JPH03280884A - ヒト腫瘍細胞抗原に対し特異性を持つマウス―ヒトキメラｋｍ１０抗体 - Google Patents

ヒト腫瘍細胞抗原に対し特異性を持つマウス―ヒトキメラｋｍ１０抗体

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JPH03280884A
JPH03280884A JP2162545A JP16254590A JPH03280884A JP H03280884 A JPH03280884 A JP H03280884A JP 2162545 A JP2162545 A JP 2162545A JP 16254590 A JP16254590 A JP 16254590A JP H03280884 A JPH03280884 A JP H03280884A
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Shau-Ping Lei
シャウ―ピン　レイ
Randy R Robinson
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ヒト腫瘍細胞に対し特異性を持つ抗体とその
誘導体、およびそれらをコードするヌクレオチド及び蛋
白の配列、並びにこのような配列を得、かつ組み換える
方法に関するものである。
〔従来技術とその！！題〕
モノクローナル抗体技術は、現在の癌治療と診断に対す
る考え方に多大の影響を及ぼした。モノクローナル抗体
（ｍＡｂ）を産生ずるためにＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔ
ｅｉｎは細胞対細胞融合技術を応用しくＮａｔｕｒｅ２
５６．４９５（１９７５）］、組換えＤＮＡクローニン
グに匹敵する程の生物学的改革をもたらした。ハイブリ
ドーマ産生ＭＡｂは既に臨床診断及び基礎研究の分野で
広く使用されている。癌、ウィルス及び微生物感染症等
のヒトにおける臨床治療に対する効果については大いに
今後の解明の余地が残されている。
ｍＡｂはヒトの病気の進行に影響を及ぼす標的要因に対
し、卓越した特異性を示すが、マウスｍＡｂの場合、ヒ
トの病気治療に応用するについては自ずと限界がある。
マウスｍＡｂはマウス細胞から得られ、ヒトに使用され
るとき被投与生体によって外来蛋白として認識され、こ
のマウス抗体に対して免疫反応が生しる。また、このよ
うな蛋白はヒト蛋白と区別されてしまい、ヒトの循環系
から異なった速度で排除されてしまうこともある。
さらにこのｍＡｂはマウスからとれたものであるため、
ヒトのエフェクター細胞もしくはヒト血清成分により、
対応するヒトの抗体と同程度には認識されない可能性が
あるといえる。
これらの諸問題を回避できる可能性を秘めているのはヒ
ｔ−ｍＡｂだが、実際にこれを開発していく上で、これ
まで技術的に様々な障害があった。
特に癌の診断と治療のためにヒト腫瘍抗原を特定するこ
とができるｍＡｂの開発に際しては、特に困難である。
腫瘍抗原の大多数は、ヒト免疫系では外来抗原として認
識されない、従って、これらの抗原はヒトにおいて免疫
源とならないことが多いと思われる。しかし、これらヒ
ト腫瘍抗原はヒト抗原が免疫源となるマウスの系を用い
るとヒト抗原を特異的に認識するマウスｍＡｂの産生が
可能になる。従って、これらマウス由来の抗体はヒトに
対して治療効果が期待出来る。さらに細胞培養で得られ
るヒ）ｍＡｂの多くは、あまり利用効率のよくない１ｇ
Ｍ型である。従ってより効果的な抗体であるＩｇＧ型の
ヒトモノクローナル抗体を得ることが必要な場合、Ｉｇ
Ｇ型の抗体を産生する僅かの細胞を同定し、分離する技
術を駆使する必要があった。このため、予め決定された
抗原特異性もしくは、必要とする抗原特異性を有する抗
体を得るために抗体のクラスを切り換える、効率のよい
方法が期待される。
モノクローナル抗体の開発は、マウス・モノクローナル
抗体からヒト・モノクローナル抗体に急速に移行しつつ
ある。しかし、ヒト・モノクローナル抗体を細胞融合で
自在に産生ずるにはまだ抗原感作の段階で困難が多い、
そのため最近では、遺伝子工学的手法でマウス・モノク
ローナル抗体の可変領域（抗原認識部位）とヒト抗体の
定常領域を組み合わせたキメラ・モノクローナル抗体の
産生研究が活発に行われている（特開昭６０−１５５１
３２他）。
抗体分子の大部分を占める定常領域がヒト蛋白であるキ
メラ抗体は、特異抗体の作製が容易で且つマウス抗体に
比べて抗原性等の面でより高い安全性を示すと期待され
る。従って診断・治療薬としての有用性は高い。このよ
うな観点から、既に癌の画像診断薬及び治療薬の開発を
目的として、キメラ化を進めている。
抗腫瘍キメラ抗体を産生ずるときの問題点に関するアプ
ローチについて、多くの研究者が報告している。
文献ＡＲ１（Ｈｏｒｗｉｔｚ、　Ａ、Ｈ，ｅｔ　ａｌ、
　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８５：８６７６−
８６８２（１９８８））には、キメラ抗体とキメラ抗体
断片が酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｓｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅの中で産生されることが記載されている。酵母中
においては２つの種由来の抗体遺伝子が同時に発現され
、標的癌細胞に結合する、正しく折りたたまれてキメラ
抗体が分泌された。
文献ＡＳ　Ｉ　　ＣＢｅｔｔｅｒ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ
、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４０：　１０４１−１０４３
（１９８８）］には大腸菌においてマウスヒトキメラ抗
癌抗体Ｌ６Ｆａｂが産生されたことが記載されている。
遺伝子工学的に産生されたＦａｂは、動物細胞で産生さ
れたキメラ上６抗体のパパイン消化で調製されるキメラ
Ｆａｂと同様の結合特性を持つ。
文献ＡＬＬ　　［Ｒｏｂｉｎｓｏｎ＋　Ｒ，Ｒ，ｅｔ　
ａｌ、、ＩｎｔｅｒｎａｔｉｎａｌＰａｔｅｎｔ　Ｐｕ
ｂｌｉｃａｔｉｏｎ＄ＰＣＴ／ＵＳ　８６１０２２６９
　（１９８７年５月７日公開）〕は、抗体遺伝子の配列
に関するものである。−例として、キメラ上６抗癌抗体
の産生が述べられている。
文献ＡＴ　Ｌ　（Ｌｉｕ、＾、Ｙ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｐ
ｒｏｃ　Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　Ｕ、Ｓ、八８４：　３４３９
−３４４３（１９８７）］は多くのヒト癌細胞の表面上
に存在する特定の抗原を認識するマウス−ヒトキメラ上
６抗体分子の産生に関するものである。マウス抗体の免
疫グロブリン定常領域を、ｃＤＮＡ技術を使用し、ヒト
の定常領域と置き換えた。この系によってリンパ細胞か
ら産生されたキメラ抗体は、当該癌細胞に対し、キメラ
抗体作製の基とした親マウス抗体と同等の親和性をもっ
て結合した。また当該キメラ抗体は抗体依存性細胞毒性
（ＡＤＣＣ）と同様に補体依存性の細胞融解を惹起した
。
文献Ａ　Ｒ２［Ｌｉｕ、　Ａ、Ｙ、ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、
Ｉｍｍｕｎｏｌ−１３９：３５２１−３５２６　（１９
８７）　］はｃＤＮＡ技術を用いて産生じたヒトＢ細胞
上の表面リン蛋白に対する２Ｈ７マウス一ヒトキメラ抗
体分子に関するものである。
このキメラ抗体は、ＡＤＣＣや補体依存性の細胞毒性を
惹起するというような、キメラ抗体作製の基となった親
マウスｍＡｂには、もともと存在しなかった特性を有す
る。
文献ＡＳ　２　（Ｂｅｉｄｌｅｒ、　Ｃ，Ｂ、　ｅｔ　
ａｌ、、Ｊ、Ｉｓｓ＋ｕｎｏｌＱ　４０５３−４０６０
（１９８８）　）は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に対
して特異性を有するマウス−ヒトキメラ抗体の産生に関
するものである。ゲノムＤＮＡ断片で構築された抗体遺
伝子を用いたキメラ抗体の高レベル産生に関して述べて
いる。
文献ＡＴ　２　（Ｓｈａｗ、　Ｄ、Ｒ，ｅｔ　ａｔ、、
　Ｊ、Ｂｔｏｌ、　Ｒｅ５ｐ。
Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ−ヱ：　２０４−２１１（１９８８
）］は］マウスｍＡｂ１７−Ｌと同一の抗原特異性をも
つキメラ抗体に関するもので、ヒトの胃腸悪性腫瘍が産
生じている抗原を認識する。このキメラ抗体はゲノムＤ
ＮＡ断片に由来するものであり、ＡＤＣＣを起こす。
文献ＡＲ３（Ｓｕｎ、　Ｌ、に、、　ｅｔ　ａｌ、　Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡＪ１４Ｈ２１４−２１８
（１９８７））は結腸癌細胞に発現する表面抗原に結合
するキメラ抗体に関するものである。このキメラ抗体は
、マウスの可変領域をコードするゲノムＤＮＡ断片とヒ
トの定常領域をコードしているゲノムＤＮＡ断片により
構成されており、マウス骨髄腫細胞によって発現された
。
文献ＡＳ　３　（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ、　Ｙ、　ｅｔ　
ａｌ、、　Ｃａｎｃ、　Ｒｅｓ。
尤９９９−１００５　（１９８７）　］は、急性リンパ
球白血病抗原（ＣＡＬＬＡ）に対するマウス−ヒトキメ
ラ抗体に関するものである。このキメラ抗体は、マウス
ｍＡｂの可変領域をコードするゲノムＤＮＡ配列とヒト
抗体の定常領域をコードするゲノムＤＮＡ配列により構
成される。この抗体はＣＡＬＬＡ細胞に特異的結合し、
ＡＤＣＣ及び補体依存性の細胞融解をおこした。
文献ＡＭ　Ｉ　ＣＡｋｉｒａ　Ｋ、　ｅｔ　ａｌ、、　
Ｅｕｒｏｐｅａｎ　ＰａｔｅｎｔＡｐｐｌｆｃａｔｉｏ
ｎ　１８４２８７（１９８６年６月１１日公開）〕はＣ
ＡＬＬＡに対するヒト−マウスキメラ抗体に関するもの
である。
文献ＡＴ３　［Ｓａｈａｇａｎ、　Ｂ、Ｇ、　ｅｔ　ａ
ｌ、、　Ｊ、Ｉ＋ｗｍｕｎｏｌ。
」釘：　１０６６−１０７４（１９８６）］はマウス可
変領域とヒト定常領域のゲノムＤＮＡ断片によるマウス
−ヒトキメラ抗体の構築に関するものである。このキメ
ラ抗体はある種のヒト癌細胞株に対し特異的に結合する
。癌を持ったマウスに対し、キメラ抗体とキメラ抗体作
製の基となったマウスｍＡｂを投与すると、それらの生
体内分布は同一であった。
文献ＡＲ４（Ｂｒｏｗｎ、　Ｂ、Ａ、ｅｔ　ａｌ、、　
Ｃａｎｃ、　Ｒｅｓ。
１７：　３５７７−３５８３（１９Ｂ？）］もまた、マ
ウス可可変域とヒト定常領域のゲノムＤＮＡ断片による
マウス−ヒトキメラ抗体の構築に関するものである。こ
のキメラ抗体はある種のヒト癌細胞株に対して特異的に
結合する。癌を持ったマウスに対し、キメラ抗体とキメ
ラ抗体作製の基となったマウスｍＡｂを投与すると、そ
れらの生体内分布は同一であった。
抗癌キメラ抗体の開発に応用できる可能性が高いキメラ
分子についての一般的なアプローチについては、多くの
研究者が、研究成果を発表している。
文献ＡＮ　１　（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ、　Ｍ、　Ｅｕｒ
ｏｐｅａｎ　ＰａｔｅｎｔＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｎ
ｏ、　１７１４９６（１９８５年２月１９日公開）Ｊは
実験動物に由来する癌特異性を持った可変領域と、ヒト
に由来する定常領域を併せ持つキメラ抗体の産生に関す
るものである。対応する重鎖遺伝子と軽鎖遺伝子はゲノ
ムＤＮＡによって構築され、哺乳動物細胞で発現された
