JPH03282257A - Chemical light emitting reagent and analyzing element using the reagent - Google Patents
Chemical light emitting reagent and analyzing element using the reagentInfo
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Landscapes
- Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、分析化学、特に生物学的試料中の特定物質を
分析するために用いられる化学発光反応を用いた分析試
薬と、それを使用する分析素子に関する。[Detailed Description of the Invention] [Industrial Application Field] The present invention relates to analytical chemistry, particularly an analytical reagent using a chemiluminescent reaction used to analyze a specific substance in a biological sample, and an analytical reagent using the chemiluminescent reaction. It relates to an analytical element.
近年、生化学、免疫学、遺伝学、分子生物学等の著しい
進歩により、生物学的試料中の極微量の特定成分を検出
する必要が出てきている。In recent years, due to remarkable advances in biochemistry, immunology, genetics, molecular biology, etc., it has become necessary to detect extremely small amounts of specific components in biological samples.
グルコース、コレステロール、尿Ｍ等を測定する方法と
して、一般にその酸化酵素、例えばグルコースオキシダ
ーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ウリカーゼ等を作
用させて生成した過酸化水素を定量することにより目的
物を定量する方法が用いられている。As a method for measuring glucose, cholesterol, urine M, etc., a method is generally used to quantify the target substance by quantifying hydrogen peroxide produced by the action of an oxidizing enzyme such as glucose oxidase, cholesterol oxidase, uricase, etc. ing.
これらの過酸化水素の定量方法としては、過酸化作用を
有する物質の存在下に、色原体を酸化型に変化させたり
、１種又は２種の色原体を酸化縮合させて比色定量する
方法がよく知られている。Methods for quantifying hydrogen peroxide include changing the chromogen into an oxidized form in the presence of a substance that has a peroxidizing effect, or performing oxidative condensation of one or two chromogens for colorimetric determination. The method to do this is well known.
そして、従来公知の各種化合物の組合せを色原体として
用いる方法は、従来公知の色原体に比べて定量感度も比
較的高く有用ではあるが、例えば、生物学的流体試料（
例えば血清）中に存在する低レベルの尿酸、クレアチニ
ン、グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（Ｇ
ＯＴ）グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（Ｇ
ＰＴ）等を過酸化水素に導いて定量する際には、定量す
べき過酸化水素の濃度が非常に低いため、これらの定量
に対する識別感度としてはまだ充分とは言い難い。The method of using a combination of various conventionally known compounds as a chromogen is relatively high in quantitative sensitivity and useful compared to conventionally known chromogens, but for example, for biological fluid samples (
For example, low levels of uric acid, creatinine, and glutamate-oxaloacetate transaminase (G
OT) Glutamate pyruvate transaminase (G
When quantitating hydrogen peroxide such as PT), the concentration of hydrogen peroxide to be quantified is very low, so it cannot be said that the discrimination sensitivity for these quantifications is sufficient.
極微量の特定成分を検出するためには、今までの発色試
薬を用いる分析手法では、充分満足できるものではない
。In order to detect trace amounts of specific components, conventional analytical methods using coloring reagents are not fully satisfactory.
一方、分析化学の分野の中で、発光反応を用いる分析方
法は、高感度を持つものとして知られている。例えば、
血液中のヘモグロビンを触媒として過酸化水素及びルミ
ノールとの共存下発光反応を行わせるルミノール反応は
、裁判化学等の分野で昔から多用されている。On the other hand, in the field of analytical chemistry, analytical methods using luminescent reactions are known to have high sensitivity. for example,
The luminol reaction, in which a luminescent reaction is carried out in the presence of hydrogen peroxide and luminol using hemoglobin in the blood as a catalyst, has been widely used in fields such as forensic chemistry for a long time.
化学発光を分析に利用するために、いくつかの提案がな
されている。例えば、特開昭５３−４０７８７号にはフ
タラジン誘導体を化学発光基質として用いる免疫分析法
について、更に、特開昭５９−１７１８３９号には、フ
タラジン誘導体を用いる増強された発光分析方法が提案
されている。Several proposals have been made to utilize chemiluminescence for analysis. For example, JP-A No. 53-40787 proposes an immunoassay method using phthalazine derivatives as a chemiluminescent substrate, and JP-A No. 59-171839 proposes an enhanced luminescence analysis method using phthalazine derivatives. There is.
また、欧州特許第００８２６３６号には、アクリジニウ
ム・エステル誘導体を化学発光標識化合物、及びそれを
用いる分析方法について提示されている。更に、米国特
許第４８５７６５２号には安定化された１、２−ジオキ
セタン化合物を化学発光の基質として用いる方法が開示
されている。Furthermore, European Patent No. 0082636 discloses an acridinium ester derivative as a chemiluminescent labeling compound and an analytical method using the same. Furthermore, US Pat. No. 4,857,652 discloses a method of using stabilized 1,2-dioxetane compounds as chemiluminescent substrates.
しかしながら、ルミノールは前記特開昭５９１７１８３
９号のごとく、増強剤を用いたとしても十分な感度を有
するとは言い難い。また、アクリジニウム・エステル誘
導体は、発光反応の時間が数秒と短いために、この検出
は著しく困難であり、高価な測定装置を必要とする。However, Luminor is
As in No. 9, even if an enhancer is used, it cannot be said that the sensitivity is sufficient. Furthermore, since the luminescence reaction time of acridinium ester derivatives is as short as several seconds, detection is extremely difficult and requires an expensive measuring device.
方、安定化された１、２−ジオキセタン化合物は、化合
物の安定性、発光寿命の長さの両方共充分であり、高感
度な分析方法である。On the other hand, a stabilized 1,2-dioxetane compound has sufficient stability and long luminescence lifetime, and is a highly sensitive analytical method.
しかしながら、化学発光がうまく行われたかどうかの確
認が困難であるという問題点がある。However, there is a problem in that it is difficult to confirm whether chemiluminescence has been successfully performed.
本発明の目的は、上記欠点を解消し、安定で、かつ化学
発光の反応を容易に検知できる、改良された高感度化学
発光試薬を提供することにある。An object of the present invention is to provide an improved highly sensitive chemiluminescent reagent that overcomes the above-mentioned drawbacks, is stable, and allows easy detection of chemiluminescent reactions.
本発明の他の目的は、検知すべき物質を、単一の基質を
用いて高濃度領域において比色法で、極微量の領域にお
いては化学発光法で測定することが可能であるような、
測定範囲を著しく拡大することが可能な基質を提供する
ことにある。Another object of the present invention is to provide a method for detecting a substance such that it is possible to measure the substance to be detected using a single substrate colorimetrically in the high concentration range and chemiluminescently in the trace amount range.
The object of the present invention is to provide a substrate that can significantly expand the measurement range.
更に具体的な本発明の目的は、過酸化作用を有する物質
の存在下での過酸化水素又は過酸化水素を生成する物質
の定量において、著しく優れた分析感度を有する分析試
薬、及び分析素子を提供することにある。A more specific object of the present invention is to provide an analytical reagent and an analytical element that have significantly superior analytical sensitivity in quantifying hydrogen peroxide or a substance that generates hydrogen peroxide in the presence of a substance that has a peroxidizing effect. It is about providing.
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は化学発光試
薬に関する発明であって、芳香族第一級アミン化合物、
及び下記一般式〔Ｉ〕 ：（式中、Ｘは活性メチレン基
若しくは活性メチン基を有する化合物の残基、Ｙは酸素
又は硫黄、Ａｒは芳香族基、Ｒはアルキル基を示す）で
表わされる化合物を含有していることを特徴とする。To summarize the present invention, the first invention of the present invention relates to a chemiluminescent reagent, which comprises an aromatic primary amine compound,
and the following general formula [I]: (wherein, X is a residue of a compound having an active methylene group or an active methine group, Y is oxygen or sulfur, Ar is an aromatic group, and R is an alkyl group) It is characterized by containing a compound.
また、本発明の第２の発明は過酸化水素分析用化学発光
試薬に関する発明であって、過酸化作用を有する物質、
及び上記第１の発明の化学発光試薬を含有していること
を特徴とする。Further, the second invention of the present invention relates to a chemiluminescent reagent for hydrogen peroxide analysis, which includes a substance having a peroxidizing effect,
and the chemiluminescent reagent of the first invention.
そして、本発明の第３の発明は、過酸化水素分析用分析
素子に関する発明であって、少なくとも一層の試薬層を
有する過酸化水素分析用分析素子において、該分析素子
が、過酸化作用を有する物質、過酸化水素を生成する物
質、芳香族第一級アミン化合物、及び上記第１の発明の
一般式〔ＩＪで表わされる化合物を含有していることを
特徴とする。A third invention of the present invention relates to an analytical element for hydrogen peroxide analysis, which has at least one reagent layer, in which the analytical element has a peroxidizing effect. It is characterized by containing a substance, a substance that generates hydrogen peroxide, an aromatic primary amine compound, and a compound represented by the general formula [IJ] of the first invention.
本発明者らは、前記目的を達成するために鋭意検討した
結果、過酸化作用を有する物質の存在下で一般式［１］
で表わされる化合物は芳香族第一級アミン化合物を組合
せて用いることにより、本発明の目的が達成された。As a result of intensive studies to achieve the above object, the present inventors found that the general formula [1]
The object of the present invention was achieved by using the compound represented by in combination with an aromatic primary amine compound.
次に本発明の詳細な説明する。Next, the present invention will be explained in detail.
一般式〔ＩＪにおけるＸは、活性メチレン基若しくは活
性メチン基を有する化合物の残基であり、芳香族第一級
アミン化合物の酸化体と酸化カップリング反応する化合
物残基である。X in the general formula [IJ is a residue of a compound having an active methylene group or an active methine group, and is a residue of a compound that undergoes an oxidative coupling reaction with an oxidized product of an aromatic primary amine compound.
これらＸは、例えば、以下の一般式（Ｉ−ａ）〜（Ｉ−
ｄ）で表わすことができる。These X are, for example, the following general formulas (I-a) to (I-
d).
Ｒ，−Ｃ−Ｃ）１
１
２
式中Ｒ１は置換若しくは非置換の第一級〜第三級アルキ
ル基、置換若しくは非置換のアリール基、複素環基、置
換若しくは非置換のアミノ基、カルボンアミド基、置換
若しくは非置換のスルホンアミド基、置換若しくは非置
換のウレイド基、アルコキシ基、カルボキシル基又はス
ルホ基を示し、Ｒ２は水素、置換若しくは非置換のアル
キル基、置換若しくは非置換のアリール基又は複素環基
を示す。R, -C-C)1 1 2 In the formula, R1 is a substituted or unsubstituted primary to tertiary alkyl group, a substituted or unsubstituted aryl group, a heterocyclic group, a substituted or unsubstituted amino group, carbon An amide group, a substituted or unsubstituted sulfonamide group, a substituted or unsubstituted ureido group, an alkoxy group, a carboxyl group, or a sulfo group, R2 is hydrogen, a substituted or unsubstituted alkyl group, a substituted or unsubstituted aryl group Or represents a heterocyclic group.
