【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
「ｆ業上の利用分野」
本発明は、α−カゼインのペプシン分解物からｊＩＬｓ
された新規ペプチドおよびその薬学的に許容される塩に
関する。さらに詳しくは、下式（１）％式％
）
（式中、ＲはＯＨまたはＬｅｕ−Ｏｌｌを示す）で示さ
れるペプチドおよびその薬学的に許容される塩に関する
０式（１）のペプチドおよびその薬学的に許容される塩
は血小板凝集阻害作用を有し、血栓症の治療および予防
に有用である。
「従来の技術」
生体の血管または心臓の腔内で血液成分が局所的に凝固
したものを血栓といい、血栓は血管内腔の狭窄または間
奏を引き起こす、そして血栓形成とそれに伴う病的現象
を血栓症と言う。
血栓形成には血小板の凝集が関与しているので血小板凝
集阻害作用を有する化合物は、血栓症の治療および予防
に有用である。
血小板凝集阻害作用を有する化合物は種々知られている
が、血小板凝集阻害作用を有するペプチドの報告例は数
少ない。
血小板凝集阻害作用が認められているペプチドとしては
、例えばに−カゼインのフラグメントペプチドが報告さ
れている（ Ｅｕｒ、 Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅａ、１５８
巻、３７９頁、１９８６年参照）が、これは、木発明ペ
プチドと全く構造を異にしている。そして、ａ−カゼイ
ンからは血小板１１２集閉害作用を存するペプチドが単
側されたとの報告はない。
「発明が解決しようとする！！題」
本発明者は、ａ−カゼインから血小板凝集阻害作用を有
するペプチドを見い出すべく種々検詞した０本発明の目
的は血小板凝集阻害活性を有する新規ペプチドまたはそ
の薬学的に許容される塩を提供することにある。
ｒｉＢを解決するための手段」
α−カゼインをペプシンで加水分解し、得られる加水分
解物を分画して種々検削の結果、本発明者等は血小板凝
集阻害活性を有する下式（＋）Ｈ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｇ
ｌｎ−Ｈｌｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−＾１ａ−Ｍｅｔ−Ｌｙ
ｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｉ Ｉｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｙ
ｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−＋１ｃｍＰｒｏ−Ｔｙｒ
−Ｖａｌ−＾ｒＨ−Ｔｙｒ−Ｒ・・・（１）（式中、Ｒ
は０１１またはＬｅｕ−０）１を示す）で示される新規
ペプチドまたはその薬学的に許容される塩の！＃動に成
功した。またこの合成にも成功して本発明を完成した。
ｆｊお、本Ｉ！１細書において、アミノ酸、アミノ酸残
基、ア泉ノ酸誘導体、ペプチド、保！ｉ基は１ｕＰＡｃ
−ＩＵＢ生化学命名委員会で１ｆｔ奨された記号（［１
ｉｏｃｈｅｍｌｓｔｒｙ、ＩＩ！’、１７２６頁、１９
７２年、ＩＵＰＡＣＰｕｒｅ Ａｐｐｌ、、４０４！、
３１７頁、１９７４年参照）ｔたは当該分野において慣
用される記号を用い、Ｌ−アミノ酸およびその残基のＬ
記号は省略する。かかる記号は例えば以下の通りである
。
Ｖａｌ：バリン、Ｔｙｒ ：チロシン、６１ｎ：グルタ
ミン、Ｇｌｕ：グルタミン酸、Ｈｉｓ：ヒスチジン、Ｌ
ｙｓ ：リジン、＾ｌａアラニン、Ｍｅｔメヂオニン、
Ｐｒｏニブロリン、Ｔｒｐトリプトファン、Ｉｌｅ：
イソロイシン、Ｔｈｒ ：スレオニン、＾「ｇ：アルギ
ニン、 Ｌｅｕ：ロイシン、Ｂｏｃ： ｔ−ブチルオキ
シカルボニル、Ｂｒ−Ｚ： Ｐ−ブロモベンジルオキシ
カルボニル、 ＣＩ−Ｚ： ｐ−クロロベンジルオキシ
カルボニル、Ｂｚｌ：ベンジル、Ｍｔｓ ：メシチレン
ー２−スルホニル、Ｄｎｐ：２，４−ジニトロフェニル
、ＣＨＩＪ＝ホルミル。
最初に、ａ−カゼインからの製造法について説明する。
α−カゼインの加水分解は、α−カゼインを塩酸中、ペ
プシンで行う、塩酸には通常０．０５〜１．５規定、好
ましくは約０．１規定の塩酸を使用しその使用量は、通
常α−カゼインに対して７〜２０倍（Ｖ／ｗ）である。
ペプシンの使用量は、カゼイン１！！量部に対して通常
０．０１〜０．０５重量部であり、好ましくは００２〜
０．０３ｆｉ量部である。
加水分解反応は、通常３５〜３８℃で３０分〜３時間、
好ましくは３７℃で約１時間行う。
次に、上記加水分解反応液にアルカリ、好ましくは、ア
ンモニア水を添加し反応液のｐｌ＋を約４にユＸ１整し
、不溶物を除去して加水分解物の水溶１ｆｔ（以下、こ
れを加水分解液と呼ぶ）を得る。
次に、陽イオン交換体を充填したカラムクロマトグラフ
ィーにより加水分解液から塩基性ペプチド混合物を分画
する。
この操作は、加水分解液を弱酸性〜弱塩基性に７Ａ整し
た後、陽イオン交換体（緩衝液で平衡化済み）を充填し
たカラムに付して加水分解液中の塩基性ペプチドを＠着
させ、次いで溶出ｍ奴でこれを溶出させ分画することに
より行なう。
陽イオン交換体には、例えばＣＭ−５ｅｐｈａｄｅｘ
＠Ｃ−２５、ＣＭ−５ｅｐｈａｄｅｘ ＠Ｃ−５０（い
ずれもファルマシア社製）の如きカルボキシル基を有す
るイオン交換体（弱酸性陽イオン交換体と呼ぶ）を使用
する。
陽イオン交換体の平衡化は、弱酸性〜弱塩基性の緩衝液
、好ましくは、ｐＨ約８６の酢酸−アンモニア緩衝液を
使用する。
溶出溶媒には、例えば、酢酸−アンモニア緩衝液、炭酸
アンモニウム水溶液、アンモニア水ｔＢ液等の徴塩基性
〜塩基性の溶出溶媒を用い、このｐｌあるいは／および
濃度を上昇させｔｌがら溶出を行う。
塩基性ペプチド混合物は溶出溶媒のｐＨあるいは塩濃度
が高い時に溶出する０例えばイオン交換体としてＣＭ−
５ｅｐｈａｄｅｘ ＠ Ｃ−２５（ファルマシア社製）
を用い、熔出ｊ６ ’）ｌとして炭酸アンモニウム水溶
液を用いた場合、炭酸アンモニウム濃度が約０．０２Ｍ
の時に熔出し妬め、約０．３Ｍの時に溶出し終る。
ｔｔ ｊｊ、効率良い分画のために、加水分解液および
溶出液に０．０１〜５ｍｉ％の割合で例えば、ポリオキ
シエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアル
キルフェニルエーテル、グリセリン脂肪酸エステル、ソ
ルビタン脂肪酸エステル、シ日ｌｌｌｌ１１肪酸エステ
ル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル等の
非イオン界面活性剤を添加するのが好ましい。
次に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によっ
て、塩基性ペプチド混合物から本発明ペプチドまたはそ
の塩を単離する。
ＨＰＬＣのカラムには、逆相系カラム、好ましくはオク
タデシルシリル化シリカゲル（ＯＤ Ｓ ）を充填した
カラムを使用する。溶出溶媒には例えばアセトニトリル
等の有ＩＩ ｆ８ ｔｌＩＬと水およびトリフルオロ酢
酸との混合溶媒を使用し、Ｈましくは有機溶媒のｄＡｙ
Ｌ勾配をかけて溶出する。ペプチドの検出は、溶出溶媒
の２８（ｉｎｎ 、 ２７５ｎｍ 、 ２３Ｓｎｍある
いは２２０同付近の吸光度を測定することにより行う。
例えば、カラムにＹＭＣ５）１３４３−５００５ （２
０ｍｍ ｘ１５０ｍｍ 、株式会社山村化学研究所製）
を用い、木−アセトニトリル−トリフルオロ酢酸（８５
：ｌ５Ｏ０ｌ）から水−アセトニトリル−トリフルオロ
酢酸（３０ニア０：（１，１）の直線的濃度勾配法で溶
出（ｔｌ速＋ｓ、ｏｍｌ／分）すると、式（りにおいて
ＲがＯＨの本発明ペプチド（１−１）のトリフルオロ酢
酸塩は保持時間的２３．１分で溶出し、式（１）におい
てＲがＬｅｕ−ＯＨの本発明ペプチド（１−２）のトリ
フルオロ酢酸塩は保持時間的２８．２分で溶出するので
、この四分をそれぞれ分取し、減圧ｄＩ縮、乾燥あるい
は凍結乾燥することにより本発明ペプチドのトリフルオ
ロ酢酸塩を得ることが出来る。
また、目的とする両分は、溶出液のカルモジュリン依存
ホスホジェステラーゼ阻害活性を指揮にして分取するこ
とも出来る。カルモジュリン依存ホスホジェステラーゼ
阻害活性の測定は、ウシ脳カルモジュリンおよびウシ脳
ホスホジェステラーゼを用い公知の方法（＾ｎａｌｙｔ
ｉｅａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。
４５壱、２２２頁、１９７２年参照〉により測定する。
次に、合成による本発明ペプチドまたはその塩の製造方
法について説明する。
本発明のペプチドまたはその塩は１例えば固相法（ペプ
チド合成の基礎と実馳、泉屋信夫など、丸善株式会社、
１９８５年出版１ｌ９４頁参照）により逐次、保護アミ
