【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
この発明はプラスミドベクターpAJ43に関す
る。pAJ43は、コリネホルム・グルタミン酸生産
菌を宿主として増殖できるものである。
コリネホルム・グルタミン酸生産菌は、大量の
Ｌ−グルタミン酸を生産することが知られてい
る。またその変異株はリジン等のアミノ酸、イノ
シン酸のプリンヌクレオチド等を生産するものが
知られていて、工業的に有用な微生物である。一
方、最近DNA組換え技術による工業微生物の育
種、改良がエシエリヒア・コリ等により試みられ
ているが、コリネホルム・グルタミン酸生産菌に
ついては、これらの微生物を宿主とするに適した
ベクターが開発されておらず、DNA組換えによ
るコリネホルム・グルタミン酸生産菌の育種、改
良の妨げとなつていた。
本発明者らは、コリネホルム・グルタミン酸生
産菌を宿主として増殖するプラスミドである、分
子量３，４メガダルトンであつて、第３図に示す
制限酸素地図を有するプラスミドベクターpAJ43
を造成することに成功した。このプラスミドベク
ターは、クロラムフエニコール耐性の遺伝情報を
有しコピー数が大きく、更に制限酵素Xma、
Hind、BamH、Xba及びHaeでは１個
所しか切断されず、又これらの切断個所は上記ク
ロラムフエニコール耐性の遺伝情報はないので、
ベクターとして勝れている。
プラスミドベクターpAJ43は実施例１に示す方
法により造成した。
コリネホルム・バクテリアは好気性、グラム陽
性桿菌であり、非抗酸性でバーヂース・マニユア
ル・オブ・デターミネイテイブバクテリオロジー
第８版599頁（1974）に記載されている。本発明
の宿主菌として利用しうるコリネホルム・グルタ
ミン酸生産菌の野生株の例としては次のようなも
のがあげられる。
ブレビバクテリウム・デイバリカタム
ATCC14020
ブレビバクテリウム・サツカロリテイクム
ATCC14066
ブレビバクテリウム・インマリオフイルム
ATCC14068
ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
ATCC13869
ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13825
ブレビバクテリウム・フラバム ATCC13826
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
ATCC19240
コリネバクテリウム・アセトアシドフイルム
ATCC13870
コリネバクテリウム・アセトグルタミクム
ATCC15806
コリネバクテリウム・カルナエ ATCC15991
コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC13032
13060
コリネバクテリウム・リリウム ATCC15990
コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC17965
ミクロバクテリウム・アンモニアフイラム
ATCC15354
コリネホルム・グルタミン酸生産菌にはグルタ
ミン酸生産性を失なつた変異株、あるいは、リジ
ン、アルギニン等のアミノ酸、イノシン等のプリ
ンヌクレオシド、イノシン5′−モノりん酸等のプ
リンヌクレオチド、又はその他の生産物を生産す
る変異株も含まれる。
本発明の複合プラスミドまたは、異種遺伝子の
挿入された複合プラスミドの宿主として、上記の
ようなコリネホルム・グルタミン酸生産菌を用い
る場合、制限活性を低める変異を常法により宿主
に与えておけば更に良好な結果が得られる。
このようなコリネホルム・グルタミン酸生産菌
を、外来遺伝子の挿入された複合プラスミドを導
入するのに用いれば外来遺伝子に担われた遺伝情
報を発現せしめるのにより有利である。
実施例 １
(1) pAJ43造成の中間体となつたpAJ655を、プ
ラスミドpBR325とpAM330から造成した。
プラスミドpBR325はエシエリヒア・コリ内で
アンピシリン、クロラムフエニコール、テトラサ
イクリン耐性を発現する分子量3.6メガダルトン
のベクタープラスミドである〔Boliver，F.
Gene，４，121（1978）〕。実験に使用したプラス
ミドpBR325は（ベセスダ・リサーチ・ラボラト
リー）（BRL）から購入した。
プラスミドpAM330はブレビバクテリウム・ラ
クトフアーメンタムATCC13869から新たに我々
が分離した分子量3.0メガダルトンのプラスミド
であり、その制限酵素切断地図を第１図に、制限
酵素による切断個所の数を第１表にそれぞれ示
す。プラスミドpAM330DNAは次の様にして調
製した。
This invention relates to plasmid vector pAJ43. pAJ43 can grow using coryneform glutamate producing bacteria as a host. Coryneform glutamic acid producing bacteria are known to produce large amounts of L-glutamic acid. Moreover, its mutant strains are known to produce amino acids such as lysine, purine nucleotides such as inosinic acid, and are industrially useful microorganisms. On the other hand, recently attempts have been made to breed and improve industrial microorganisms using recombinant DNA technology, such as Escherichia coli, but vectors suitable for using these microorganisms as hosts have not yet been developed for coryneform/glutamate producing bacteria. However, this has hindered the breeding and improvement of coryneform-glutamic acid-producing bacteria through DNA recombination. The present inventors have developed a plasmid vector pAJ43, which has a molecular weight of 3.4 megadaltons and has a limiting oxygen map shown in FIG.