式（１−ａ）におけるしの例としては、メチル、エチル
、プロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ヘキシル、２−
ヒドロキシエチル、２−フェニルエチルのような相当す
るアルキル基、フェニル、ナフチル、２，４．６−）リ
クロロフエ二Ｊｌ／、２−クロロ−４，６−シメチルフ
エニル、２．６−ジクロロ−４−メトキシフェニル、４
−アルキルアミノフェニル、４−トリフルオロメチルフ
ェニル、３．５−ジブロモフェニル、４カルボキシフエ
ニル、２−メチルフェニル、４−スルファモイルフェニ
ル、３．５−ジカルボキシフェニル、４−スルホフェニ
ルのような相当するアリール基、複素原子として窒素又
は酸素を含む５及び６員の複素環基例えばキノリニル、
ピリジル、ベンゾフラニル、オキサシリルのような複素
環基、アミノ、メチルアミノ、ジエチルアミノ、ジブチ
ルアミノ、フェニルアミノ、トリルアミノ、４− （３
−スルホベンズアミノ）アニリノ、２−クロロ−５−ア
シル、アミノアニリノ、２−９０ロー５−アルコキシカ
ルボニルアニリノ、２−トリフルオロメチルフェニルア
ミノ、３．５−ジカルボキシフェニルアミノ、５−カル
ボキシ−２−メトキシフェニルアミノ、２−メトキシ−
３−（Ｎ−メチル）スルファモイルフェニルアミノ、４
−スルファモイルフェニルアミノ、３−スルファモイル
フェニルアミノ、５−カルボキシ−２−クロロフェニル
アミノのような相当するアミノ基、アルキルカルボンア
ミド、アリールカルボンアミド、ペンゾチアソ′リルカ
ルボンアミドのような相当するカルボンアミド基、スル
ホンアミド、複素環スルホンアミドのような相当するス
ルホンアミド基、アルキルウレイド、アリールウレイド
、複素環ウレイドのような相当するウレイド基、メトキ
シ、エトキシのような相当するアルコキシ基、カルボキ
シル基又はスルホ基が挙げられる。Examples of silane in formula (1-a) include methyl, ethyl, propyl, n-butyl, t-butyl, hexyl, 2-
Corresponding alkyl groups such as hydroxyethyl, 2-phenylethyl, phenyl, naphthyl, 2,4.6-)lichlorophenylene, 2-chloro-4,6-dimethylphenyl, 2,6-dichloro-4-methoxy phenyl, 4
-Alkylaminophenyl, 4-trifluoromethylphenyl, 3.5-dibromophenyl, 4carboxyphenyl, 2-methylphenyl, 4-sulfamoylphenyl, 3.5-dicarboxyphenyl, 4-sulfophenyl, etc. corresponding aryl groups, 5- and 6-membered heterocyclic groups containing nitrogen or oxygen as heteroatoms, such as quinolinyl,
Heterocyclic groups such as pyridyl, benzofuranyl, oxacylyl, amino, methylamino, diethylamino, dibutylamino, phenylamino, tolylamino, 4-(3
-sulfobenzamino)anilino, 2-chloro-5-acyl, aminoanilino, 2-90rho-5-alkoxycarbonylanilino, 2-trifluoromethylphenylamino, 3,5-dicarboxyphenylamino, 5-carboxy-2 -methoxyphenylamino, 2-methoxy-
3-(N-methyl)sulfamoylphenylamino, 4
-corresponding amino groups such as sulfamoylphenylamino, 3-sulfamoylphenylamino, 5-carboxy-2-chlorophenylamino, corresponding carbonyl groups such as alkylcarbonamide, arylcarbonamide, penzothiazolylcarbonamide; amide groups, sulfonamides, corresponding sulfonamide groups such as heterocyclic sulfonamides, corresponding ureido groups such as alkylureido, arylureido, heterocyclic ureido, corresponding alkoxy groups such as methoxy, ethoxy, carboxyl groups or Examples include sulfo groups.
Ｒ２の例としては、ナフチル、フェニル、２，４゜６−
） ＩＪ クロ０ フェニル、２−クロロ−４，６ジ
メチルフエニル、２，６−ジクロロ−４−メトキシフェ
ニル、４−アルキルアミノフェニル、４−トリフルオロ
メチルフェニル、３．５−ジブロモフェニル、４−カル
ボキシフェニル、２メチルフエニル、４−スルファモイ
ルフェニル、３．５−ジカルボキシフェニル、４−スル
ホフェニルのような相当する了リール基、複素原子とし
て窒素又は酸素を含む５及び／又は６員の複素環基、例
えばベンゾフラニル、ナフトオキサゾリニル、キノリニ
ルのような複素環基、エチル、ベンジル、２−シアノプ
ロピル、２−カルボキシプロピルのような相当するアル
キル基が挙げられる。Examples of R2 include naphthyl, phenyl, 2,4°6-
) IJ Chloro Phenyl, 2-chloro-4,6 dimethylphenyl, 2,6-dichloro-4-methoxyphenyl, 4-alkylaminophenyl, 4-trifluoromethylphenyl, 3.5-dibromophenyl, 4- Corresponding aryl groups such as carboxyphenyl, 2-methylphenyl, 4-sulfamoylphenyl, 3,5-dicarboxyphenyl, 4-sulfophenyl, 5- and/or 6-membered heteroyl groups containing nitrogen or oxygen as heteroatoms Cyclic groups include, for example, heterocyclic groups such as benzofuranyl, naphthoxazolinyl, quinolinyl, and the corresponding alkyl groups such as ethyl, benzyl, 2-cyanopropyl, 2-carboxypropyl.
一般式（Ｉ−ａ）で表わされる代表的なものとしては次
のようなものを挙げることができる。Representative examples of the general formula (I-a) include the following.
−ａ ■ ａ−３ ■ ａ ■ ■ １ Ｒ３ＣＯＣＨ，Ｃ０ＮＨＲ。-a ■ a-3 ■ a ■ ■ 1 R3COCH, C0NHR.
（Ｉ −ｂ）
式中Ｒ３は置換若しくは非置換の第一級〜第三級アルキ
ル基、置換若しくは非置換のアリール基又は置換若しく
は非置換のアミノ基を示し、Ｒ１は置換若しくは非置換
のアリール基を示す。(I-b) In the formula, R3 represents a substituted or unsubstituted primary to tertiary alkyl group, a substituted or unsubstituted aryl group, or a substituted or unsubstituted amino group, and R1 represents a substituted or unsubstituted aryl group. Indicates the group.
式（Ｉ−ｂ）におけるＲ３の例としては、ｔ−ブチル、
１，１−ジメチルプロピル、１，１−ジメチル−１−エ
チルチオメチル、１．１−ジメチル−１−（４−メトキ
シフェノキシ）メチルのような相当するアルキル基、３
−メチルフェニル、２−メトキシフェニル、４−メトキ
シフェニル、ハロフェニル、２−ハロー５−アルカノイ
ルアミノフェニル、２−クロロ−５−〔α−（２，４ジ
ーｔ−アミノフェノキシ）ブチルアミド〕フェニル、２
−メトキシ−５−アルカノイルアミノフェニル、２−ク
ロロ−５−スルホンアミドフェニル、３−カルボキシフ
ェニルのような相当するアリール基、アニリノ、ｐ−メ
トキシアニリノ、３．５−ジカルボキシアニリノ、ブチ
ルアミノのような相当するアミノ基が挙げられる。Examples of R3 in formula (I-b) include t-butyl,
Corresponding alkyl groups such as 1,1-dimethylpropyl, 1,1-dimethyl-1-ethylthiomethyl, 1,1-dimethyl-1-(4-methoxyphenoxy)methyl, 3
-methylphenyl, 2-methoxyphenyl, 4-methoxyphenyl, halophenyl, 2-halo 5-alkanoylaminophenyl, 2-chloro-5-[α-(2,4 di-t-aminophenoxy)butyramido]phenyl, 2
Corresponding aryl groups such as -methoxy-5-alkanoylaminophenyl, 2-chloro-5-sulfonamidophenyl, 3-carboxyphenyl, anilino, p-methoxyanilino, 3,5-dicarboxyanilino, butylamino Corresponding amino groups such as
Ｒ４の例としては２−クロロフェニル、２−ノ＼ロー５
−アルカノイルアミノフェニル、２−り四ロー５−〔α
−（２，４−ジ−ｔ−アミルフェノキシ）アセトアミド
フェニル、２−クロロ５− （４−メチルフェニルスル
ホンアミド）フェニル、２−クロロ−５−ヘキサデカン
スルホンアミドフェニル、２−メトキシ−３−（２゜４
−ジ−ｔ−アミルフェノキシ）アセトアミドフェニル、
２−メトキシフェニル、２−エトキシフェニル、３．５
−ジメトキシカルボニルフェニル、３．５−ジカルボキ
シフェニル、５−エトキシカルボニル−２−メトキシフ
ェニル、５カルボキシ−２−メトキシフェニル、５−メ
トキシカルボニル−２−クロロフェニル、５−カルボキ
シ−２−クロロフェニル、４−スルホフェニル、３−カ
ルボキシ−４−ヒドロキシフェニル、３−（Ｎ−カルボ
キシメチル）スルファモイルフェニル、５−カルボキシ
−２−メトキシフェニル、３−カルボキシ−５−メタン
スルホニルアミノフェニル、４− （Ｎ−（３，５−ジ
カルボキシフェニル））スルファモイルフェニル、５−
カルボキシ−２−ヒドロキシフェニル、３− （Ｎ−（
２−カルボキシエチル））スルファモイルフェニル、３
．５−ジスルホフェニルのような相当するアリール基が
挙げられる。Examples of R4 are 2-chlorophenyl, 2-no\ro5
-alkanoylaminophenyl, 2-ri-4-5-[α
-(2,4-di-t-amylphenoxy)acetamidophenyl, 2-chloro5-(4-methylphenylsulfonamido)phenyl, 2-chloro-5-hexadecanesulfonamidophenyl, 2-methoxy-3-(2゜4
-di-t-amylphenoxy)acetamidophenyl,
2-methoxyphenyl, 2-ethoxyphenyl, 3.5
-dimethoxycarbonylphenyl, 3.5-dicarboxyphenyl, 5-ethoxycarbonyl-2-methoxyphenyl, 5-carboxy-2-methoxyphenyl, 5-methoxycarbonyl-2-chlorophenyl, 5-carboxy-2-chlorophenyl, 4- Sulfophenyl, 3-carboxy-4-hydroxyphenyl, 3-(N-carboxymethyl)sulfamoylphenyl, 5-carboxy-2-methoxyphenyl, 3-carboxy-5-methanesulfonylaminophenyl, 4- (N- (3,5-dicarboxyphenyl))sulfamoylphenyl, 5-
Carboxy-2-hydroxyphenyl, 3- (N-(
2-carboxyethyl)) sulfamoylphenyl, 3
．． Corresponding aryl groups such as 5-disulfophenyl are mentioned.
一般式（Ｉ−ｂ）で表わされる代表的なものとしては次
のようなものを挙げることができる。Representative examples of the general formula (I-b) include the following.
−ｂ−１
■
■
−ｂ−５
１
式中Ｒ３は、水素、ハロゲン、置換若しくは非置換のカ
ルバモイル基、置換若しくは非置換のスルファモイル基
、アルコキシカルボニル基又はアリールオキシカルボニ
ル基を示す。-b-1 ■■ -b-5 1 In the formula, R3 represents hydrogen, halogen, a substituted or unsubstituted carbamoyl group, a substituted or unsubstituted sulfamoyl group, an alkoxycarbonyl group, or an aryloxycarbonyl group.
式（Ｉ−ｃ）におけるＲ３の例としては、Ｎアルキルカ
ルバモイル、Ｎ、Ｎ−ジアルキルカルバモイル、Ｎ−７
エニルカルバモイル、Ｎ−アリールカルバモイル、Ｎ−
アルキル−Ｎ−アリールカルバモイル
ルバモイルのような相当するカルバモイル基、Ｎ−アル
キルスルファモイル、Ｎ．Ｎ−ジアルキルスルファモイ
ル、Ｎ−アリールスルファモイル、Ｎ−アルキル−Ｎ−
アリールスルファモイルのような相当するスルファモイ
ル基が挙げられる。一般式（Ｉ−ｃ）で表わされる代表
的なものとしては、次のようなものを挙げることができ
る。Examples of R3 in formula (I-c) include N-alkylcarbamoyl, N,N-dialkylcarbamoyl, N-7
enylcarbamoyl, N-arylcarbamoyl, N-
Corresponding carbamoyl groups such as alkyl-N-arylcarbamoylrubamoyl, N-alkylsulfamoyl, N. N-dialkylsulfamoyl, N-arylsulfamoyl, N-alkyl-N-
Corresponding sulfamoyl groups such as arylsulfamoyl are mentioned. Representative examples of the general formula (I-c) include the following.