ノ酸を縮合して合成することが出来る。固相担体には４
−（ヒドロキシメチル）フェニルアセトアミドメチルポ
リ（スチレンーコージビニルベンゼン） （Ｊｏｕｒｎ
ａｌ ｏｆ ｔｈｅ＾−ｅｒｉｃａｎＣｈｅｍｉｃａｌ
５ｏｃｉｅｔｙ、９８壱、７３５７頁、ｌ５７６年参
照、以下、ＨＯＣＨ，−Ｐａｎ−８４ｆｆ１と略記）が
好適に用いられる。
アミノ酸のα−アミソ基の保臘には、トリフルオロ酢酸
あるいは塩酸で切断され易い保護基、例えばＢＯＣ基が
用いられる。アミノ酸の側鎖官能基にはこれら酸で切断
され難い保！ｉ基を用いる。すなわちＴｙｒの水酸基は
Ｂｒ−Ｚ基で、＾「８のグアニジノ基はＭｔｓ基で、Ｌ
ｙｓのε−アミノ基はＣ＋−Ｚ基で、Ｔｈｒの水酸基は
Ｂｘｌ ＆で、 Ｈｉｓのイミダゾリル基はＤｎｐ基で
モしてＴｒｐのインドール基はそｉｌぞれホルミル基で
保璋するのが好適である。
担体上でのペプチド鎖の延長は通常の固相法に従い行う
ことが出来る。すなわち、Ｎ端アミノ基の脱保護と保護
アミノ酸との縮合反応をくり返し担体上にＣ＃４から順
次ペプチド鎖を延長させ保護ペプチド−Ｐａｗ−樹脂を
得る。
縮合反応は、ジシクロへキシルカルボジイミド法を用い
ることも出来るが、活性エステル法、特に保護アミノ酸
の１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルを用いる
活性エステル法が副反応が少く好ましい。
担体からのペプチドの切断および保護基の除去は、フッ
化水素で除去できない保護基、例えば旧Ｓイミダゾリル
基のＤｎｐをチオリシスで除去した後、−クレゾール、
エタンジチオール、ジメチルスルフィド等の存在下にフ
ッ化水素で行うことが出来る。
担体からの切断および脱保護により得られた粗ペプチド
またはその塩は、カラムクロマトグラフィーあるいは前
記と同様高速液体クロマトグラフィー等により精製する
ことが出来る。
０
「発明の効果」
本発明のペプチドおよびその薬学的に許容される塩はア
デノシン−５° −ジホスフェート（＾ＤＩ’）誘発血
小板凝集に対する阻害活性およびコラーゲン誘発血小板
凝集に対する阻害活性を有する（後記試験例１参照〉、
従って、血栓症の治療および予防に有用である。また、
生化学的試薬としても有用である。
以下、本発明ペプチドの血小板凝集作用について試験例
を挙げて説明する。"Field of industrial application" The present invention is directed to the production of jILs from the pepsin decomposition product of α-casein.
The present invention relates to novel peptides and pharmaceutically acceptable salts thereof. More specifically, the peptide of formula (1) and its pharmaceutically acceptable salts are related to the peptide represented by the following formula (1) (% formula %) (in the formula, R represents OH or Leu-Oll) and its pharmaceutically acceptable salt. Pharmaceutically acceptable salts have platelet aggregation inhibiting effects and are useful in the treatment and prevention of thrombosis. ``Prior art'' Local coagulation of blood components within a living body's blood vessels or heart cavity is called a thrombus. Thrombi cause narrowing or interlude in the vascular lumen, and cause thrombus formation and associated pathological phenomena. It's called thrombosis. Since platelet aggregation is involved in thrombus formation, compounds that inhibit platelet aggregation are useful for treating and preventing thrombosis. Although various compounds are known that have an inhibitory effect on platelet aggregation, there are only a few reports of peptides that have an inhibitory effect on platelet aggregation. As a peptide that has been shown to inhibit platelet aggregation, for example, a fragment peptide of casein has been reported (Eur, J., Biochea, 158
Vol., p. 379, 1986), but its structure is completely different from that of the wood-invented peptide. Furthermore, there is no report that a peptide having a platelet 112 attracting and blocking effect was isolated from a-casein. "Problem to be Solved by the Invention" The present inventor has made various efforts to discover a peptide from a-casein that has an inhibitory effect on platelet aggregation. The object of the present invention is to provide pharmaceutically acceptable salts. "Means for Solving riB" As a result of hydrolyzing α-casein with pepsin, fractionating the resulting hydrolyzate, and conducting various tests, the present inventors have determined that the following formula (+) has platelet aggregation inhibiting activity. H-Val-Tyr-G
ln-Hls-Gln-Lys-^1a-Met-Ly
s-Pro-Trp-I Ie-Gln-Pro-Ly
s-Thr-Lys-Val-+1cmPro-Tyr
-Val-^rH-Tyr-R... (1) (wherein, R
011 or Leu-0)1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof! ＃The movement was successful. They also succeeded in this synthesis and completed the present invention. fj Oh, book I! In one specification, amino acids, amino acid residues, azumi acid derivatives, peptides, and protection! i group is 1uPAc
- The symbol recommended by the IUB Biochemical Nomenclature Committee ([1
iochemlstry, II! ', p. 1726, 19
72 years, IUPAC Pure Appl,, 404! ,
(see p. 317, 1974) or the symbols commonly used in the field to denote L-amino acids and their residues.
