JPH03183479A - Method for secreting and producing human lysozyme - Google Patents
Method for secreting and producing human lysozymeInfo
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規なヒトリゾチームの分泌生産法に関する。[Detailed description of the invention] [Industrial application field] The present invention relates to a novel method for secretory production of human lysozyme.
更に詳しくは、本発明は、ニワトリリゾチームのシグナ
ルペプチドをコードするＤＮＡとヒトリゾチーム構造遺
伝子から成る雑種プレリゾチーム遺伝子を含有する組み
換えＤＮＡを保持する酵母の形質転換体を発現すること
によるヒトリゾチームの分泌生産方法に関する。More specifically, the present invention provides secretion of human lysozyme by expressing a yeast transformant carrying a recombinant DNA containing a hybrid prelysozyme gene consisting of DNA encoding the signal peptide of chicken lysozyme and the human lysozyme structural gene. Regarding production methods.
ヒトリゾチームはヒトの涙、唾液、鼻粘液、乳、リンパ
腺、白血球、血漿、軟骨、肺、腎臓、牌臓、肝臓、腸管
、耳下腺、皮膚、精液、白血病患者の尿中等に見出され
る酵素蛋白質であり、Ｎ−アセチルグルコサミンとＮ−
アセチルムラミン酸量のβ−１，４結合を加水分解する
ムラミダーゼ（ｍｕｒａ−ｍｉｄａｓｅ）としての酵素
活性を有していることが知られている。Human lysozyme is found in human tears, saliva, nasal mucus, breast, lymph glands, white blood cells, plasma, cartilage, lungs, kidneys, spleen, liver, intestinal tract, parotid gland, skin, semen, and urine of leukemia patients. It is an enzyme protein that contains N-acetylglucosamine and N-
It is known to have enzymatic activity as a muramidase that hydrolyzes β-1,4 bonds in acetylmuramic acid.
またヒト乳由来のリゾチームは下記の配列で示される１
３０個のアミノ酸からなる事が知られている（例えば、
船津ら「溶菌酵素」５５〜５８頁、講談社すイエンティ
フィク（１９７７）参照）。In addition, lysozyme derived from human milk has the sequence 1 shown below.
It is known that it consists of 30 amino acids (for example,
(See Funatsu et al., "Lytic Enzymes," pp. 55-58, Kodansha Scientific (1977)).
Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇ
ｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙ
ｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ
−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−１１ｅ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−
Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ａ
ｌａ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙ
ｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ
−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−
Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｐ
ｈｅ−Ｇｌｎ−１１ｅ−Ａｓｎ−３ｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｙ
ｒ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ
−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−
Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ｃｙｓ−Ｓ
ｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ａｓ
ｎ−１１ｅ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ
−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−
Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇ
ｌｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−リゾチームは種々の細
菌を溶解する作用を有するので、食品等の防腐剤あるい
は医薬品として、リゾチーム単独又は抗生物質との併用
による抗菌剤として利用することができる。また、血液
凝固及び止血作用、抗炎症作用、呼吸器疾患者に対する
喀痰喀出作用等をも有するのでそれらを対象とした医薬
品としても利用することができる。Lys-Val-Phe-Glu-Arg-Cys-G
lu-Leu-Ala-Arg-Thr-Leu-Ly
s-Arg-Leu-Gly-Met-Asp-Gly
-Tyr-Arg-Gly-11e-3er-Leu-
Ala-Asn-Trp-Met-Cys-Leu-A
la-Lys-Trp-Glu-Ser-Gly-Ty
r-Asn-Thr-Arg-Ala-Thr-Asn
-Tyr-Asn-Ala-Gly-Asp-Arg-
Ser-Thr-Asp-Tyr-Gly-11e-P
he-Gln-11e-Asn-3er-Arg-Ty
r-Trp-Cys-Asn-Asp-Gly-Lys
-Thr-Pro-Gly-Ala-Val-Asn-
Ala-Cys-His-Leu-3er-Cys-S
er-Ala-Leu-Leu-Gln-Asp-As
n-11e-Ala-Asp-Ala-Val-Ala
-Cys-Ala-Lys-Arg-Val-Val-
Ala-Trp-Arg-Asn-Arg-Cys-G
Since ln-Asn-Arg-Asp-lysozyme has the effect of lysing various bacteria, it can be used as a preservative for foods, etc., or as a pharmaceutical agent, and as an antibacterial agent by using lysozyme alone or in combination with antibiotics. It also has blood coagulation and hemostasis effects, anti-inflammatory effects, and sputum expectoration effects for people with respiratory disorders, so it can be used as a pharmaceutical for those patients.
ヒトリゾチームはヒトの乳、尿等から単離することがで
きるが、医療等を目的とする工業的生産の要求を満たす
には効率が悪く実用的ではない。Human lysozyme can be isolated from human milk, urine, etc., but it is inefficient and impractical to meet the demands of industrial production for medical purposes.