。
文献Ａ　Ｓ　４　［Ｓｕｎ、　Ｌ、に、　ｅｔ　ａｌ、
、　Ｋｙｂｒｉｄｏｍａ　５（ｓｕｐｐｌ、　Ｉ）：　
５１７（（１９８６）フは、癌特異性を潜在的に持つヒ
ト−マウスキメラ抗体に関するものである。キメラ重鎖
遺伝子と軽鎖遺伝子はゲノム（ＤＮＡ）によって構築さ
れ、哺乳動物細胞で発現された。
文献ＡＴ　４　（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、　Ｓ、Ｌ、　ｅｔ
　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８１：　
６８５１−６８５５（１９８４）］は特定の抗原との結
合特異性があるマウス−ヒトキメラ抗体分子の産生に関
するものである。このキメラ抗体分子は、ヒト免疫グロ
ブリンの定常領域遺伝子に、既知抗原との結合特異性を
持った骨髄腫細胞で産生されるマウス抗体の可変頭載遺
伝子を、組換えＤＮＡ技術を使って結合させることによ
って産生されるものである。キメラ遺伝子は、骨髄腫細
胞株５１０７から得られるマウス重鎖可変領域エクソン
とヒトＩｇＧ１またはＩ　ｇＧ２重鎖定常領域エクソン
とを結合して構築された。又、同一の骨髄腫のマウス軽
鎖可変領域エクソンとヒトに軽鎖エクソンとを結合して
構築された。これら遺伝子はマウス骨髄腫細胞株に導入
され、マウス−ヒトキメラ抗リン酸コリン抗体を産生じ
た。
文献ＡＯ１（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、　Ｓ、Ｌ、　ｅｔ　ａ
ｌ、、　ＥｕｒｏｐｅａｎＰａｔｅｎｔ　Ｐｕｂｌｊｃ
ａｔｉｏｎ　Ｎｏ、　１７３４９４（１９８６年３月５
日公開）〕は、一つの種から得られた可変領域と別の種
から得られた定常領域の両方を持つキメラ「受容体」　
（抗体）に関するものである。遺伝子を得るためのｃＤ
ＮＡクローニング利用可能性が述べられているが、ｃＤ
ＮＡプライミングやクローニングに関する例や説明がな
く、またキメラ抗体遺伝子の開発に関する記述も特にな
い（ｐｐ。
５．７及び８参照）。
文献ＡＲ５［Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ、　Ｇ、Ｌ、　ｅｔ　
ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ」■：　６４３−６４６（１９
８４）］もまた、マウス可可変域とヒト定常領域を結合
させてできる抗体の産生に関するものである６本文献は
、免疫グロブリン遺伝子の構築に関し、ハブテンである
トリニトロフェニル（ＴＮＰ）に対して特異性を持つマ
ウス可変領域をコードするＤＮＡ部分とヒトμおよびに
定常領域をコードする部分との結合について言及してい
る。これらのキメラ遺伝子は哺乳動物細胞においてＴＮ
Ｐに結合する機能的なキメラＩｇＭ抗体として発現され
た。
文献Ａ　Ｓ　５　（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、　Ｍ、Ｓ、　
ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ」口：　２６Ｂ　（１９
８５））はキメラ重鎖免疫グロブリン遺伝子の構築に関
するものである。この構築においては、ハブテンである
４−ヒドロキシ−３−ニトロフェンアセチル（ＮＰ）に
対して特異的なマウス可変領域をコードするＤＮＡ部分
とヒトイプシロン領域をコードするＤＮＡ部分とを結合
させている。このキメラ遺伝子にコードされた抗体が産
生されたとき、この抗体はＮＰハプテンと結合し、ヒト
ＩｇＧ特性を持つに至った。
文献ＡＴ　５　［Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、　Ｍ、Ｓ、　ｅ
ｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ＋１６０４−６０８　（１
９８４）］はＦｃ部分がｃ−ｍｙｃの抗原決定基を持つ
ポリペプチドで置換されたハブテン特異的な抗体を分泌
する細胞株の調製に関する。
文献ＡＲ６（Ｗｉｌｌｉａｍｓ、　Ｇ、　ｅｔ　ａｌ、
、　Ｇｅｎｅ　４３：３１９−３２４　（１９８６））
はＦｃ部分が活性酵素成分で置換されたハプテン特異的
な抗体を分泌する細胞株の調製に関するものである。
文献ＡＰ　Ｉ　（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ＋　Ｍ、Ｓ、　ｅ
ｔ　ａｌ、、　ＰＣＴＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　１１０
８６１０１５３３　　（１９８６年３月１３日公開）〕
は、キメラ抗体の産生に関するもので、−膜技術の数多
くのコンセプト的応用の１つとしてｒクラススイッチ」
のコンセプトを示唆する。
文献Ａ　Ｓ　６　（Ｔａｋｅｄａ、　Ｓ、ｅｔ　ａｌ、
　Ｎａｔｕｒｅ　肚４５２−４５４　（１９８５）　］
は、イントロン配列を有するキメラ免疫グロブリン遺伝
子を構築する方法の可能性に関するものである。この中
で、イントロン配列はレトロウィルスベクターの使用に
より除去されてしまう、しかし、予想外のスプライスド
ナ一部位が■領域リーダー配列を削除することなった。
このため、この手法では、完全なキメラ抗体分子を産生
ずることができなかった。
文献ＡＴ６　［Ｃａｂｉｌｌｙ、　ｓ、　ｅｔ　ａｌ、
、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。
＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡＪ３１Ｈ３２７３−３２
７７（１９８４）］は大腸菌において、抗癌胎児性抗原
（ＣＥＡ）抗体の重鎖及び／または軽鎖の合成を支持す
るプラスミドに関するものである。別のプラスミドは、
大腸菌抽出物中に軽鎖と重鎖の一部分である（Ｆｄ’）
断片の結合型を発現すべく構築されている。
文献Ａ　Ｌ　２　（Ｃａｂｉｌｌｙ、　Ｓ、　ｅｔ　ａ
ｌ、、　ＥｕｒｏｐｅａｎＰａｔｅｎｔ　Ｐｕｂｌｉｃ
ａｔｉｏｎ　１２５０２３　（１９８４年１１月１４日
）〕はキメラ免疫グロブリン遺伝子とその類推生成物並
びにその他の修飾型生成物に関するものである。２１．
２８．３３頁ではｃＤＮＡクローニングとブライミング
に関する考察が記載されている。
文献ＡＭ　２　（Ｂｏｓｓ、　Ｍ、Ａ、　Ｅｕｒｏｐｅ
ａｎ　Ｐａｔｅｎｔ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　１２０
６９４　（１９８４年１０月３日公開）Ｊは４−ニトロ
フェニルに対する特異性を持つ非キメラ免疫グロブリン
鎖の大腸菌における発現に関するものである。キメラ抗
体に関する幅広い記述するものであるが、詳細には触れ
ていない（９頁参照）。
文献ＡＲ７（Ｗｏｏｄ、　　Ｃ，Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、　
Ｎａｔｕｒｅ」■：４４６　（１９８５）　）は、酵母
菌において、マウス抗ニトロフェニル抗体蛋白の合成を
指示するプラスミドに関するものである。μ重鎖は酵母
菌細胞中でグリコジル化された。重鎖と軽鎖の両方が同
一細胞中で合成されたとき、それらの一部は機能的な抗
体分子に組み立てられた。これは酵母菌細胞から調製さ
れた可溶性蛋白質中の抗ニトロフェニル結合活性により
検出することができた。
文献Ａ　Ｓ　７　［Ｔａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｉ
ｓ＋ｍｕｎｏ１．　■：８５６４　（１９８５）　］　
では、マウス骨髄腫細胞に導入した後のヒト−マウス免
疫グロブリンキメラゲノム遺伝子の発現について記載さ
れている。
文献ＡＴ　Ｔ　［Ｊｏｎｅｓ、　Ｐ、Ｔ、　ｅｔ　ａｌ
、、　Ｎａｔｕｒｅ　３２１：５２２　（１９８６）］
は、ゲノム遺伝子の構造とその発現に関するもので、マ
ウスｍＡｂからの可変領域のＣＤＲドメインを用いてヒ
ト抗体のこれに対応したドメインを置換している。
文献Ａ　Ｒ８（Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　
５ｃｉｅｎｃｅ　皿１５３４　（１９８８）］は、同様
にＣＤＲ置換を行ってリゾチームに対する抗体の形態を
変化させたことを記載している。
文献Ａ　Ｓ　８　（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、
　５ｃｉｅｎｃｅ４凹：１２０２−１２０７（１９８５
）　）はこの分野全般を総説している。
文献ＡＴ　８　［Ｏｉ、　Ｖ、Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、、　
ＢｉｏＴｅｃｈｉｎｉｑｕｅｓ虹２１４−２２１　（１
９８６）］もまた、この分野全般を総説している。酵母
菌及び／またはバクテリア細胞内でｃＤＮＡ構築体から
キメラ抗体を産生ずるのは必ずしも有利とは限らないこ
とを論じている文献ＡＲ９（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、　Ｓ、
Ｌ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３９：Ｇ２８Ｇ４８　（１９
８８））では、この分野全般についての最新の総説が紹
介されている。
文献ＡＮ　２　（Ｊａｐａｎｅｓｅ　Ｐａｔｅｎｔ　Ｐ
ｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｎｏ。
６ｌ−１６７６９９（１９８６年年６月２９日公開）は
ＫＭ１０マウスｍＡｂを開示するものである。
〔本発明が解決しようとする課題〕
本発明に記載されるキメラ抗体は、ハイブリドーマ技術
と遺伝子工学の両技術を橋渡しし、ヒト癌の治療と診断
に新しい可能性を開くものである。
本発明のキメラ抗体分子とその誘導体は、従来からのｍ
Ａｂの長所を併せ持つものである。キメラｍＡｂは、マ
ウスｍＡｂと同様、ヒトの癌組織に存在する腫瘍抗原を
認識し、これに結合することができる。しかし、マウス
ｍＡｂと相異する点は、キメラ抗体の「種」特異性が免
疫反応発現の可能性を少なくし、ヒトに対し生体内で使
用したとき、クリアランスを遅滞させる。キメラ抗体の
ヒトに由来する成分は、ヒト免疫系のエフェクター細胞
及び／または補体成分と連繋して、標的細胞を破壊させ
る効果を促進する可能性がある。さらに、本発明で開示
した方法を使用した場合、必要とされる抗体のアイソタ
イプを特定の抗原結合部位に置くことができる。また、
本発明では一つもしくはそれ以上の抗体分子のドメイン
を機能的に活性をもった形で直接産生ずることができる
。
〔課題を解決するための手段〕
本発明は、遺伝子のクローニング及び軽鎖と重鎖の発現
により製造される所望の可変領域の特異性及び定常領域
の特性を併せ持つ遺伝子工学的キメラ抗体を開示するも
のである。キメラ抗体とその誘導体はヒトの癌治療と診
断に対する応用可能性を有する。クローニングした免疫
グロブリン遺伝子生成物とその誘導体は、哺乳動物細胞
または、微生物細胞内で産生ずることができる。
本発明は、ヒト定常領域とヒト以外の生物の可変領域と
から構成される免疫グロブリン鎖をコードするｃＤＮＡ
配列を開示するものである。免疫グロブリン鎖は軽鎖と
重鎖との両方を有する。
本発明は、適当な原核生物または真核生物宿主によって
発現することが可能で、プラスミドベクターのような運
搬媒体に組み込まれた組換ＤＮＡ分子中に存在する上記
配列を開示するものである。
本発明は、培養によりキメラ抗体を産生ずることができ
る宿主と、これらの宿主の使用方法を開示するものであ
る。本発明は、またキメラ免疫グロブリンの個々の鎖及
び、ヒト定常領域とヒト腫瘍細胞抗原に対して特異性を