■
一口
ｎ■
式中Ｒ６は置換若しくは非置換の第一級〜第三級アルキ
ル基、置換若しくは非置換のアリール基、複素環基、置
換若しくは非置換のアミノ基、アルキルカルボンアミド
基、アリールカルボンアミド基、スルホンアミド基、ア
ルキルスルファモイル基又はアリールスルファモイル基
又はカルバモイル基を示し、Ｒ７、Ｒ６及びＲ３はＲ６
で定義した基の他に、ハロゲン又はアルコキシ基を示す
。また、Ｒ８とＲｇとでピリジン環、ビロール環、ピリ
ドン環、オキサジン環のような複素溝を形成してもよい
。式（Ｉ−ｄ）におけるＲ６−Ｒ９の例としては、メチ
ル、エチル、プロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ヘキ
シル、２−ヒドロキシエチル、２−フェニルエチルのよ
ウナ相当スるアルキル基、ナフチル、フェニル、２．４
゜６−ドリクロロフエニル、２−クロロ−４，６−シメ
チルフエニル、２．６−ジクロロ−４−メトキシフェニ
ル、４−アルキルアミノフェニル、４−トリフルオロメ
チルフェニル、３．５−ジブロモフェニル、４−カルボ
キシフェニル、２−メチルフェニル、４−スルファモイ
ルフェニル、３．５−ジカルボキシフェニル、４−スル
ホフェニル基のような相当するアリール基、複素原子と
して窒素又は酸素を含む５及び／又は６員の複素環基、
例えば、キノリニル、ピリジル、ベンゾフラニル、オキ
サシリルのような複素環基、アミノ、アルキルアミノ、
了り−ルアミノのような相当する了ミノ基が挙げられる
。■ Sip n ■ In the formula, R6 is a substituted or unsubstituted primary to tertiary alkyl group, a substituted or unsubstituted aryl group, a heterocyclic group, a substituted or unsubstituted amino group, an alkylcarbonamide group, an arylcarbonyl group. represents an amide group, a sulfonamide group, an alkylsulfamoyl group, an arylsulfamoyl group, or a carbamoyl group, and R7, R6 and R3 are R6
In addition to the groups defined above, it also represents halogen or alkoxy groups. Furthermore, R8 and Rg may form a complex groove such as a pyridine ring, virol ring, pyridone ring, or oxazine ring. Examples of R6-R9 in formula (I-d) include alkyl groups equivalent to una such as methyl, ethyl, propyl, n-butyl, t-butyl, hexyl, 2-hydroxyethyl, and 2-phenylethyl; naphthyl; , phenyl, 2.4
゜6-Dolichlorophenyl, 2-chloro-4,6-dimethylphenyl, 2.6-dichloro-4-methoxyphenyl, 4-alkylaminophenyl, 4-trifluoromethylphenyl, 3.5-dibromophenyl, 4- Corresponding aryl groups such as carboxyphenyl, 2-methylphenyl, 4-sulfamoylphenyl, 3,5-dicarboxyphenyl, 4-sulfophenyl groups, 5- and/or 6-membered containing nitrogen or oxygen as heteroatom heterocyclic group,
For example, heterocyclic groups such as quinolinyl, pyridyl, benzofuranyl, oxacylyl, amino, alkylamino,
Corresponding ryomino groups such as ryamino are mentioned.
一般式（Ｉ−ｄ）で表わされる代表的なものとしては次
のようなものを挙げることができる。Representative examples of the general formula (I-d) include the following.
■
〜ｄ−１
Ｎ
Ｃ，Ｒ３
Ｉ −ｄ−５
Ｈ
その他の活性メチレン基含有化合物としてはアセチルア
セトンのような１．３−ジケトンやＴシル酢酸エステル
類が挙げられる。(2) ~d-1 N C, R3 I -d-5 H Other active methylene group-containing compounds include 1,3-diketones such as acetylacetone and T-syl acetate esters.
一般式〔Ｉ〕のＡｒの例としては置換基を有してもよい
ベンゼン環含有基、若しくはナフタレン環含有基が挙げ
られる。置換基としては、上記Ｘの説明で記載した基が
挙げられる。Ｒの例としては炭素数１〜８個を有する、
分岐又は置換基を有してもよいアルキル基が挙げられる
。Examples of Ar in general formula [I] include a benzene ring-containing group that may have a substituent or a naphthalene ring-containing group. Examples of the substituent include the groups described in the explanation of X above. Examples of R have 1 to 8 carbon atoms,
Examples include alkyl groups that may be branched or have substituents.
次に一般式〔Ｉ〕で表わされる本発明に係る化合物の代
表的具体例を示すが、本発明に用いられる化合物はこれ
らに限定されるものではない。Next, typical examples of the compound according to the present invention represented by the general formula [I] will be shown, but the compounds used in the present invention are not limited to these.
本発明において使用し得る芳香族第一級アミン化合物と
しては、〇−又はｐ−アミノフェノール系化合物及び〇
−又はｐ−フェニレンジアミン系化合物及びそれらの塩
が挙げられる。Examples of aromatic primary amine compounds that can be used in the present invention include 〇- or p-aminophenol compounds, 〇- or p-phenylenediamine compounds, and salts thereof.
好ましくはｐ−フェニレンジアミン系化合物であり下記
一般式ＣＩ［］で示されるものである。Preferred is a p-phenylenediamine compound represented by the following general formula CI [].
式中、Ａ及びＢは水素又はアルキル基を表わし、ＡとＢ
は窒素原子と共に複素環を形成してもよく、ＤＳＥ、Ｇ
’及びＪは水素、ハロゲン、ヒドロキシ基、アミノ基、
アルコキシ基、アシルアミド基、アリールスルホンアミ
ド基、アルキルスルホンアミド基又はアルキル基を表わ
す。In the formula, A and B represent hydrogen or an alkyl group, and A and B
may form a heterocycle with a nitrogen atom, DSE, G
' and J are hydrogen, halogen, hydroxy group, amino group,
It represents an alkoxy group, an acylamido group, an arylsulfonamide group, an alkylsulfonamide group, or an alkyl group.
Ａ及びＢで表わされるアルキル基としては、炭素数１〜
６のものが好ましく、特に１〜４のものが好ましい。例
えばメチル基、エチル基、ブチル基を挙げることができ
る。これらのアルキル基は置換基を有していてもよく置
換基としては、例えばウレイド基、テトラヒドロフリル
基、カルボキシル基、メタンスルホンアミド基、スルホ
基、メトキシ基、エトキシ基、メトキシエトキシ基、メ
トキシエトキシエトキシ基、メトキシテトラエトキシ基
が挙げられる。The alkyl group represented by A and B has 1 to 1 carbon atoms.
6 is preferred, and 1 to 4 are particularly preferred. Examples include methyl group, ethyl group, and butyl group. These alkyl groups may have a substituent, and examples of the substituent include a ureido group, a tetrahydrofuryl group, a carboxyl group, a methanesulfonamide group, a sulfo group, a methoxy group, an ethoxy group, a methoxyethoxy group, and a methoxyethoxy group. Examples include ethoxy group and methoxytetraethoxy group.
Ｄ、Ｇ及びＪとしては水素、アルコキシ基及びアルキル
スルホンアミド基、アリールスルホンアミド基が好まし
く、更に好ましくは水素である。Ｅとしては水素、アル
キル基、アシルアミド基が好ましく、より好ましくは炭
素数１〜３のアルキル基特にメチル基である。また、般
式〔■〕で示される化合物の塩としてはｐトルエンスル
ホン酸、スルホン酸、スルフィン酸、硫酸エステル、ス
ルファミン酸、チオ硫酸Ｓ−エステル、カルボン酸、リ
ン酸エステル、アミドリン酸、リン酸、亜リン酸エステ
ル、有機ホウ素化合物、塩酸及び硫酸等の有機酸又は無
機酸の塩を挙げることができ、特にｐ−）ルエンスルホ
ン酸塩、塩酸塩及び硫酸塩が好ましい。D, G and J are preferably hydrogen, an alkoxy group, an alkylsulfonamide group, or an arylsulfonamide group, and more preferably hydrogen. E is preferably hydrogen, an alkyl group or an acylamido group, more preferably an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, especially a methyl group. In addition, as salts of the compound represented by the general formula [■], p-toluenesulfonic acid, sulfonic acid, sulfinic acid, sulfuric acid ester, sulfamic acid, thiosulfuric acid S-ester, carboxylic acid, phosphoric acid ester, amidophosphoric acid, phosphoric acid , phosphorous acid esters, organic boron compounds, salts of organic or inorganic acids such as hydrochloric acid and sulfuric acid, and p-)luenesulfonates, hydrochlorides and sulfates are particularly preferred.
以下に本発明に係る芳香族第一級アミン化合物の代表的
具体例を示すが、本発明はこれに限定されるものではな
い。Typical examples of the aromatic primary amine compound according to the present invention are shown below, but the present invention is not limited thereto.
例示化合物
（ＩＩ−１）Ｎ、Ｎ−ジエチル−３−メチル−４＝アミ
ノアニリン
（ｎ−２）Ｎ、Ｎ−ジエチル−４−アミノアニリン
（ＩＩ−３）Ｎ−カルバミドメチル−Ｎ−メチル４−ア
ミノアニリン
（ＩＩ−４）Ｎ−カルバミドメチル−Ｎ−テトラヒドロ
フルフリル−３−メチル−４−アミノアニリン
（ｎ−５）Ｎ−エチル−Ｎ−力ルボキシメチル３−メチ
ル−４−アミノアニリン
（ＩＩ−６）Ｎ−カルバミドメチル−Ｎ−エチル３−メ
チル−４−アミノアニリン
（ＩＩ−７）Ｎ−エチル−Ｎ−テトラヒドロフルフリル
−３−メチル−４−アミノフェノール（ＩＩ−８）３−
アセチルアミノ−４−アミノジメチルアニリン
（ｎ−９）Ｎ−エチル−Ｎ−β−メタンスルホンアミド
エチル−４−アミノアニリン
（Ｉ［−１Ｏ）Ｎ−エチル−Ｎ−β−メタンスルホンア
ミドエチル−３−メチル−４−了ミノアニリ ン
（ＩＩ−１１）Ｎ−メチル−Ｎ−β−スルホエチル−ｐ
−フェニレンジアミン
（ｎ−１２）Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキシエチル３−メ
チル−４−アミノアニリン
（ＩＩ−１３）Ｎ−エチル−Ｎ−［２−（２−メトキシ
エトキシ）エチルクー３−メチル−４−アミノアニリン
（ｎ−１４）Ｎ−エチル−Ｎ−（２−［２−（２−メト
キシエトキシ）エトキシ〕エチル）−３−メチル−４−
アミノアニリン
（ｎ−１５）Ｎ−エチル−Ｎ−［２−［２−［２−［２
−（２−メトキシエトキシエトキシ）エトキシ］エトキ
シ〕エトキシ）エチルツー３メチルー４−アミノアニリ
ン
１６） Ｎ、 Ｎ−ジエチル−３−メタンスルホンアミ
ドエチル−４−了ミノアニリン。Exemplary compound (II-1) N, N-diethyl-3-methyl-4 = aminoaniline (n-2) N, N-diethyl-4-aminoaniline (II-3) N-carbamidomethyl-N-methyl 4 -Aminoaniline (II-4) N-carbamidomethyl-N-tetrahydrofurfuryl-3-methyl-4-aminoaniline (n-5) N-ethyl-N-carboxymethyl 3-methyl-4-aminoaniline (II -6) N-carbamidomethyl-N-ethyl 3-methyl-4-aminoaniline (II-7) N-ethyl-N-tetrahydrofurfuryl-3-methyl-4-aminophenol (II-8) 3-
Acetylamino-4-aminodimethylaniline (n-9) N-ethyl-N-β-methanesulfonamidoethyl-4-aminoaniline (I[-1O) N-ethyl-N-β-methanesulfonamidoethyl-3 -Methyl-4-minoaniline (II-11) N-methyl-N-β-sulfoethyl-p
-phenylenediamine (n-12) N-ethyl-N-hydroxyethyl 3-methyl-4-aminoaniline (II-13) N-ethyl-N-[2-(2-methoxyethoxy)ethyl-3-methyl-4 -aminoaniline(n-14)N-ethyl-N-(2-[2-(2-methoxyethoxy)ethoxy]ethyl)-3-methyl-4-
Aminoaniline (n-15)N-ethyl-N-[2-[2-[2-[2
-(2-Methoxyethoxyethoxy)ethoxy]ethoxy]ethoxy)ethyl-3methyl-4-aminoaniline 16) N,N-diethyl-3-methanesulfonamidoethyl-4-reminoaniline.