Symbols are omitted. Examples of such symbols are as follows. Val: valine, Tyr: tyrosine, 61n: glutamine, Glu: glutamic acid, His: histidine, L
ys: lysine, ^la alanine, Metmethionine,
Pronibroline, Trp tryptophan, Ile:
Isoleucine, Thr: threonine, g: arginine, Leu: leucine, Boc: t-butyloxycarbonyl, Br-Z: P-bromobenzyloxycarbonyl, CI-Z: p-chlorobenzyloxycarbonyl, Bzl: benzyl, Mts: mesitylene-2-sulfonyl, Dnp: 2,4-dinitrophenyl, CHIJ = formyl. First, the production method from a-casein will be explained. Hydrolysis of α-casein is carried out by treating α-casein with pepsin in hydrochloric acid. The hydrochloric acid used is usually 0.05 to 1.5 N, preferably about 0.1 N, and the amount used is usually 7 to 20 times (V/w) that of α-casein. The amount of pepsin used is usually 0.01 to 0.05 parts by weight, preferably 0.02 to 0.05 parts by weight, per 1 part of casein.
The amount is 0.03 fi parts. The hydrolysis reaction is usually carried out at 35 to 38°C for 30 minutes to 3 hours.
It is preferably carried out at 37°C for about 1 hour. Next, an alkali, preferably aqueous ammonia, is added to the above hydrolysis reaction solution to adjust the PL+ of the reaction solution to about 4, and the insoluble matter is removed to dissolve 1 ft of the hydrolyzate in water (hereinafter referred to as hydration). (referred to as decomposition liquid) is obtained. Next, the basic peptide mixture is fractionated from the hydrolysis solution by column chromatography packed with a cation exchanger. In this operation, the hydrolyzate is adjusted to 7A to be weakly acidic to weakly basic, and then subjected to a column packed with a cation exchanger (equilibrated with a buffer solution) to remove the basic peptides in the hydrolyzate. This is carried out by allowing the protein to attach to the membrane, and then eluting and fractionating it using an eluator. Cation exchangers include, for example, CM-5ephadex.
An ion exchanger having a carboxyl group (referred to as a weakly acidic cation exchanger) such as @C-25 and CM-5ephadex @C-50 (both manufactured by Pharmacia) is used. Equilibration of the cation exchanger uses a weakly acidic to weakly basic buffer, preferably an acetic acid-ammonia buffer with a pH of about 86. As the elution solvent, for example, a basic to basic elution solvent such as an acetic acid-ammonia buffer solution, an aqueous ammonium carbonate solution, or an aqueous ammonia tB solution is used, and elution is performed while increasing the pl and/or concentration and tl. Basic peptide mixtures elute when the pH or salt concentration of the elution solvent is high. For example, CM-
5ephadex @ C-25 (manufactured by Pharmacia)
When using an ammonium carbonate aqueous solution as the melting agent, the ammonium carbonate concentration is approximately 0.02M.
It starts to melt at about 0.3M, and ends at about 0.3M. For efficient fractionation, for example, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene alkyl phenyl ether, glycerin fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester, It is preferable to add a nonionic surfactant such as a fatty acid ester or a polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester. Next, the peptide of the present invention or a salt thereof is isolated from the basic peptide mixture by high performance liquid chromatography (HPLC). A reverse phase column, preferably a column packed with octadecylsilylated silica gel (OD S ), is used as the HPLC column. For example, a mixed solvent of acetonitrile or other f8 tlIL, water, and trifluoroacetic acid is used as the elution solvent, and H or an organic solvent dAy is used.
Elute using a L gradient. Peptide detection is performed by measuring the absorbance of the elution solvent at 28 (inn, 275 nm, 23 S nm, or around 220 nm).
0mm x 150mm, manufactured by Yamamura Chemical Research Institute Co., Ltd.)
using wood-acetonitrile-trifluoroacetic acid (85
: 15O0l) by a linear concentration gradient method of water-acetonitrile-trifluoroacetic acid (30N0:(1,1) (tl speed + s, oml/min), the present invention where R is OH in the formula The trifluoroacetate of the peptide (1-1) elutes at a retention time of 23.1 minutes, and the trifluoroacetate of the peptide (1-2) of the present invention in which R is Leu-OH in formula (1) elutes at a retention time of 23.1 minutes. Since the target elutes at 28.2 minutes, the trifluoroacetate of the peptide of the present invention can be obtained by separating each of these four fractions, compressing them under reduced pressure and drying or freeze-drying them. The fraction can also be fractionated based on the calmodulin-dependent phosphogesterase inhibitory activity of the eluate.The calmodulin-dependent phosphogesterase inhibitory activity can be measured by a known method using bovine brain calmodulin and bovine brain phosphogesterase ( ^nalyt
ieal Biochemistry. 45, 1, p. 222, 1972). Next, a method for producing the peptide of the present invention or a salt thereof by synthesis will be explained. The peptide of the present invention or its salt can be prepared by one method, for example, by solid-phase method (Basics and Practice of Peptide Synthesis, Nobuo Izumiya et al., Maruzen Co., Ltd.,
(Refer to p. 1194, published in 1985), it can be synthesized by sequentially condensing protected amino acids. 4 on the solid phase support
-(Hydroxymethyl)phenylacetamidomethylpoly(styrene-codivinylbenzene) (Journ
al of the^-ericanChemical
5ociety, 981, p. 7357, 1576, hereinafter abbreviated as HOCH, -Pan-84ff1) is preferably used. A protecting group that is easily cleaved with trifluoroacetic acid or hydrochloric acid, such as a BOC group, is used to protect the α-amiso group of an amino acid. The side chain functional groups of amino acids have a structure that is difficult to cleave with these acids! Use the i group. That is, the hydroxyl group of Tyr is a Br-Z group, and the guanidino group of 8 is an Mts group,
It is preferable to bind the ε-amino group of ys with a C+-Z group, the hydroxyl group of Thr with Bxl &, the imidazolyl group of His with a Dnp group, and the indole group of Trp with a formyl group. It is. Extension of the peptide chain on the carrier can be carried out according to a conventional solid phase method. That is, the deprotection of the N-terminal amino group and the condensation reaction with the protected amino acid are repeated to extend the peptide chain sequentially from C#4 onto the carrier to obtain a protected peptide-Paw-resin. For the condensation reaction, a dicyclohexylcarbodiimide method may be used, but an active ester method, particularly an active ester method using a 1-hydroxybenzotriazole ester of a protected amino acid, is preferred because it causes fewer side reactions. Cleavage of the peptide from the carrier and removal of the protecting group are carried out by removing the protecting group that cannot be removed with hydrogen fluoride, such as the Dnp of the former S imidazolyl group, by thiolysis, followed by -cresol,
This can be carried out using hydrogen fluoride in the presence of ethanedithiol, dimethyl sulfide, etc. The crude peptide or salt thereof obtained by cleavage from the carrier and deprotection can be purified by column chromatography or high performance liquid chromatography as described above. 0 "Effects of the Invention" The peptide of the present invention and its pharmaceutically acceptable salts have inhibitory activity against adenosine-5°-diphosphate (^DI')-induced platelet aggregation and inhibitory activity against collagen-induced platelet aggregation (see below). See Test Example 1〉,
Therefore, it is useful for treating and preventing thrombosis. Also,
It is also useful as a biochemical reagent. Hereinafter, the platelet aggregation effect of the peptide of the present invention will be explained using test examples.