持つマウス可変領域を有し、しかも重鎖の可変領域が同
一の結合特性を持つ、完全に組み立てられた分子を開示
するものである。
本発明により開示されるその他の免疫グロブリン鎖及び
／または分子としては下記のものがある。
（ｉ）腫瘍細胞抗原に対し一価特異性を持つ抗体、例え
ば下記のものから構成される完全な機能的免疫グロブリ
ン分子 （ａ）二つの相異なるキメラ重鎖で、そのうちの一つは
、抗腫瘍細胞特異性を持つ可変領域を有する。
（ｂ）二つの相異なる軽鎖でこれらは重鎖の可変領域と
同等の特異性を持つ、この結果、産生されるヘテロ二重
機能性抗体はヒト腫瘍細胞に対して一価の結合特異性を
示す。
（Ｉｆ　）　Ｆａｂ＋　Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）ｚ等の
抗体断片上記キメラ鎖の組み合わせをコードする遺伝子
配列、特にｃＤＮＡ配列もまた、本発明において提供さ
れる。
本発明はまた、抗体分子の重鎖及び／または軽鎖で目的
とする特異性を持った可変領域をコードした遺伝子配列
、特にｃＤＮＡ配列で、免疫グロブリン鎖とは異なるポ
リペプチド（例えば酵素）をコードする配列と結合して
いるものをも開示する。これらの配列は、本発明の方法
により組み立てられ、それは混合した機能を持つ分子を
産生ずべく発現させることができる。
ｃＤＮＡ配列の使用がゲノム配列（イントロンを含む）
に比較して有利なのは、ｃＤＮＡ配列が、適切なＲＮＡ
スプライシング系を欠くバクテリアもしくはその他の宿
主内で発現することができるからである。
（Ｉ）遺伝子生成工程と生成物 本発明は、ヒトの癌治療と診断に際し、単独でもしくは
他の薬剤と併せて使用できる抗体を提供するものである
。抗原はＫＭ１０と命名されたｍＡｂと結合するもので
ある。
生産方法は以下の５つの工程を組み合わせる。
■　ｍＡｂを産生するマウスＢ細胞ハイブリドーマ系か
らのメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）（７）単離、
クローニング及びｃＤＮＡの調製；■　精製ｍＲＮＡか
ら完全長のｃＤＮＡライブラリーを調製する。このライ
ブラリーから適切な軽鎖及び重鎖遺伝子の可変領域部分
が（ａ）適切なプローブにより同定され、（ｂ）配列決
定され、（ｃ）定常領域遺伝子と融合される。
■　ｃＤＮＡｍ製及びクローニングによる定常領域遺伝
子部分の調製 ■　上記■のクローン化された特定の免疫グロブリン可
変領域遺伝子部分を上記■のクロニン化されたヒト定常
領域遺伝子部分モジュールと結合することからなる、完
全な重鎖または軽鎖をコードする配列の構築。
■　原核生物や真核生物等を含む宿主内でキメラ軽鎖及
び重鎖を発現産生させる。
全ての免疫グロブリン軽鎖遺伝子、重鎖遺伝子及びそれ
らをコードしたメツセンジャーＲＮＡに共通した特徴は
、いわゆるＪ領域に関するものである。重鎖Ｊ　６Ｎ域
と軽鎖Ｊ領域は相異なる配列をもつが、各群間で、特に
定常領域の近辺で、８０％以上の高度な配列のホモロジ
−（相同性）がみられる。このホモロジー（相同性）は
本発明で利用され、軽鎖及び重鎖のＪ領域のコンセンサ
ス（共通）配列はプライマーまたはプローブとして使用
するために、オリゴヌクレオチドをデザインするのに使
われた。これは有用な制限酵素部位をＪ領域に導入する
ことにより、その後、可変領域部分をヒト定常領域部分
と結合させるのに使われるものである。
ヒト細胞から調製され、かつヒト配列中に類似の部位に
制限酵素切断部位をサイトダイレクティドーミニータジ
ェネシス（部位特定的突然変異）による修飾法で導入し
た定常領域ｃＤＮＡモジュールベクターを使用した。例
えば、完全なヒトに軽鎖Ｃ領域と完全なヒトＴＩ　Ｃ領
域をクローン化することができる。Ｃ領域モジュールベ
クターのソースとして、ゲノムＣＡＭ域クローンを使う
代替方法をとる場合、介在配列を除去するために必要と
される酵素が存在しえないバクテリアの様な系では、こ
のような遺伝子の発現はされない。
クローン化された■領域部分は切り出され、軽鎖または
重鎖ＣｅＩ域モジュールベクターと結合される。さらに
、ヒト１１領域は終末コドンを導入して修飾することに
より、重鎖の一部のみ□例えばＦａｂ分子にみられる部
位□をコードする遺伝子配列を作り出す事ができる。
結合した■とＣｅｌ域（またはその一部）をコードする
配列は、原核生物または真植生物といった適当な宿主で
の発現のために適当なベヒクル（運搬媒体）に挿入され
る。ここでいう「結合」とは、コード配列のインフレー
ムの結合を意味し、トリブレットリーディングフレーム
を変化させたり、妨げたりすることなく、継続的に翻訳
可能な遺伝子配列を引き出すことである０発現のための
運搬媒体としては、プラスミドまたはその他のベクター
が挙げられる。これらの媒体のなかでも好適に使用され
るべきものは、適切な制限部位を工学的手法で導入しで
ある機能的に完全なヒト重鎖または軽鎖の定常領域配列
を運搬する媒体である。
ここで工学的手法とは適切な接着末端を導入し、どの様
な重鎖または軽鎖の可変領域配列でもベクター中に容品
に挿入できるようにされていることをいう、従って、ヒ
ト重鎖または軽鎖の定常領域配列を含んだ媒体は、本発
明を実施するにあたり重要な要因となる。これらの媒体
は、適当な宿主において目的とする完全な重鎖または軽
鎖を発現させる上での仲介物として使用することができ
る。
宿主として適当なものの一つに酵母菌がある。
酵母菌は、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖の産生に使う場
合、実質的なメリットがある。酵母菌は、グリコジル化
を含む翻訳後のペプチド修飾を行うことができる。現在
、数多くあるＤＮＡ組換え技術では、酵母菌体内で目的
とする蛋白質を産生ずるために、強力なプロモーター配
列と高コピー数のプラスミドを使う、酵母菌はクローン
化した哺乳動物遺伝子産物のリーダー配列を認識し、リ
ーダー配列をともなったペプチド（即ち、プレペプチド
）を分泌する（旧ｔｚｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、＋　１１ｔ
ｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃ
ｅ　ｏｎ　Ｙｅａｓｔ、　Ｇｅｎｅｔｊｃｓ　ａｎｄＭ
ｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ＋　Ｍｏｎｔｐｅｌ
ｌｉｅｒ、　Ｆｒａｎｃｅ、　Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ　１
３−１７．１９８２）。
酵母菌での遺伝子発現系は、産生量、分泌、及びキメラ
重鎖、軽鎖蛋白質と組み立てられたキメラ抗体の安定性
といった面からルーチンに評価することができる。酵母
菌をグルコースの豊富な培地で成育させたときに大量に
産生される解糖酵素をコードし、また活発に発現してい
る遺伝子から得られるプロモーター及び転写終結要素（
ターミネータ−）とを採り入れた一連の酵母菌での遺伝
子発現系が利用されうる。知られている解糖酵素の遺伝
子もまた非常に有効な転写調製シグナルとして利用可能
である６例えばイソ−１−チトクロームＣ（ＣＹＣ−１
）遺伝子のプロモーターと転写終結シグナルも利用され
うる。クローン化された免疫グロブリンｃＤＮＡの酵母
菌体内での発現に最適な発現プラスミドを評価するため
に多くのアプローチを取ることができる。
本発明で述べた抗体分子もしくは抗体断片を生成するた
めに、バクテリア株を形質転換宿主として使うこともで
きる。Ｌ匹且−３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）等の大
腸菌　Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２株、及びサルモネラ菌５
ａｌｓｏｎｅｌｌａ　ｔ　　ｈｉｍｕｒｉｕｍ　　やセ
ラチア菌Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ　　等
のその他の腸内細菌、さらには種々の縁ＩＩ菌Ｐｃｅｕ
ｄｏｍｕｎａｓ　　等も使うことができる。
宿主細胞と併存できる菌株に由来するレプリコン及びコ
ントロール配列を含むプラスミドベクターは、これらバ
クテリア宿主との関連で使われる。
このベクターは、複製部位のみならず、形質転換した細
胞内で表現型選択を提示することができる特別な遺伝子
をも運搬する。
バクテリア内において、クローン化した免疫グロブリン
ｃＤＮＡによりコードされるキメラ抗体または抗体鎖の
生成に関して発現プラスミドを評価するのであるが、こ
のためのアプローチは数多くある。
これ以外の宿主として適当なのはｉｎ　ｖｉｔｒｏまた
はｉｎ　ｖｉｖｏ　　で生育した哺乳動物細胞である。
哺乳動物細胞は、免疫グロブリン蛋白分子に対して翻訳
後の修飾を提供する。この修飾のなかには、リーダーペ
プチド除去、重鎖と軽鎖の折り畳み（ｆｏｌｄｉｎｇ）
と組み立て（ａｓｓｅ＋ｍｂｌｙ）、抗体分子のグリコ
シル化、及び機能的な抗体蛋白の分泌等が含まれる。抗
体蛋白産生のための宿主として有用な哺乳動物細胞とし
ては、ハイブリドーマ５ｐ２１０−Ａ　ｇ　１４　（Ａ
ＴＣＣＣＲＬ　１５８１　）または骨髄腫瘍細胞Ｐ　３
　ｘ６３Ａｇ　８　（ＡＴＣＣＴＩＢ　９）及びその誘
導体等のリンパ芽球由来細胞が含まれる。その他の細胞
としては、Ｖｅｒｏ（ＡＴＣＣＣＲＬ　８１）またはＣ
Ｉ（ＯＫ　１　（ＡＴＣＣＣＲＬ　６１）等の線維芽細
胞系のものがある。
哺乳動物細胞においてクローン化した重鎖（Ｈ）と軽鎖
（Ｌ）遺伝子の発現については数多くのベクター系があ
る。完全なＨ，Ｌ、抗体を得るために異なったアプロー
チができる。細胞内会合を果たし、完全なテトラメリッ
クＨ，Ｌ、抗体へと重鎖と軽鎖を結合させるために、同
一細胞内で軽鎖と重鎖を共−発現（ｃｏ−ｅｘｐｒｅｓ
ｓ　１ｏｎ）させることは可能である。この共−発現（
ｃｏ−ｅｘｐｒｅｓｓ　１ｏｎ）は、同一宿主において
、同一のプラスミドまたは異なったプラスミドのいずれ
かを用いれば実現する。重鎖と軽鎖の両方の遺伝子は、
同一のプラスミド内に位置づけられ、ついで細胞内にト
ランスフェクトされ、かくして重鎖、軽鎖の両方を発現
させる細胞を直接選択することができる。代替の方法と
しては、細胞を一つの鎖、例えば軽鎖の方をコードした
プラスミドで先ずトランスフェクトし、次いでこの結果
得られる細胞系を二番目に選択可能なマーカーを含んだ
重鎖プラスミドでトランスフェクトする工程をとるもの
である。いずれかの工程を経由して得られたＨ、Ｌ！分
子を産生ずる細胞株は、別の選択マーカーを結合した軽
鎖、重鎖または軽鎖十重鎖をコードするプラスミドでト
ランスフェクトされる。このトランスフェクトされた細
胞株には、組み立てられた（ＨｚＬｚ）抗体分子の産生
量向上やその細胞株の安定性向上等の特性が増強される
。
（ＩＩ）ポリペプチド生成物 本発明により、ヒト腫瘍細胞に対し特異性を有する重鎖
または軽鎖“キメラ”免疫グロブリン鎖が提供される。
キメラ鎖は、天然ヒト免疫グロブリン中に存在するのと
本質的に近似の定常領域と、本発明の目的とする抗腫瘍
特異性を持つ可変領域とを含有する。本発明はまた、重
鎖と軽鎖が会合し、それにより分子全体として所望の結
合特性及び認識特性を発揮する免疫グロブリンを提供す
る。
種々のタイプの免疫グロブリン分子が提供される；すな
わち所望機能を有する部位と結合した本発明の可変結合
ドメインを有する１価、２価あるいは分子が提供される
０本発明はまたＦａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）、
分子の様なキメラ免疫グロブリン分子の断片を提供し、
あるいは短縮された遺伝子によりコードされ、その結果