succeeded in creating. This plasmid vector has genetic information for chloramphenicol resistance, has a large copy number, and also contains restriction enzymes Xma and
Hind, BamH, Xba, and Hae are only cleaved at one site, and these cleavage sites do not have genetic information for resistance to chloramphenicol, so
It is superior as a vector. Plasmid vector pAJ43 was constructed by the method shown in Example 1. Coryneform bacteria are aerobic, Gram-positive bacilli, non-acid-fast, and are described in Bird's Manual of Determinative Bacteriology, 8th edition, page 599 (1974). Examples of wild strains of coryneform glutamic acid producing bacteria that can be used as host bacteria of the present invention include the following. Brevibacterium deivalicatum
ATCC14020 Brevibacterium satucaloriticum
ATCC14066 Brevibacterium immariofilm
ATCC14068 Brevibacterium lactofamentum
ATCC13869 Brevibacterium roseum ATCC13825 Brevibacterium flavum ATCC13826 Brevibacterium thiogenitalis
ATCC19240 Corynebacterium acetoacid film
ATCC13870 Corynebacterium acetoglutamicum
ATCC15806 Corynebacterium carnae ATCC15991 Corynebacterium glutamicum ATCC13032 13060 Corynebacterium Lilium ATCC15990 Corynebacterium melasecola ATCC17965 Microbacterium ammoniaphilum
ATCC15354 Corineform-glutamate producing bacteria include mutant strains that have lost glutamate production, or amino acids such as lysine and arginine, purine nucleosides such as inosine, purine nucleotides such as inosine 5'-monophosphate, or other products. This also includes mutant strains that produce . When using a coryneform glutamate producing bacterium as described above as a host for the complex plasmid of the present invention or a complex plasmid into which a heterologous gene has been inserted, it will be even better if a mutation that reduces the restriction activity is given to the host by a conventional method. Get results. If such a coryneform-glutamic acid producing bacterium is used to introduce a complex plasmid into which a foreign gene has been inserted, it is more advantageous to express the genetic information carried by the foreign gene. Example 1 (1) pAJ655, which served as an intermediate for the construction of pAJ43, was constructed from plasmids pBR325 and pAM330. Plasmid pBR325 is a vector plasmid with a molecular weight of 3.6 megadaltons that expresses ampicillin, chloramphenicol, and tetracycline resistance in Escherichia coli [Boliver, F.
Gene, 4 , 121 (1978)]. Plasmid pBR325 used in the experiment was purchased from (Bethesda Research Laboratory) (BRL). Plasmid pAM330 is a plasmid with a molecular weight of 3.0 megadaltons that we newly isolated from Brevibacterium lactofamentum ATCC13869. Its restriction enzyme cleavage map is shown in Figure 1, and the number of restriction enzyme cleavage sites is shown in Table 1. Each is shown below. Plasmid pAM330DNA was prepared as follows.