【試験例１］
Ｎａｔｕｒｅ、 １９４ ＠、 ９２７〜９２９頁（１
１６２年）に記載の方法に従って、以下の通り、アデノ
シン−５’％−ジホスフェート（＾Ｄｒ）誘発血小板凝
集に対する阻害活性およびコラーゲン誘発血小板凝集に
対する阻害活性を測定した。
１検体
本発明ペプチド（１−１）のトリフルオロ酢酸塩・・・
Ｈ−Ｖａｔ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｈｌｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ
−＾Ｉａ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−目ｅ−Ｇ
ｌｎ−ｒ’ｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−１
１ｅ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−＾ｒｇ−Ｔｙｒ−ＯＨ
・トリフルオロ酢酸塩［実施例１で得たペプチド（１−
１） ・トリフルオロ酢酸塩］本発明ペプチド（１−
２）のトリフルオロ酢酸塩・・・Ｈ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−
Ｇｉｎ−Ｈｌｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−＾ｌａ−Ｍｅｔ−Ｌ
ｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−＋１ｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｙ
ｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ
−シａｌ−＾ｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−０）１・）リフル
オロ酢酸塩［実施例１で得たペプチド（１−２） ・
トリフルオロ酢酸塩］２、試験方法
（２−１１血小板ｍｆｆ１（ｐ＋ｕ＋） ト乏血小板血
漿（ＰＰｆ’）の調整：
モルモット（４７０〜６ｏ０ｇ）より採取された血液に
１１１Ｏ容の３．８％クエン酸ナトリウム水溶液を加え
て１１０（ｌｒ、ｐ、ｓ、 （１３０ｘ ｇ）で１０分
間遠心分離し、血小板濃度の高い上澄を得た。残漬を更
に３０００ｒ、ｐ、ｍ、 （１７００ｘ ｇ）で１５分
間遠心分離して上澄部分を採取して乏血小板血漿（以下
ＰＰＰと略す）を得た。前記の血小板濃度の高い上澄中
の血小板数をコールタ−カウンター（コールタ１
２
一エレクトロニクス社）により計算し、ＰＰＰで５ ｘ
ＩＯ’ｃｅｌｌｓ／ｃｍ’に希釈して多血小板血Ｉ！
！（以下ＰＩＩＰと略す）を調製した。
＋２−２１八〇Ｐ誘発ｌＩ＆阻害試験
回転子を入れた血小板凝集ｆｌｌｉ！芝用セルにｒｎｒ
１６０μＱおよび検体溶液（生理食塩水溶液に溶解して
調製）２０μＯを加え、攪拌した。このセルをヘマトレ
ーサー（三光バイオサイエンス社製）中、３７℃で１分
間インキュベーションした。
その後、５０μＨアデノシン−５°−ジホスフェート（
＾Ｄｒ）溶液［＾Ｄｒ （シグマ社製）を２５１１ト
リス−塩酸緩衝液（ｐｌ＋７．４１に熔解して調製３２
０１口を加え、血小板の凝集を５分間モニタリングした
。
血小板の８１集が最大とｔｊった時点（光の透過度が最
大となった時点）の凝！ｆ！（Ｂ）を下記の式により算
出した。
ａ ： ＰＲＰの光の透過度
ｂ ： ＰＰＰの光の透過度
Ｃ：上記の方法で血小板凝集を起こさせ血小板凝集が最
大となったときの光の透過度一方、検体溶液の代わりに
生理食塩水を加え同１！ｅ血小板を凝集させ、コントロ
ールの凝集率（Ａ）を求め、下式により凝集阻害率（％
）を算出した。
凝集阻害！Ｉ！（％）＝１−ＸＩＯ［＋種々の濃度の検
体溶液について上記と同様に試験し、検体が５０％の凝
集阻害率を示す濃度（ＩＣ５ｏ値）を、用量反応１ＩＩ
ｌ線のＩｉＩ線回帰によって求めた。
（２−３）コラーゲン誘発凝集阻害試験凝集剤として＾
ＤＰ ｆ８液を用いるかわりにコラーゲン溶ｉ［コラー
ゲンのアイソトニックグルコース悲濁液ｐＨ２，７〜２
．９（ホルム社製）をアイソ］・ニックグルコースｍ
？＆で１０倍に希釈して調製、濃度１００μｇ／ｍｌ
］ ２０μＱを加え、血小板のｇｌｉ２を１０分間モニ
タリングする以外は上４
Ｒｔ２−２） と同様にして、ｒ ｃ 、 ｏ ｉｂ
を求めた。
３．試験結果
第１表に示す。
第１表
°）検体は、それぞれのペプチドのトリフルオロ酢酸塩
である。
以下、実施例を挙げて本発明を説明する。
なお、本発明ペプチドわよびその塩の各種分析は、下記
の方法で実施した。
ペプチドのＣアミノ ： ０．２Ｍ Ｎ−二チル
モルホリンー酢＠ｌｌｋｍｆｌｔ （ｐＨ８，５） Ｏ
，Ｓｍｌ ニ溶解したペプチド約８ｎｍｏｌに対し、ジ
イソプロピルフルオロリン酸で釦理したカルボキシペプ
チダーゼＡ（シグマ社製タイプＩ）の８ｐ■Ｏ１を加え
、２５℃で反応を行い、１ｌｌＩ的に遊間のアミノ酸を
アミノ酸分析機で定量することにより行？ｊった。
アミノ １１ ：気相プロティンシーケンサ−（ア
プライドバイオシステムズ社４７１＾）で行なった。
のアミノ ：４％グリコール酸
を含む６Ｎ ＭＣＩで加水分解（１１０℃、２２時間）
して得た加水分解物をアミノ酸分析機（日立８３５型）
で行ｆｌった。
体クロマトグラフィー Ｒｔ ’、Ｒｔ ’土
、トに生」エニ」−二東ソー株式会社製高速液体クロマ
トグラフを使用し、下記条件で測定した。
Ｒｔ’の測定条件
カラム： ＹＭＣ＾コ１２０ＤＳ （８ｍｓ ｘ ＩＳ
Ｄｍｍ、株式会社山村化学研究所製）
溶出：水−アセトニトリル−トリフルオロ酢酸（ＩＩｓ
：Ｉｓ：０．１）から水−アセトニトリル−トリフルオ
ロ酢酸（３０ニア０：０．１）のｉ純的濃度勾配
流速：ｌ、５量ｌ／分
５
６
検出： ２７５ ｎ■における吸光度
Ｒｔ’の測定条件
溶出に水−アセトニトリル−トリフルオロ酸＠ （７９
：２１：０．１）を使用する（濃度勾配をかけない）以
外は、Ｒｔ’の測定の場合に同じ。
Ｒｔ”の測定条件
溶出に水−アセトニトリル−トリフルオロ酸Ｍ （７５
：２５：０．１）を使用する（濃度勾配をかけない〉以
外は、Ｒｔ’の測定の場合に同じ。
実施例１ カゼイン加水分解物からのｊＩＬＩＩｌα−
カゼイン（シグマ社製） １０ｇを（１，ＩＮ塩酸２０
０■１に３７℃で懸濁し、これにペプシン（バイオザイ
ムラボラトリー製）２５ｏ■ｇを加え、同温で１＆８間
攪拌した０反応液のｐＨをアンモニア水の添加によって
４，２に調整した後、遠心分＠ （８０００ｒｐｍ）
して不溶物を除去した。
得られた上清にＴｒｉＬｏｎ Ｘ−１００［ポリオキシ
エチレン（ｌＯ）オクチルフェニルエーテルの商品名〕
を０１％の割合に加え、アンモニア水を添加してそのｐ
ｌ＋を８６にＦＡ整した。このｍ ｔ＆を、０．１％Ｔ
ｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む０．１Ｍ酢酸−アンモニ
ア１１衝液（ｐＨ８，６）で予め平衡化したＣＭ−５ｅ
ｐｈａｄｅｘ ＠Ｃ−２５（ファルマシア製）カラム（
２，６ｅｓｘ ２５ｃｍ）に通し０．１％Ｔｒｌｔｏｎ
Ｘ−１００を含む０．１Ｍ酢酸−アンモニア１１衝液
（ｐＨ６，６） ６０ｍ１でカラムを洗浄した０次いで
吸着したペプチドを０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
および０．１Ｍ＃酸−アンモニアＩＩ衝液を含む炭酸ア
ンモニウム水溶液を用いて、直線的濃度勾配法（炭酸ア