これらの断片と類似の機能を有する蛋白分子種を提供す
る。
同しまたは異なる、可変領域の結合特異性を持つキメラ
重鎖と軽鎖を有する抗体は、必要なポリペプチド鎖を適
切に会合させることにより提供できる。これらの鎖は本
発明のモジュール組み立て法により個々に調製される。
（作用・効果） 本発明の抗体はヒトの癌治療に際し、単独で、例えば、
ＡＤＣＣを介して働き、あるいはｒｉｃｉｎ（リシン）
、放射性核種、薬剤等の治療用成分あるいは毒素と結合
させて、治療目的に試験することができる０本杭体はＡ
ＤＣＣエフェクター細胞の数、活性を増加させる因子（
例えばリンホカイン、コロニー刺激因子等）と組み合わ
せて効果的に利用することも可能である。
ヒト定常領域を有する本発明の抗体はマウス由来の抗体
に比し、血清疾患やアナフィラキシ−ショックのような
不都合な免疫反応の発症が低く、特にヒトの受動免疫に
利用される０本杭体はまた、検出用標識化法（例えば酵
素、＋２５７，１４０、螢光標識など）で、あるいは固
定化法（高分子管、ビーズ上）で、免疫診断アッセイや
キットに使用することができる。これらはまたか」１す
造影用のために標識化形態でも利用でき、この場合標識
は放射活性物質、あるいは重金属原子核のような核磁気
共鳴造影剤、あるいは重金属のようなＸ線造影剤である
０本杭体はまた、適当な標識化によって、特定の腫瘍細
胞抗原のｉｎ　ｖｉｔｒｏでの局在化（Ｉｏｃａｌｉｚ
ａｔｉｏｎ）にも使用することができる。
抗体−酵素複合体はＥＬＩＳＡのような免疫診断法に使
用することができる。抗体−ペプチドエフェクター複合
体は高度の効力及び特異性を持ってエフェクター成分を
目標部位に運搬するのに使用される。
とりわけ本発明のキメラ抗体はネズミ由来のＫＭｌｏｍ
Ａｂが使用される総ての用途に、キメラ抗体が人体に対
する適合性において優れているという明白な有利性をも
うて使用することができる。
〔実施例〕
以下、実施例を以て本発明をさらに詳しく説明するが、
これらの実施例は本発明を限定するものするものではな
い。
実施例１ モノクローナル抗体ＫＭ１０の調製 １、免疫原の調製 低分化型のヒト胃腺癌由来細胞株（ＭＫＮ−４５）を超
音波で破壊した。遠心骨ｊ！！　（１５，０００ｘ　ｇ
、３０分）後、沈澱物を廃棄した。この上澄液を５ｅｐ
ｈａｒｏｓｅ４ｂゲル濾過カラムにかけた０分子量７０
０ｋＤから１，５００ｋＤまでのフラクションを回収し
、Ｆｒｅｕｎｄの完全アジュバントと混合した。この混
合物をＢＡＬＢ／ｃマウスに腹膜腔内投与を行った。
マウスに１週間に１度、５週間に渡り免疫を行った。最
終免疫の４日後、細胞融合に使用するためマウスからｌ
ｌＩ！！臓を取り出した。
２、細胞融合及びクローニング （ａ）方法の記述 前記のマウス肺臓細胞とマウス骨髄腫Ｐ３Ｕ１（Ｃｕｒ
ｒ、　Ｔｏｐ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ、　　Ｉｌｌ：Ｈ１９７Ｂ）参照〕を４：１の割合で
混ぜ、一部改訂したＫｏｈｌｅｒら　（Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｉｃａｌ　　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　　Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ、　　Ｐｒｅｓｓ。
Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ｐ、３９Ｈ１９７９）］の方法に
従って４２．６％ポリエチレングリコール（平均分子量
：　１，０００　）を使用して融合反応を２分間行った
。
処理した細胞を９６ウエルミクロプレートに接種し、Ｈ
ＡＴ培地〔後記参照〕で１０〜１４日間培養した；その
後これらをＨＴ培地〔後記参照〕に移した。それがフラ
スコ（２５ｃ４）内で培養可能なまで充分成長した後、
Ｄ−ＭＥＭ培地〔後記参照〕で培養した。分裂増殖が生
した各ウェルの培養上澄液の抗体力価をＥＬＩＳＡによ
り測定し、所期のハイブリドーマのクローニングを限界
希釈分析法によって行った。
マウス腹腔浸出細胞（２５，０００／ウエル）を栄養補
給層として使用した。次にこのハイブリドーマをＤ−Ｍ
ＥＭ培地７１０’、５，２．５．１細胞１０．１−に希
釈し、希釈初冬々の０．１　ｄをミクロタイター板のウ
ェルに植えつけ培養した。４日後、Ｄ−ＭＥＭ培地０．
１ｍを添加した；その後培地の半分を４〜７日の間隔で
交換した。培養開始後１０〜２０日以内に目視可能なコ
ロニーが形成されクローンが得られた。
（ｂ）選択培地 使用した塩基性培地は、ニッスイ製薬会社製Ｄｕｌｂｅ
ｃｃｏの改良Ｅａｇｌｅ培地（Ｄ−ＭＥＭ）であった。
ＨＡＴ培地はＤ−ＭＥ？Ｉに次の添加剤を加えて調製さ
れた：ウマ血清（１０χ、Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ）、Ｌ−グルタミン（３００■／Ｌ）、ピルビ
ン酸ナトリウム（１００■／Ｌ）、ペニシリン（１００
ＩＵ／戚）、ストレプトマイシン（１００μｇ／蔽）、
ブドウＩＩ　（３，５ｇ／　Ｌ）　、ＮａＨＣ（＋＋　
（３，７ｇ／Ｌ）、ヒボキサンチン（Ｉ　Ｘｌ０−’Ｍ
）　、アミノプテリン（４Ｘ　１０−’Ｍ）　、チミジ
ン（１，６Ｘ１０−’Ｍ）。ＨＴ培地はアミノプテリン
が添加されない点を除き、ＨＡＴ培地と同じ添加剤を含
有した。
３、スクリーニングの方法 こうして得られたハイブリドーマについて下記の如く所
望のｍＡｂを産生ずるクローンを得るためスクリーニン
グを行った。
（ａ）方法 ＥＬＩＳＡは次のようにして実施された。ハイブリドー
マ培養上澄液を、抗原（Ｎ々の確立された癌細胞株、特
に部分精製された癌関連抗原または正常細胞の１つ）被
覆マイクロプレートのウェルに加え、次に３７゛Ｃで１
時間インキユヘートした。マイクロプレートを洗浄後ペ
ルオキシダーゼ標識抗マウス免疫グロブリン（ＩｇＧ＋
１ｇＡ十ｒｇＭ）ウサギ抗体を加え、３７℃で１時間イ
ンキュベートした。過剰の標識抗体を除去するための洗
浄後、基質として０−フェニレンジアミン溶液を加え酵
素反応を室温で３０分間行った。２Ｍ硫酸を加えて反応
を停止させ、４９０ｎｍで吸収を測定した。
この方法で種々の細胞との反応性を調べた。白血球との
交叉反応性はβ−ガラクトシダーゼで標識した抗体を使
用して測定、また赤血球との交叉反応はヒトのＡ、Ｂ、
Ｏ型赤血球の混合物を使用したＰＨＡ法にて測定した。
（ｂ）スクリーニングのフローシート 第一次スクリーニングは腫瘍標的細胞、ＭＫＮ−４５及
び対照として胎児肺由来線維芽細胞（ＰＬＯＷ−２００
０）を使用してＥＬｒＳ＾により行った。　ＭＫＮ−４
５との結合に対して陽性で、Ｆｌｏｗ−２０００との結
合に対して陰性であるウェルが選択された。第二次スク
リーニングには他の正常組織由来細胞株、及び白血球と
赤血球についても行われた；これらの正常細胞型に対し
全て陰性であるウェルが選択された。
スクリーニングの第三段階として、第二次スクリーニン
グで選ばれたハイブリドーマを２〜３回クローン化した
。培養上澄液を種々の癌由来の確立された細胞株との反
応性について調べた。
第三次スクリーニングで選ばれたハイブリドーマはＫＭ
１０と命名された。
ｍ　Ａ　ｂ　Ｋ　Ｍ　１０を産生ずるハイブリドーマは
、Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｆｅｒｗ＋ｅｎｔａｔ
ｉｏｎ、　０ｓａｋａ　（財団法人醗酵研究所、ＩＦＯ
）、大阪、日本に１９８９年３月２４日受は入れ番号Ｉ
　Ｆ　０５０１８７で寄託された。
４、ｍＡｂＫＭｌｏの特性 この抗体のアイソタイプ（ｉｓｏｔｙｐｅ）はＩｇＧ１
であり、大腸、胃、膵臓、及び食道を含む多くのヒト癌
の細胞表面に存在する抗原に結合する；この抗原は正常
成人細胞中には掻く微量にしか存在しない。
実施例２ 哺乳動物細胞から産生されるヒト腫瘍特異性を有するマ
ウス−ヒトキメラ免疫グロブリンＫＭ］ＯｍＡｂはヒト
大腸癌細胞で免疫したマウスから得られ、その後ＰＩ臓
細胞をＮ５−１マウス骨髄腫細胞と融合した。この抗体
は大腸、胃、膵臓、及び食道を含む多くのヒト癌細胞表
面に存在する抗原と結合するが、この抗原は正常成人細
胞中には掻く微量にしか存在しない、ｍＡｂＫＭｌｏの
アイソタイプはＩｇＧ１である。
１、組換えプラスミドとバクテリオファージＤＮＡオリ
ゴ−ｄ’Ｇティルを有するｐ　１１３．Ｒ３２２，ｐ　
Ｕ　Ｃ１８、ｐＵｃ１９．Ｍ１３ｍｐ１Ｂ、及びＭ１３
ｍｐ１９をＢ　ＲＬ　（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　
Ｍａｒｙｌａｎｄ）より購入した。浮遊密度遠心分離に
よるプラスミドＤＮＡの精製、制限エンドヌクレアーゼ
消化、アガロースゲル電気泳動によるＤＮＡ断片の精製
、ＤＮＡの連結反応及びＥ、ｃｏｌｉの形質転換を含め
たＤＮＡ操作法は、Ｍａｎｊａｔｉｓ、　Ｔ、ｅｔ　ａ
ｌ、、　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（１９８２Ｌま
たは他の標準操作法に記載されている通りである。制限
エンドヌクレアーゼと他のＤＮＡ／ＲＮＡ修飾酵素はＢ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉ＋＊（Ｉｎｄｉａ
ｎａｐｏｌｉｓ、　Ｉｎｄｉａｎａ）ＢＲＬ、及びＮｅ
ｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　　（Ｂｅｖｅｒ
ｌｙ。
Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）から購入した。
２、ＲＮＡ精製とｃＤＮＡライブラリー構築約ｌＸｌ０
’細胞／ｄのＫＭ１０ハイブリドーマ細胞１リットルを
遠心分離で集め、ＰＢＳ（ＮａＣＩ　８　ｇ　。
ＫＨｚＰＯｎ　０．２ｇ、　ＮａＪＰＯａ　１．１５ｇ
及びＫＣＩ　Ｏ，２ｇ／Ｌ）１００ｍで洗浄した。細胞
を再び遠心分離にかけ、細胞ペレットをグアニジンチオ
シアネート溶液に懸濁し、全細胞１？ＮＡをＭａｎｉａ
ｔｊｓ＋　Ｔ、ｅｔ　ａｌ。
同上記載の方法に従って調製した。ポリ（Ａ）　’　Ｒ
ＮＡはＭａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、ｅｔ　ａｌ−＋同上記載
の方法に従って調製された。ポリ（Ａ）’ＲＮＡがら、
オリゴ−ｄＴをブライマーとしてｃＤＮＡライブラリー
をＧｕｂｌｅｒら、Ｇｅｎｅ亜２６３（１９８３）の方
法で調製した。ｃＤＮＡにターミナルデオキシヌクレオ
チドトランスフェラーゼでｄＣティルを付加し、ｄＧテ
イルを有するｐＢＲ３２２とアニール（ａｎｎｅａｌ）
した、ｃＤＮＡライブラリーを″２Ｐ標識のニックトラ
ンスレーションしたＤＮＡ断片、即ち力、バのクローン
に対してはマウスＣに領域プローブで、また重鎖のクロ
ーンに対してはマウスＩｇＧ１定常領域プローブで、ハ
イブリッド形成法（Ｍａｎｉａｔｉｓ。
Ｔ、、同上）によりスクリーニングを行った。
完全長ｃＤＮＡクローン、ｐＭｌｏに−１６とＰＭ１０
Ｇ−２から得た軽鎖及び重鎖Ｖ領域断片の各々をＭ１３
バクテリオファージベクターに挿入してヌクレオチド配
列分析を行った。これらクローンの可変領域の完全ヌク
レオチド配列はジデオキシ鎖伸長停止法（Ｄｉｄｅｏｘ
ｙ　Ｃｈａｉｎ　ＴｅｒｍｉｎａｔｉｏｎＭｅｔｈｏｄ
）により決定した（図１及び図２）、これらの配列から
予想されるｖ領域のアミノ酸組成は、観察された領域の
アミノ酸組成とよく一致した。
また直接アミノ酸配列決定法により既に実証されている
ｖＳｌ域の部分のペプチド配列と予想されたアミノ酸配
列も良く一致した。
ｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列は、ｖｔ１１域ノ