本発明は、組み換えＤＮＡ技術により安価にしかも多量
に純粋なヒトリゾチームを分泌生産することを可能にし
たものである。The present invention makes it possible to secrete and produce pure human lysozyme in large quantities at low cost using recombinant DNA technology.
合成雑種プレリゾチーム遺伝子を用いて組み換えＤＮＡ
技術によりヒトリゾチームを製造する方法は後により詳
しく記述するが基本的には下記の工程により成る。Recombinant DNA using a synthetic hybrid prelysozyme gene
The method for producing human lysozyme by this technique will be described in more detail later, but basically consists of the following steps.
（１）遺伝子の設計
（２）遺伝子の化学合成
（３）適当な発現用ベクターへの遺伝子の組み込み
（４）得られた組み換えプラスミドに依る適当な宿主の
形質転換
（５）形質転換体の培養によるヒトリゾチームの生産及
び回収
上記の工程において、宿主として大腸菌を用いた場合の
製造法に関しては、すでに本発明者らの一部によってそ
の詳細が日本特許出願５９−２０１３６６号及び５９−
２０１３６７号明細書に開示されている。(1) Gene design (2) Chemical synthesis of the gene (3) Integration of the gene into an appropriate expression vector (4) Transformation of an appropriate host using the obtained recombinant plasmid (5) Cultivation of the transformant Production and recovery of human lysozyme In the above process, the details of the production method using Escherichia coli as a host have already been described by some of the present inventors in Japanese Patent Application Nos. 59-201366 and 59-201366.
It is disclosed in the specification of No. 201367.
宿主として酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）を用いた場合、大腸菌を用いた場合と
比較して（イ）培養が安全かつ容易であり、より高密度
で培養する事が可能である。Yeast (Saccharomyces cer
Compared to the case of using Escherichia coli, (a) culture is safer and easier when using E. evisiae), and it is possible to culture at a higher density.
（ロ）発熱物質等の毒性物質の混入をさける事ができる
ため生産物の安全性がより高くなる。(b) The safety of the product is increased because the contamination of toxic substances such as pyrogens can be avoided.
（ハ）高等動物由来の遺伝子産物が正しい構造をとりや
すい。(c) Gene products derived from higher animals tend to have the correct structure.
（ニ）酵母細胞はリゾチームに対して非感受性であるた
めより安定に生産し得る。(d) Since yeast cells are insensitive to lysozyme, they can produce it more stably.
等の利点を有している。It has the following advantages.
しかしながら、本発明者らによって既に提案された方法
（日本特許出願６Ｏ−１３９７１０）では、酵母細胞内
で発現したヒトリゾチームを培地中に分泌させることが
できない。従って、酵母菌体を回収し、菌体を破砕し、
ここから目的タンパク質を抽出、分離、精製する必要が
ある。しかし、酵母菌体内には多量の夾雑タンパク質が
存在するため、分離、精製はかなり困難な作業となる。However, with the method already proposed by the present inventors (Japanese Patent Application No. 6O-139710), human lysozyme expressed in yeast cells cannot be secreted into the medium. Therefore, the yeast cells are collected, the cells are crushed,
From this, it is necessary to extract, separate, and purify the target protein. However, since there are a large amount of contaminant proteins inside the yeast cells, separation and purification are quite difficult tasks.
また、酵母菌体内で直接発現されたタンパク質ではＮ末
端アミノ酸として、翻訳開始コドンＡＵＧに由来するメ
チオニンが目的タンパク質のＮ末端に付加した所望でな
い付加物として産生される可能性がある。従って、適当
なシグナルペプチドを含有する融合タンパク質前駆体と
して産生させた後、発現産物を酵母菌体でプロセシング
させ、成熟タンパク質として菌体外に分泌させることが
できれば、前記の様な問題点を一挙に解決することが可
能となる。Furthermore, in proteins directly expressed in yeast cells, methionine derived from the translation initiation codon AUG may be produced as an undesired adduct added to the N-terminus of the target protein as an N-terminal amino acid. Therefore, if the expression product could be produced as a fusion protein precursor containing an appropriate signal peptide, then processed in yeast cells and secreted outside the cells as a mature protein, the above-mentioned problems could be solved at once. It becomes possible to solve the problem.
ところで、ヒトリゾチームのアミノ酸配列は既知である
が、その前駆体タンパク質及び遺伝子はいずれも未だ単
離されていない。しかし、ヒトリゾチームと生物活性が
極めて類似したニワトリリゾチームについては、遺伝子
が単離されており、この配列から前駆体タンパク質にワ
トリプレリゾチーム）と、これをコードするＤＮＡ配列
を知ることができる。（例えば、Ａ、 Ｊｕｎｇら、Ｐ
ｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。Incidentally, although the amino acid sequence of human lysozyme is known, neither its precursor protein nor gene have been isolated yet. However, the gene for chicken lysozyme, which has biological activity extremely similar to that of human lysozyme, has been isolated, and from this sequence, we can learn the precursor protein (chicken lysozyme) and the DNA sequence encoding it. (e.g. A, Jung et al., P
roc, Natl.