ンモニウムのＯＩｌ！かう０．５Ｍまでの直線的濃度勾
配、４００婁１）で溶出させた。 ２１１Ｏｎ口におけ
る吸光度を有する両分（炭酸アンモニウム濃度（１，０
２Ｍ〜０，３Ｍで溶出）を集め、減圧濃縮した。濃縮液
を１６分割し、その１７１６ずつを下記条件の高速液体
クロマトグラフィー（ウォーターズ社製、高速液体クロ
マトグラフ使用）に付し、保持時間約２３．１分の画分
（画分Ａ）および保持時間約２８．２分の画分く画分Ｂ
〉をそれぞれ分取した。
カラム： ＹＭＣ５）１３４３−５０ＤＳ （２０ｇｍ
ｘ １５０ＩＩｍ 、株式会社山村化学研究所製）
溶出 水−アセトニトリル−トリフルオロ酢酸７
Ｂ
（８５：１５：０．１）から水−アセトニトリル−トリ
フルオロ０１酸（３０ニア０：０．１）の凸線的濃度勾
配
流速・１５．０ｔｌ／分
検出 ２３５ｎ＋ｎにおける吸光度
得られた画分を減圧濃縮後、凍結乾燥して画分Ａから式
（１）においてＲが０１１のペプチド［ペプチド（１−
１） ］のトリフルオロ酢酸塩２７．１ｍｇ、画分Ｂか
ら式（１）おいてＲがＬ ｅ ｕ −ＯＮのペプチド［
ペプチド（Ｉ−２） ］のトリフルオロ酢酸塩６９−８
を得た。夫々の分析結果は以下の通りである。
ペプチド（１−１・トリフルオロ
ペプチドのＣｔ４アミノ酸分析結果： Ｔｙｒアミノ酸
配列配列分析結果１ｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｈｌ
ｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−＾１ａ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ
−Ｔｒｐ−＋１ｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−
Ｌｙｓ−Ｖａｌ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａ
ｒｇ−Ｔｙｒ−ＯＨ
酸加水分解物のアミノ酸分析４ｍ （モル比）：Ｔｈｒ
、０．９５；Ｇｌｕ、３．４２；＾Ｉａ、１．３０；Ｖ
ａｌ、２．６４；Ｍｅｔ、０．９２；ｌｌｅ、１．５３
；Ｔｙｒ、２．８５；Ｌｙｓ、４．２９；１０ｓ、１．
００：＾ｒｇ、１．０６；Ｐｒｏ）、２４；Ｔｒｐ、０
．８１液体クロマトグラフィー保持時間
Ｒｔ、’、約１２，１分、Ｒｔ”、約１５．１分ペプチ
ド １−２ ・トリフルオロ
Ｃ端アミノ酸分析結果： Ｌｅｕ
アミノ酸配列分析結果： ＩＩ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｇｉ
ｎ−旧５−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−＾１ａ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−
Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−１１ｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔ
ｈｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−＋１ｅ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｖａ
ｉ＾ｒＨ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−ＯＨ
酸加水分解物のアミノ酸分析値（そル比〉Ｔｈｒ、１．
０１；Ｇｌｕ、３．４２；＾ｌａ、１．４４；Ｖａｌ、
２．６０；Ｍｅｔ、０．９１；Ｉｌｅ、１．６９；Ｌｅ
ｕ、１．３５；Ｔｙｒ、２．９８Ｌｙｓ、４．１３：Ｈ
ｉｓ、０．９４；＾ｒｇ、１．１０；Ｐｒｏ、２．７３
；Ｔｒｐ、０．７１
液体クロマトグラフィー保持時間
Ｒｔ ｌ、約１４．７分、Ｒｔ’、約７７分実施例２
Ｈ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−）１ｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙ
ｓ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−１１ｅ
−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−
＋１ｅ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−＾ｒｇ−Ｔｙｒ−０
）１ ［式（１）においてＲが０■９
０
のベブチドコトリフルオロ酢酸塩の合成アプライド・バ
イオシステム社製モデル４３０＾ペプチド合成装置を使
用し、固相法にて室温で合成した。
１ｔｃｃ−Ｔｙｒ （ｆｉｒ−２）−Ｐａａｌｌ脂０．
５ｍｍｏｌを出発原料とし、Ｂｏｃ−Ｖａｌ、Ｂｏｃ−
Ｔｙｒ（Ｂｒ−２）、Ｂｏｃ−Ｇｌｎ、 Ｂｏｃ−Ｈｉ
ｓ（Ｄｎｐ）、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（ＣＩ−Ｚ）、Ｂｏｃ−
＾１ａ、Ｂｏｃ−Ｍｅｔ、 Ｂｏｃ−Ｔｒｐ（ＣＨＯ）
、 Ｂｏｃ−Ｐｒｏ、 Ｂｏｃ−＋１ｅ、 Ｂｏｃ
−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｒｏｃ−ＡｒｇｆｌＪｔｓ）の各
保護アミノ酸を使用し、■Ｎｔ４？ｏｃの脱保護■洗浄
０中和■洗浄■縮合反応■洗浄■未反応Ｎｆ４アミノ基
のアセチル化■洗浄、の各工程をくり返してＣｆｉ部か
ら逐次、樹脂上にペプチド釦を延長させた。
■Ｎ端の脱保護は２０ｉ＋１のトリフルオロ酢酸−ジク
ロロメタン混合液（４０・６０）で１０分間３８埋する
ことにより行なった。
■のｔ′ＩＣ浄はＮ−メチルピロリドン−ジメチルスル
ホキシド（９５：５）混合ｍ ！１１２０ｍ ｌで行な
った。
Ｓ、の中和はジイソプロピルエチルアミンｌ＋＋ｉｏ＋
を合方するジクロロメタン２０ｍ１で行ｔｊつた。
■の洗浄はジクロロメタン２０ｓ１、次いでジメチルス
ルホキシド２０−１で行なった。
■の縮合反応は、保護アミノ酸より調製した４当量の保
脛アミノ酸の１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステ
ル（活性エステル）？８液を加え、まず３０分間、次い
で０．２５容量のジメチルスルホキシドを加えて１６分
間、さらに当量のジイソプロビルエチルアよンを加えて
７分間行った。
なお、活性エステル溶液は、Ｎ−メチルピロリドン４
ｍｌにそれぞれ２ｍｍｏｌの保護アミノ酸、ジシクロへ
キシルカルボジイミド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾ
ールを加え、室温で４０分間攪拌の後、生成するジシク
ロへキシルウレアを濾別することにより調製した。
■のｔ先ｔｔはジクロロメタン２０ｍ１で行なった。
■のアセチル化は、無水酢酸１０％とジイソプロピルエ
チルアミン５％とを含むジクロロメタン２０１１で２０
分間行なった。
Φ）の１先！争はジクロロメタン２０の１で行なった。
最後のＢｏｃ−Ｌｅｕの縮合反応紅了後、塩化メチレ２
ンで洗痒、◆′を蜂し保躇ペプチドーＰ−−−銅断を１
９た。
これを、チオフ鼻ノールーＮ、Ｎ−ジメチル本ルムアミ
ド（２５ニア５１況合ｆｋ１００園１に加え、１特間撹
拌し、Ｄｎｐ ＆を１ｉｌｕｔＩシめた後、不溶物を濾
取し、エーテル、ジクロロメタンで洗浄して減圧・２燥
した。
次ニ、 ４Ｇ ’） １１ ｔ：ｒｌＩＵｕ ｋｍ−１
しＶ −ル０．７５Ｉ１． Ｌタンジチオールａ ２