【表】
ス
[Table]
【表】
蒸留水１あたりペプトン10ｇ、粉末酵母エキ
ス10ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、グルコース５ｇを
含むCMG培地（pH7.2）１中に温度30℃でブ
レビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
ATCC13869を対数増殖期後期まで培養し、菌体
を集めた。得られた菌体を、リゾチームとSDSに
より溶菌させる簡便法により溶菌せしめた後、
30000×ｇで30分間遠心分離し64mlの上澄液を得
た。上澄液中のプラスミドDNAは、上澄液にポ
リエチレングリコール（最終濃度10％）を添加し
沈降させた後、10mlのTEN緩衝液に溶解した。
DNAをリボヌクレアーゼで処理した後（リボ
ヌクレアーゼ150μg／mlで37℃、30分間反応）、
フエノール抽出し、ついで２倍量のエタノールを
加え−20℃℃でDNAを沈澱させ、沈澱を１mlの
TEN緩衝液に溶解した。このDNA溶液をアガロ
ースゲル電気泳動にかけ、ゲルから約74μgの純
粋なプラスミドDNAを分離した。
プラスミドpBR325 0.2μgに１ユニツトの制限
酵素BamH （BRLから購入）を37℃で60分
間反応させ、DNAを充分分解した。
プラスミドpAM330（1.2μg）に0.2ユニツトの
制限酵素Mboを37℃で15分間反応させ、DNA
を部分分解した。
得られたDNA断片を混合し制限酵素を不活化
するため65℃で10分間熱処理した後、ATPとジ
チオスレイトール存在下22℃で２時間0.01ユニツ
トのT4 DNAリガーゼを作用させた。T4 DNA
リガーゼを65℃、10分間の処理で不活化し、２倍
量のエタノールを加えた後、15000×ｇ 15分間
の遠心分離によりDNAを回収した。
このようにして得た複合プラスミドをトランス
フオーメイシヨンに使用した。
エシエリヒア・コリＣ−600（thr-，leu-，
thiamine-，r-，m-）（Meselson，M.and
Yuan，R.Nature，217，1110（1968））を20mlの
CMG培地に30℃で対数増殖期中期まで培養し、
菌体を集めた。Kushner等（“Genetic
Engineering”，p.17（1978），Elsevier／North
Holland Biomedical Press）の方法にしたがつ
て、得られたDNAを用いてＣ−600を形質転換し
た。
形質転換株は20μg／mlのクロラムフエニコー
ルを含むCMG培地で37℃、24時間培養し選択し
た。形質転換株の中からAJ11882（FERM−
BP136）を選択し、次の実験に用いた。
複合プラスミドpAJ655は、次のような方法に
よりAJ11882の溶菌液から分離した。AJ11882を
CMG培地で培養後、簡便法（TamaKa et al.，
J.Bacteriol.，121，354（1975））により溶菌せし
め、溶菌液をアガロースゲルにかけ、電気泳動に
かけた（Sharp et al.，Biochemistry12，3055
（1973））。分子量マーカーとの比較により、プラ
スミドの分子量は6.6メガダルトンと計算された。
プラスミドの制限酵素切断地図を第２図に示し
た。プラスミドはpBR325とpAM330のフラグメ
ントから成ることを、K.J.Dannaの方法
（Methods in Enzymology 65，449，
Academic Press（1980））により確認した。
pAJ655を、ブレビバクテリウム・ラクトフア
ーメンタムATCC13869を親株とする三重栄養要
求（リジン、メチオニン、スレオニン）突然変異
株ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタムNo.
64（ATCC39134）に以下のようにして導入した。
ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタムNo.
64を５mlのCMG培地で対数増殖期の初期まで培
養し、ペニシリンG0.6ユニツト／mlを添加後、
さらに1.5時間振盪培養し、遠心分離により菌体
を集め、菌体を0.5Mシユークロース、20mMマ
レイン酸、20mM塩化マグネシウム、3.5％ペナ
ツセイブロス（Difco）からなるSMMP培地