本発明に係る過酸化作用を有する物質としては、種々の
ものを用いることができるが、代表的なものとして例え
ば、ペルオキシダーゼが挙げられる。ペルオキシダーゼ
は、過酸化水素が別の物質を酸化する際の反応を触媒す
る酵素である。このペルオキシダーゼは一般に鉄ポルフ
ィリンを含有する複合タンパクであり、西洋わさび、じ
ゃがいも、いちじくの樹液、カブラ（植物のペルオキシ
ダーゼ）、牛乳（ラクトペルオキシダーゼ）及び白血球
（ベルドペルオキシダーゼ）中に存在し、また微生物中
にも存在し、抽出又は発酵により得ることができる。Various substances can be used as the substance having a peroxidizing effect according to the present invention, and a typical example thereof includes peroxidase. Peroxidase is an enzyme that catalyzes the reaction in which hydrogen peroxide oxidizes another substance. This peroxidase is a complex protein that generally contains iron porphyrin and is present in horseradish, potato, fig sap, turnip (plant peroxidase), milk (lactoperoxidase), and white blood cells (berdoperoxidase), and in microorganisms. Also exists and can be obtained by extraction or fermentation.
また、［アクタ・ケミ力・スカンジナビ力、（＾ｃｔａ
Ｃｈｅｍ、 ５ｃａｎｄ、）第４巻、第４２２〜４３
４頁、１９５０年、セオレル（Ｔｈｅｏｒｅｌｌ）及び
メーリイ（Ｍａ−ｅｈｌｙ）著」に開示されているよう
な合成ペルオキシダーゼも本発明において用いることが
でき（■
る。ペルオキシダーゼのばかメトヘモグロビン、オキシ
ヘモグロビン、ヘモグロビン、アルカリ性ヘマチン、ヘ
ミン及びヘミン誘導体等も本発明において用いることが
できる。Also, [Actor, Chemi-force, Scandinavian force, (^cta
Chem, 5cand,) Volume 4, Nos. 422-43
Synthetic peroxidases can also be used in the present invention, such as those disclosed in Theorell and Ma-ehly, 1950, page 4. , alkaline hematin, hemin and hemin derivatives, etc. can also be used in the present invention.
酵素以外に過酸化作用を示すものとして、例えばチオシ
アン酸鉄、スズ酸鉄、フェロシアン酸第１鉄、シリカゲ
ルに吸着させた第ニクロム塩（例えば硫酸クロムカリウ
ム）等も用いることができる。In addition to enzymes, substances exhibiting a peroxidizing effect such as iron thiocyanate, iron stannate, ferrous ferrocyanate, and nichrome salts adsorbed on silica gel (eg, potassium chromium sulfate) can also be used.
これらのうちでは、ペルオキシダーゼが好ましい。Among these, peroxidase is preferred.
本発明の試薬を用いる分析方法において、過酸化水素又
は過酸化水素を生成する物質の作用により生成した過酸
化水素は、過酸化作用を有する物質の作用により、芳香
族第一級アミン化合物を酸化する。その結果生成した芳
香族第一級アミン化合物の酸化体が本発明に係る一般式
〔Ｉ〕で表わされる化合物とカップリング反応して、色
素を形成する。生成される色素は、５００〜７００ ｎ
ｍに主たる可視吸収を有し、極めて高感度に発色を呈す
る。In the analytical method using the reagent of the present invention, hydrogen peroxide produced by the action of hydrogen peroxide or a substance that produces hydrogen peroxide oxidizes an aromatic primary amine compound by the action of a substance that has a peroxidizing action. do. The resulting oxidized aromatic primary amine compound undergoes a coupling reaction with the compound represented by the general formula [I] according to the present invention to form a dye. The pigment produced is 500-700 n
It has major visible absorption in m, and exhibits color development with extremely high sensitivity.
生成した色素についての情報は、目視にて、若しくは技
術的に公知な方法例えば分光光度計を用いて読み取るこ
とができる。また、適当な有機溶剤を加え、色素を溶解
した後、情報を読み取っても良い。Information about the pigment produced can be read visually or using methods known in the art, such as a spectrophotometer. Alternatively, the information may be read after adding a suitable organic solvent to dissolve the dye.
本発明の上記分析方法は、例えば次のように実施するこ
とができる。The above analysis method of the present invention can be carried out, for example, as follows.
流体試料に一般式〔Ｉ〕で表わされる化合物、芳香族第
一級アミン化合物、及び反応触媒として、過酸化作用物
質を同時に、又は適宜の順序で添加し、混合物を４℃か
ら４０℃、好ましくは２０℃から４０℃の範囲の温度及
びｐＨ３，０から９．０、好ましくはｐｉ（４，５から
８．０の範囲において１分から６０分の時間範囲にお
いて発色反応を行い、生成した色素を含有する反応混合
物の吸光度を測定する。A compound represented by general formula [I], an aromatic primary amine compound, and a peroxidizing substance as a reaction catalyst are added to the fluid sample simultaneously or in an appropriate order, and the mixture is heated at 4°C to 40°C, preferably. The coloring reaction is carried out at a temperature in the range of 20°C to 40°C and a pH of 3.0 to 9.0, preferably in the range of pi (4.5 to 8.0) for a time range of 1 minute to 60 minutes, and the resulting pigment is The absorbance of the containing reaction mixture is measured.
本発明方法は、過酸化水素の微量定量に特に有用である
。流体試料中の過酸化水素濃度は、全発色反応溶液中に
おいて、０．０１〜２００μｇ／ｄであることが好まし
い。The method of the invention is particularly useful for trace determination of hydrogen peroxide. The hydrogen peroxide concentration in the fluid sample is preferably 0.01 to 200 μg/d in the total color reaction solution.
この範囲の過酸化水素濃度において、一般式〔Ｉ〕で表
わされる化合物は、０．１０〜１００μｍｏｌｅ／ｒｎ
ｌ、芳香族第一級アミン化合物は、０、１０〜１０ 、
ｕｍｏｌｅ／ ｍｌ、過酸化作用物質、好ましくはペル
オキシダーゼであるが、０．０１〜１００車位／−の量
で用いられることが好ましい（全発色反応溶液中におい
て）。In this range of hydrogen peroxide concentration, the compound represented by general formula [I] has a concentration of 0.10 to 100 μmole/rn
l, aromatic primary amine compound is 0, 10-10,
umole/ml, the peroxidizing agent, preferably peroxidase, is preferably used in an amount of 0.01 to 100 mol/ml (in the total color reaction solution).
一般式〔Ｉ〕で表わされる化合物は、少量の親水性の有
機溶剤例えばメタノール、エタノーノベＮ、Ｎ−ジメチ
ルホルムアミド（ＩＩＭＦ）等に溶解して加えてもよい
。一般式〔Ｉ〕で表わされる化合物と芳香族第一級アミ
ン化合物とのモル比は１対１００から１００対１が適当
であり、１対１０から１０対１が好ましい。The compound represented by the general formula [I] may be added after being dissolved in a small amount of a hydrophilic organic solvent such as methanol, ethanol, N-dimethylformamide (IIMF), or the like. The molar ratio of the compound represented by the general formula [I] to the aromatic primary amine compound is suitably from 1:100 to 100:1, preferably from 1:10 to 10:1.
また、本発明の分析方法においては、発色試薬として一
般式ＣＩ］で表わされる化合物、芳香族第一級アミン化
合物及び過酸化作用物質のほかに、過酸化水素を生成す
る物質を組合せることにより、最終的に分析すべき物質
を該物質の作用によって過酸化水素に導くことにより、
目的とする種々の物質の分析が可能となる。In addition, in the analytical method of the present invention, in addition to a compound represented by the general formula CI, an aromatic primary amine compound, and a peroxidizing substance as a coloring reagent, a substance that generates hydrogen peroxide is used in combination. , by ultimately converting the substance to be analyzed into hydrogen peroxide through the action of the substance,
It becomes possible to analyze various target substances.
この方法によって、分析が可能となる生物学的流体試料
中の物質としては、グルコース、コレステロール、尿酸
、クレアチニン、トリグリセリド、乳酸、遊離脂肪酸、
グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＵＴ
） グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（Ｇ
ＰＴ） コリンエステラーゼ、クレアチンホスホキナ
ーゼ、乳酸脱水素酵素などが挙げられる。Substances in biological fluid samples that can be analyzed by this method include glucose, cholesterol, uric acid, creatinine, triglycerides, lactic acid, free fatty acids,
Glutamate oxaloacetate transaminase (GUT)
) Glutamate pyruvate transaminase (G
PT) Cholinesterase, creatine phosphokinase, lactate dehydrogenase, etc.
こｔらの分析に用いる該物質としては、例えば、グルコ
ースオキシダーゼ゛、ウリカーゼ、コレステロールオキ
シダーゼ°、グリセロールオキシダーゼ、グリセリン−
３−リン酸オキシダーゼ、サルコシンオキシダーゼ、ピ
ルビン酸オキシダーゼ、Ｄ−アスパラギン酸オキシダー
ゼ、Ｄ（又はＬ）−アミノ酸オキシダーゼ、Ｌ−グロノ
−Ｔ−ラクトンオキシダーゼ、Ｌ−ソルボースオキシダ
ーゼ、Ｌ−２−ヒドロキシ酸オキシダーゼ、６−ヒドロ
キシ−Ｄ−ニコチンオキシダーゼ、６−ヒドロキシ−し
−ニコチンオキシダーゼ、ピリドキサミンリン酸オキシ
ダーゼ、ピリドキシンオキシダーゼ、ヘキソースオキシ
ダーゼ、○−アミノフェノールオキシダーゼ、アミンオ
キシダーゼ（ピリドキサール含有、又はフラビン含有）
キサンチンオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、
エタノールアミンオキシダーゼ Ｎ６−メチル−Ｌ −
ＩＪレシンキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、アシルＣ
ｏＡオキシダーゼ、亜硫酸オキシダーゼ等の種々のもの
が挙げられる。Examples of the substances used in these analyzes include glucose oxidase, uricase, cholesterol oxidase, glycerol oxidase, and glycerin.
3-phosphate oxidase, sarcosine oxidase, pyruvate oxidase, D-aspartate oxidase, D (or L)-amino acid oxidase, L-gulono-T-lactone oxidase, L-sorbose oxidase, L-2-hydroxy acid oxidase, 6-hydroxy-D-nicotine oxidase, 6-hydroxy-nicotine oxidase, pyridoxamine phosphate oxidase, pyridoxine oxidase, hexose oxidase, ○-aminophenol oxidase, amine oxidase (pyridoxal-containing or flavin-containing)
xanthine oxidase, alcohol oxidase,
Ethanolamine oxidase N6-methyl-L-
IJ resinoxidase, choline oxidase, acyl C
Various examples include oA oxidase and sulfite oxidase.
これらの該物質は、いずれの起源のものを用いてもよく
、固体粉末の形でも溶液として用いてもよい。These substances may be of any origin and may be used in solid powder form or as a solution.
該物質を用いる場合は、過酸化水素を前もって発生させ
ておいてもよいが、過酸化水素の生成反応と発色反応を
同時に進行させることが好ましい。When using this substance, hydrogen peroxide may be generated in advance, but it is preferable that the hydrogen peroxide production reaction and the coloring reaction proceed simultaneously.
該物質を発色試薬溶液に添加する時期は、任意であって
よく、使用量はその種類、目的とする基質に応じて任意
に選択される。The timing of adding the substance to the coloring reagent solution may be arbitrary, and the amount used is arbitrarily selected depending on the type and target substrate.
更に、本発明の他の実施の例として、一般式ＣＩＩで表
わされる化合物、芳香族第一級アミン化合物、及び過酸
化作用物質を含有させた分析素子を挙げることができる
。Further, as another embodiment of the present invention, there may be mentioned an analytical element containing a compound represented by the general formula CII, an aromatic primary amine compound, and a peroxidizing substance.