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ７７、５７５９（１
９８０）参照）。リゾチームはヒトでもニワトリでも細
胞内から細胞外に分泌されるタンパク質であることから
、酵母においても、適切なシグナルペプチドをヒトリゾ
チーム成熟タンパク質のＮ末端に付加できれば、酵母の
分泌系を利用して培地中に分泌させることが可能である
と考えられる。Acad, Sci, USA 77, 5759 (1
980)). Lysozyme is a protein that is secreted from the inside of cells to the outside of cells in both humans and chickens. Therefore, in yeast, if an appropriate signal peptide can be added to the N-terminus of the human lysozyme mature protein, the yeast secretion system can be used to culture the protein. It is thought that it is possible to secrete it into the body.
本発明者らは、この様な状況の中で、酵母細胞を用いた
ヒトリゾチームの菌体外分泌生産を目的として種々検討
を重ねた結果、ニワトリリゾチームのシグナルペプチド
をコードするＤＮＡを利用することにより正しくプロセ
シングされたヒトリゾチームを高レベルで培地中に分泌
生産させることが可能であることを見出し、本発明を完
成するに至った。本発明を次に詳細に説明する。Under these circumstances, the present inventors conducted various studies with the aim of producing human lysozyme by extracellular secretion using yeast cells, and as a result, the present inventors found that by using DNA encoding the signal peptide of chicken lysozyme, We have discovered that it is possible to secrete and produce correctly processed human lysozyme into a medium at high levels, and have completed the present invention. The invention will now be described in detail.
（１）遺伝子の設計
１−１ 構造遺伝子対応ＤＮＡ
ヒトリゾチームを構成するアミノ酸を指定するいくつか
のコドンのうちから下記の条件を満すものを選んでＤＮ
Ａを合成する。(1) Gene design 1-1 DNA corresponding to structural genes Select a codon that satisfies the following conditions from several codons specifying the amino acids that make up human lysozyme and create a DNA.
Synthesize A.
（Ａ）可能な限り酵母で高頻度に使用されているコドン
を選ぶ。(A) Choose codons that are used as frequently in yeast as possible.
（Ｂ）後記する各々の合成フラグメントが分子内あるい
は分子間で望まない相補性配列を持たない様にする。(B) Ensure that each of the synthetic fragments described below does not have any undesired complementary sequences within or between molecules.
本発明で用いる構造遺伝子は第６図に示される遺伝子で
あるが、同遺伝子の設計及び取得法については、すでに
本発明者らにより日本特許出願５９−２０１３６７号明
細書にその詳細が開示されているので、それを参照され
たい。The structural gene used in the present invention is the gene shown in Figure 6, and the details of the method for designing and obtaining the gene have already been disclosed by the present inventors in Japanese Patent Application No. 59-201367. Please refer to it.
１−２ シグナルペプチド対応ＤＮＡ酵母での分泌を
可能にするためには、上記の構造遺伝子の５゛末端側に
分泌に必要なシグナルペプチド配列に対応するＤＮＡを
翻訳読取枠を一致させて付加する必要がある。通常、酵
母で異種タンパク質を分泌生産させるために利用される
シグナルペプチドとしては酵母が本来培地中に分泌する
酵母タンパク質のシグナルペプチドが利用されている。1-2 DNA corresponding to the signal peptide In order to enable secretion in yeast, DNA corresponding to the signal peptide sequence necessary for secretion is added to the 5′ end of the above structural gene with the translation reading frame matching. There is a need. Normally, as a signal peptide used to secrete and produce a foreign protein in yeast, a signal peptide of a yeast protein that yeast originally secretes into the medium is used.
これを以下「同種シグナル」という。例えば、インベル
ダーゼに通常結合しているアミノ酸プレ配列テあるイン
ベルターゼシグナルペプチドや酵母α因子の前駆体タン
パク質に含まれるシグナルペプチドを利用する場合であ
る。一方、ニワトリリゾチームのシグナルペプチドとし
ては、前記の如く、単離されたニワトリリゾチーム遺伝
子の解析から、以下の構造であることが見出された。This is hereinafter referred to as a "same type signal." For example, the invertase signal peptide, which has the amino acid presequence normally associated with inverdase, or the signal peptide contained in the yeast α-factor precursor protein may be used. On the other hand, as described above, the signal peptide of chicken lysozyme was found to have the following structure from the analysis of the isolated chicken lysozyme gene.
（例えば、Ａ、 Ｊｕｎｇら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。(e.g. A. Jung et al., Proc. Natl.
Acad, Sci.