特徴を示すアミノ酸残基（Ｋａｂａｔ　ａｔ　ａｌ、５
ｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍ
＋ｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅ−ｒｅｓｔ　；　
Ｕ。
Ｓ、　Ｄｅｐｔ　ｏｆ　ＨＨＳ、　１９８３）を含んで
いるので、それらが免疫グロブリンＶＷ４域クローンで
あることを示している。
ＫＭ１０ＶＮはサブグループ■に属している。
ＫＭ１０Ｖ、はＪＭ４配列を有し、ＫＭｌｏＶにはＪに
　５配列を持っている。
３、キメラ発現プラスミドの構築 キメラＫＭ１０を発現させるために■８とｖＬ遺伝子モ
ジュールの挿入に遺した発現ベクターが構築された。軽
鎖ベクターｐ　Ｉ　Ｎ　Ｇ１７１２は、まず試験キメラ
軽鎖遺伝子を含有するプラスミドＤＮＡ　（ｐ　Ｉ　Ｎ
　０２１２２）を作り、これにマウスＡｂｅｌｓｏｎＬ
ＴＲプロモーター、スプライス領域及びマウスゲノムカ
ッパ領域３′をポリアデニル化シグナルに付加すること
により作られた０Ｍ　１３　Ｍ８　ａｌｐｈａＲＸ１２
　（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、　Ｒ，Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、、Ｐ
ｃＴ　ＵＳ　８６１０２２６９）の重鎖マウスエンハン
サ−０，７ｋｂ　　Ｘｂａ　Ｉ　〜Ｅｃ。
ＲＩ断片をＸｂａ　ＩとＥｃｏ　ＲＩで切断したＭ１３
ｍｐ１９に挿入した。エンハンサ−含有Ｈｉｎｄｌｌ［
〜１■断片を、ユニークなη＋ｏ　Ｉ　、　Ｂ）Ｊ　１
１及び…ｎｄｌ［［部位をこの順序で含有するＥ、ｃｏ
ｌｉ＆ｌｌ換えプラスミドＤＮＡ　（ｐＳＨ６）のシ山
ｎ　−ＨｌｎｄＩ［ｌ領域に挿入した。次にエンハンサ
−含有ηｒａ　Ｉ　−Ｘｈｏ　Ｉ　断片を、ｐｌＮＧ２
１２１ｂのエンハンサ−担徂Ｉ〜珈■領域に挿入した。
このｐＩＮＧ２１２１ｂは、その構築に２ＨＴＶＬＳＩ
域の代わりにＬ６　ＶＬ領領域Ｌｉｕ、　Ａ、Ｙ、ｅｔ
ａｌ、、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ
、　ＵＳＡＪ１４Ｈ３４３９（１９８７））を使用する
ことを除いてはＰ　Ｉ　Ｎ　Ｇ２１０８ｂ［Ｌｉｕ、Ａ
。
Ｙ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、　Ｉｓｎｕｎｏｌｏｇｙ　１
３２５１（１９８７））と全く同じ発現プラスミドであ
る。こうして作られたプラスミドがｐｌＮＧ２１２２で
ある。
マウスＡｂｅｌｓｏｎウィルスＬＴＲはｐｅｌｉｎ２（
Ｄｒ、Ｏｗｅｎ　Ｗｉｔｔｅ、　Ｕ、Ｃ，Ｌ、Ａ、ｌ供
）から得られた。
ｐｅｌｌｎ　２は、ウィルス位置４６２３のｊＪ１１部
位にＥｃｏ　Ｒ１オリゴヌクレオチドリンカーＧＧＡＴ
ＴＣＧを挿入することによって変更されたｐ１２０ウィ
ルスの３’ＬＴＲ（Ｒｅｄｄｙ、　Ｅ、Ｐ、ｅｔ　ａｌ
。　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８０：３６２３（１９Ｂ３）］を担持
している。　ｐ１２０３’ＬＴＲプロモーターを担持す
るｐ　ｅ　Ｉ　ｉ　ｎ２の０．８ｋｂ　　匙ｏＲＩ〜Ｌ
副Ｉ断片をＫＬｉＴと匙ｏＲＩで切断したｐＵｃ１８に
挿入した。ＬＴＲを影立Ｒ１−５ａｉｌ断片として切除
し、ＥｃｏＲＩζＳａｔ　　Ｉで切断したｐｌＮＧ２１
２２にライゲートさせ、ＬＴＲプロモーターがＬ６軽鎖
遺伝子に隣合ったプラスミドを得た（ｐＩＮＧ２１２６
）。
ＳＶ４０　１６５スプライスドナーとアクセプターの部
位を含有するＸｈｏ　　Ｉ　−３ａｔ　Ｉ断片をｐｕＣ
１２／　Ｐ　Ｌ　１　　（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ　ｅｔ　ａ
ｌ、、ＰＣＴ　［５８６１０２２６９）から切除し、ｐ
ｌＮＧ２１２６の狗＋１１部位に挿入し、スプライスド
ナーがＬＴＲと軽鎖遺伝子間に存在する方向性（ｏｒｉ
ｅｎｔａｔｉｏｎ）についてスクリーニングを行った（
ｐｒｎｇ２１３３）。
カッパ発現ベクターのポリアデニル化／転写停止領域に
ついても修正した。その第一段階は、ｐＩＮＧ２１２１
　ａ　−ｄｅｌｔａ　Ｈの構築に２８７　ＶＬ領領域代
わってＬ６　ＶＬ領領域使用することを除いてはｐｌＮ
Ｇ２１０８ａ　　（ｌｊｕ、　Ａ、Ｙ、　ｅｔ　ａｌ、
、　Ｊ、　Ｉｍｓ＋ｕｎｏｌｏｇｙ皿３５２１　（１９
８７）　）の場合と同様にプラスミドｐｌＮＧ２１２１
ａの）Ｉｉｎｄ　ｉｌｌ消化と再連結を行った。
ポリアデニル化部位の遠位のマウスゲノムＤＮＡの１．
１　ｋ　ｂ　ＩＩ　ＩＩ　〜Ｂａｍ　ＨＩ断片（Ｘｕ、
　Ｍ、ｅｔ　ａｌ、＋Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、韮
：３８３８（１９８６）　）が、ｐｓ　１０７Ａ（Ｄｒ
、　Ｒａｎｄｏｌｐｈ　Ｗａｌｌ、　Ｕ、Ｃ，Ｌ、Ａ、
提供）から単離され、これをｐｌＮＧ　２１２１ａ−ｄ
ｅｌｔａ　ＨのＢａｍＨ１部位に挿入し、天然型の遺伝
子との配列相同性についてスクリーニングを行った。こ
の修正３′領域を有する３、３　ｋ　ｂ　（７）、［Ｉ
　ＩＩ　〜Ｓｓｔ　Ｉ断片をｐｌＮＧ２１２１ｂの５．
２　ｋ　ｂ　　ＩＩ　ＩＩ　〜Ｓｓｔ　Ｉ断片に連結し
てｐＩＮＧ１７０３を調製した。修正３°領域とキメラ
カッパコード化配列をもったｐｌＮＧｌ　７０３　（７
）ｊｉｚｌ　ｎ　〜Ｓａｌ　Ｉ断片をｐｌＮＧ２１３３
のｌＩＩ［〜５ａｉｌの大断片に連結して図４の９゜ｌ
ｋｂカッパ発現ベクターｐｌＮＧ１７１２を調製した。
　Ａｂｅｌｓｏｎ　Ｌ　Ｔ　Ｒプロモーターもキメラ重
鎖発現ベクターｐｌＮＧ１７１４に使用された。
ｐ　Ｉ　ＮＧ　２１１１　　（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、　Ｒ
，Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、ＰＣＴＵＳ８６１０２２６９）は
Ｘｂａ　１部位にＡａｔＩＩオリゴヌクレオチドリンカ
ーを挿入することにより変更を加え、ＡａｔＩ［開裂と
再連結を行ってｐ　Ｉ　Ｎ　Ｇ１７０７を調製した。　
／１ｂｅｌｓｏｎ　ＬＴＲプロモーター含有のＡａｔｌ
Ｉ〜５ａｌｌ断片をｐｌＮＧ２１３３から切除し、ｐＩ
ＮＧ１７０７の担＋ｔＩＩ〜Ｓａｌ　Ｉ大断片に連結し
、ｐｌＮＧ１７１１を調製した。重鎖エンハンサ−をＥ
ｃｏＲＩ消化によりｐｌＮｃ１７１１から除去し、Ｔ４
ポリメラーゼ処理、ＡａｔＩＩオリゴヌクレオチドリン
カーの連結、開裂及びＡａｔＩ［による再連結により７
．７　ｋ　ｂ発現ベクターｐｌＮＧ１７１４を得た。
同様のプラスミドｐｌＮＧ２２２７は２個の付加的調節
因子、ＩｇＨエンハンサ−とヒトゲノムＩｇＧポリアデ
ニル化配列を担持している。ＩｇＨエンハンサ−１Ａｂ
ｅｌｓｏｎ　Ｌ　Ｔ　Ｒプロモーター及び１６Ｓスライ
ストナーとアクセプタ一部位を有するＢ）１４　ＩＩ　
〜Ｓａｌ　Ｉ　ＧＮ域ニオイテハ、ｐｌＮＧ２２２７と
ｐｌＮＧ１７１２とは相同である。ヒトゲノムＩ　ｇＧ
３’末端配列を１１８５ｂＰｊυ■ＤＮＡ断片として得
、ｐｌＮＧ１７１４内の重鎖遺伝子の停止コドンの６　
ｂｐ後方に位置するＸｍａ　ｍ部位に連結した。ゲノム
ガンマ３゛末端を含む１３００ｂｐ石■断片はｐＨ０３
Ａの誘導体から単離された（Ｅｌｌｉｓｏｎ　ｅｔ　ａ
ｌ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ
ユ４０７１　（１９Ｂ２）　）　。
４、ＫＭ１０重鎖及び軽鎖発現プラスミドの構築サイト
ダイレクテッドミニータジェネシス（部位特異的突然変
異）　　（Ｋｒａｓｅｒ、　Ｗ、ｅｔ　ａｔ、、　　Ｎ
ｕｃｌ。
Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　ＪＪ−：　９４４１−９４５６
（１９８４）］により、好適な制限エンドヌクレアーゼ
部位を適当なＭ１３サブクローンに導入することにより
、ＫＭ１０重鎖を含有するｃＤＮＡクローン（ｐＫ１０
Ｇ）の哺乳動物細胞での発現を可能にした（図３）、オ
リゴヌクレオチドをサイクロンＤＮＡ合成装置（Ｎｅｗ
Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃｏ、）
で合成し、アクリルアミドゲル電気泳動法により精製し
た。ＢｓＬＥＩ［部位をＭ１３サブクローンｐ４Ｇ２に
挿入するためにＪｔｒＩ域ミュータニーネシス（Ｍｕｔ
ａｇｅｎｅｓｉｓ　）ブライマー５°−ＧＡＧＡＣＧＧ
ＴＧＡＣＣＧＡＧＧＴＴＣＣ−３°が使用された。５ａ
ｌＩ制限部位をサブクローンｐＲ６Ｃの開始コドンＡＴ
Ｇの上流に挿入するために、オリゴヌクレオチド５”Ａ
ＴＣＣＡＴＧＡＴＧＴＣＧＡＣＧＡＣＣＴＴＧＣ，ＧＣ
−３°が使用された０次にＫＭ１０重鎖Ｖ領域を含む５
ａｌｌとＢｓＬＥＩＩ間の制限酵素消化断片を発現ベク
ターｐＩＮＧ２２２１にクローン化しＫＭ１０軽鎖を含
有するｃＤＮＡクローン（ｐＭ１０Ｋ−１６）を同様の
方法で哺乳動物細胞での発現に適合させた（図４　）　
、　ＦＩｉｎｄｌ１１部位をＭ１３サブクローンｐ４に
１４に挿入するためにＪＳＪＩ域ミュータニーネシス（
ｌｌｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）ブライマー５’　−ＣＡＧ
ＣＴＣＡＡＧＣＴＴＧＧＴＣＣＣ−３゛が使用された。
５ａ１１制限部位をサブクローンｐ４ＢＤの開始コドン
ＡＴＧの上流に挿入するために、オリゴヌクレオチド５
”−ＧＧＡＴＴＴＴＣ，ＧＴＣＧＡＣＣ；ＣＣＴＡＡＴ
ＴＡＧＴＧ−３’が使用された。ＫＭ１０軽鎖■領域を
含むＳａｌ　＋と…ｎｄＩ［１間の制限酵素断片を発現
ベクターｐｌＮＧ１７１２にクローン化した。
５、キメラ抗体産生のためのマウスリンパ様細胞の安定
なトランスフェクション 細胞株Ｓ　ｐ　２　／　Ｏ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐ
ｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ＩＣＲＬ１
５８１）を、４．５ｇ／ｊ！ブドウ糖とウシ胎児血清１
０％を含有するよう調製したＤ−ＭＥＭ　（前出参照）
中で生育した。
Ｐｏｔｔｅｒ、　Ｈｌらによるエレクトロボーレーショ
ン（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）法（Ｐｒｏｃ、
　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　５ｅｔＵＳＡ且７１６１　
（１９８４）　）が使用された。トランスフェクション
の後、完全Ｄ−ＭＥＭ中で２４時間細胞を放置して回復
させ、次に選択培養基存在中９６−ウェルの培養プレー
ト上で１ウヱルにつき１０，０００〜ｓｏ、ｏｏｏ個を
播種した。Ｇ４１Ｂ　（ＧＩＢＣＯ）の選択は０．８Ｗ
ｇ／Ｈ１、またミコフェノール酸（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅ
ｍ）濃度は６μｇ／ｄプラス０．２５ｍｇ／１１キサン
チンとした。このエレクトロボーレーション技術は５Ｐ
２１０細胞に対しｌ〜ｌ０Ｘ１０−’のトランスフエフ
シラン頻度を与えた。
キメラＫＭ１０軽鎖発現プラスミドｐ　ｌＮＧ２２４２
をＰｖｕ　　Ｉ制限エンドヌクレアーゼによる消化で直
線化し、５ｐ２１０細胞中にトランスフェクションし、
ミコフェノール酸耐性クローンを得た。これらの細胞に
ついて軽鎖合成のスクリーニングを行った。生育させ、
サブクローン化したのち最もよく産生ずる細胞にＰｖｕ
　　Ｉ消化で直線化したキメラＫＭ１０重鎖遺伝子を含
有する発現プラスミドｐＩＮＧ２２４０をトランスフェ