本発明の分析素子は、分析に必要な試薬が素子中に乾燥
状態で組込まれた乾式タイプのものをいう。これらの分
析素子としては、単層のもので試薬を担持する層の材料
としてろ紙、メンブランフィルタ−等を用いるもの（特
公昭３６−４１９８号、米国特許３．６０７．０９３号
等）、また、単なる積層やはく離を前提とした非一体型
多層分析素子としてガラスフィルターやメンブランフィ
ルタ−を用いたり（特開昭４９−１１３９５号） ２
枚のろ紙の上に網をかけたもの（特開昭５４−１５１０
９６号、米国特許３，５２６、４８０号）等が挙げられ
る。The analytical element of the present invention is of a dry type in which reagents necessary for analysis are incorporated into the element in a dry state. These analytical elements include single-layered ones that use filter paper, membrane filters, etc. as the material for the reagent-supporting layer (Japanese Patent Publication No. 36-4198, U.S. Patent No. 3.607.093, etc.); Glass filters and membrane filters are used as non-integral multilayer analysis elements based on simple lamination or peeling (Japanese Patent Application Laid-open No. 11395/1983) 2
A piece of filter paper covered with a net (Japanese Patent Application Laid-open No. 1510-1989)
No. 96, U.S. Patent No. 3,526, 480), and the like.
更に本発明の分析素子として、好ましくは、液体不浸透
性、光透過性支持体上に少なくとも１つの試薬層及び多
孔性展開層を有する一体型多層分析素子（特公昭５３−
２１６７７号、特開昭５５−１６４３５９号、同５５−
９０８５９号、同５７−１９７４６６号、同５７−１０
１７６０号、同５７−１０１７６１号、同５８−９０１
６７号等）が挙げられる。Furthermore, the analytical element of the present invention is preferably an integrated multilayer analytical element having at least one reagent layer and a porous spreading layer on a liquid-impermeable, light-transmitting support
No. 21677, JP-A-55-164359, JP-A-55-164359
No. 90859, No. 57-197466, No. 57-10
No. 1760, No. 57-101761, No. 58-901
67 etc.).
上記試薬層は水溶性ポリマー又は親水性かつ有機溶媒可
溶性のポリマーをバインダとして支持体上に塗布するこ
とによって層として設けることができる。水溶性ポリマ
ーバインダとしてはゼラチン、フタル化ゼラチン等のゼ
ラチン誘導体、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキ
シメチルセルロースナトリウム塩等の水溶性セルロース
誘導体、ポリビニルアルコール１．ポリ（Ｎ−ビニルピ
ロリドン） ポリアクリルアミド、ポリメタクリルア
ミド、アクリルアミドとアクリル酸エステルの共重合体
、ポリ （モノ又はジアルキル置換）アクリルアミド、
ポリ （モノ又はジアルキル置換）メタクリルアミド及
びこれらの水溶性共重合体等が挙げられ、好ましくはゼ
ラチン、ポリアクリルアミド及びアクリルアミドとアク
リル酸エステルの共重合体が用いられる。親水性かつ有
機溶媒可溶性ポリマーバインダとしては、ポリ （Ｎ−
ビニルピロリドン） ポＩＪ（Ｎ−ビニルイミダゾール
） ポリ（Ｎ−ビニルトリアゾール）及びこれらの誘導
体又はそれらの共重合体、エチルセルロース、メチルセ
ルロース等のセルロース誘導体等が挙げられる。これら
のポリマーバインダは主としてアルコール類、例えばエ
タノール、プロパ７／−ル、ブタノール等に溶解し且つ
親水性の高分子物質である。The reagent layer can be provided as a layer by applying a water-soluble polymer or a hydrophilic and organic solvent-soluble polymer as a binder onto the support. Water-soluble polymer binders include gelatin, gelatin derivatives such as phthalated gelatin, water-soluble cellulose derivatives such as hydroxyethyl cellulose and carboxymethyl cellulose sodium salt, polyvinyl alcohol. Poly(N-vinylpyrrolidone) polyacrylamide, polymethacrylamide, copolymer of acrylamide and acrylic acid ester, poly(mono- or dialkyl-substituted) acrylamide,
Examples include poly(mono- or dialkyl-substituted) methacrylamide and water-soluble copolymers thereof, and preferably gelatin, polyacrylamide, and copolymers of acrylamide and acrylic ester are used. As a hydrophilic and organic solvent soluble polymer binder, poly(N-
Poly(N-vinyltriazole), derivatives thereof or copolymers thereof, cellulose derivatives such as ethylcellulose and methylcellulose, and the like can be mentioned. These polymer binders are mainly hydrophilic polymeric substances that are soluble in alcohols such as ethanol, propyl, butanol, and the like.
上記ポリマーバインダは、選ばれる特定成分及びその分
析反応によって任意に選ぶことができる。また、選ばれ
る分析反応が２種以上の試薬から構成されている場合、
この試薬を同一試薬層内に一緒に混合して含有させても
、また、２種以上の試薬を２つ又はそれ以上の別々の試
薬層として含有させてもよい。これらは分析反応自体の
作用機構によって決定されることもあり、好ましくない
影響を及ぼさない限りにおいて、その構成は任意である
。The above polymer binder can be arbitrarily selected depending on the specific component selected and its analytical reaction. In addition, if the selected analytical reaction is composed of two or more types of reagents,
The reagents may be contained mixed together in the same reagent layer, or two or more reagents may be contained in two or more separate reagent layers. These may be determined by the mechanism of action of the analytical reaction itself, and their configuration is arbitrary as long as it does not have an undesirable effect.
上記試薬層の膜厚は所望に応じて任意に選択することが
可能であるが、好ましくは１〜２００μｍ１更に好まし
くは５〜１００μｍである。The thickness of the reagent layer can be arbitrarily selected as desired, but is preferably 1 to 200 μm, and more preferably 5 to 100 μm.
上記多孔性展開層は、（１）一定容量の流体試料を単位
面積当り試薬層に均一に配布する機能を有するものであ
る。その上、更に、特公昭５３−２１６７７号公報に記
載された性能、すなわち、（２）流体試料中の分析反応
を阻害する物質又は要因を除去する機能及び／又は（３
）分光光度分析を行うときに支持体を経て透過する測定
光を反射するバックグランド作用を行う機能を有するも
のであれば好ましい。したがって、本発明に係る多孔性
展開層は、上記（１）の機能のみを有する層、（１）に
加えて（２）及び／又は（３）の機能を併せて有する層
のいずれかとすることができ、あるいは（１）を包含す
る複数の機能を適宜分離し、各機能ごとに別の層を使用
することも可能である。更に（１）、（２）及び（３〕
の機能のうち、２つの機能を有する層と、残りの１つの
機能を有する層を組合せて使用することもできる。例え
ば、前述の特公昭５３−２１６７７号公報に記載された
二酸化チタン及び二酢酸セルロースから成るプラッシュ
ポリマーと呼称される非繊維多孔質媒体の展開層、特開
昭５５−１６４３５６号公報に記載された親水化処理し
た織物の展開層、特開昭５７−９４６５８号、同５７−
１２８４７号、同５７−１９７４６６号及び同５８−７
０１６１号の各公報等に記載された繊維構造展開層、特
開昭５８−９０１６７号公報に記載された粒子結合体構
造展開層が挙げられる。特に、上記繊維構造展開層及び
粒子結合体構造展開層は、血球部分も速やかに移送する
ことが可能な素材として特に有用である。本発明の分析
素子における展開層の膜厚は、その空隙率によって決定
されるべきであるが、好ましくは約１００〜６００μｍ
、更に好ましくは約１５０〜４００μｍである。また、
空隙率は好ましくは約２０〜８５％である。The porous spreading layer has the function of (1) uniformly distributing a fixed volume of fluid sample to the reagent layer per unit area; Moreover, the performance described in Japanese Patent Publication No. 53-21677, namely (2) the ability to remove substances or factors that inhibit analytical reactions in fluid samples, and/or (3)
) It is preferable that it has the function of performing a background effect of reflecting measurement light transmitted through the support when performing spectrophotometric analysis. Therefore, the porous development layer according to the present invention may be either a layer having only the function (1) above, or a layer having functions (2) and/or (3) in addition to (1). Alternatively, it is also possible to separate a plurality of functions including (1) as appropriate and use a separate layer for each function. Furthermore, (1), (2) and (3)
It is also possible to use a combination of a layer having two of the functions and a layer having the remaining one function. For example, the spread layer of a non-fibrous porous medium called a plush polymer consisting of titanium dioxide and cellulose diacetate is described in the above-mentioned Japanese Patent Publication No. 53-21677; Developing layer of hydrophilized fabric, JP-A No. 57-94658, No. 57-
No. 12847, No. 57-197466 and No. 58-7
Examples include the fiber structure spreading layer described in each publication such as No. 0161, and the particle bond structure spreading layer described in JP-A-58-90167. In particular, the fiber structure spreading layer and particle combination structure spreading layer are particularly useful as materials capable of rapidly transporting blood cell portions. The thickness of the spreading layer in the analytical element of the present invention should be determined by its porosity, but is preferably about 100 to 600 μm.
, more preferably about 150 to 400 μm. Also,
The porosity is preferably about 20-85%.
上記多孔性展開層には、選ばれる特定成分及びその分析
反応によっては、前述の試薬層の場合と同様、流体試料
中の特定成分と直接的又は間接的に関与する試薬を含有
することができる。Depending on the specific component selected and its analytical reaction, the porous spreading layer can contain a reagent that directly or indirectly interacts with the specific component in the fluid sample, as in the case of the reagent layer described above. .
また他の付加的な添加剤として、例えば保恒剤、界面活
性剤等、種々の添加剤も所望に応じて添加することもで
きる。Furthermore, various other additives such as preservatives and surfactants may also be added as desired.
特に界面活性剤は、流体試料を本発明の分析素子に適用
した際の浸透速度の調節等有効に用いることができる。In particular, surfactants can be effectively used to adjust the permeation rate when a fluid sample is applied to the analytical element of the present invention.
使用可能な界面活性剤としては、イオン性（アニオン性
又はカチオン性）、非イオン性を問わず使用することが
可能であるが、非イオン性界面活性剤が有効である。非
イオン性界面活性剤の例としては、例えば２．５−ジ−
ｔ−ブチルフェノキシポリエチレングリコール、ｐ−オ
クチルフェノキシポリエチレングリコール、ｐイソノニ
ルフェノキシポリエチレングリコール等のアルキル置換
フェノールのポリアルキレングリコール誘導体、高級脂
肪酸のポリアルキレングリコールエステルなどが挙げら
れる。これらの界面活性剤は流体試料の試薬層への浸透
速度を調節し、同時に好ましくからざる「クロ７トグラ
フイー現象」発生を抑制する効果を有する。As usable surfactants, both ionic (anionic or cationic) and nonionic surfactants can be used, but nonionic surfactants are effective. Examples of nonionic surfactants include 2,5-di-
Examples include polyalkylene glycol derivatives of alkyl-substituted phenols such as t-butylphenoxypolyethylene glycol, p-octylphenoxypolyethylene glycol, p-isononylphenoxypolyethylene glycol, and polyalkylene glycol esters of higher fatty acids. These surfactants have the effect of regulating the rate of penetration of the fluid sample into the reagent layer and at the same time suppressing the occurrence of undesirable "chromatographies".
上記界面活性剤は広範囲に選択された量を用いることが
可能であるが、塗布液の重量に対して２５重量％〜０．
００５重量％、好ましくは１５重量％〜０．０５重量％
用いることができる。The surfactant can be used in an amount selected within a wide range, but ranges from 25% by weight to 0.5% by weight based on the weight of the coating solution.
0.05% by weight, preferably 15% to 0.05% by weight
Can be used.
上記の液体不浸透性の光透過性支持体（以下、本発明に
係る支持体と略す）は、液体不浸透性で、かつ光透過性
であればその種類を問わないが、例えば酢酸セルロース
、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート又は
ポリスチレンのような種々の重合体材料のみならず、ガ
ラスのごとき無機材料も用いることが可能である。The above-mentioned liquid-impermeable, light-transparent support (hereinafter referred to as the support according to the present invention) can be of any type as long as it is liquid-impermeable and light-transparent, but examples include cellulose acetate, Various polymeric materials such as polyethylene terephthalate, polycarbonate or polystyrene can be used, as well as inorganic materials such as glass.