Ｓａ Ｉ １３よびジメチルスルフィド＠、Ｓｓｌの混
合物に加えた１＆、−２０℃でフッ化水素２」・１を加
え３０分間、さらに０℃で２時間撹拌した。＃＆正圧下
反応混合物をｉｓ縮し、残喘に再度フッ化水素１ｎｌを
加え０℃で４０分間攪拌し、城圧下にフッ化水素を除去
した。残ｉ；をエーテル、ジクロロメタンでｔ先棒した
後、酢錬−木（３０：１０）の混合ｆ８奴で抽出し、抽
出液を凍結乾燥した。
得られた和ペプチドを下記条件の高速液体クロマトグラ
フィーで鎖側した。
カラム：センノエー（１１１５−５２５Ｈｂμｍ０Ｄ＾
２０＊ｍｘ ２ＳＯｓｓ Ｃ１ａ （センシａ−１ａ
１字社劃）
溶出；水−アセトニトリルートリフルオ０＃験（７１：
Ｈａｌｌ）から水−アセトニトリル−トリフルオロ酢瞭
（７０； ３・；・、０のａａｍ約１ｌｌＩＦ！１勾配
梳４７０ｍ１／分
検出：■Ｏロー＆：おける吸光度
ｆｆｌ＠＠閤約■、−分の一分を分取し、標記ペプチド
・トリフルオロ酢瞭龜２■−ｇを得た。
このペプチド・トリフルオロ＃ＩＩＩｋ塩の高速液体ク
ロマトグラフィーｆｆｌ特時ＩＩＩＲｔ’＊よびＲｔ”
は、実施例１で得たペプチド（夏−ｔ）・トリフルオロ
酢ａｉ＊ｏそれとそれぞれ一敗した。
瞭加水分解物のア竜ノ皺分析４１（モル比）：Ｔｈｒ、
ＩＪ）；Ｃ１ｍ、３．Ｂ；＾Ｉａ、１．ｌＨ：Ｖａ１．
ＬＨ；Ｍ＠ｔ、１０３Ｈ１１ｅ、１．？３ＨτＦＦ、３
．０＠：Ｌｙｓ、４．１２；旧ｓ、１．０４；＾ｒｇ、
１．＠！ＢＰｒｏ、３．Ｏｌ；丁ｒｐ、ＩＪ１゜実施例
３
訃νｍ１−Ｔｙｒ−（ｉｌｎ−Ｈｌｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ
−＾１ａ−Ｍ＊Ｌ−Ｌｙｓ−Ｆｒｏ−３
４
丁ｒｐ−ｉ Ｉｔ−Ｇ Ｉｎ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ
−Ｌｙｓ−ν・１−夏１ｅ−ｆ’ｒｏ−ｔｙｒ−ｖＮ−
＾ｒｌ−Ｔｙｒ−Ｌ＊ｕ４Ｈ（式（１）にわいてＲがＬ
ｅｕ−Ｏ射のベブチドコトリフルオロカ阪塩の合成
＠ｏｃ−Ｌａｕ−Ｆｉ＠ １ｌｌｌ１１．５ｓｓｏｌを
出発フ料とし、実施例２の場合と同様にして固相法にて
合成した。
得られた粗ペプチドを１５ｍ例２の場合と同様、高速核
体クロマトグラフィー【但し、熔出は＊−アセトニトリ
ルート９７ Ａ／オロｒｈｌｌ（７ＬＨ（１，１） Ｔ
ｈら水−アセトニトリル−トリフルオロ酢瞭（＠３：Ｂ
：ｔ１．ｌ）のＷＬ＃Ｒ的横度勾配】で精粒した。保持
時ｍｌ約３１１分の１ｍ分を分取し、「記ペプチドのト
リフルオＯｆｉＬ ｅ：ｉ １１１２３４ｔｚ ｆ（４
１； ｔ： 。
このペプチド・１リフ・〉オワ酢鮭塩の高ｉ！ 喰１４
りＯマドクラ７４−１４ｉ１ｉ！； ｎ！ｊ ７． ｔ
’ ｊｊ ２びＩＩＬ’：＝、実Ｌ＝り：；！てｉ″
！Ｉ：ぺ−゛チ；′！−２）・トリフルメ１ ロわ＾
ム：場Ｃノそ ｚ−、！： ＋Ｐ”’−−で二 Ｌ す
ご。
れｔ加水分％ｔｌ ：Ｉ、○アζノ鮫分析イへ（そル比
）：１１＋ｒ、１．ＤＳ；（ｉｌしＪ、Ｄ！ｌ；Ａｌｇ
、１．０６：Ｖａｌ、２．＆ａ；Ｍｅ１．０．９４；ｌ
ｌ（，１，７０；Ｌｅｕ、１．（Ｉｌｌ；丁ｙｒ、コ、
０９ｔｙｓ、４．１（１；ｍ１ｍ、１．・３：＾ｒｇ＋
ＬＩｉ；Ｆｒｅ、Ｌ１１１；ｉｒ）、＄、１＄
Ｓ
６
手続補正書（０劃
平成２年５月１８日
事件の表示
平成・２年特許願第５２５５４号
２、発明の名称
カゼインペプチド
３、補正をする者
事件との関係 特許出願人
住所 東京都墨田区墨田五丁目１７番４号〒５３４
大阪市部島区友渕町１丁目鑓紡株式会社特許部
電話（０６） ９２１−１２５１
５番■号
６、補正の対象
明細書の「発明の詳細な説明」の欄
７、補正の内容
（１）明細書籍８頁４行目の「直線的濃度勾配法」の後
に、ｒ（ｔｏｏ分間かけて濃度勾配をかける）１を挿入
する。
（２）明細書第■頁１９行目の「直線的濃度勾配」の後
に、ｒ（５０分間かけて濃度勾配をかける）Ｊを挿入す
る。
（３）明細書′５ＩＩＩ頁５行目ｆ） ｒ６０ｍｌ」ヲ
、ｒ ２０Ｇｍｌ Ｊと訂正する。
（４）明細書第１９頁３行目の「濃度勾配」の後に’（
ｌｏｏ分間かけて濃度勾配をかける）１を挿入する。
（５）明細書籍２４頁６行目の「濃度勾配」の後にｒ（
ｇｏ分間かけて濃度勾配をかける）１を挿入する。
（６）明細書第２５頁１１行目の「直線的濃度勾配」の
後に、ｒ（ａｏ分間かけて濃度勾配をかける）１を挿入
する。[Test Example 1] Nature, 194 @, pages 927-929 (1
The inhibitory activity against adenosine-5'%-diphosphate (^Dr)-induced platelet aggregation and the inhibitory activity against collagen-induced platelet aggregation were measured as follows according to the method described in 162). 1 sample trifluoroacetate of the peptide of the present invention (1-1)...
H-Vat-Tyr-Gln-Hls-Gln-Lys
-^Ia-Met-Lys-Pro-Trp-E-G
ln-r'ro-Lys-Thr-Lys-Val-1
1e-Pro-Tyr-Val-^rg-Tyr-OH
・Trifluoroacetate [peptide obtained in Example 1 (1-
1) ・Trifluoroacetate] Peptide of the present invention (1-
2) Trifluoroacetate...H-Val-Tyr-
Gin-Hls-Gln-Lys-^la-Met-L
ys-Pro-Trp-+1e-Gln-Pro-Ly
s-Thr-Lys-Val-11e-Pro-Tyr
-Sial-＾rg-Tyr-Leu-0)1.) Lifluoroacetate [Peptide (1-2) obtained in Example 1
Trifluoroacetate] 2. Test method (2-11 Platelet mff1 (p+u+) Preparation of platelet-poor plasma (PPf'): Add 111 O volume of 3.8% citric acid to blood collected from a guinea pig (470-600 g) Add a sodium aqueous solution and centrifuge at 110 (lr, p, s, (130 x g)) for 10 minutes to obtain a supernatant with a high platelet concentration. After centrifugation for 1 minute, the supernatant was collected to obtain platelet-poor plasma (hereinafter referred to as PPP).The number of platelets in the supernatant with a high platelet concentration was measured using a Coulter counter (Coulter 12-Electronics Co., Ltd.). Calculate and 5x with PPP
Platelet-rich blood diluted to IO'cells/cm'!