（pH6.5）0.5mlで洗浄した。次いで10mg／mlのリ
ゾチームを含むSMMP培地に懸濁し30℃で20時
間プロトプラスト化を図つた。6000×ｇ 10分間
遠心分離後、プロトプラストをSMMPで洗浄し
0.5mlのSMMPに再度懸濁した。
得られたプロトプラストを、pAJ655DNA2μg
と混合し、ポリエチレングリコールを最終濃度が
30％になるように添加した後、DNAをプロトプ
ラストに取り込ませるために室温に２分間放置し
た。細胞をSMMP培地１mlで洗浄後、DNAを取
り込んだプロトプラストをSMMP培地１ml中に
再懸濁し、薬剤耐性を発現させるために、30℃で
３時間培養した。この培養液をpH7.0のプロトプ
ラスト再生培地上に塗布した。プロトプラスト再
生培地は蒸留水１あたりトリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン12g、KCl 0.5g、グルコース
10g、MgCl2・6H2O 8.1g、CaCl2・2H2O2.2g、
ペプトン4g、粉末酵母エキス4g、カザミノ酸
（Difco社）1g、K2HPO4 0.2g、コハク酸ナトリ
ウム135g、寒天18g及びクロラムフエニコール
5μg／mlを含む。
30℃で３〜10日間培養後に出現したコロニー中
の５株を選びこれらを20μg／mlのクロラムフエ
ニコールを含むCMG培地で培養し、薬剤（クロ
ラムフエニコール）耐性株であることを確認し
た。
さらにプラスミドの存在を確認するため、ここ
で生育したクロラムフエニコール耐性株を溶菌せ
しめ、溶菌液をアガロースゲル電気泳動にかけ、
PAJ655と同じ分子量と制限酵素切断地図を持つ
プラスミドを認めた。
pAJ655より次のようにしてpAJ43を造成した。
pAJ655を保持するブレビバクテリウム・ラクト
フアーメンタムNo.64はクロラムフエニコール
100μg／mlを含むCMG寒天培地（ペプトン10g／
、酵母エキス10g／、グルコース5g／、
NaCl5g／、寒天20g／を含みpH7.2に調製し
たもの）上で生育不可能であるが、本菌をCMG
培地で培養後、クロラムフエニコール100μg／
を含むCMG液体培地に接種し、30℃で一晩培養
後、同濃度のクロラムフエニコールを含むCMG
培地に適当量塗布し30℃１〜２日間培養すること
によりクロラムフエニコール100μg／mlに耐性を
示す株を１株得た。本株のクロラムフエニコール
耐性度をCMG培地で調べたところ200μg／mlま
で耐性を示した。
上記の結果、得られたクロラムフエニコール高
濃度耐性株からpAJ43DNAを次のようにして調
製した。まず本株をクロラムフエニコールを
10μg／ml含む１のCMG液体培地に接種し、30
℃で対数増殖期後期まで培養し、集菌した。常法
によりリゾチームとSDSにより溶菌せしめた後、
30000×ｇ、30分の超遠心により上清を得た。こ
れにポリエチレングリコール（最終濃度10％）を
添加してDNAを沈澱せしめ、これを濃縮後、沈
澱物をTEN緩衝液10mlに溶解した。DNAをリボ
ヌクレアーゼで処理（リボヌクレアーゼ
50μg／mlで37℃、30分間反応）後、フエエノー
ル抽出し、ついで２倍量のエタノールを加え−20
℃でDNAを沈澱させ、沈澱物を１mlのTEN緩衝
液に溶解した。このDNA溶液をアガロースゲル
電気泳動法（電圧ゲル１cm当り5V、15時間）に
よつて最終150μgの純粋なpAJ43プラスミドDNA
を分画採取した。
(3) pAJ43 DNAの性質
pAJ43の分子量の決定はアガロースゲル電気泳
動によつた。
アガロースゲル電気泳動はシヤープ（P.A.
Sharp）らの方法（Biochemistry 12，3055
（1973））により、0.8％ゲルを用い、ゲル長さcm
当り、5Vで15時間、定電圧で泳動した。分子量
はpAJ43を１ヶ所切断する制限酵素Hind0.5ユ
ニツトをpAJ43 0.5μgに37℃、１時間反応させ、
切断し、直線状にした後、分子量既知の分子量マ
ーカー、λフアージのHindフラグメント
（BRLから購入）との移動度の比較によつて算出
し、3.4メガダルトンと計算された。
pAJ43DNAによるブレビバクテリウム・フア
ーメンタムNo.64の形質転換
ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタムNo.