ＵＳＡ、 ７７、５７５９（１９８０）参照）ｌｅｕ−
ｐｒｏ−１ｅｕ−ａｌａ−ａｌａ−１ｅｕ−ｇｒｙ’ｌ
ｙｓ−ｖａｌ−ｐｈｅ−ｇ ｌ ｙａｒｇ −−−”
”’・
但し、＋１は成熟型ニワトリリゾチームのＮ末端アミノ
酸を示し、−１〜−１８は前駆体ニワトリリゾチームに
含まれるシグナルペプチドを示している。矢印は前駆体
がニワトリ細胞内で成熟型に変換される際の切断位置を
示している。USA, 77, 5759 (1980)) leu-
pro-1eu-ala-ala-1eu-gry'l
ys-val-phe-g l yarg---”
``'・ However, +1 indicates the N-terminal amino acid of mature chicken lysozyme, and -1 to -18 indicate the signal peptide contained in the precursor chicken lysozyme. Indicates the cutting position during conversion.
この様なニワトリ由来のシグナルペプチドを酵母本来の
シグナル以外という意味で、以後「異種シグナル」とい
う。この様な異種シグナルが前記の同種シグナルと全く
同様に機能するか否か、即ち、酵母細胞内で発現、プロ
セシング及び分泌を達成するか否かは明らかではない。Such a chicken-derived signal peptide is hereinafter referred to as a "heterologous signal" in the sense that it is a signal other than yeast's original signal. It is not clear whether such heterologous signals function in exactly the same way as the homologous signals described above, ie, whether they achieve expression, processing, and secretion in yeast cells.
何故ならば、酵母の分泌過程はまだ十分に解明されてい
ないことから、ニワトリやヒトなど高等哺乳類細胞の分
泌過程と同一か否かが明らかでないからである。This is because the secretion process of yeast has not yet been fully elucidated, and it is not clear whether it is the same as the secretion process of higher mammalian cells such as chickens and humans.
酵母で異種タンパク質の分泌生産に「異種シグナル」を
用いた例としては、ヒトインターフェロンのシグナルペ
プチド（アミノ酸残基２３個に対応するＤＮＡ）を利用
した例がある。（Ｒ，Ａ、 Ｈｉｔｚｅｍａｎら、５ｃ
ｉｅｎｃｅ、 ２１９．６２０（１９８３）） Ｌかし
、この場合には、培地中に分泌されたインターフェロン
は、酵母によって発現した全インターフェロンの約ｌＯ
％にすぎなかった。しかも分泌されたインターフェロン
は、所望の切断部位でプロセシングされたものは約６５
％であり、これより長さの長い所望でないインターフェ
ロンが約３５％、同時に副生していた。An example of using a "heterologous signal" for secretory production of a heterologous protein in yeast is the use of a human interferon signal peptide (DNA corresponding to 23 amino acid residues). (R,A, Hitzeman et al., 5c
219.620 (1983)), in which case the interferon secreted into the medium accounts for approximately 100% of the total interferon expressed by the yeast.
It was only %. Moreover, the secreted interferon processed at the desired cleavage site is about 65
%, and about 35% of undesired interferon having a longer length than this was produced as a by-product at the same time.
このことは、酵母細胞がヒト由来のシグナルペプチドを
不完全に認識していることを示唆するものである。一般
に、分泌タンパク質は通常粗面小胞体（ＲＥＲ）中での
翻訳によって形成されるが、この際、シグナルペプチド
はシグナル認識粒子（ＳＲＰ）という推定粒子と相互作
用し、次いでＳＲＰ受容体又は結合タンパク質（ｄｏｃ
ｋｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）といわれる推定ＲＥＲ膜タ
ンパク質を認識し、その後にタンパク質がＲＥＲ膜を通
って輸送される（例えば、Ｇ、 Ｂｌｏｂｅｌ ａｎｄ
Ｂ、 Ｄｏｂｂｅｒｓｔｅｉｎ、 Ｊ、 Ｃｅ１１．
Ｂｉｏｌ、。This suggests that yeast cells incompletely recognize human-derived signal peptides. In general, secreted proteins are usually formed by translation in the rough endoplasmic reticulum (RER), during which a signal peptide interacts with a putative particle called a signal recognition particle (SRP) and then an SRP receptor or binding protein. (doc
The protein is then transported through the RER membrane (e.g., G, Blobel and
B. Dobberstein, J. Ce11.
Biol.
６７、８３５（１９７５）或いはＰ、 Ｗａｉｔｅｒ
ａｎｄ Ｇ、 ＢｌｏｂｅｌｌＪ、 Ｃｅ１１． Ｂｉ
ｏｌ、、 ９１．５４５（１９８１）参照）。67, 835 (1975) or P, Waiter
and G, Blobell J, Ce11. Bi
ol., 91.545 (1981)).
このタンパク質は一旦ＲＥＲ内腔に分離された後、ゴル
ジ装置へ移送され、次に小胞内へ包入される。Once this protein is separated into the RER lumen, it is transported to the Golgi apparatus and then packaged into vesicles.
小胞が原形質膜と融合すると小胞内容物（タンパク質）
が原形質膜と細胞壁の間に限定されたペリプラズム空間
（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ５ｐａｃｅ）に放出される
。When the vesicle fuses with the plasma membrane, the vesicle contents (proteins)
is released into the periplasmic space defined between the plasma membrane and the cell wall.