本発明に係る支持体の厚さは任意であるが、好ましくは
５〜２５０μｍである。また、本発明に係る支持体の観
測側の一側面は、その目的に応じて任意に加工すること
が可能である。更に試薬層を積層する側の支持体面に、
場合によっては光透過性の下塗り層を使用して試薬と支
持体との接着性を改良することができる。Although the thickness of the support according to the present invention is arbitrary, it is preferably 5 to 250 μm. Further, one side surface of the observation side of the support according to the present invention can be arbitrarily processed depending on the purpose. Furthermore, on the side of the support on which the reagent layer will be laminated,
Optionally, a light-transparent subbing layer can be used to improve adhesion between the reagent and the support.
上記の一体型多層分析素子は必要に応じて、例えば米国
特許３．９９２．１５８号明細書記載の反射層、下塗り
層、米国特許４．０４２．３３５号明細書記載の放射線
ブロッキング層、米国特許４．０６６、４０３号明細書
記載のバリヤ層、米国特許４．１６６、０９３号明細書
記載のマイグレーション阻止層、特開昭５５−９０８５
９号公報記載のスカベンジャ層、及び米国特許４．１１
０．０７９号明細書記載の破壊性ポンド状部材等を任意
に組合せて本発明の目的に合せて任意の構成とすること
ができる。The above-mentioned integrated multilayer analytical element may include, if necessary, for example, a reflective layer as described in U.S. Pat. No. 3,992,158, an undercoat layer, a radiation blocking layer as described in U.S. Pat. Barrier layer described in U.S. Pat. No. 4.066,403, Migration prevention layer described in U.S. Pat. No. 4.166,093, JP-A-55-9085
Scavenger layer described in Publication No. 9 and US Pat. No. 4.11
The breakable pound-shaped members described in the specification of No. 0.079 can be arbitrarily combined to form an arbitrary configuration according to the object of the present invention.
これら分析素子の種々の層は、本発明に係る支持体上に
所望の構成に従い、従来写真工業において用いられてい
るスライドホッパ塗布法、押出し塗布法、浸漬塗布法等
を適宜選択して用い、順次積層することで任意の厚みの
層を塗設することができる。The various layers of these analytical elements are formed on the support according to the present invention by appropriately selecting the slide hopper coating method, extrusion coating method, dip coating method, etc. conventionally used in the photographic industry according to the desired configuration. By sequentially laminating layers, layers of arbitrary thickness can be applied.
本発明の一般式〔Ｉ〕で表わされる化合物を、本発明に
係る分析素子を形成するための液に添加する方法は、上
記化合物の化学構造等に応じて、適宜選択することがで
きる。例えば、水、緩衝剤水溶液、有機溶媒等に溶解し
て添加する方法、固体分散法、ラテックス分散法、氷中
油滴型乳化分散法等種々の方法を用いることができる。The method of adding the compound represented by the general formula [I] of the present invention to the liquid for forming the analytical element of the present invention can be appropriately selected depending on the chemical structure of the compound. For example, various methods can be used, such as a method in which the material is added after being dissolved in water, an aqueous buffer solution, an organic solvent, etc., a solid dispersion method, a latex dispersion method, an oil-in-ice emulsion dispersion method, and the like.
氷中油滴型乳化分散法は、従来写真工業において公知の
カプラー等の疎水性添加物を分散させる方法が適用でき
、通常、高沸点溶媒及び／又は低沸点溶媒に溶解し、ア
ニオン系界面活性剤及び／又はノニオン系界面活性剤を
含むゼラチン等の親水性コロイドを含む水溶液と混合し
、高速回転ミキサ、コロイドミル、フロージェットミキ
サ、超音波分散装置等で乳化分散して用いることができ
る。The oil-in-ice emulsion dispersion method can be applied to a method of dispersing hydrophobic additives such as couplers, which are conventionally known in the photographic industry, and are usually dissolved in a high-boiling point solvent and/or a low-boiling point solvent, and an anionic surfactant. And/or it can be mixed with an aqueous solution containing a hydrophilic colloid such as gelatin containing a nonionic surfactant, and emulsified and dispersed using a high-speed rotation mixer, colloid mill, flow jet mixer, ultrasonic dispersion device, etc. and used.
高沸点溶媒としては、例えば有機酸アミド類、カルバメ
ート類、エステル類、ケトン類、尿素誘導体等、特に、
ジ−ｎ−ブチルフタレート、トリクレジルホスフェート
、トリフェニルホスフェート、ジイソオクチルアジペー
ト、ジ−ｎ−ブチルセバケート、）！Ｊ−ｎ−ヘキシル
ホスフェ−）、Ｎ、Ｎ−ジエチルカプリルアミド、Ｎ、
Ｎ−ジエチルラウリルアミド、ｎ−ペンタデシルフェニ
ルエーテル、ジオクチルフタレート、ｎ−ノニルフェノ
ール、３−ペンタデシルフェニルエチルエーテル、２．
５−ジー５ｅＣ−アミルフェニルブチルエーテル、モノ
フエニルジ−Ｏ−クロロフェニルホスフェートあるいは
、フッ素化パラフィン等が挙げられる。これらの中でも
、ジアルキルフタレート特に炭素数１〜６のアルキル基
を有するものが好ましい。Examples of high boiling point solvents include organic acid amides, carbamates, esters, ketones, urea derivatives, etc.
Di-n-butyl phthalate, tricresyl phosphate, triphenyl phosphate, diisooctyl adipate, di-n-butyl sebacate, )! J-n-hexylphosphate), N,N-diethylcaprylamide, N,
N-diethyl laurylamide, n-pentadecyl phenyl ether, dioctyl phthalate, n-nonylphenol, 3-pentadecyl phenylethyl ether, 2.
Examples include 5-di5eC-amylphenylbutyl ether, monophenyl di-O-chlorophenyl phosphate, and fluorinated paraffin. Among these, dialkyl phthalates, particularly those having an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, are preferred.
低沸点溶媒としては、例えば、酢酸メチル、酢酸プロピ
ル、酢酸ブチル、プロピオン酸ブチル、シクロヘキサノ
ール、ジエチレングリコールモノアセテート、ニトロメ
タン、四塩化炭素、クロロホルム、シクロヘキサン、テ
トラヒドロフラン、メチルアルコール、アセトニトリル
、ＤＭＦ、ジオキサン、メチルエチルケトン等が挙げら
れる。Examples of low-boiling solvents include methyl acetate, propyl acetate, butyl acetate, butyl propionate, cyclohexanol, diethylene glycol monoacetate, nitromethane, carbon tetrachloride, chloroform, cyclohexane, tetrahydrofuran, methyl alcohol, acetonitrile, DMF, dioxane, and methyl ethyl ketone. etc.
アニオン系界面活性剤としては、例えばアルキルベンゼ
ンスルホン酸、アルキルナフタレンスルホン酸等が、ノ
ニオン系界面活性剤としては、例えばソルビタンセスキ
オレイン酸エステル、ソルビタンモノラウリン酸エステ
ル等カ挙げられる。Examples of anionic surfactants include alkylbenzenesulfonic acids and alkylnaphthalenesulfonic acids, and examples of nonionic surfactants include sorbitan sesquioleate and sorbitan monolaurate.
本発明の分析素子は、前記の過酸化作用を有する物質、
一般式〔ＩＪで表わされる化合物以外に、分析すべき成
分の種類に応じて、過酸化水素を生成する物質及び他の
酵素、基質、緩衝剤、保恒剤、界面活性剤、硬膜剤等の
種々の試薬を含有することができる。The analytical element of the present invention comprises the above-mentioned substance having a peroxidizing effect,
In addition to the compound represented by the general formula [IJ, depending on the type of component to be analyzed, substances that generate hydrogen peroxide, other enzymes, substrates, buffers, preservatives, surfactants, hardening agents, etc. can contain a variety of reagents.
本発明に係る過酸化作用を有する物質は広範囲に選択さ
れた量を用いることが可能であるが、例えばペルオキシ
ダーゼの場合は、１００〜１、０００．０００［Ｊ／ｍ
２、好ましくは１．０００〜１００．０ＯＯＵ／ｍ’の
範囲で用いることができる。The amount of the substance having a peroxidizing effect according to the present invention can be selected within a wide range, but for example, in the case of peroxidase, the amount of
2, preferably in the range of 1.000 to 100.0 OOU/m'.
前述したように、本発明の方法によれば、生成される色
素は、極めて高感度に発色を呈するために、本発明の分
析素子は、流体試料が例えば、人血清中の微量成分（例
えば、尿酸、クレアチニン、ＧＯＴ、ＧＰＴ等）に対し
ても鋭敏に対応し、微ｌ成分の定量に特に有用である。As mentioned above, according to the method of the present invention, the produced pigment exhibits color development with extremely high sensitivity. It also responds sensitively to uric acid, creatinine, GOT, GPT, etc., and is particularly useful for quantifying trace components.
本発明において、本発明に係る過酸化作用を有する物質
、一般式ＣＩ’ｌで表わされる化合物は、例えば、一体
型多層分析素子の場合、試薬層、多孔性展開層及びその
他の層のいずれの層に含有させることもできる。In the present invention, the substance having a peroxidizing effect according to the present invention, the compound represented by the general formula CI'l, may be used in any of the reagent layer, porous development layer, and other layers in the case of an integrated multilayer analytical element, for example. It can also be included in the layer.
本発明の分析素子を用いて、過酸化水素又は過酸化水素
を生成する物質を定量するに当っては、分析素子を流体
試料中に浸漬するか流体試料を分析素子上に滴下し、反
射スペクトロホトメ） ＩＪ−により初速変法又は反応
終点法に従って測定することができる。このようにして
得られた測定値は、あらかじめ作成しておいた検量線に
当てはめることで過酸化水素又は過酸化水素を生成する
物質の量を決定することができる。When quantifying hydrogen peroxide or a substance that generates hydrogen peroxide using the analytical element of the present invention, the analytical element is immersed in a fluid sample or the fluid sample is dropped onto the analytical element, and the reflection spectrometer is It can be measured by IJ- according to a modified initial velocity method or a reaction end point method. The amount of hydrogen peroxide or a substance that generates hydrogen peroxide can be determined by applying the measured value thus obtained to a calibration curve prepared in advance.
本発明の分析素子に適用される流体試料は生物学的、非
生物学的流体試料であれ、過酸化水素又は過酸化水素を
生成する物質を含むものであればよい。例えば、血液（
血漿・血清を含む）リンパ液、尿等が挙げられる。The fluid sample applied to the analytical element of the present invention may be a biological or non-biological fluid sample as long as it contains hydrogen peroxide or a substance that generates hydrogen peroxide. For example, blood (
Examples include lymph fluid (including plasma and serum), urine, etc.
また、用いる流体試料の量は、試験片の場合には試薬を
含む吸収性担体に流体試料が十分含浸される量以上であ
れば任意である。一方、体型多層分析素子の場合も任意
であるが、好ましくは約５０μｌ〜約５μｌであり、更
に好ましくは約２０μｌ〜約５μ！である。通常的１０
μｌの流体試料を適用することが好ましい。Further, in the case of a test piece, the amount of the fluid sample to be used is arbitrary as long as it is at least the amount that allows the absorbent carrier containing the reagent to be sufficiently impregnated with the fluid sample. On the other hand, in the case of a body type multilayer analytical element, the volume is optional, but preferably about 50 μl to about 5 μl, more preferably about 20 μl to about 5 μl! It is. normal 10
Preferably, μl of fluid sample is applied.
次に一般式〔Ｉ〕で表わされる化合物のうち代表的なも
のについて合成法を例示する。以下に具体的に示されて
いない化合物も合成例１〜２に準じて合成できる。Next, synthetic methods for typical compounds represented by the general formula [I] will be illustrated. Compounds not specifically shown below can also be synthesized according to Synthesis Examples 1 and 2.
合成例１ （例示化合物Ｉ−３の合成法）合成経路
Ｉ
＊（２）テトラヘドロン レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄ
ｒａｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ）第２８巻、第９号、第９３５
〜９３８頁（１９８７）記載の化合物
中間体（３）の合成方法
（１） ３．８ ｇと（２） ３．２ ｇをアセトン５
０ｍ１に溶解し、更に炭酸カリウム１．４ｇを添加し、
４時間加熱還流した。溶媒のアセトンのほぼ全量を減圧
留去して除いた後、酢酸エチル５０ｍｆ、水５０ｍ１を
加え、有機物を酢酸エチルで抽出した。Synthesis Example 1 (Method of Synthesizing Exemplary Compound I-3) Synthetic Route I *(2) Tetrahedron Letters
Ran Letters) Volume 28, No. 9, No. 935
- Synthesis method of compound intermediate (3) described on page 938 (1987) 3.8 g of (1) and 3.2 g of (2) were added to acetone 5
0ml and further added 1.4g of potassium carbonate,
The mixture was heated under reflux for 4 hours. After almost all of the acetone solvent was removed by distillation under reduced pressure, 50 mf of ethyl acetate and 50 ml of water were added, and the organic matter was extracted with ethyl acetate.