64（ATCC39134）を５mlのCMG培地で対数増殖
期の初期まで培養し、0.6ユニツト／mlになるよ
うにペニシリンＧを添加後さらに1.5時間振盪培
養し、遠心分離により菌体を集め、菌体を0.5M
シユークロース、20mMマレイン酸、20mM塩化
マグネシウム、3.5％ペナツセイブロス（Difco）
からなるSMMP培地（pH6.5）0.5mlで洗浄した。
次いで10mg／mlのリゾチームを含むSMMP培地
に懸濁し30℃で20時間プロトプラスト化を図つ
た。6000×ｇにて10分間遠心分離後、プロトプラ
ストをSMMPで洗浄し0.5mlのSMMPに再度懸濁
した。このようにして得たプロトプラスト
pAJ43DNA1μgと混合し、ポリエチレングリコー
ルを最終濃度が30％になるように添加した後、
DNAをプロトプラストに取り込ませるために室
温に２分間放置した。プロトプラストをSMMP
培地１mlで洗浄後再度１mlのSMMPに懸濁し、
薬剤耐性を発現させるため、30℃で２時間培養し
た。この培養液をpH7.0のプロトプラスト再生培
地上に塗布した。プロトプラスト再生培地は蒸留
水１あたりトリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン12g、KCl0.5g、グルコース10g、MgCl2・
6H2O8.1g、CaCl2・2H2O2.2g、ペプトン4g、酵
母エキス4g、カザミノ酸（Difco）1g、
K2HPO40.2g、コハク酸ナトリウム135g、寒天8g
及びクロラムフエニコール3μg／mlを含む。30℃
で10日間培養後に出現したコロニー中の５株を選
び、これを100μg／mlのクロラムフエニコールを
含むCMG培地で培養し、pAJ655保持株よりも高
いクロラムフエニコール耐性を示すことを確認し
た。さらにプラスミドの存在を確認するため、こ
こで生育したクロラムフエニコール耐性株を溶菌
せしめ、溶菌液をアガロースゲル電気泳動にか
け、pAJ43と同じ分子量を持つプラスミドが存在
することを認めた。
pAJ43DNAの制限酵素切断地図の作成
制限酵素はBRLの市販品を使用し、制限酵素
によるpAJ43DNAの切断は、少なくとも３倍過
剰以上の酵素を使用して、各酵素毎に指定された
条件で行なつた。制限酵素切断地図作成のために
プラスミドDNAを２種以上の制限酵素で切断す
る場合には、第１の制限酵素切断断片を分離用ア
ガロースゲルよりタナカらの方法（Ｔ・
Tanaka.，B.Weisblum.J.Bacteriol.，121，354
（1975）により単離後、エタノール沈澱により濃
縮し第２の制限酵素で切断した。切断断片を実施
例(3)の方法によりアガロースゲル電気泳動にか
け、分子量を算出し、制限酵素切断地図を作成し
た。この結果からpAJ43はpAJ655からin vivoで
deletionにより生じたpBR325のクロラムフエニ
コール耐性遺伝子領域を含む約１メガダルトンと
pAM330の複製維持に必須の領域を含む約2.4メ
ガダルトンのフラグメントから成る小型プラスミ
ドであることが判明した。
pAJ43のコピー数の測定
pAJ43を保持するブレビバクテリウム・ラクト
フアーメンタムNo.64（AJ 11997、FERM−
P6857）をクロラムフエニコール10μg／mlを含む
５mlのCMZG液体培地に接種し、30℃で一晩培
養後その0.1mlをクロラムフエニコール10μg／ml
を含む５mlのCMG液体培地に再度接種した。30
℃で対数増殖期の初期まで培養し1000μg／mlに
なるようにアンピシリンを添加後さらに２時間培
養し、遠心分離により菌体を集め10mg／mlのリゾ
チームを含むTEN緩衝液1.5mlに懸濁し37℃で２
時間インキユベート後、SDS（最終濃度４％）を
添加し65℃、20分間溶菌した。プロトプラストは
完全に溶菌したことを確認した後、フエノール抽
出し、ついで２倍量のエタノールの加え−20℃で
DNA沈澱させ、沈澱物を少量のTEN緩衝液に懸
濁した。このDNA溶液をリボヌクレアーゼで処
理（リボヌクレアーゼ50μg／mlで37℃、60分
間反応）後、再度フエノール抽出し、ついで２倍
量のエタノールを加え−20℃でDNAを沈澱させ、
沈澱物を少量のTEN緩衝液に懸濁後0.8％のアガ
ロースゲル電気泳動にかけ、泳動ネガフイルムを
デンシトメーターにかけ、染色体DNAとプラス
ミドDNAの割合を測定し、染色体DNAの分子量
を3.0×109ダルトン、pAJ43を3.4×106ダルトン
として計算によりコピー数を求めたところ、染色
体あたり24コピー存在することが判明した。同様
の方法で求めたpAJ655のコピー数は11コピーで
あり、小型化することによりコピー数が倍増した
ことを認めた。[Table] Brevibacterium lactofamentum at a temperature of 30°C in 1 CMG medium (pH 7.2) containing 10 g peptone, 10 g powdered yeast extract, 5 g sodium chloride, and 5 g glucose per 1 distilled water.