! (hereinafter abbreviated as PIIP) was prepared. Platelet aggregation fli with +2-2180P induced lI & inhibition test rotator! rnr to lawn cell
160 μQ and 20 μO of a specimen solution (prepared by dissolving in physiological saline solution) were added and stirred. This cell was incubated for 1 minute at 37°C in a hematotracer (manufactured by Sanko Bioscience). Then 50 μH adenosine-5°-diphosphate (
^Dr) solution [^Dr (manufactured by Sigma) was dissolved in 2511 Tris-HCl buffer (pl+7.41 to prepare 32
01 was added and platelet aggregation was monitored for 5 minutes. Coagulation at the time when the number of platelets reaches the maximum (the time when the light transmittance reaches the maximum)! f! (B) was calculated using the following formula. a: Light transmittance of PRP b: Light transmittance of PPP C: Light transmittance when platelet aggregation is caused by the above method and platelet aggregation reaches maximum On the other hand, physiological saline was used instead of the sample solution Same as 1! e Aggregate platelets, determine the control aggregation rate (A), and calculate the aggregation inhibition rate (%) using the formula below.
) was calculated. Aggregation inhibition! I! (%) = 1-XIO
It was determined by IiI line regression of the I line. (2-3) Collagen-induced aggregation inhibition test as a flocculant ^
Instead of using DP f8 solution, collagen lysis i [isotonic glucose suspension of collagen pH 2.7-2]
．． 9 (manufactured by Holm)] nick glucose m
? Prepared by diluting 10 times with &, concentration 100μg/ml
] r c , o ib in the same manner as above 4 Rt2-2) except that 20 μQ was added and platelet gli2 was monitored for 10 minutes.
I asked for 3. The test results are shown in Table 1. Table 1 °) The analytes are trifluoroacetate salts of the respective peptides. The present invention will be explained below with reference to Examples. In addition, various analyzes of the peptide of the present invention and its salts were carried out by the following methods. C-amino of peptide: 0.2M N-ditylmorpholine-vinegar @llkmflt (pH 8,5) O
, Sml To about 8 nmol of the dissolved peptide, 8pO1 of carboxypeptidase A (Type I, manufactured by Sigma) was added, which had been digested with diisopropylfluorophosphate, and the reaction was carried out at 25°C. By quantifying with an amino acid analyzer? It was. Amino 11: Performed using a gas phase protein sequencer (Applied Biosystems 471^). Amino: Hydrolyzed with 6N MCI containing 4% glycolic acid (110°C, 22 hours)
The obtained hydrolyzate was analyzed using an amino acid analyzer (Hitachi Model 835).
So I went there. Body chromatography Rt', Rt' soil, toni raw'eni'-ni'-ni A high performance liquid chromatograph manufactured by Tosoh Co., Ltd. was used for measurement under the following conditions. Rt' measurement condition column: YMC^co120DS (8ms x IS
Dmm, manufactured by Yamamura Kagaku Kenkyusho Co., Ltd.) Elution: Water-acetonitrile-trifluoroacetic acid (IIs
: Is: 0.1) to water-acetonitrile-trifluoroacetic acid (30 Nia 0:0.1) Pure concentration gradient Flow rate: l, 5 volumes l/min 5 6 Detection: Absorbance Rt' at 275 n■ Measurement conditions: water-acetonitrile-trifluoroic acid @ (79
:21:0.1) (no concentration gradient applied) is the same as for the measurement of Rt'. Rt” measurement conditions Water-acetonitrile-trifluoroic acid M (75
:25:0.1) (no concentration gradient applied) is the same as for the measurement of Rt'. Example 1 jILIIlα- from casein hydrolyzate
Casein (manufactured by Sigma) 10g (1, IN hydrochloric acid 20g)
The mixture was suspended in 0.1 at 37°C, 25 o g of pepsin (manufactured by Biozyme Laboratories) was added thereto, and the mixture was stirred at the same temperature for 1 and 8 hours.The pH of the 0 reaction solution was adjusted to 4.2 by adding aqueous ammonia. , centrifugation @ (8000 rpm)
to remove insoluble matter. TriLon X-100 [trade name of polyoxyethylene (lO) octylphenyl ether] was added to the obtained supernatant.
to a ratio of 0.01% and aqueous ammonia to reduce its p.
FA adjusted l+ to 86. This m t& is 0.1%T
CM-5e pre-equilibrated with 0.1M acetic acid-ammonia 11 buffer solution (pH 8,6) containing riton X-100.
phadex @C-25 (manufactured by Pharmacia) column (
2,6es x 25cm) and 0.1%Trlton
The column was washed with 60ml of 0.1M acetic acid-ammonia 11 buffer (pH 6,6) containing X-100.Then, the adsorbed peptide was washed with 0.1% Triton X-100.
and an aqueous ammonium carbonate solution containing 0.1M #acid-ammonia II buffer, and was eluted by a linear concentration gradient method (linear concentration gradient of ammonium carbonate OIl! to 0.5M, 400 mm). Both components (ammonium carbonate concentration (1,0
2M to 0.3M) were collected and concentrated under reduced pressure. The concentrated solution was divided into 16 parts, and 1,716 parts were subjected to high-performance liquid chromatography (manufactured by Waters, using a high-performance liquid chromatograph) under the following conditions to obtain fractions with a retention time of approximately 23.1 minutes (fraction A) and retained fractions. Fraction B takes approximately 28.2 minutes.
> were separated. Column: YMC5) 1343-50DS (20gm
x 150IIm, manufactured by Yamamura Kagaku Kenkyusho Co., Ltd.) Elution From water-acetonitrile-trifluoroacetic acid 7B (85:15:0.1) to water-acetonitrile-trifluoro01 acid (30Nia 0:0.1) Linear concentration gradient flow rate / 15.0 tl/min detection Absorbance at 235n+n The obtained fractions were concentrated under reduced pressure and lyophilized to extract the peptide [peptide (1-
1) ], 27.1 mg of trifluoroacetate, fraction B was used to obtain a peptide [
Trifluoroacetate of peptide (I-2) 69-8
I got it. The results of each analysis are as follows. Ct4 amino acid analysis result of peptide (1-1 trifluoropeptide: Tyr amino acid sequence analysis result 1l-Val-Tyr-Gln-Hl
s-Gln-Lys-^1a-Met-Lys-Pro
-Trp-+1e-Gln-Pro-Lys-Thr-
Lys-Val-11e-Pro-Tyr-Val-A
Amino acid analysis of rg-Tyr-OH acid hydrolyzate 4m (molar ratio): Thr
, 0.95; Glu, 3.42; ^Ia, 1.30; V
al, 2.64; Met, 0.92; lle, 1.53
;Tyr, 2.85;Lys, 4.29;10s, 1.
00:^rg, 1.06; Pro), 24; Trp, 0
．． 81 Liquid chromatography retention time Rt, ', approximately 12.1 minutes, Rt'', approximately 15.1 minutes Peptide 1-2 - Trifluoro C-terminal amino acid analysis result: Leu Amino acid sequence analysis result: II-Val-Tyr-Gi
n-old 5-Gln-Lys-^1a-Met-Lys-
Pro-Trp-11e-Gln-Pro-Lys-T
hr-Lys-Val-+1e-Pro-Tyr-Va
i^rH-Tyr-Leu-OH Amino acid analysis value of acid hydrolyzate (sol ratio>Thr, 1.