得られた酢酸エチル溶液を無水硫酸ナトリウムで乾煙し
た後、酢酸エチルを減圧留去したところ黄色油状物が得
られ、これをシリカゲルカラムクロマトグラフィーによ
り精製することにより淡黄色結晶の（３） ４．９ ｇ
を得た。After drying the obtained ethyl acetate solution with anhydrous sodium sulfate, ethyl acetate was distilled off under reduced pressure to obtain a yellow oil, which was purified by silica gel column chromatography to obtain pale yellow crystals (3) 4 .9 g
I got it.
［’ＨＮＭＲ、Ｆ Ｄマススペクトル、ＩＲにより（３
）であることを確Ｓ忍した。〕
例示化合物Ｉ−３の合成法
（３）０．２６ｇを０．２０ ｇのセンシトツクス（Ｓ
ＢＮＳＩＴＯＸ） Ｉを含む塩化メチレンとアセトンの
１＝１混合液１００ｍ１！に溶解し、−７８℃で１００
０Ｗの高圧ナトリウムランプを２時間照射した。センシ
トックスＩをろ別した後、溶媒を減圧留去し、得られた
生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精
製したところ淡黄色結晶の例示化合物Ｉ−３の０．２１
ｇを得た。['HNMR, FD mass spectrum, IR (3
). ] Synthesis method (3) of exemplified compound I-3 0.26 g was mixed with 0.20 g of Sensitox (S
BNSITOX) 100ml of a 1=1 mixture of methylene chloride and acetone containing I! 100 at -78℃
It was irradiated with a 0W high pressure sodium lamp for 2 hours. After Sensitox I was filtered off, the solvent was distilled off under reduced pressure, and the resulting product was purified by silica gel column chromatography.
I got g.
（’ＨＮＭＲ、Ｆ Ｄマススペクトル、ＩＲにより１−
３であることを確Ｓ忍した。）
合成例２ （例示化合物ｌ−１８の合成法）合成経路
Ｈ
中間体（５）の合成法
炭酸カリウム１．７ｇにメタノール４０ｍｊ２を加え加
熱溶解後、水冷下塩化第−銅５０■を加え１５分間かく
はんした。ここに（４） ’１．８ ｇとピリジン３０
−を加え２時間かくはんした後、反応液に水１００ｍ１
．酢酸エチル２００ｍ１を加え塩酸で酸性にして生成物
を酢酸エチル抽出した３この溶液を無水硫酸ナトリウム
で乾燥し、更に溶媒を減圧留去した後、シリカゲルカラ
ムクロマトグラフィーで精製することにより白色結晶の
（５） １．９ ｇを得た。('HNMR, FD mass spectrum, IR shows 1-
I was very sure that it was 3. ) Synthesis Example 2 (Synthesis method of exemplified compound 1-18) Synthesis route H Synthesis method of intermediate (5) Add 40 mj2 of methanol to 1.7 g of potassium carbonate and dissolve by heating. After cooling with water, add 50 μm of cupric chloride. Stir for a minute. Here (4) '1.8 g and pyridine 30
- was added and stirred for 2 hours, then 100ml of water was added to the reaction solution.
．． 200ml of ethyl acetate was added, acidified with hydrochloric acid, and the product was extracted with ethyl acetate.3 This solution was dried over anhydrous sodium sulfate, and after distilling off the solvent under reduced pressure, it was purified by silica gel column chromatography to obtain white crystals ( 5) 1.9 g was obtained.
［’ＨＮＭＲ、Ｆ Ｄマススペクトル、ＩＲにより（５
）であることを確認した。〕
例示化合物ｌ−１８の合成法
（５）０．２５ｇを０．２０ｇのセンシトツクス■を含
む塩化メチレンとアセトンの１＝１混合液１００７＋！
１７に溶解し、−７８℃で１００ＯＷの高圧ナトリウム
ランプを２時間照射した。センシトックス■をろ別した
後、溶媒を減圧留去し、得られた生成物をシリカゲルカ
ラムクロマトグラフィーにより精製したところ、白色結
晶の例示化合物■−１８の０．２０ ｇを得た。['HNMR, FD mass spectrum, IR (5
). ] Synthesis method of exemplified compound 1-18 (5) 0.25g to 1=1 mixed solution of methylene chloride and acetone containing 0.20g of Sensitox 1007+!
17 and irradiated with a 100 OW high pressure sodium lamp at -78°C for 2 hours. After Sensitox (1) was filtered off, the solvent was distilled off under reduced pressure, and the resulting product was purified by silica gel column chromatography to obtain 0.20 g of exemplified compound (1)-18 as white crystals.
［’ＨＮＭＲ、Ｆ Ｄマススペクトル、ＩＲにより、■
−１８であることを確認した。〕
〔実施例〕
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発
明はその実施例によりその範囲を限定されるものではな
い。['HNMR, FD mass spectrum, IR, ■
-18 was confirmed. [Examples] The present invention will be specifically explained below using Examples, but the scope of the present invention is not limited by the Examples.
実施例１
にトロセルロース膜上での抗原の測定）純水にて洗浄後
、風乾したニトロセルロース膜（バイオランド社製；厚
み０．４５μｍ）に、リン酸緩衝液（以下ＰＢＳと称す
）にて段階希釈したヤギＩｇＧの１μｍをスポットした
。Example 1 Measurement of antigen on trocellulose membrane) After washing with pure water, a nitrocellulose membrane (manufactured by Bioland; thickness 0.45 μm) that had been air-dried was coated with phosphate buffer (hereinafter referred to as PBS). 1 μm of serially diluted goat IgG was spotted.
風乾後１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ） −ＰＢＳ溶液
により４℃にて一晩ブロッキングを行い、次いでパーオ
キシダーゼ標識ウサギ抗ヤギＩｇＧ抗体くカッペル社製
；１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液により１５００倍希釈したも
の）と４℃２時間反応させた。After air-drying, blocking was performed overnight at 4°C with a 1% bovine serum albumin (BSA)-PBS solution, followed by peroxidase-labeled rabbit anti-goat IgG antibody manufactured by Kappel; diluted 1500 times with a 1% BSA-PBS solution. ) for 2 hours at 4°C.
０．０５％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０（ポリオキシ
エチレンソルビタンモノラウレート；和光紬薬社製）−
ｐａｓ溶液にて５回洗浄し発色用基質溶液中に浸漬した
。発色用基質溶液は次の４種を用い、比較した。0.05% Tween-20 (polyoxyethylene sorbitan monolaurate; manufactured by Wako Tsumugi Pharmaceutical Co., Ltd.)
It was washed five times with PAS solution and immersed in a coloring substrate solution. The following four types of coloring substrate solutions were used and compared.
（１）例示化合物１−３の０．０１８ミリモルをＤＭＦ
１ｒｄ！に溶解し、５ｍ１２の０．０５Ｍ）リス塩酸緩
衝液（ｐＨ８，５，４，２００ｍＭ ＮａＣ１含有、以
下ＴＢＳと称す）を加え、１ｍｇのＮ−エチル−Ｎ−β
−メタンスルホンアミドエチル−３−メチル−４−アミ
ノアニリン３／２硫酸１水塩を加え、更に３％過酸化水
素２０μｌを加えた。(1) 0.018 mmol of Exemplified Compound 1-3 in DMF
1rd! Add 5ml of 0.05M) Lis-HCl buffer (pH 8, 5, 4, containing 200mM NaCl, hereinafter referred to as TBS), and add 1mg of N-ethyl-N-β.
-Methanesulfonamidoethyl-3-methyl-4-aminoaniline 3/2 sulfuric acid monohydrate was added, and further 20 μl of 3% hydrogen peroxide was added.
（２） （１）における例示化合物Ｉ−３を例示化合
物１−９の０．０１８ミ’Ｊモルに変えた以外は全く同
じものを用意した。(2) Exactly the same product as in (1) was prepared except that Exemplified Compound I-3 was changed to 0.018 mmol of Exemplified Compound 1-9.
（３） （１）における例示化合物Ｉ−３を例示化合
物ｌ−１８の０．０１８ミｌＪモルに変えた以外は全く
同じものを用意した。(3) Exactly the same product as in (1) was prepared except that Exemplified Compound I-3 was changed to 0.018 mlJ mole of Exemplified Compound I-18.
比較−（１） （１）における例示化合物Ｉ−３を比
較−（２） ルミノール１２５ ｍｇを５−の０．０
５Ｍ ＴＢＳを加え溶解し３％過酸化水素２０μｌを
加えた。Comparison - (1) Comparison of Exemplified Compound I-3 in (1) - (2) Luminol 125 mg to 0.0 of 5-
5M TBS was added and dissolved, and 20 μl of 3% hydrogen peroxide was added.
本発明の基質溶液（１）、（２）、（３）及び比較基質
溶液（２）に前記ニトロセルロース膜を浸漬した後、暗
室下ラップフィルムに包み、コニカＸレイフィルム〔コ
ニカ■〕と重ね合せ、コニカフィルムカセツテ５Ｄ−Ｃ
Ｆ ［コニカ■〕に入れ室温２０分間反応させた。After immersing the nitrocellulose membrane in the substrate solutions (1), (2), (3) of the present invention and the comparative substrate solution (2), it was wrapped in cling film in a dark room and layered with Konica X-ray film [Konica ■]. Combined with Konica film cassette 5D-C
F [Konica ■] and allowed to react at room temperature for 20 minutes.
反応後、本発明の基質溶液（１）〜（３）の場合ニトロ
セルロース膜は充分水洗の後、風乾した。After the reaction, in the case of the substrate solutions (1) to (3) of the present invention, the nitrocellulose membrane was thoroughly washed with water and then air-dried.
また、Ｘレイフィルムは常法に従い、現像を行った。比
較基質溶液（１）については、ニトロセルロース膜を浸
漬、２０分間室温で反応させた後、十分水洗後、風乾し
た。Further, the X-ray film was developed according to a conventional method. Regarding the comparative substrate solution (1), the nitrocellulose membrane was immersed, reacted for 20 minutes at room temperature, thoroughly washed with water, and air-dried.
結果は本発明の基質溶液（１）はメン、プラン上に黄色
に、（２）は赤色、（３）は青色にスポットを、比較−
〔１〕は赤色に染色していた。The results show that the substrate solution of the present invention (1) has a yellow spot on the plan, (2) a red spot, and (3) a blue spot.
[1] was stained red.
この際、本発明の基質溶液（１）〜（３）、比較基質溶
液（１）共１ｎｇのヤギＩｇＧが検出可能であった。At this time, 1 ng of goat IgG was detectable in both the substrate solutions (1) to (3) of the present invention and the comparative substrate solution (1).
またＸレイフィルムの場合本発明の基質溶液（１）〜（
３）では０．５ ｐｇのヤギＩｇＧまでが銀画像として
確認されたが、比較基質溶液（２）では２０ｐｇのヤギ
ＩｇＧまでしか確認できなかった。In addition, in the case of X-ray film, the substrate solution (1) to (
In 3), up to 0.5 pg of goat IgG was confirmed as a silver image, but in comparison substrate solution (2), only up to 20 pg of goat IgG could be confirmed.
以上の結果のごとく、本発明の化合物は、高感度な化学
発光法であるばかりでなく、比色法としての確認も行え
る有用なものであることが判る。The above results show that the compound of the present invention is useful not only for highly sensitive chemiluminescent methods but also for colorimetric confirmation.
実施例２
（１） ニトロセルロースフィルター上でのドツトブ
ロッティング
２ Ｘ ３ ｃｍのニトロセルロースフィルター上に熱
処理し一本鎖にしたλフアージＤＮＡ（ＨｉｎｄＩ［Ｉ
で切断）を０．１ ｐｇ、 ０．５ ｐｇ、 １ ｐｇ
。Example 2 (1) Dot blotting on a nitrocellulose filter Lambda phage DNA (HindI [I
0.1 pg, 0.5 pg, 1 pg
.