クションした。Ｇ４１８で選択後、最も多量の軽鎖プラ
ス重鎖を産生するクローン５ｐ２１０−２２４２６Ｇ　
２　２２４０１　Ｃ４（ＡＴＣＣＡｃｃｅｓｓｉｏｎ　
Ｉｔ）ＩＢ　１０１３１）は約２１μｇ／ｄの抗体を分
泌した。
６、組織培養で分泌されたキメラＫＭ１０抗体の精製 ５ｐ２１０−２２４２６Ｇ２−２２４０１Ｃ４細胞（Ａ
ＴＣＣＡｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｉ）ＩＢ　１０１３１）を
、１０ｍＭＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓ　、　　Ｉ　ＸＧｕｌｕｔ
ａｍｉｎｅ−Ｐｅｎ−５ｔｒｅｐ（ＩｒｖｉｎｅＳｃｉ
ｅｎｔｉｆｊｃ　１９３１６）を添加した培養基ＨＢ１
０Ｉ（Ｈａｎａ　Ｂｉｏｌｏｇｊｃｓ）　＋　１％ウシ
胎児血清中で生育した。使用した培地を約１４，０ＯＯ
Ｘ　ｇで約２０分間遠心分離し、上澄液を０．４５　ｕ
　ｍ　　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　ニトロセルローズ膜フィ
ルターで濾過し、冷凍保存した。抗体含有量はＥＬＩＳ
Ａにより測定した。細胞培養上澄液的１５．５ＬをＤＣ
−１０ｆ！４縮器（ＡｍｔｃｏｎＣｏｒｐ、）を使用し
、Ｓ　］、　ＯＹ　３０カートリツジ上で１０倍に濃縮
した。抗体約８０■を含有する上澄液を１．５　Ｍ　Ｎ
ａＣｌ　、ｐＨ８，４内の１００　ｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ
　Ａカラム（門ａｂＬａｂ、　０ｒｏｓ）にかけた。Ｋ
Ｍ１０抗体をｐＨ勾配（ｐＨ２〜９）で溶出したところ
、ｐＩ（３，５〜４．０で溶出することがわかった。抗
体含有フラクション（収率７０％）を集め、限外濾過（
ＹＭ３０膜、５ｔｉｒｒｅｄ　ｃｅｌｌ、　Ａｍ１ｃｏ
ｎ　Ｃｏｒｐ、）により１８倍に濃縮し、ＰＢＳで２０
倍に希釈した後、５倍に再濃縮し、ＰＢＳで１．５倍に
再希釈し、最後に１０倍に再濃縮した。抗体を１．５　
ｄの分包にして一２０°Ｃで保存した。
７、キメラＫＭ１０抗体の分析 （ａ）　　結合の阻害：マウスＫＭ１０ｍＡｂとキメラ
ＫＭ１０抗体を結合阻害アッセイで比較した。
この阻害アッセイは抗原認識の同一性を確認するために
使われているものである。マウスＫＭ１０ｍＡｂをＩ！
ＳＩで標識した０次いで精製された非標識キメラＫＭ１
０抗体とマウスＫＭ１０抗体にツイテ、放射標＠ＫＭ１
０（Ｄ標的細胞（ＬＳＩ７４Ｔ大腸腫瘍）に対する結合
阻害活性を調べた。
キメラＫＭ１０抗体とマウスＫＭ１０抗体は標識ＫＭ］
Ｏ抗体のＬＳＩ７４Ｔ腫瘍細胞に対する結合阻害活性に
関して同等であった（表１）。
表１ ＫＭ１０抗体のＬＳＩ７４７ＩＩ瘍細胞に対する結合の
阻害 競合抗体１による阻害％ ０．１５　　　　　２　　　　　　　２　　　　　　−
８０．４５　　　　　９　　　　　　１４　　　　　　
　２１．３５　　　　　９　　　　　　３２　　　　　
　１Ｂ４．０４　　　４２　　　　　　４６　　　　　
　　６１２．１　　　　　６３　　　　　　５９　　　
　　　１４３６．４　　　　　７４　　　　　　８０　
　　　　　−７１０９　　　　　　７５　　　　　　７
２　　　　　−２２ａ；Ｉ２Ｓ■標１１ｉＫＭ１０抗体
を競合抗体存在下、４°（４’ＬＳ　１７４Ｔ！１１ｒ
Ｉｋ細胞トインキユヘートした。細胞を、結合していな
い抗体がなくなるよう洗浄し、細胞に結合した放射能を
測定して結合阻害％を調べた。
ｂ；ヒト１ｇＧは非特異的抗体対照として使用された。
（ｂ）　　機能的アッセイ：　ＡＤＣＣエフェクター細
胞としてのヒト末梢血白血球、あるいはＣＤＣにおける
補体としてのヒト血清の存在下、キメラＫＭ１０抗体と
マウスＫＭ１０抗体のヒト腫瘍細胞を溶解する能力を比
較した。表２はキメラＫＭ１０抗体はＡＤＣＣを媒介す
る能力があるがマウス抗体は媒介する能力が無いことを
示している。マウス並びにキメラＫＭ１０はどちらもヒ
ト血清存在下でＣＤＣによって標的ＬＳＩ７４Ｔ細胞を
検出可能程度に溶解することはできなかった。
〔以下余白〕
表２゜ キメラＫＭ１０抗体によって媒介される抗体依存性細胞
毒性１ ５０　　　　　　　　　　　　８０　　　　　　　　２
６５、　　　　　　　　　　　６１　　　　　　　　２
００．５　　　　　　　　　　　３９　　　　　　　　
　２２０．０５　　　　　　　　　　２７　　　　　　
　　　２１０．００５　　　　　　　　　２３　　　　
　　　　　２１０．０００５　　　　　　　　　２３　
　　　　　　　　２１０　　　　　　　　　　　　２４
　　　　　　　　　２２ａ；ＬＳ１７４Ｔ腫瘍細胞を５
ＩＣｒで標識、洗浄し、１７％ヒト血清の存在下新鮮な
末梢血白血球と３７°Ｃで４時間インキユヘートした。
培養は腫瘍細胞１個につき該　白血球５０個の割合で行
った。培地中に放出された５ＩＣｒ量と１％ＮＰ４０の
添加によって熔解された細胞とを比較することにより細
胞溶解性％を算出した。
実施例３ 酵母菌で産生されるヒト腫瘍細胞に特異性を有するマウ
ス−ヒトキメラＦａｂ 酵母細胞は外来蛋白の発現及び分泌が可能である。この
実施例ではマウス−ヒトキメラＦａｂ産生に際して酵母
細胞は、宿主の役割を果たす。本発明は、癌診断に於い
て適切に標識されたＦａｂによるｉｎ　ｖｉｖｏでの造
影により、また癌治療面ではＦａｂを薬剤、放射性核種
あるいは毒素との免疫複合体として投与することにより
、有用であると思われる。
１、酵母菌株及び生育条件 ＩＮＧＥＮＥで生育された５ａｃｃｈａｒｏ＋ａ　ｃｅ
ｓ　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株Ｐ　Ｓ　６　（ｕｒａ
３ユｅｕ２　ＭＡＴａ）をＩｔｏ　ｅｔ　ａｌ、。
Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１５３　：　１６３〜１
６Ｂ（１９８３）に記述した方法に従って酵母形質転換
の宿主として使用した。酵母形質転換細胞をＳＤ寒天〔
２％ブドウ糖、０．６７％イーストナイトロジエンベー
ス（Ｙｅａｓｔｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｂａｓｅ）、２χ寒
天上〕で選別し、５０ｍＭコハク酸ナトリウム、Ｐ　Ｈ
５，５にて緩衝化されたＳＤブイヨンで育成した。
２、ｉｎ　ｖｉｔｒｏミュータジニーシス（Ｍｕｔａｇ
ｅｎｅｓｉｓ）Ｋｒａｍｅｒらの同上の方法に従って部
位指定ｉｎ　ｖｉｔｒｏミュータジニーシスを行い、闘
１０に軽鎖ｃＤＮＡ配列（図１）の成熟コード化領域と
リーダーペプチドの接合点にオリゴヌクレオチドプライ
マー５’−Ｃ；ＡＧＣＡＣＡＡＴＴＴＣＴＧＣＡＴＴＣ
ＧＡＣＡＣＴＧＴＧＡＣ−３’　　で影１１制限酵素部
位を導入した。同様にして、オリゴヌクレオチドブライ
マー５”−ＣＡＡＣＴＧＧＡＴＣＴＧＡＧＣＴＣＧＧＧ
ＣＡＣＴＴＴＧ−３“でＫＭ１０重鎖の成熟コード化領
域とリーダーペプチドの接合点に５ｓｔＩ部位が導入さ
れた（図２）。
３、抗体遺伝子を含有する酵母発現プラスミドの構築 成熟型ＫＭ１０軽鎖Ｖｆ＋ＪＩ域をコードし、３ｗ４域
に…ｎｄＩ［Ｉ部位（実施例１に記述）、及びシグナル
配列プロセッシング部位にＢｓｍ　１部位が導入された
遺伝子配列を、■含有Ｓａｌ　１−）ｆｉｎｄ　Ｉｔ断
片をヒトＣにコード化遺伝子配列含有ベクター（ｐｌＮ
０１４６０）にクローン化することにより、ヒトＣに領
域に接合させ、ＫＭ１０キメラ軽鎖プラスミドｐＭＩＤ
を作成した（図６参照）。
次にｐＭＩＤからの成熟キメラＫｌ’１１０軽鎖遺伝子
を下記のごとく酵母ＰＧＫプロモーターの制御下（Ｈｊ
ｔｚｅｓｌａｎ＋　Ｒ，Ａ、、ｅｔ　ａｌ−＋　Ｎｕｃ
ｌ、　Ａｃ１ｄ、　Ｒｅｓ。
ニア７９１−７８０（１９８２）　）　、酵母インベル
ターゼシグナル配列をコードする遺伝子配列（Ｔａｕｓ
ｓｉｇ、　Ｒ。
及びＭ、　Ｃａｒｌｓｏｎ、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ
、　Ｒｅｓ、　　１工：１９４３−１９５４　（１９８
３）　）に融合させたニブラスミドｐＭＩＤをＢｓｓ　
Ｉで消化し、Ｔ、ＤＮＡポリメラーゼで処理し、さらに
Ｘｈｏ　Ｔで消化してｖ＋Ｃにを含有する制限酵素断片
を精製した。この断片を、インベルターゼでシグナル配
列（Ｓ）に接合（ｆｕｓｅｄ）　シたＰＣＫプロモータ
ー（Ｐ）を含有するプラスミド（ｐｌＮＧ１１４９）か
ら同様に調製された制限酵素断片と結合させ、ＰＲ９Ｄ
を調製した（図５ａ）、この接合の結果、成熟型ＫＭ１
０キメラ軽鎖をコードする遺伝子配列が酵母インベルタ
ーゼシグナル配列（Ｓ）をコードする遺伝子配列とイン
フレームで接合した。ＰＧＫプロモーターインベルター
ゼシグナル配列−キメラ軽１（Ｖ、Ｃに）接合体を２μ
環の一部、ＰＧＫポリアデニル化シグナル（Ｔｍ）を含
むｕｒａ３酵母発現ベクターにクローン化し、ｐＸＩＤ
を調製した（図５０）。
ＫＭ１０重鎖の成熟型可変領域をコードし、Ｊｅ！ＩＮ
ｉ内にＢｓｔＥ１１部位（実施例１記載）、シグナル配
列プロセッシング部位に５ｓｔＴ部位が導入された遺伝
子配列をｐｌＮＧｌ　４５３のヒ）ＣｎｌｅＮ域（これ
はヒンジに停止コドンを導入することによりあらかじめ
生成されたものである。Ｒｏｂｉｎｓｏｎ。
Ｒ，Ｒ，ｅｔ　ａｔ、、　ＰＣＴＵ５８６１０２２６９
）に接合させ、ＫＭ１０Ｆｄ鎖プラスミドｐＦ３Ｄを調
製した（図６参照）。
続いてｐＦ３Ｄ由来の成熟型キメラＫＭ１０Ｆｄ遺伝子
を、ｐＰＩ２Ｄを調製する軽鎖の項で記述したのと同様
の方法で酵母ＰＧＫプロモーターの制御下、酵母インベ
ルターゼシグナル配列に接合した（図５Ｂ）。ＰＧＫプ
ロモーターインベルターゼシグナル配列−キメラＦｄ鎖
（Ｖ、ＣＨｌ）接合体を２μ環の一部、ＰＧＫポリアデ
ニル化シグナル（Ｔｍ）を含む発現ベクターにクローン
化し、ｐ　Ｗ　６　Ｄを調製した（図５６）。
キメラ軽鎖とキメラＦｄ鎖遺伝子、およびそれらの発現
シグナルの両方を含有する単一の酵母発現ベクターがｐ
ｘｌＤとｐＷ６Ｄから構築された。
この最終ベクター、ｐ　ｌＮＧ３２００　（図５ｅ）は
２μ環の一部（ｏｒｉＹ、ＲＥＰ３）および２個の選択
マーカー１ｅｕ２ｄとｕｒａ３を含有している。
４、酵母のキメラＫＭ１０Ｆａｂ分泌 プラスミドｐｌＮｃ；３２００でＳ、　ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅＰＳ６を形質転換し、この形質転換細胞を上記の
ごとく遺灰条件下、ブイヨン中で育成した６培養上澄液
をＥＬ　Ｉ　ＳＡでアッセイした結果、含有Ｆａｂ濃度
は約１ｏ　Ｏｎｇ／ｄであった。
１１００ｎ／ｄのＦａｂ蛋白を分泌した酵母菌株をＳＤ
ブイヨン５０Ｌ中で６０時間育成し、培養上澄液中のＦ
ａｂ蛋白を精製した。
５、キメラＦａｂの酵母からの分離ならびにＫＭ１０抗
体からのマウスＦａｂＯ産生 培養上澄液４３ＬからＦａｂを精製した。まず培養上澄
液をＤＣ１０装置により５ｉｏｙ１ｏカートリツジ（Ａ
ｍｉｃｏｎ）上で濃縮し、蒸留水２０Ｌで洗浄、再濃縮
、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８，０で洗浄、
さらにこれを濃縮した。次に、濃縮液を１０ｍＭリン酸
ナトリウム緩衝液で予めｐＨ８，０に調整したＤ　Ｅ　
５２　（Ｗｈａｔｍａｎ）カラムにかけた。ＤＥ５２流
出液に０．２　Ｍリン酸−ナトリウムを十分に加えてｐ
）１７．３に調整し、試料をＹＭ１０膜（Ｓｔｉｒｒｅ
ｄ　Ｃｅ１ｌ　２００．　Ａ＋ｎ１ｃｏｎ）上で濃縮し
た。
次に試料を充分量の水で希釈し、２００−に再濃縮し、
１．６１１５／Ｃ１ｌの伝導率が得られた。蛋白の総量
は比色アッセイによって推定された。次に試料をＣＭ５
２　（］　ＯｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ＰＨ７，３で