ATCC13869 was cultured until the late logarithmic growth phase, and the bacterial cells were collected. After lysing the obtained bacterial cells using a simple method of lysing them with lysozyme and SDS,
Centrifugation was performed at 30,000×g for 30 minutes to obtain 64 ml of supernatant. The plasmid DNA in the supernatant was precipitated by adding polyethylene glycol (final concentration 10%) to the supernatant, and then dissolved in 10 ml of TEN buffer. After treating the DNA with ribonuclease (reaction with 150 μg/ml of ribonuclease at 37°C for 30 minutes),
Extract with phenol, then add twice the amount of ethanol to precipitate the DNA at -20°C, and transfer the precipitate to 1 ml of
Dissolved in TEN buffer. This DNA solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and approximately 74 μg of pure plasmid DNA was separated from the gel. 0.2 μg of plasmid pBR325 was reacted with 1 unit of restriction enzyme BamH (purchased from BRL) at 37°C for 60 minutes to sufficiently degrade the DNA. Plasmid pAM330 (1.2 μg) was reacted with 0.2 units of restriction enzyme Mbo at 37°C for 15 minutes to remove DNA.
was partially disassembled. The resulting DNA fragments were mixed and heat treated at 65°C for 10 minutes to inactivate the restriction enzymes, and then 0.01 unit of T4 DNA ligase was allowed to act on the mixture for 2 hours at 22°C in the presence of ATP and dithiothreitol. T4 DNA
The ligase was inactivated by treatment at 65° C. for 10 minutes, and after adding twice the amount of ethanol, DNA was recovered by centrifugation at 15,000×g for 15 minutes. The composite plasmid thus obtained was used for transformation. Escherichia coli C-600 (thr - , leu - ,
thiamine - , r - , m - ) (Meselson, M.and
Yuan, R. Nature, 217, 1110 (1968)) in 20 ml
Culture in CMG medium at 30°C until mid-logarithmic growth phase.
Bacterial cells were collected. Kushner et al. (“Genetic
Engineering”, p.17 (1978), Elsevier/North
The obtained DNA was used to transform C-600 according to the method of (Holland Biomedical Press). The transformed strain was selected by culturing in CMG medium containing 20 μg/ml chloramphenicol at 37° C. for 24 hours. AJ11882 (FERM-
BP136) was selected and used in the next experiment. The composite plasmid pAJ655 was isolated from the lysate of AJ11882 by the following method. AJ11882
After culturing in CMG medium, a simple method (TamaKa et al.,
J. Bacteriol., 121 , 354 (1975)), and the lysate was applied to an agarose gel and subjected to electrophoresis (Sharp et al., Biochemistry 12 , 3055).
(1973)). By comparison with molecular weight markers, the molecular weight of the plasmid was calculated to be 6.6 megadaltons.
A restriction enzyme cleavage map of the plasmid is shown in FIG. The plasmid was determined to consist of fragments of pBR325 and pAM330 using the method of KJ Danna (Methods in Enzymology 65 , 449,
Academic Press (1980)). pAJ655 was used as a triple auxotrophic (lysine, methionine, threonine) mutant strain Brevibacterium lactofamentum No. whose parent strain is Brevibacterium lactofamentum ATCC13869.
64 (ATCC39134) as follows. Brevibacterium lactofamentum No.
64 was cultured in 5 ml of CMG medium until the early logarithmic growth phase, and after adding 0.6 units/ml of penicillin G,
After culturing with shaking for an additional 1.5 hours, the bacterial cells were collected by centrifugation, and the bacterial cells were washed with 0.5 ml of SMMP medium (pH 6.5) consisting of 0.5 M sucrose, 20 mM maleic acid, 20 mM magnesium chloride, and 3.5% Penatusei broth (Difco). . The cells were then suspended in SMMP medium containing 10 mg/ml of lysozyme to form protoplasts at 30°C for 20 hours. After centrifugation at 6000×g for 10 min, protoplasts were washed with SMMP.
Resuspended in 0.5ml SMMP. The obtained protoplasts were added to 2 μg of pAJ655DNA.
Mix the polyethylene glycol with the final concentration of
After adding the DNA to a concentration of 30%, it was left at room temperature for 2 minutes to incorporate the DNA into protoplasts. After washing the cells with 1 ml of SMMP medium, the protoplasts incorporating DNA were resuspended in 1 ml of SMMP medium and cultured at 30°C for 3 hours to develop drug resistance. This culture solution was spread on a protoplast regeneration medium at pH 7.0. Protoplast regeneration medium contains 12 g of tris(hydroxymethyl)aminomethane, 0.5 g of KCl, and glucose per 1 ounce of distilled water.