５ｐｇ、７．５ Ｐｇ、１０ｐｇ、１１００ｐ、ｌｎｇ
及びＬｏｎｇを直径４ｍｍの大きさになるようにスポッ
トし、減圧下８０℃で２時間焼付けをした。5pg, 7.5Pg, 10pg, 1100p, lng
and Long were spotted to a diameter of 4 mm and baked at 80° C. for 2 hours under reduced pressure.
（２） ＤＮＡプローブの作成
λファージＤ Ｎ Ａ ［ＨｉｎｄｌＩＩで切断、日本
ジーン■より人手〕 １０μｇを熱処理し一本鎖とした
後、ラベザイムＰＯＤセット〔日本ジーン■より入手〕
を用いＰＯＤをラベルし精製した。(2) Creation of DNA probe λ phage DNA [cleaved with Hindl II, manually from Nippon Gene ■] After heat treating 10 μg to make it single stranded, labezyme POD set [obtained from Nippon Gene ■]
was used to label and purify POD.
（３） ニトロセルロースフィルター上でのハイブリ
ダイゼーション
（１）で作成したニトロセルロースフィルターをヒート
シールバッグに入れ、４２℃で２時間プレハイブリダイ
ゼーションし、次いでＤＮＡプローブを加え、 １６
時間ハイブリダイゼーションを行った。(3) Hybridization on a nitrocellulose filter The nitrocellulose filter prepared in (1) was placed in a heat seal bag, prehybridized at 42°C for 2 hours, then a DNA probe was added, and 16
Time hybridization was performed.
フィルターは蒸留水で３回洗浄した。The filter was washed three times with distilled water.
（４）ＤＮＡの検出
実施例１の本発明の基質溶液（１）〜（３）及び比較基
質溶液（２）を用い、反応時間を６０分とした以外は実
施例１と同様に行った。(4) Detection of DNA DNA was carried out in the same manner as in Example 1 except that the substrate solutions (1) to (3) of the present invention and the comparative substrate solution (2) of Example 1 were used and the reaction time was 60 minutes.
Ｘレイフィルムでは本発明の基質溶液は０、１ ｐｇの
スポットを確認できた。またニトロセルロース上では１
１００ｐのスポットまで確認できた。On the X-ray film, spots of 0 and 1 pg were confirmed for the substrate solution of the present invention. Also, on nitrocellulose, 1
I was able to confirm up to the 100p spot.
一方１、比較基質溶液（２）ではＸレイフィルムで１０
ｐｇのスポットまでしか確認できなかった。On the other hand, 1, comparative substrate solution (2) has an X-ray film of 10
I could only confirm up to the pg spot.
実施例３
透明な厚さ１８０μｍの下塗り済ポリエチレンテレフタ
レート支持体上に以下の組成の層を順次積層した。Example 3 Layers having the following composition were successively laminated onto a transparent, 180 μm thick primed polyethylene terephthalate support.
（試薬層）
脱イオン化ゼラチン
１２ｇ／ｍ２ノイラミニダーゼ
１，５０ＯＮ−アセチルノイラ
ミン酸アルドラーゼ ８，０００ピル
ビン酸オキシダーゼ １
２，０００フラピンアデニンジヌクｂオチド・２ナトリ
ウム塩 ０．１１塩化マグネシウム・７水和物
１．５５トリアミンピロホスフ
Ｉ−ト ０．３５ピ
ペラジン−Ｎ、 Ｎ’−ビス（２−エタン
１．５５スルホン酸）
塩化カルシウム
１．５５トリトンＸ−１００（ロームエンドハース
社）０．５ビス（ビニルスルホニルメチル）エーテル
０．８０ＫＤＨでＰＨ６，５に調整
（接着層）
Ｕ／
１１／ｍ’
［１／ｍ２
８７ｍ２
ｇ／ｍ”
ｇ／ｍ’
８７ｍ２
ｇ／ｒｒＩ２
８７ｍ２
ｇ／ ｍ ２
ピ勾しビロリドン／酢酸ビニル共重合体（重量比１ ：
４ ） １．２５８７ｍ２（多孔性展開
層）
ろ紙厚材料用繊維（４ｏメフシュ以上） １０５ ｇ／
ｍ２トｉ丹ンＸ−１００１０，２８／ ｍ’ジメドン
１．７５
ｇ／ｍ”
上記組成により作成した分析素子を１．５Ｘ１．５ｃｍ
に裁断しプラスチックマウントに装置し、分析フィルム
とした。(Reagent layer) Deionized gelatin
12g/m2 neuraminidase
1,50ON-acetylneuraminic acid aldolase 8,000pyruvate oxidase 1
2,000 Flapin adenine dinucu b otide disodium salt 0.11 Magnesium chloride heptahydrate 1.55 Triamine pyrophosphite 0.35 Piperazine-N, N'-bis(2-ethane
1.55 sulfonic acid) Calcium chloride
1.55 Triton X-100 (Rohmendhaas) 0.5 bis(vinylsulfonylmethyl)ether
Adjust the pH to 6.5 with 0.80KDH (adhesive layer) U/ 11/m' [1/m2 87m2 g/m''g/m' 87m2 g/rrI2 87m2 g/m2 Pigradated pyrrolidone/vinyl acetate copolymer Combined (weight ratio 1:
4) 1.2587m2 (porous spread layer) Fiber for filter paper thick material (4o mesh or more) 105 g/
m2 Toi Tan X-10010,28/ m' Dimedone 1.75 g/m" The analytical element prepared with the above composition was 1.5 x 1.5 cm.
It was cut into pieces, mounted on a plastic mount, and used as an analysis film.
試料としてシアリルラクトースアンモニウム塩５２．１
■を０．１Ｍピペラジン−Ｎ、Ｎ’−ビス（２−エタン
スルホン酸）緩衝液（ＰＩＦＢＳ緩衝液と略す） （
ｐＨ６，５） １０−に溶解し、８ｍＭシアリルラク
トース溶液を作成した。これをＰＩＦＢＳ緩衝液を用い
希釈を行い、１ ｍＭ、１００［１１１Ｍ、１０ｎＭ、
１ ｎＭ、 ０．１ ｎＭ、の試料を作成した。Sialyllactose ammonium salt 52.1 as a sample
■ 0.1M piperazine-N,N'-bis(2-ethanesulfonic acid) buffer (abbreviated as PIFBS buffer) (
pH 6.5) 10- to create an 8mM sialyllactose solution. This was diluted using PIFBS buffer to give 1 mM, 100[111M, 10nM,
Samples of 1 nM and 0.1 nM were prepared.
測定装置として、コニカドライラボ８０Ｍ〔コニカ（株
）製〕を用い、各試料を１０μ１分析フィルムの展開層
に点着し、３７℃、７分間反応させた後、６５０ｎｍの
フィルターを用い、反射濃度を測定した。Using Konica Dry Lab 80M (manufactured by Konica Corporation) as a measuring device, each sample was spotted on the developing layer of a 10 μl analysis film, reacted at 37°C for 7 minutes, and then measured using a 650 nm filter to measure the reflection density. was measured.
測定が終了した上記フィルムに５０ｍＭ、トリス塩酸緩
衝液（ｐＨ９，５）を１０μｍ、更に点着し、支持体側
から反射発光量測定実験装置を用い、点着後、１分から
５分間の発光量を積算した。結果を以下の表１に示す。After the measurement was completed, 10 μm of 50 mM Tris-HCl buffer (pH 9,5) was further spotted on the film, and the amount of light emitted for 1 to 5 minutes was measured from the support side using an experimental apparatus for measuring the amount of reflected light. It was added up. The results are shown in Table 1 below.
表 １
シアリルラクトース濃度
０．１ｎＭ １ｎＭ １０ｎＭ １１００ｎ
１ｍＭ反射濃度 ０，３０１ ０．３０３ ０．３０９
０．４８７ １．２６４以上の結果から明らかなよう
に、極微量濃度域では、呈色は認められないが、発光量
を調べることで、感度よく定量することができる。Table 1 Sialyllactose concentration 0.1nM 1nM 10nM 1100n
1mM reflection density 0.301 0.303 0.309
As is clear from the results of 0.487 and 1.264, no coloration is observed in the ultra-trace concentration range, but it can be quantified with high sensitivity by examining the amount of luminescence.
以上詳細に説明したように、本発明の分析素子では、定
量感度が著しく改善されるという顕著な効果が奏せられ
る。As described above in detail, the analytical element of the present invention has the remarkable effect of significantly improving quantitative sensitivity.
Claims (1)
〕： ▲数式、化学式、表等があります▼…〔 I 〕 （式中、Ｘは活性メチレン基若しくは活性メチン基を有
する化合物の残基、Ｙは酸素又は硫黄、Ａｒは芳香族基
、Ｒはアルキル基を示す）で表わされる化合物を含有し
ていることを特徴とする化学発光試薬。 ２、過酸化作用を有する物質、及び請求項１記載の化学
発光試薬を含有していることを特徴とする過酸化水素分
析用化学発光試薬。 ３、少なくとも一層の試薬層を有する過酸化水素分析用
分析素子において、該分析素子が、過酸化作用を有する
物質、過酸化水素を生成する物質、芳香族第一級アミン
化合物、及び請求項１記載の一般式〔 I 〕で表わされ
る化合物を含有していることを特徴とする過酸化水素分
析用分析素子。[Claims] 1. An aromatic primary amine compound, and the following general formula [I
]: ▲There are mathematical formulas, chemical formulas, tables, etc.▼...[I] (In the formula, X is the residue of a compound having an active methylene group or an active methine group, Y is oxygen or sulfur, Ar is an aromatic group, and R is A chemiluminescent reagent characterized by containing a compound represented by (representing an alkyl group). 2. A chemiluminescent reagent for hydrogen peroxide analysis, comprising a substance having a peroxidizing effect and the chemiluminescent reagent according to claim 1. 3. An analytical element for hydrogen peroxide analysis having at least one reagent layer, in which the analytical element contains a substance having a peroxidizing effect, a substance that generates hydrogen peroxide, an aromatic primary amine compound, and Claim 1 An analytical element for hydrogen peroxide analysis, characterized in that it contains a compound represented by the general formula [I].
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8067590A JPH03282257A (en) | 1990-03-30 | 1990-03-30 | Chemical light emitting reagent and analyzing element using the reagent |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| JP8067590A JPH03282257A (en) | 1990-03-30 | 1990-03-30 | Chemical light emitting reagent and analyzing element using the reagent |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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| JPH03282257A true JPH03282257A (en) | 1991-12-12 |
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ID=13724930
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8067590A Pending JPH03282257A (en) | 1990-03-30 | 1990-03-30 | Chemical light emitting reagent and analyzing element using the reagent |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH03282257A (en) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5728350A (en) * | 1992-08-21 | 1998-03-17 | Showa Yakuhin Kako Co., Ltd. | Chemical or microbiological test kit |
| US5955352A (en) * | 1994-12-22 | 1999-09-21 | Showa Yakuhin Kako Co., Ltd. | Instruments for chemical and microbiological tests |
| CN104568926A (en) * | 2015-01-20 | 2015-04-29 | 中国科学院长春应用化学研究所 | Creatinine detection method |
| WO2018143106A1 (en) * | 2017-02-03 | 2018-08-09 | 国立大学法人大阪大学 | Device and determination system using same |
-
1990
- 1990-03-30 JP JP8067590A patent/JPH03282257A/en active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5728350A (en) * | 1992-08-21 | 1998-03-17 | Showa Yakuhin Kako Co., Ltd. | Chemical or microbiological test kit |
| US5955352A (en) * | 1994-12-22 | 1999-09-21 | Showa Yakuhin Kako Co., Ltd. | Instruments for chemical and microbiological tests |
| CN104568926A (en) * | 2015-01-20 | 2015-04-29 | 中国科学院长春应用化学研究所 | Creatinine detection method |
| WO2018143106A1 (en) * | 2017-02-03 | 2018-08-09 | 国立大学法人大阪大学 | Device and determination system using same |
| US11619628B2 (en) | 2017-02-03 | 2023-04-04 | Osaka University | Device and determination system using same |
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