予め緩衝化された＞Ｉｇにつき総蛋白１０■の割合でＣ
Ｍ　５２　（Ｗｈａｔｍａｎ）カラムにがけた。
ＣＭ５２カラムを、２．５．１０．１５．２０．５０．
１００．２００および５００ｍＭ　　ＮａＣｌを含有す
る１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，３各２０
カラム容で連続ステップで溶出した。ＥＬＩＳＡにより
検査し、Ｆａｂ含有フラクションを集め、Ｆａｂｆｉ度
が約１ｍｇ／Ｉ１１になるまで、ＹＭ１０膜上で濃縮し
、冷凍保存した。プールしたフラクシヨンをさらに５Ｄ
Ｓ−ＰＡＣ；ＥとＨｅｓ　ｔｅｒｎプロッティング法で
分析した。その結果ヌクレオチド配列に基づいて推定さ
れる分子量と合致した単一の４６ＫＤバンドを示した。
６、酵母によって分泌されたＦａｂ蛋白の結合特性酵母
培養上澄液からＦａｂの推定サイズの蛋白が精製された
結果、酵母は正しく折り畳まれた機能的分子を分泌して
いることが示唆された。これはヒト癌細胞株ＬＳ１７４
Ｔとの直接および競合結合アッセイを行うことにより確
かめられた。直接結合アッセイでは酵母由来Ｆａｂはマ
ウスＫＭ１０抗体と同じ標的癌細胞に結合した。しかし
抗原を欠く細胞株には結合しなかった　１２５１−標識
マウスＫＭ１０抗体を使用した競合アッセイでは酵母由
来キメラＫＭ１０Ｆａｂは放射標識マウスＫＭ１０抗体
がヒト腫瘍細胞（ＬＳ　Ｉ　７４Ｔ）に結合するのを阻
害した。酵母由来Ｆａｂは約３．７μｇ／ｄ濃度でマウ
スＫＭ１０抗体の結合を５０％抑制しく表３）、これは
ＫＭ１０マウス抗体の抑制力と近似している。酵母由来
ＫＭ１０Ｆａｂは完全マウスＫＭ１０抗体とＦａｂ断片
（マウス全抗体のパパイン消化により調製されたマウス
ＫＭ１０Ｆａｂをさらにパパイン消化することのより調
製された）両者の結合を阻害した。
〔以下余白〕
実施例４ Ｅ、　Ｃｏ１１で産生じたヒト腫瘍細胞特異性を有する
マウス−ヒトキメラＦａｂ 細菌は、良（検討されたプロモーターから全コード化配
列が発現されうるので、哺乳動物ｃＤＮＡから発現され
るキメラ抗体の産生に適している。
Ｅ、　Ｃｏ１１　はその遺伝子発現の最適化に多くの遺
伝学的情報が得られているので、外来蛋白の産生［Ｈｏ
１ｌａｎｄ　ｅｔ　ａｌ、、　ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ　４　：　４２７　（１９８６）］に有用な多くの
細菌株のうちの１つである。
Ｅ、　Ｃｏ１１　は菌体内での外来蛋白産生あるいは細
胞質から菌体外への蛋白の分泌−それらは多くの場合細
胞周辺腔に蓄積するーに使用することができるＣＧｒａ
ｙ　ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ　３９　：　２４７　（１
９８５）　；　０ｋａｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　５ｃｊ、　ＵＳＡ　８２　　：
　７２１２（１９８５）　）。Ｅ、Ｃｏ１１細胞質から
の分泌はこれまでに多くの蛍白に認められているが、こ
れにはシグナル配列が必要である。菌体内に産生された
蛋白は適切な折り畳まれ方をしていない場合がしばしば
ある　１ｓｃｈｏｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　ＢｉｏＴｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ　３　　：　１５１（１９８５）］。
しかしながら細菌から分泌された蛋白は適切に折り畳ま
れていることが多く、本来の二次および三次構造をとっ
ている（Ｈｓｉｕｎｇ　ｅｔ　ａｌ、＋ＢｉｏＴｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ　４　：　９９１　（１９８６））。
Ｆａｂ分子は２個の相同でない蛋白鎖から成り、これら
が１本のジスルフィド橋で連結されている。
これら２本の鎖は完全な抗体軽鎖と抗体重鎖（Ｆｄ）の
ｖ、、ＪおよびＣに１部分である。
ＫＭ１０キメラ軽鎖とＦｄ遺伝子の適切なｃＤＮＡクロ
ーンは既に同定されている。この実施例ではこれらのｃ
ＤＮＡクローンは、Ｅｒｗｉｎｉａ　ｃａｒｏｔｏｖｏ
ｒａがらのペクチン酸リアーゼ（、ＰＬＬＬＢ）遺伝子
リーダー配列に遺伝子接合して、１つの細菌オペロン（
ジシストロンメソセージ）に編成され、強い調節作用を
有するプロモーターから発現された。これはＥ、ｃｏｌ
ｉにおいて、２本の蛋白鎖を同時に発現させる方法であ
り、これにより免疫学的に活性な適切に組み立てられた
ＫＭ１０キメラ抗体のＦａｂが分泌された。
次の項ではＥ、ｃｏｌｉによるキメラＫＭ１．０Ｆａｂ
ノ分泌について述べる。
１、ｐｅｌＢリーダー配列カセットの合成Ｅｒｗｉｎｉ
ａ　ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ　（ＥＣ）　は数種のペクチ
ン酸リアーゼ（ポリガラクツロン酸トランスエリミナー
ゼ）をコードしている［Ｌｅｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅ
ｎｅ　３５：　６３（１９８５）］。３個のペクチン酸
リアーゼ遺伝子がクローン化され、これらの遺伝子のＤ
ＮＡ配列が決定された。強力なプロモーターの制御下で
臘且内にクローンを行うと、ＬＬＬＢ遺伝子が発現し、
多量のペクチン酸リアーゼが細胞周辺腔と培養上澄液に
蓄積された。Ｌ！土Ｂシグナル配列はＥ、ｃｏｌｉ内で
有効に機能し、この実施例では抗体遺伝子に対する分泌
シグナルとして使用された（他のシグナル配列もこの目
的に使用できるだろう）。
１１上Ｂ遺伝子のシグナル配列を含む周辺部のヌクレオ
チド配列は発表されている［Ｌｅｉ　ｅｔ　ａｌ、＋Ｊ
、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１６９　：　４３７９〜４
３８３　（１９８７）］。
上！上Ｂシグナル配列はシグナルペプチダーゼ開裂部位
：ａｌａ−ａｌａに隣接したアミノ酸２２位に且ａｅｍ
制限酵素部位を有している。ｐＵＣ８（ＶＪｅｒｒａと
Ｍｅｓｓｉｇ、　Ｇｅｎｅ　１９　：　２５９　（１９
８２）］に１１↓Ｂ遺伝子が含まれているプラスミド、
ｐＳＳ　１００４　（Ｌｅｉ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、　
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１６９　：４３７９〜４３８８
　　（１９８７）ｌは上」Ｌ立■とヱ」Ｌ免ＲＩにより
消化された。このＤＮＡに８塩基対５ｓｔｌリンカ−を
付加し、Ｓｓ工■とＥｃｏＲＩで切断したｐＢＲ３２２
に連結した。こうしてできたプラスミドはＬＬＬＢの２
２個のアミノ酸リーダー配列と上流Ｅ、　ｃａｒａｔｏ
ｖｏｒａ　Ｄ　Ｎ　Ａの約２３０ｂｐを含む３００ｂＰ
断片を含有した。
このプラスミド、ｐｌＮＧ１７３はΣ土工１で消化し、
Ｔ４　　ＤＮＡポリメラーゼで処理すると、どの遺伝子
でも成熟コード配列の最初のアミノ酸の部位で平滑化さ
れたＤＮＡ断片と直接連結でき、参入遺伝子とイン−フ
レームで機能的細菌リーダー配列との融合物を生じる。
　ｐＩＮＧ１７３のΣ土工１〜Ｅｃ±Ｒ１断片をｐＵｃ
ｌＢにクローン化し、ｐＲ＋２１７５を得た［Ｙａｎｉ
ｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｇｅｎｅ　３３
二１０３　（１９８５））。このヘクターは−】：１−
□−」（ニー□□１４Ｂリーダー配列と、隣接する上流
非コード配列（リボソーム結合部位を含む）をＩａｃプ
ロモーター配列の下流に含有する。ｐＲＲ１７５から導
かれたプラスミドｐｌＮＧ１５００はＬＬＬＢ遺伝子の
−４８から、ｌＬ土Ｂリーダー配列の下流のＸｈｏ１部
位までの領域のみを含有し、接合点に５ｓｔｌ部位を有
している。
２、細菌での発現のための軽鎖の調製 シグナル配列プロセッシング部位にＢｓｍ　　Ｉ制限酵
素部位を有し、遺伝子の下流にユニークな…乞１部位を
含有する２ＭＩＤ内の完全なＫＭ１０キメラ軽鎖遺伝子
は細菌での発現の出発点として役立った。
プラスミドＰＭＩ　ＤはＢｓｍ１で切断され、Ｔ４ポリ
メラーゼで処理し、ついでｘｈ±Ｉで消化された。軽鎖
遺伝子を含有する約５ｏｏｂｐ断片が精製され、これを
５ｓｔｌで切断し、Ｔ４ポリメラーゼで処理し、Ｘｈｏ
ｌで切断したｐｌＮＧ１５００に連結した（図６Ａ、Ｂ
）。こうして作られたＬＬＬＢ　：　：　Ｋ　Ｍ　１０
軽鎖融合体を含有するプラスミドは、正しくイン−フレ
ームの融合が形成されていることをシーフェンシングで
確認した。このプラスミドはｐＳ２Ｄと命名された。
３、細菌での発現のためのＦｄの調製 シグナル配列プロセッシング部位に５ｓｔｌ制限部位、
および遺伝子の下流にＸｈｏｌ制限部位を有するｐＦ３
Ｄの完全ＫＭ１０キメラＦｄ遺伝子は細菌での発現の出
発点として役立った。プラスミドｐＦ３Ｄを５ｓｔｌで
切断し、Ｔ４ポリメラーゼで処理し、Ｘｈｏｌで消化し
た。Ｆｄ遺伝子を含有する約８００ｂｐの断片を精製し
、これを５ｓｔｌで切断、Ｔ４ポリメラーゼで処理、そ
してＸｈｏｌで切断したｐｌＮｃ；１５００に連結した
（図６８．Ｃ）。こうして作られた。ＰＬＬＬＢ：：Ｋ
Ｍ１０Ｆｄ融合体を含有するプラスミドについてシーフ
ェンスし、正しいイン−フレーム融合が形成されている
ことの確認が行われた。このプラスミドはｐＱｌ　６Ｄ
と命名された。
４、軽鎖とＦｄ遺伝子に対するマルチシストロン発現系 細菌由来Ｆａｂを産生ずるには軽鎖とＦｄＯ両方が細胞
内で同時に生成される必要がある。これらの遺伝子のそ
れぞれについて、別々に構築したプラスミドを使用して
、両遺伝子を整列し、単一のプロモーターからの転写で
両遺伝子が転写されるような発現ベクターが構築された
。
これは２個の遺伝子の間の非コード化ＤＮＡを最小限に
するやり方でなされた。各遺伝子は翻訳開始に必要なリ
ポソーム結合部位と−４８から１ｅｌＢリ一ダー冒抗体
遺伝子接合部までの相同ＤＮＡ配列を持っている。プラ
スミドｐＳ２Ｄを１ＬｉＩで切断、Ｔ４ポリメラーゼで
処理して旦且土土Ｒ１で切断し、ベクター断片を精製し
た（図６Ｄ）。同様にｐＱｌ　６ＤをＸｈｏｌで切断、
Ｔ４ポリメラーゼで処理、ＥｃｏＲＩで切断し、Ｆｄ遺
伝子を含有する断片を精製した（図６Ｅ）。
精製したこれら２つのＤＮＡ断片を連結し、ｐＢ７Ｅを
作成した。これは近接して連結した２個のＫＭ１０キメ
ラ遺伝子融合体を含有する。２個の遺伝子シストロンは
ｐｌＮＧ３１０４内のｌ上ｌＢプロモーターの制御下に
置かれた。プラスミドｐ８７Ｅを５工」」で切断、Ｔ４
ポリメラーゼで処理、入↓」」で切断、そしてＦｄとに
遺伝子を含有する断片を精製した（図６Ｇ）。このＤＮ
Ａ断片を、旦ｃｏＲＩで切断、Ｔ４ポリメラーゼで処理
、ｘｈユ■で切断して生成したｐ　ｌＮＧ３１０４から
得たベクター断片に連結しく図６Ｆ）、ｐＩＮＧ３２０
２を作成した。このベクターはｈｃｏｌｉに於けるＫＭ
１０キメラＦａｂの発現に必要な特徴を全て有している
。
５、細菌に於けるキメラＫＭ１０Ｆａｂの産生り９旦に
於けるｐｌＮＧ３２０２からのＫＭ１０キメラＦａｂの
発現はａ　ｒａＢプロモーターの誘導性制御下にある。
アラビノース誘導を行うと培地に分泌されるＦａｂは１
０倍以上に増加した。
ｐＴＮＧ３２０２を内包している非誘導細菌コロニーは
形質の観点からｐｌＮＧ３１０４内包Ｅ、ｃ。
旦とは区別できなかった。ｐｌＮＧ３２０２内包菌株を
、炭素源として０．７％グリセロールを補足した最少培
地１０Ｌで培養し、０．２％アラビノースで１２時間以
上にわたり誘導した。ＦａｂはＥＬＩＳＡにより醗酵ブ
イヨン中で検出された。Ｆａｂはこの醗酵ブイヨンから
精製することができ、上記のキメラＦａｂと同じ性質を
