes with CJal# and 5naBI ends. pTrp-cansD-TNFa is obtained. similar Then, fragments 6 and 7 were ligated to create pTrp2-78 and 8. Obtain TNFa.
C)TNFeの発現 実施例2の記載に木質的に従って、プラスミドpTrp−conSD−TNFa およびpTrp2− T N F aをイー・コリ(E、col i)菌株JM 103に形質転換し、発現を誘発し、発現について分析する。C) Expression of TNFe Plasmid pTrp-conSD-TNFa according to the description in Example 2 and pTrp2-TNFa from E. coli strain JM 103, induce expression, and analyze for expression.
pTrp−consD−TNFaおよびpTrp2−TNFa由来のTNFa発 現のレベルは、各々、全細胞タンパクの約5%および30%である。したがって 、AT−リッチリポソーム結合部位は、TNFα発現を増加させる。TNFa production from pTrp-consD-TNFa and pTrp2-TNFa Current levels are approximately 5% and 30% of total cellular protein, respectively. therefore , AT-rich liposome binding sites increase TNFα expression.
チャート1.プラスミドのリスト pTrpl pTrp−BStnl pTrp−BStmlb pTrp−BSe102. pTrp−BSem4 (4,11kb)A+ap R繻アンピシアンピシ リン耐性”trpプロモーター/オペレーターE −リポソーム結合部位 C−合成配列 B −BSt配列 チャート2 :PAT−BStm4の構築a ) pTrp −B S tm4 をHpal、C1alおよびマングービーンヌクレアーゼで処理して、フラグメ ントlを得る。Chart 1. List of plasmids pTrpl pTrp-BStnl pTrp-BStmlb pTrp-BSe102. pTrp-BSem4 (4,11kb) A+ap R-striped ampichiampici Phosphorus resistant "trp promoter/operator E - liposome binding site C-Synthetic sequence B-BSt array Chart 2: Construction of PAT-BStm4 a) pTrp-B S tm4 was treated with Hpal, C1al and mango bean nuclease to generate fragments. Obtain the component l.
b)2つのオリゴヌクレオチドをアニールして、フラグメント2を得る。b) Anneal the two oligonucleotides to obtain fragment 2.
5’ AACTAにTACCCAAGTrCACGTTATTAAAAATT AAAGAll;CTATA、TAτrrcATcATcccTTcAAc’r cCAA?AATTrTTAATrTCTCCATATATAC)フラグメント lおよび2をライゲートして、pAT−BStm4(4,8Kb)を得る。5' AACTA TACCCAAGTrCACGTTATTAAAAATT AAAGAAll; CTATA, TAτrrcATcATcccTTcAAc'r cCAA? AATTrTTAATrTCTCCATATATAC) fragment 1 and 2 are ligated to obtain pAT-BStm4 (4,8 Kb).
pAT−BS国4 チャート4: 1)Trp−conSD−TNFaおよびpTrp2 T N F aの構築 a ) pTrp−cons DをC1alおよびBamHI ″F処理して、 フラグメント5を得る。pTrp2をC1alおよびBamHIで処理して、7 ラグメント6を得る。pAT-BS country 4 Chart 4: 1) Trp-conSD-TNFa and pTrp2 TN Construction of Fa a) pTrp-cons D was treated with C1al and BamHI″F, Fragment 5 is obtained. pTrp2 was treated with C1al and BamHI to Obtain ragment 6.
フラグメント5および6(4,6Kb)b)TNFir遺伝子を5naBlおよ びBamHlで処理して、7ラグメント7(460bp)を巣離する。Fragments 5 and 6 (4,6 Kb)b) TNFir gene with 5naBl and 7 fragment 7 (460 bp) is isolated by treatment with BamHl and BamHl.
c)2つの相補的なオリゴヌクレオチドをアニールして、フラグメント8を得る 。c) Annealing the two complementary oligonucleotides to obtain fragment 8 .
フラグメント8 CGATAATにGτ八C へATTACCATC d)フラグメント5.7および8をライゲートしてpTrp−consDT N F aを得、フラグメント6.7および8をライゲートしてpTrp2 T NFaを得る。fragment 8 Gτ8C in CGATAAT TOATTACCATC d) Ligate fragments 5.7 and 8 to create pTrp-consDTN Fa was obtained and fragments 6.7 and 8 were ligated to create pTrp2T Obtain NFa.