以上の分泌過程は酵母においても妥当であると考えられ
ているが、酵母の推定ＳＲＰは哺乳類細胞のＳＲＰと同
等ではないかも知れない。また、分泌過程でタンパク質
のｉｎ ｖｉｖｏでの修飾（例えばリン酸化、グリコジ
ル化等）がおこるか否か、分泌タンパク質の局在化にど
の程度関与するのかも明らかではない。にも拘らず、ニ
ワトリリゾチームのシグナルペプチドが酵母内で正しく
機能するかも知れないと推定された根拠は以下の理由に
よる。Although the above secretion process is thought to be valid in yeast as well, the estimated SRP in yeast may not be equivalent to the SRP in mammalian cells. Furthermore, it is not clear whether in vivo modifications of proteins (eg, phosphorylation, glycosylation, etc.) occur during the secretion process, and to what extent they are involved in the localization of secreted proteins. Nevertheless, the reason for assuming that the signal peptide of chicken lysozyme may function properly in yeast is as follows.
（Ａ）ニワトリリゾチームのシグナルペプチドは１８個
のアミノ酸残基からなり、酵母本来のインベルターゼシ
グナル（アミノ酸１８個）、α−ガラクトシダーゼシグ
ナル（アミノ酸１８個）、酸性フォスファターゼシグナ
ル（アミノ酸１７個）等と極めて類似した長さを有して
いる。(A) The signal peptide of chicken lysozyme consists of 18 amino acid residues, and is extremely similar to yeast's original invertase signal (18 amino acids), α-galactosidase signal (18 amino acids), acid phosphatase signal (17 amino acids), etc. have similar lengths.
（Ｂ）シグナルペプチドのＮ末端付近には、同種シグナ
ルによく見られる塩基性アミノ酸残基としてａｒｇが存
在している。(B) Near the N-terminus of the signal peptide, arg is present as a basic amino acid residue often found in homologous signals.
（Ｃ）シグナルペプチドの中央部には、ｌｅｕ、 ｉｌ
ｅ。(C) The central part of the signal peptide contains leu, il
e.
ｖａＬ ｐｈｅ等の疎水性アミノ酸からなる領域が存在
し、これも同種シグナルと極めて類似している。There are regions consisting of hydrophobic amino acids such as vaL phe, which are also very similar to the cognate signal.
ニワトリリゾチーム前駆体が成熟型に変換（プロセシン
グ）させる際の切断部位はｇｌｙ（−１）と１ｙｓ（＋
１）の間であるが、酵母の場合には、これと同一の部位
で切断されるか否かを予測する根拠は明確ではない。し
かし、前記の理由から同一部位で切断される可能性は高
いと推定される。The cleavage sites for converting (processing) chicken lysozyme precursor into the mature form are gly (-1) and 1ys (+
1), but in the case of yeast, there is no clear basis for predicting whether or not it will be cleaved at the same site. However, for the reasons mentioned above, it is presumed that there is a high possibility that they will be cleaved at the same site.
以上の考えから、異種シグナルを酵母でのリゾチーム分
泌用シグナルとして利用することとした。Based on the above considerations, we decided to use a heterologous signal as a signal for lysozyme secretion in yeast.
その設計に際しての基本的な考えは以下の通りである。The basic idea behind its design is as follows.
（Ａ）シグナルペプチドに対応するヌクレオチド配列と
しては、ｍＲＮＡレベルでの２次構造上の障害を防止す
るために、ニワトリ由来のコドンをそのまま利用する。(A) As the nucleotide sequence corresponding to the signal peptide, chicken-derived codons are used as they are in order to prevent secondary structure problems at the mRNA level.
（Ｂ）シグナルペプチドに対応するＤＮＡは、構造遺伝
子との連結を容易にするため構造遺伝子の５°側に存在
する制限酵素Ｔａｑ Ｉ部位までをカバーする領域とし
て、これを化学合成する。(B) The DNA corresponding to the signal peptide is chemically synthesized as a region covering up to the restriction enzyme Taq I site located on the 5° side of the structural gene in order to facilitate connection with the structural gene.
（Ｃ）プラスミドへの組み込み、プラスミドからの切り
出しを容易するため、５゛側に制限酵素認識配列をもた
せる。(C) A restriction enzyme recognition sequence is provided on the 5' side to facilitate integration into the plasmid and excision from the plasmid.
この様にして設計されたシグナル配列ＤＮＡの一具体例
は第７図のヌクレオチド配列式で表わされるＤＮＡであ
り、これを適当な制限酵素で処理したヒトリゾチーム構
造遺伝子と連結することにより雑種プレリゾチーム遺伝
子とした後、適当なベクターに組み込むことにより酵母
で発現、分泌させることが可能である。A specific example of the signal sequence DNA designed in this way is the DNA represented by the nucleotide sequence formula shown in Figure 7, and by linking this with the human lysozyme structural gene treated with an appropriate restriction enzyme, a hybrid prelysozyme can be produced. After making it into a gene, it can be expressed and secreted in yeast by incorporating it into an appropriate vector.