有していた。細菌で産生されたキメラＫＭ１０Ｆａｂは
ＬＳ１７４Ｔ細胞に結合する。
慧並 上記の実施例は本発明のキメラＫＭ１０抗体と遺伝子工
学的に作製されたＫＭ１０Ｆａｂ蛋白の種々の重要な性
質を示している。まず、キメラＫＭ１０抗体とそのＦａ
ｂ誘導体は、マウスＫＭ１０抗体とほぼ同程度の親和性
でもってヒト腫瘍細胞株に結合する。キメラＫＭ１０抗
体はこれがヒト腫瘍細胞表面に結合する点で重要である
。ＫＭ１０ｍＡｂの主要臓器の線維芽細胞、内皮細胞ま
たは上皮細胞などの正常細胞との反応性は極小である。
従って、キメラＫＭ１０ｍＡｂはヒト腫瘍細胞と非腫瘍
細胞とをｉｎ　ｖｉｔｒｏで区別するのに有用である抗
原を明らかにすることができ、従って釦−！ロエｑ用診
断試薬としての有用性を有している。
ｗ＋Ａｂを使用した腫瘍治療の実施の将来性については
関心の持たれるところであるが、これまでのところ−Ａ
ｂ療法の成功例は限られている（Ｈｏｕｇｈｔｏｎｅｔ
　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ
ｃｉ、」Ｌ：　１２４２〜１２４６　（Ｆｅｂ、　１９
８５））　、修飾されていない元のマウスｍＡｂによる
治療効果は非常に低く実用に耐えない、キメラＫＭ１０
抗体はヒト腫瘍のｉｎ　ｖｊν０治療に対してマウスＫ
Ｍ１０ｍＡｂより改善された治療薬である。第一に、キ
メラＫＭ１０抗体がヒト腫瘍細胞株に対する高い生物学
的活性と正常組織に対する最小反応性を兼ね備えている
ことは、この抗体が悪性腫瘍組織の選択的破壊を媒介し
得ることを示唆している。第二に「よりヒト由来の」キ
メラＫＭ１０抗体はマウスＫＭ１０抗体に比べ、体内か
らの角、速なりリアランスに対し大きい抵抗を示す。第
三に、循環系（および多分、組織）に於ける存在量の増
大は、キメラＫＭ１０抗体とそれらの誘導体が、薬剤、
毒素、免疫変調剤、放射性核種などとの免疫複合体の形
でｉｎ　ｖｉｖｏでの腫瘍の診断および治療に好都合で
あることを意味している。このような免疫複合体および
それらを作る技術はこの分野の研究技術者には熟知され
ており、本発明の範囲内でキメラＫＭ１０抗体を修飾す
るのに使用することができる。
！丘 例証となるキメラＫＭ１０抗体分泌細胞株、２株を米国
出願臼に先立ち、１９８９年５月５日にＡＴ　ＣＣ，Ｒ
ｏｃｋｖｉｌｌｅ　Ｍａｒｙｌａｎｄに寄託した。それ
らは次の通りである： １、トランスフェクトされたハイブリドーマ５ｐ２１０
　（ｐ　Ｉ　ＮＧ２２４０およびｐｌＮＧ２２４２）、
Ｃ７３９株、ＡＴＣＣ＃ＨＢ１０１３１と指定された。
２、　Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　　ｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ　　　Ｐ　　Ｓ　　６　　（Ｐ　　Ｉ　　ＮＧ
３２００）、Ｇ２６７株、ＡＴＣＣ＃２０９４５と指定
された。
【図面の簡単な説明】
図１：ＫＭ１０重鎖のマウス可変領域をコードする塩基
配列。オリゴｄｃ尾部末端からＪＨ４ＣＨＩ接合部まで
の塩基配列を図に示す。また塩基配列から類推できるア
ミノ酸配列も図に示す。サイトダイレクティットミニー
タジェネシス（部位特異的突然変異）に用いたオリゴヌ
クレオチドと、制限酵素切断部位を導入した部位を太い
線で示す。 図２二ＫＭ１０カッパマウス可変領域をコードする一塩
基配列、オリゴｄｃ尾部末端からＪに５−Ｃに接合部ま
での塩基配列を図に示す。また塩基配列から類推できる
アミノ酸配列も図に示す、サイトダイレクティッドミニ
ータジェネシス（部位特異的突然変異）に用いたオリゴ
ヌクレオチドと制限酵素切断部位を導入した部位を太い
線で示す。 図３：マウスーヒトキメラＫＭ１０重鎖発現用咄乳動物
発現プラスミド、ｐｌＮＧ２２４０の構築。 ｃＤＮＡ、クローンｐＭ１０Ｇ−２可変領域が真核生物
用発現プラスミド、ｐｌＮＧ２２２７と融合できるよう
に工学的手法を施した。プラスミドｐｌＮＧ２２２７は
哺乳動物細胞における発現に有用な次のような遺伝子制
御部位を含む、：（１）　　ＩｇＧ重鎖エンハンサ−要
素、　（２）　　７’ベルソンＬＴＲプロモーター　　
（３）　　ＳＶ４０　１６Ｓスプライス部位、及び　（
４）ＩｇＧ重鎖ポリアゾニレ−ジョンシグナル配列。こ
のプラスミドｐｌＮＧ２２２７は、また　ｐＧＭＨ−６
からの完全なヒトＩｇＧ１一定常領域をも含む（Ｌｉｕ
Ａ、Ｙ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４：３４３９−３４
４３．１９８７））。ｐｌＮＧ２２２７はトランスフェ
クションされた細胞内において０４１８選択のできるネ
オマイシンリン酸トランスフェラーゼ遺伝子を含む。 図４：マウスーヒトキメラＫＭ１０軽鎖発現に用いる哺
乳動物発現プラスミド、ｐｌＮＧ２２４２の構築。ｃＤ
ＮＡクローンｐＭ１０に−１６の可変領域が、真核生物
用発現プラスミドｐＴＮＧ１７１２と融合できるように
工学的手法を施した。 プラスミドｐｌＮＧ１７１２は哺乳動物細胞における発
現に有用な次のような遺伝子制御部位を含む。： （１）ＩｇＨエンハンサ−要素、（２）アベルソンＬＴ
Ｒプロモーター　　（３）　　Ｓ　Ｖ　４０　１６　Ｓ
スプライス部位、及び（４）　　ヒトにポリアゾニレ−
ジョンシグナル配列。このプラスミドｐＩＮＧ１１１２
は、また完全なヒトに定常領域（Ｌｉｕ、＾、Ｙ、　ｅ
ｔａｌ、、同上）と形質転換された細胞内でのマイコフ
ェノール酸抵抗性をもたらすＧＰＴ遺伝子を含む。 図５：Ｆａｂ発現のための酵母発現プラスミド。 図示については下記の通りである。： ａ；　酵母ＰＧＫプロモーターとインベルターゼシグナ
ル配列及びＰＧＫポリアゾニレ−ジョンシグナルと融合
したＫＭ１０キメラ軽鎖遺伝子を含む酵母発現プラスミ
ド、ｂ、Ｆｄ遺伝子を含む同様の酵母プラスミド、ｃ；
　　ＰＧＫプロモーター／リーダー転写終結シグナルと
融合した軽鎖を含む酵母発現プラスミド、ｄ、Ｆｄ遺伝
子を含む同様の酵母発現プラスミド、及びｅ；最終的な
２つ（軽鎖と重鎖）の遺伝子を含む酵母発現プラスミド
ｐｌＮｃ３２００゜ 図６＝バクテリアのキメラＫＭ１０Ｆａｂ発現プラスミ
ド、ｐｌＮＧ３２０２の構築。プラスミドｐｌＮＧ３２
０２は、大腸菌における発現に有用な次のような部位を
含む。： （１）ａｒａＣ遺伝子、（２）誘導性のａｒａＢプロモ
ーター、（３）ＪＬＬ１Ｂリーダー配列と融合したジシ
ストロニックなＫＭ１０のＦｄとに遺伝子、（４）エエ
且Ａ転写ターミネーター配列、及び（５）大腸菌内にお
いて選択に有用なＬｅｔ”遺伝子。

Claims (28)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）マウスＫＭ１０モノクローナル抗体と結合する抗
    原に対して特異性を有する免疫グロブリン鎖の可変領域
    をコードするｃＤＮＡ配列を含んでなることを特徴とす
    るポリヌクレオチド分子。
  2. （２）該鎖が重鎖である請求範囲第（１）項記載の分子
    。
  3. （３）該鎖が軽鎖である請求範囲第（１）項記載の分子
    。
  4. （４）ヒト免疫グロブリン鎖の定常領域をコードする付
    加的配列を更に含んでなり、該配列の両者が互いに操作
    可能に結合されている請求範囲第（１）項の分子。
  5. （５）該付加的配列がｃＤＮＡ配列である請求範囲第（
    ４）項の分子。
  6. （６）組み換えＤＮＡ遺伝子である請求範囲第（１）項
    の分子。
  7. （７）二本鎖ＤＮＡ形態である請求範囲第（６）項の分
    子。
  8. （８）発現可能なベヒクルである請求範囲第（７）項の
    分子。
  9. （９）該ベヒクルがプラスミドである請求範囲第（８）
    項の分子。
  10. （１０）請求範囲第（４）項の分子で形質転換された原
    核生物宿主。
  11. （１１）細菌である請求範囲第（１０）項の宿主。
  12. （１２）請求範囲第（４）項記載の分子でトランスフェ
    クトされた真核生物宿主。
  13. （１３）酵母細胞または哺乳動物細胞である請求範囲第
    （１２）項の宿主。
  14. （１４）ヒト定常領域およびＫＭ１０マウスモノクロー
    ナル抗体と結合する抗原に対し特異性を有する可変領域
    を含んでなる免疫グロブリン重鎖。
  15. （１５）ヒト定常領域およびＫＭ１０マウスモノクロー
    ナル抗体と結合する抗原に対し特異性を有する可変領域
    を含んでなる免疫グロブリン軽鎖。
  16. （１６）２つの軽鎖と２つの重鎖を含んでなり、該鎖は
    それぞれヒト定常領域およびＫＭ１０マウスモノクロー
    ナル抗体と結合する抗原に対し、特異性を有する可変領
    域を含んでなるキメラ抗体分子。
  17. （１７）検出可能な標識形態にある請求範囲第（１６）
    項の抗体。
  18. （１８）水−不溶性固体層に固定化した請求範囲第（１
    ６）項の抗体。
  19. （１９）ヒト定常領域およびＫＭ１０マウスモノクロー
    ナル抗体と結合する抗原に対して特異性を有する可変領
    域を有する免疫グロブリン重鎖を調製する工程で次のも
    のを含んでなる： 培養条件下で該鎖を発現し得る宿主の培養；および該培
    養液から該重鎖の回収。
  20. （２０）ヒト定常領域およびＫＭ１０マウスモノクロー
    ナル抗体と結合する抗原に対し特異性を持つ可変領域を
    有する免疫グロブリン軽鎖を調製する工程で次のものを
    含んでなる： 培養条件下で該鎖を発現し得る宿主の培養；および該培
    養液から該軽鎖の回収。
  21. （２１）重鎖と軽鎖を含有するキメラ免疫グロブリンを
    調製する工程で、該重鎖、軽鎖の各々がヒト定常領域お
    よびＫＭ１０マウスモノクローナル抗体と結合する抗原
    に対して特異性を持つ可変領域を有し、次のものを含ん
    でなる： 培養条件下で該重鎖または該軽鎖、または両者を発現し
    得る宿主の培養；および該培養液から該キメラ免疫グロ
    ブリン分子の回収。
  22. （２２）該宿主が原核生物である請求範囲第（１９）、
    第（２０）、第（２１）のいずれかの工程。
  23. （２３）該宿主が真核生物である請求範囲第（１９）、
    第（２０）、第（２１）項のいずれかの工程。
  24. （２４）下記のものを含んでなる試料中ＫＭ１０マウス
    モノクローナル抗体と結合し得る抗原を検出する免疫ア
    ッセイの方法： 該試料を請求範囲第（１６）項の抗体と接触させること
    ；および該抗体が該抗原と結合するか否かを検出するこ
    と。
  25. （２５）該抗原を請求範囲第（１７）項の標識抗体と接
    触させることおよび該抗体を検出することを含んでなる
    、ＫＭ１０マウスモノクローナル抗体と結合可能な抗原
    を検出する￥ｉｎ　ｖｉｖｏ￥または￥ｉｎ　ｖｉｔｒ
    ｏ￥の画像法。
  26. （２６）下記の事柄を含んでなる、ＫＭ１０マウスモノ
    クローナル抗体に結合可能である抗原を持っている細胞
    を殺消する方法： 該細胞を請求範囲第（１６）項の抗体と接触させること
    および該殺消を引き起こさせること。
  27. （２７）該細胞の補体媒介細胞溶解により該殺消が生じ
    る、請求範囲第（２６）項の方法。
  28. （２８）該殺消がＡＤＣＣによって生じる、請求範囲第
    （２６）項の方法。
JP2162545A 1989-06-19 1990-06-19 ヒト腫瘍細胞抗原に対し特異性を持つマウス―ヒトキメラｋｍ１０抗体 Pending JPH03280884A (ja)

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