pTrp−consD−TNFaおよびpTrp2 TNFa(5,IKb) Ao+pR−アンピシリン耐性 D −trpプロモーター/オペレーターE −シャインーダルガーノ配 列 C−合成配列 T =TNFa配列 チャート5: BSt発現用プラスミドにおけるリポソーム結合部位配列X pTrp−BSt102 AAGTTCACGTAAAMGGOTATCCATAATG I GCCTT CCCAGCCpAT−BSt102 AAGTTCACGTTATTAMAATTAAAにAGGT^TATAπ緑τ clccc買CCC^cccpTrp−BSc+++4 McicAccrAAAAIIIcccTATccATAAlrc l ccc rrccchccxpAτ−BSt!+14 IIIAcrrcp、ccTTATTAAAAATTAAAII:AGciAT ArAmmrc l cccrrcCCAGCTpTrp2−15cm4 AAGTTCACGTTATTAAAAATTMGGAGGTATATCCAT AATに l cccrrcccAccT本縦線の左側に、異種ポリペプチドを 発現するために有用なリポソーム結合部位を示す。縦線の右側の配列は、BSt 遺伝子の部分からなる。pTrp-consD-TNFa and pTrp2 TNFa (5, IKb) Ao+pR-ampicillin resistance D - trp promoter/operator E - Shine-Dalgarno arrangement column C-Synthetic sequence T = TNFa sequence Chart 5: Liposome binding site sequence X in BSt expression plasmid pTrp-BSt102 AAGTTCACGTAAAMGGOTATCCATAATG I GCCTT CCCAGCCpAT-BSt102 AAGTTCACGTTATTAMAATTAAA to AGGT^TATAπgreenτ clccc buy CCC^cccpTrp-BSc+++4 McicAccrAAAAIIIcccTATccATAAlrc l ccc rrccchccxpAτ-BSt! +14 IIIAcrrcp, ccTTATTAAAATTAAAII:AGciAT ArAmmrc cccrrcCCAGCTpTrp2-15cm4 AAGTTCACGTTATTAAAAAAATTMGGAGGTATATCCAT Add the heterologous polypeptide to the left of the AAT cccrrcccAccT main vertical line. Liposome binding sites useful for expression are shown. The array to the right of the vertical line is BSt Consists of genetic parts.
国醇I審輻牛 国際調査報告National cuisine I trial beef international search report
Claims (10)
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US16688288A | 1988-03-11 | 1988-03-11 | |
US166,882 | 1988-03-11 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH03503360A true JPH03503360A (en) | 1991-08-01 |
Family
ID=22605061
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP50365989A Pending JPH03503360A (en) | 1988-03-11 | 1989-02-23 | ribosome binding site |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0404824A1 (en) |
JP (1) | JPH03503360A (en) |
AU (1) | AU3341089A (en) |
DK (1) | DK201090A (en) |
WO (1) | WO1989008708A1 (en) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AUPM772494A0 (en) * | 1994-08-30 | 1994-09-22 | Austin Research Institute, The | Improvements in production of proteins in host cells |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0111814A3 (en) * | 1982-12-16 | 1985-08-14 | Mgi Pharma, Inc. | The cloning and expression of nucleotide sequences encoding bovine growth hormone |
DE3430683A1 (en) * | 1984-08-21 | 1986-03-06 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | SYNTHETIC REGULATION REGION |
CA1340091C (en) * | 1986-03-27 | 1998-10-20 | Peter Olafs Olins | Enhanced protein production in bacteria by employing novel ribosome binding site |
-
1989
- 1989-02-23 JP JP50365989A patent/JPH03503360A/en active Pending
- 1989-02-23 EP EP19890904305 patent/EP0404824A1/en not_active Withdrawn
- 1989-02-23 AU AU33410/89A patent/AU3341089A/en not_active Abandoned
- 1989-02-23 WO PCT/US1989/000650 patent/WO1989008708A1/en not_active Application Discontinuation
-
1990
- 1990-08-22 DK DK201090A patent/DK201090A/en not_active Application Discontinuation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU3341089A (en) | 1989-10-05 |
DK201090D0 (en) | 1990-08-22 |
DK201090A (en) | 1990-08-22 |
WO1989008708A1 (en) | 1989-09-21 |
EP0404824A1 (en) | 1991-01-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4678751A (en) | Hybrid human leukocyte interferons | |
EP0234888B1 (en) | Process for producing human epidermal growth factor and analogs thereof | |
EP0043980B1 (en) | Mature human leukocyte interferon a, process for its microbial preparation, intermediates therefor and compositions containing it. | |
EP0272703B1 (en) | Novel polypeptide | |
EP0051873B1 (en) | Hybrid human leukocyte interferons, process for their microbial production, intermediates therefor and compositions containing them | |
RU2094439C1 (en) | Recombinant polypeptide pgh(a) with n-terminal alanine | |
JPH0141312B2 (en) | ||
JPH0612996B2 (en) | Microbiological expression of partially synthetic genes | |
HU197349B (en) | Process for producing cloning vectors usable for the expression of growth hormones | |
IE54592B1 (en) | Anumal interferons, processes involved in their production, compositions containing them, dna sequences coding therefor and espression vehicles containing such sequences and cells transformed thereby | |
EP0111389A2 (en) | Substantially pure porcine growth hormone, DNA sequences therefor, and expression vehicles and transfected microorganisms for the production of porcine growth hormone | |
JP2834111B2 (en) | Microbial production of human parathyroid hormone | |
EP0147178B1 (en) | Expression plasmids for improved production of heterologous protein in bacteria | |
EP0040466B1 (en) | Adaptor molecules for dna and their application to synthesis of gene-derived products | |
EP0159123B1 (en) | Vectors for expressing bovine growth hormone derivatives | |
JP2612264B2 (en) | DNA sequence | |
Mayne et al. | Direct expression of human growth in Escherichia coli with the lipoprotein promoter | |
EP0153961B1 (en) | Recombinant materials and methods for producing human connective tissue-activating peptide-iii and analogs thereof | |
US5268284A (en) | Ribosome binding site | |
JPH03503360A (en) | ribosome binding site | |
JP2580303B2 (en) | CDNAs, expression vectors and hosts for coding heterologous proteins | |
WO1987005935A1 (en) | Methods and compositions for expression of competent eukaryotic gene products | |
EP0163603B1 (en) | A human t-cell growth factor | |
Katsuya et al. | Construction of a new plasmid vector that can express cloned cDNA in all translational reading frames | |
CA1301676C (en) | Genetic expression of somatostatin as hybrid polypeptide |