（２）遺伝子の合成
上記のように設計した遺伝子を合成するには、＋、−両
鏡のそれぞれについて、これをいくつかのフラグメント
に分けて、それらを化学的に合成し各々のフラグメント
を連結する方法によれば良い。(2) Gene synthesis To synthesize the gene designed as described above, each of the + and - mirrors is divided into several fragments, they are chemically synthesized, and each fragment is linked. It depends on how you do it.
本発明で用いた構造遺伝子は、第６図に示される遺伝子
であるが、同遺伝子の取得法についてはすでに本発明者
らに依り日本特許出願５９−２０１３６７号明細書にそ
の詳細が開示されているので、それを参照されたい。一
方、シグナルペプチドＤＮＡについては、第７図に示さ
れるＤＮＡフラグメントに分割して、フラグメントの合
成、精製、５′−水酸基のリン酸化及びフラグメントの
連結を行なうが、それ自体は公知の方法に従って行うこ
とができる。The structural gene used in the present invention is the gene shown in Figure 6, and the details of the method for obtaining the gene have already been disclosed by the present inventors in Japanese Patent Application No. 59-201367. Please refer to it. On the other hand, the signal peptide DNA is divided into the DNA fragments shown in Figure 7, and the fragments are synthesized, purified, 5'-hydroxyl group phosphorylated, and the fragments are ligated according to known methods. be able to.
（３）組み換えプラスミドの調製
３−１ プロリゾチーム遺伝子のプラスミドベクターへ
の導入
前記の様にして作成した雑種プレリゾチーム遺伝子を宿
主内で増殖可能なプラスミドベクター又は宿主内で増殖
、発現が可能な様に構成されたプラスミドベクターの適
当な挿入部位に組み込む。(3) Preparation of recombinant plasmid 3-1 Introduction of prolysozyme gene into plasmid vector The hybrid prelysozyme gene created as described above can be used in a plasmid vector that can be propagated in the host, or in a vector that can be propagated and expressed in the host. into the appropriate insertion site of a plasmid vector constructed as follows.
組み込み操作そのものは分子生物学の分野で公知の常法
に従って行うことができる。具体的な方法については後
記の実施例を参照されたい。The incorporation operation itself can be performed according to conventional methods known in the field of molecular biology. For specific methods, please refer to Examples below.
本発明により雑種プレリゾチーム遺伝子の増殖はｐＢＲ
３２２、ｐＡＴ１５３ （例えば、Ｔｗｉｇｇら、Ｎａ
ｔｕｒｅ。According to the present invention, the hybrid prelysozyme gene can be propagated in pBR.
322, pAT153 (e.g., Twigg et al., Na
true.
２８３．２１６〜２１８（１９８０）参照）等の公知の
種々のプラスミドベクターを用いて行うことができる。283.216-218 (1980)) can be carried out using various known plasmid vectors.
また、プラスミドＤＮＡの単離精製も分子生物学の分野
で公知の常法に従って行うことができる。第６図に示さ
れる構造遺伝子をｐＢＲ３２２のＢａｍＨｒ切断部位に
挿入して得られたｐＨＬＹ−１の取得法に関しては日本
特許出願５９−２０１３６７号明細書を参照されたい。Further, isolation and purification of plasmid DNA can also be performed according to conventional methods known in the field of molecular biology. Regarding the method for obtaining pHLY-1 obtained by inserting the structural gene shown in FIG. 6 into the BamHr cleavage site of pBR322, please refer to Japanese Patent Application No. 59-201367.
本発明雑種プレリゾチーム遺伝子によりヒトリゾチーム
の酵母での発現は、ＡＤ旧プロモーター（例えばＨｉ
ｔｚｅｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ ２９３７１７〜７２
２（１９８１）参照）、ＰＧＫプロモーター（例えば、
ＨｉｔＺｅｍａｎら、５ｃｉｅｎｃｅ ２１９６２０（
１９８３）参照）、ＧＡＰＤＨプロモーター（例えば、
Ｕｒｄｅａら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ。Expression of human lysozyme in yeast by the hybrid prelysozyme gene of the present invention can be performed using the AD old promoter (e.g. Hi
Tzerman et al., Nature 293717-72
2 (1981)), PGK promoter (e.g.
HitZeman et al., 5science 219620 (
(1983)), GAPDH promoter (e.g.
Urdea et al., Proc. Natl. Acad.
Sci.