10g, MgCl2・6H2O 8.1g, CaCl2・2H2O2.2g ,
4g peptone, 4g powdered yeast extract, 1g casamino acid (Difco), 0.2g K 2 HPO 4 , 135g sodium succinate, 18g agar and chloramphenicol
Contains 5μg/ml. After culturing at 30℃ for 3 to 10 days, select 5 strains from the colonies that appeared and culture them in CMG medium containing 20 μg/ml chloramphenicol to confirm that they are drug (chloramphenicol) resistant strains. did. Furthermore, in order to confirm the presence of the plasmid, the chloramphenicol-resistant strain grown here was lysed, and the lysate was subjected to agarose gel electrophoresis.
A plasmid with the same molecular weight and restriction enzyme cleavage map as PAJ655 was found. pAJ43 was constructed from pAJ655 as follows.
Brevibacterium lactofamentum No. 64 carrying pAJ655 is chloramphenicol
CMG agar medium containing 100μg/ml (peptone 10g/ml)
, yeast extract 10g/, glucose 5g/,
This bacterium cannot grow on CMG (containing 5 g of NaCl and 20 g of agar and adjusted to pH 7.2).
After culturing in medium, chloramphenicol 100μg/
CMG containing the same concentration of chloramphenicol was inoculated into a CMG liquid medium containing chloramphenicol and incubated overnight at 30°C.
By applying an appropriate amount to a medium and culturing at 30°C for 1 to 2 days, one strain showing resistance to 100 μg/ml of chloramphenicol was obtained. When the degree of chloramphenicol resistance of this strain was examined in CMG medium, it showed resistance up to 200 μg/ml. pAJ43DNA was prepared from the chloramphenicol high concentration resistant strain obtained as described above as follows. First, add chloramphenicol to this stock.
Inoculate 1 CMG liquid medium containing 10 μg/ml,
The cells were cultured at ℃ until the late logarithmic growth phase and harvested. After lysing the bacteria with lysozyme and SDS in a conventional manner,
A supernatant was obtained by ultracentrifugation at 30,000×g for 30 minutes. Polyethylene glycol (final concentration 10%) was added to this to precipitate DNA, and after concentrating it, the precipitate was dissolved in 10 ml of TEN buffer. Treat DNA with ribonuclease (ribonuclease
After reacting at 37°C for 30 minutes at 50 μg/ml, extract with phenol, then add twice the amount of ethanol for -20
The DNA was precipitated at °C, and the precipitate was dissolved in 1 ml of TEN buffer. This DNA solution was subjected to agarose gel electrophoresis (voltage gel 5V per cm, 15 hours) to obtain a final 150μg of pure pAJ43 plasmid DNA.
A fraction was collected. (3) Properties of pAJ43 DNA The molecular weight of pAJ43 was determined by agarose gel electrophoresis. Agarose gel electrophoresis was performed using Sharp (PA)
Sharp et al.'s method (Biochemistry 12, 3055
(1973)) using 0.8% gel, gel length cm
Electrophoresis was performed at constant voltage for 15 hours at 5V. The molecular weight was determined by reacting 0.5 μg of pAJ43 with Hind0.5 unit, a restriction enzyme that cuts pAJ43 at one site, at 37°C for 1 hour.
After cutting and linearizing, the mobility was calculated to be 3.4 megadaltons by comparison with a molecular weight marker of known molecular weight, the Hind fragment of λ phage (purchased from BRL). Transformation of Brevibacterium lactofamentum No. 64 with pAJ43DNA Brevibacterium lactofamentum No.
64 (ATCC39134) was cultured in 5 ml of CMG medium until the early logarithmic growth phase. After adding penicillin G to 0.6 units/ml, the culture was further shaken for 1.5 hours, and the bacterial cells were collected by centrifugation. 0.5M
Seuculose, 20mM maleic acid, 20mM magnesium chloride, 3.5% Penatusei broth (Difco)
The cells were washed with 0.5 ml of SMMP medium (pH 6.5) consisting of:
The cells were then suspended in SMMP medium containing 10 mg/ml of lysozyme to form protoplasts at 30°C for 20 hours. After centrifugation at 6000×g for 10 minutes, protoplasts were washed with SMMP and resuspended in 0.5 ml of SMMP. Protoplasts obtained in this way
After mixing with 1 μg of pAJ43DNA and adding polyethylene glycol to a final concentration of 30%,
The DNA was left at room temperature for 2 minutes to incorporate into the protoplasts. SMMP protoplasts
After washing with 1 ml of medium, resuspend in 1 ml of SMMP,
In order to develop drug resistance, the cells were cultured at 30°C for 2 hours. This culture solution was spread on a protoplast regeneration medium at pH 7.0. The protoplast regeneration medium contains 12 g of tris(hydroxymethyl)aminomethane, 0.5 g of KCl, 10 g of glucose, and MgCl 2/1 of distilled water.