01; Glu, 3.42; ^la, 1.44; Val,
2.60; Met, 0.91; He, 1.69; Le
u, 1.35;Tyr, 2.98Lys, 4.13:H
is, 0.94; ^rg, 1.10; Pro, 2.73
; Trp, 0.71 Liquid chromatography retention time Rtl, about 14.7 minutes, Rt', about 77 minutes Example 2 H-Val-Tyr-Gln-)is-Gln-Ly
s-Ala-Met-Lys-Pro-Trp-11e
-Gln-Pro-Lys-Thr-Lys-Val-
+1e-Pro-Tyr-Val-^rg-Tyr-0
)1 [Synthesis of bebutidocotrifluoroacetate with R being 0x90 in formula (1) Synthesis was performed at room temperature by a solid phase method using a peptide synthesizer model 430^ manufactured by Applied Biosystems. 1tcc-Tyr (fir-2)-Paall fat 0.
Using 5 mmol as the starting material, Boc-Val, Boc-
Tyr(Br-2), Boc-Gln, Boc-Hi
s (Dnp), Boc-Lys (CI-Z), Boc-
^1a, Boc-Met, Boc-Trp (CHO)
, Boc-Pro, Boc-+1e, Boc
-Thr (Bzl), Roc-ArgflJts), and ■Nt4? The following steps were repeated: deprotection of oc ■ washing 0 neutralization ■ washing ■ condensation reaction ■ washing ■ acetylation of unreacted Nf4 amino group ■ washing to sequentially extend the peptide button onto the resin starting from the Cfi part. (2) Deprotection of the N-terminus was carried out by burying the mixture in a 20i+1 trifluoroacetic acid-dichloromethane mixture (40.60) for 10 minutes. (2) t'IC cleaning is a mixture of N-methylpyrrolidone-dimethylsulfoxide (95:5)! The volume was 1120 ml. Neutralization of S, diisopropylethylamine l++io+
20 ml of dichloromethane were added to the mixture. Washing (2) was carried out with 20 sl of dichloromethane and then 20 sl of dimethyl sulfoxide. The condensation reaction (2) is a 4-equivalent 1-hydroxybenzotriazole ester (active ester) of an amino acid prepared from a protected amino acid. 8 liquid was added for 30 minutes, then 0.25 volume of dimethyl sulfoxide was added for 16 minutes, and an equivalent amount of diisopropylethylamine was added for 7 minutes. Note that the active ester solution is N-methylpyrrolidone 4
2 mmol of protected amino acid, dicyclohexylcarbodiimide, and 1-hydroxybenzotriazole were added to each ml, and after stirring at room temperature for 40 minutes, the resulting dicyclohexylurea was filtered off. Steps 1 and 2 were carried out using 20 ml of dichloromethane. Acetylation of
I did it for a minute. One ahead of Φ)! The mixture was mixed with 20 parts of dichloromethane. After the final condensation reaction of Boc-Leu was completed, it was washed with 2 methylene chloride, ◆' was washed with 1 ml of peptide-P --- copper cut.
It was 9. This was added to thiophylamide, N,N-dimethylbenzene (25nia, 51 conditions, fk100, 1), stirred for 1 hour, and Dnp& was added to 1 ilutI. Washed with water and dried under reduced pressure for 2 hours.Next, 4G') 11 t: rlIUu km-1
and V-le 0.75I1. L tandithiol a 2
To a mixture of Sa I 13, dimethyl sulfide @, and Ssl, 1 & hydrogen fluoride 2'.1 was added at -20°C, and the mixture was stirred for 30 minutes and further at 0°C for 2 hours. #& The reaction mixture was condensed under positive pressure, 1 nl of hydrogen fluoride was added again to the residual gas, and the mixture was stirred at 0° C. for 40 minutes, and the hydrogen fluoride was removed under pressure. The residue was washed with ether and dichloromethane, extracted with a mixture of vinegar and wood (30:10), and the extract was freeze-dried. The obtained Japanese peptide was subjected to high performance liquid chromatography under the following conditions. Column: Sennoe (1115-525Hbμm0D^
20*mx 2SOss C1a (Sensia a-1a
Elution; water-acetonitrile refluoro 0# test (71:
Hall) to water-acetonitrile-trifluoroacetic acid (70; One minute fraction was collected to obtain 2-g of the title peptide trifluoroacetate salt.High performance liquid chromatography of this peptide trifluoro #IIIk saltffl special IIIRt'* and Rt'
The peptide (summer-t) obtained in Example 1, the trifluoroacetic acid ai*o, and each were defeated once. Aryu no wrinkle analysis of transparent hydrolyzate 41 (molar ratio): Thr,
IJ); C1m, 3. B;^Ia, 1. lH: Va1.
LH; M@t, 103H11e, 1. ? 3HτFF, 3
．． 0@:Lys, 4.12; old s, 1.04; ＾rg,
1. @! BPro, 3. Ol; Drp, IJ1゜Example 3
-^1a-M*L-Lys-Fro-3 4 Drp-i It-G In-Pro-Lys-Thr
-Lys-ν・1-Summer 1e-f'ro-tyr-vN-
^rl-Tyr-L*u4H (R is L in formula (1)
Synthesis of eu-O conjugated bebutidocotrifluorocarbon salt @oc-Lau-Fi@1llll11.5ssol was used as a starting material and synthesized by the solid phase method in the same manner as in Example 2. The resulting crude peptide was subjected to high-speed nuclear chromatography in the same manner as in Example 2 [however, the elution was performed using *-acetonitrile route 97 A/orohll (7LH(1,1) T
Water-acetonitrile-trifluoroacetic acid (@3:B
:t1. The grains were refined using the WL#R transverse gradient of 1). At the time of retention, 1/311 ml of the peptide was collected,
1; t: . This peptide 1 riff 〉Owa vinegar salmon salt high i! Eating 14
riO Madokura74-14i1i! ; n! j7. t
'jj 2bi IIL':=, real L=ri:;! tei''
! I: Pe-chi;'! -2)・Trifulme 1 Lowa^
M: Place C no so z-,! : +P"'--2 L Sugo. Rethydrolysis%tl :I, ○Azeta shark analysis I (Soru ratio): 11+r, 1.DS; (il J, D!l; Alg
, 1.06: Val, 2. &a;Me1.0.94;l
l(,1,70;Leu,1.(Ill;Dingyr,ko,
09tys, 4.1(1;m1m,1.・3:＾rg+
LIi; Fre, L111; ir), $, 1 $ S 6 Procedural amendment (0) Indication of May 18, 1990 case 1990 Patent Application No. 52554 2, Title of invention casein peptide 3, Amendment Relationship with the case of a person who does the following: Address of patent applicant: 5-17-4 Sumida, Sumida-ku, Tokyo 534
Yarobo Co., Ltd. Patent Department, 1-chome, Tomobuchi-cho, Bejima-ku, Osaka Telephone: (06) 921-1251 No. 5 ■ No. 6, "Detailed Description of the Invention" column 7 of the specification to be amended, Contents of the amendment (1) ) Insert 1 after "linear concentration gradient method" in the 4th line of page 8 of the specification book. (2) Insert r (concentration gradient is applied over 50 minutes) J after "linear concentration gradient" on page 1, line 19 of the specification. (3) Specification page '5III, line 5f) r60ml'', corrected to r20GmlJ. (4) After “concentration gradient” on page 19, line 3 of the specification
Apply a concentration gradient over loo minutes) 1. (5) After “concentration gradient” on page 24, line 6 of the specification book, r
Apply a concentration gradient over go minutes) 1. (6) Insert r (concentration gradient is applied over ao minutes) 1 after "linear concentration gradient" on page 25, line 11 of the specification.