ＵＳＡ ８０７４６１〜７４６５（１９８３）参照）、
ＰＨ０５プロモーター（例えばＫｒａｍｅｒら、Ｐｒｏ
ｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｃｆ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ８
１３６７〜３７０（１９８４）参照）、ＥＮＯプロモー
ター（例えばＨｏ１ｌａｎｄら、Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃ
ｈｅｍ、 ２５６１３８５〜１３９５（１９８１）参照
）及びＧＡＬＩＯプロモーター（例えば、Ｂｒｏａｃｈ
ら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉ
ｏｎ ｏｆ ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ８３〜
１１７（１９８３）参照）等を有する公知の種々の発現
ベクターを用いて行うことができる。(see USA 807461-7465 (1983)),
PH05 promoter (e.g. Kramer et al., Pro
c, Natl, Acacf, Sci, USA8
1367-370 (1984)), the ENO promoter (e.g. Holland et al., J. Biol., C.
hem, 2561385-1395 (1981)) and the GALIO promoter (e.g. Broach
et al., Experimental Manipulati
on of GeneExpression 83~
117 (1983)), etc., can be carried out using various known expression vectors.
これらの発現ベクターのうちの一具体例はＹＥｐ５１（
例えば、Ｂｒｏａｃｈら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｔｎａｌ
Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅ
ｓｓｉｏｎ、 ８３〜１１７（１９８３）参照）である
。One specific example of these expression vectors is YEp51 (
For example, Broach et al., Experimental
Manipulation of Gene Expression
ssion, 83-117 (1983)).
３−２ 方向性の判定
プラスミドに組み込まれた雑種プレリゾチーム遺伝子の
方向性の判定は遺伝子内に含まれる特定の塩基配列を認
識する制限酵素（例えば、Ｔａｇ Ｉ、Ｂｓｔ ＥＩＩ
、 Ｘｂａ Ｉ等であり、第６図及び第７図を参照され
たい）でその部位を切断し、遺伝子外の特定部位を別の
制限酵素を用いて切断して、得られた断片のサイズをア
ガロースゲル電気泳動等の通常用いられている方法で分
析する事により行うことができる。3-2 Determination of directionality The directionality of the hybrid prelysozyme gene integrated into the plasmid can be determined using restriction enzymes (e.g., Tag I, Bst EII) that recognize specific base sequences contained within the gene.
, Xba I, etc. (see Figures 6 and 7), and then cut the specific site outside the gene using another restriction enzyme to determine the size of the resulting fragment. This can be carried out by analysis using commonly used methods such as agarose gel electrophoresis.
（４）形質転換
４−１ 宿主
雑種プレリゾチーム遺伝子を組み込んだ組み換えプラス
ミドの調製、増殖は大腸菌を用いて行われるが、宿主細
胞の大腸菌の一具体例はＥ、ｃｏｌｉＣ６００（例えば
、Ｎｅ１ｓｏｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １０８ ３３８
〜３５０（１９８１）参照）である。(4) Transformation 4-1 Preparation and propagation of a recombinant plasmid incorporating the host hybrid prelysozyme gene is carried out using E. coli, and a specific example of E. coli as a host cell is E. coliC600 (e.g., Nelson et al., Virology 108 338
~350 (1981)).
雑種プレリゾチーム遺伝子を組み込んだ組み換えプラス
ミドによるヒトリゾチームの発現は酵母を用いて行われ
るが、宿主細胞の酵母での一具体例は、Ｓ、 ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ ＫＫ４（例えば、Ｎｏｇｉら、Ｍｏｌ。Expression of human lysozyme by a recombinant plasmid incorporating a hybrid prelysozyme gene is carried out using yeast, and one specific example in yeast as a host cell is S. cere
visiae KK4 (e.g. Nogi et al., Mol.
Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、 １９５２９〜３４（１９８４
）参照である。ヒトリゾチーム遺伝子を組み込んだ組換
えプラスミドによる形質転換は上記の宿主に限定される
ものではなく、公知の種々のＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
誘導体（例えば、イーストジエネティックストックセン
ター（Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ ５ｔｏｃｋ Ｃｅ
ｎｔｅｒ）カタログ参照）を使用することができる。こ
れらのＳ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ誘導体の多くのもの
はイーストブエネティックストックセンター（Ｙｅａｓ
ｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ ５ｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）及び
公認の微生物機関、例えばアメリカンタイプカルチャー
コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔ
ｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託されておりそこか
ら分譲が可能である。Gen, Genet, 19529-34 (1984
) is a reference. Transformation with a recombinant plasmid incorporating the human lysozyme gene is not limited to the above-mentioned hosts, but can be performed on various known S. cerevisiae
derivatives (e.g. Yeast Genetic 5tock Ce
(see catalog) can be used. Many of these S. cerevisiae derivatives are found in the East Buenetic Stock Center (Yeas
Genetic 5tock Center and recognized microbiological institutions, such as the American Type Culture Collection.
ureCollection) and can be distributed from there.
４−２ 形質転換
形質転換操作そのものは、分子生物学の分野で公知の常
法に従って行うことができる。（大腸菌の形質転換につ
いては、例えば、Ｃｏｈｅｎら、Ｐｒｏｃ。4-2 Transformation The transformation itself can be performed according to conventional methods known in the field of molecular biology. (For transformation of E. coli, see, eg, Cohen et al., Proc.