6H2O8.1g , CaCl2・2H2O2.2g , peptone 4g, yeast extract 4g, casamino acid (Difco) 1g,
K 2 HPO 4 0.2g, sodium succinate 135g, agar 8g
and chloramphenicol 3 μg/ml. 30℃
We selected 5 strains from the colonies that appeared after 10 days of culture, cultured them in CMG medium containing 100 μg/ml chloramphenicol, and confirmed that they exhibited higher chloramphenicol resistance than the pAJ655-carrying strain. . Furthermore, to confirm the presence of the plasmid, the chloramphenicol-resistant strain grown here was lysed, and the lysate was subjected to agarose gel electrophoresis, and the presence of a plasmid with the same molecular weight as pAJ43 was confirmed. Creation of a restriction enzyme cleavage map for pAJ43DNA Use commercially available restriction enzymes from BRL, and cut pAJ43DNA with restriction enzymes using at least a 3-fold excess of enzyme under the conditions specified for each enzyme. Ta. When plasmid DNA is cut with two or more types of restriction enzymes to create a restriction enzyme map, the first restriction enzyme cut fragment is separated from a separation agarose gel using the method of Tanaka et al.
Tanaka., B. Weisblum. J. Bacteriol., 121 , 354
(1975), concentrated by ethanol precipitation and cut with a second restriction enzyme. The cleaved fragment was subjected to agarose gel electrophoresis according to the method of Example (3), the molecular weight was calculated, and a restriction enzyme cleavage map was created. This result shows that pAJ43 can be isolated from pAJ655 in vivo.
Approximately 1 megadalton containing the chloramphenicol resistance gene region of pBR325 generated by deletion.
It turned out to be a small plasmid consisting of an approximately 2.4 megadalton fragment containing a region essential for maintaining the replication of pAM330. Measurement of copy number of pAJ43 Brevibacterium lactofamentum No. 64 (AJ 11997, FERM-) carrying pAJ43
P6857) was inoculated into 5 ml of CMZG liquid medium containing 10 μg/ml of chloramphenicol, and after culturing overnight at 30°C, 0.1 ml of chloramphenicol (10 μg/ml) was inoculated.
The cells were re-inoculated into 5 ml of CMG liquid medium containing. 30
After culturing at ℃ until the early logarithmic growth phase, ampicillin was added to 1000 μg/ml, the cells were further cultured for 2 hours, and the cells were collected by centrifugation and suspended in 1.5 ml of TEN buffer containing 10 mg/ml of lysozyme. ℃2
After incubation for an hour, SDS (final concentration 4%) was added and the cells were lysed at 65°C for 20 minutes. After confirming that the protoplasts were completely lysed, they were extracted with phenol, then added with twice the amount of ethanol and incubated at -20°C.
DNA was precipitated and the precipitate was suspended in a small amount of TEN buffer. This DNA solution was treated with ribonuclease (reaction with 50 μg/ml of ribonuclease at 37°C for 60 minutes), then extracted with phenol again, and then twice the volume of ethanol was added to precipitate the DNA at -20°C.
After suspending the precipitate in a small amount of TEN buffer, it was subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis, the electrophoresis negative film was run on a densitometer, the ratio of chromosomal DNA to plasmid DNA was measured, and the molecular weight of chromosomal DNA was determined to be 3.0×10 9 When the copy number was calculated by assuming pAJ43 to be 3.4×10 6 Daltons, it was found that there were 24 copies per chromosome. The copy number of pAJ655 determined by the same method was 11 copies, and it was confirmed that the copy number doubled due to miniaturization.
【図面の簡単な説明】[Brief explanation of drawings]
第１図は、プラスミドpAM330の制限酵素切断
地図である。第２図は、プラスミドpAJ655の制
限酵素切断地図である。第３図は、プラスミド
pAJ43の制限酵素切断地図である。
FIG. 1 is a restriction enzyme cleavage map of plasmid pAM330. FIG. 2 is a restriction enzyme cleavage map of plasmid pAJ655. Figure 3 shows plasmid
This is a restriction enzyme cleavage map of pAJ43.