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ６９
２１１０〜２１１４（１９７２）及びＭａｎｉａｔｉＳ
ら、 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２４９
〜２５３（１９８２）参照。酵母の形質転換については
、例えばＨｉｎｎｅｎら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａ
ｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ７５１９２９（１９７８
）及びＩｔＯら、Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １５３
１６３〜１６８（１９８３）参照）。Natl, Acad, Sci, USA 69
2110-2114 (1972) and ManiatiS
et al., Molecular Cloning 249
See ~253 (1982). For yeast transformation, see, eg, Hinnen et al., Proc. Natl.
cad, Sci, USA 751929 (1978
) and ItO et al., J. Bacteriol, 153
163-168 (1983)).
４−３ 形質転換体
酵母に於ける形質転換体の具体例は、Ｓ、 ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ ＫＫ４をＹＥｐ−ＨＬＹＳ ＩＧで形質転
換させて得た形質転換体であって、本発明ではこれをＳ
、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＫＫ４ （ＹＥｐ−ＨＬＹＳ
ＩＧ）と命名した。4-3 Transformants Specific examples of transformants in yeast include S, cerev
This is a transformant obtained by transforming S. isiae KK4 with YEp-HLYS IG.
, cerevisiae KK4 (YEp-HLYS
It was named IG).
５ ヒトリゾチームの分泌生産
この様にして得た形質転換体を分子生物学及び発酵学の
分野で公知の常法に従って培養すればヒトリゾチームが
分泌生産される。5 Secretory production of human lysozyme Human lysozyme is secreted and produced by culturing the transformant thus obtained according to conventional methods known in the fields of molecular biology and fermentation science.
ヒトリゾチームは公知の免疫沈降反応、ラジオイムノア
ッセイ（例えばＹｕｚｕｒｉｈａらＣｈｅｍ、 Ｐｈａ
ｒｍ。Human lysozyme can be detected by known immunoprecipitation reactions, radioimmunoassays (e.g. Yuzuriha et al. Chem, Pha
rm.
Ｂｕｌｌ、 ２７２８０２〜２８０６（１９７６）及び
ＹｕｚｕｒｉｈａらＣｈｅｍ。Bull, 272802-2806 (1976) and Yuzuriha et al. Chem.
Ｐｈａｒｍ、 Ｂｕｌｌ、 ２６９０８−９１４（１９
７８）参照）、酵素活性測定法（例えば５ｉｄｈａｎら
、Ａｇｒｉｃ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ。Pharm, Bull, 26908-914 (19
78)), enzyme activity assays (e.g., 5idhan et al., Agric, Biol, Chem.
４５１８１７〜１８２３（１９８１）及びＭｏｒｓｋｙ
Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ。451817-1823 (1981) and Morsky
Anal, Biochem.
１２８７７〜８５（１９８３）参照）等を用いて検出、
定量することができる。12877-85 (1983)), etc.
Can be quantified.
また生産したヒトリゾチームは生化学及び発酵学分野で
公知の常法を適宜組み合せて回収、精製することができ
る。In addition, the produced human lysozyme can be recovered and purified by appropriately combining conventional methods known in the fields of biochemistry and fermentation science.
実施例
シグナルペプチド対応ＤＮＡフラグメントの化学合成
前記のようにして設計したニワトリリゾチームシグナル
ペプチド対応ＤＮＡは第７図に示す９個のフラグメント
に分けて合成した。これらのすリゴヌクレオチドフラグ
メントは公知の方法（例えば、Ｐ、 Ｌ、 ｄｅＨａｓ
ｅｔｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、、
１１゜７７３ （１９８３）参照）に準じて、固相合
成法により、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社
製のＤＮＡ合成機（Ｍｏｄｅｌ ３８０Ａ）を用いて合
成した。ホスファアミダイト試薬等の合成用試薬はすべ
てＡｐｐＩｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のものを
用い、付属のオペレーターズマニュアル（（株）日科機
より入手可能）に従って使用した。合成りＮＡは、核酸
塩基と５′水酸基が保護されリン酸保護基が脱保護され
た状態でシリカゲル担体から切り離し、回収した。これ
らの保護ＤＮＡオリゴマーは２８％アンモニア水３ｍｌ
で６０°Ｃ，４時間処理することにより、５′端のジメ
トキシトリチル基以外はすべて脱保護されたオリゴマー
を得た。同オリゴマーを高速液体クロマトグラフィー逆
相系担体（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８：牛丼化学社製
）を用い、０．１Ｍ酢酸−トリエチルアミン緩衝液（ｐ
Ｈ６，５）中アセトニトリルの直線濃度勾配による溶出
にて精製した。Example Chemical Synthesis of DNA Fragment Corresponding to Signal Peptide The DNA corresponding to the chicken lysozyme signal peptide designed as described above was divided into nine fragments shown in FIG. 7 and synthesized. These oligonucleotide fragments can be prepared using known methods (e.g., P, L, deHas
eth et al., Nucleic Ac1ds Res.
11°773 (1983)) using a DNA synthesizer (Model 380A) manufactured by Applied Biosystems. All synthesis reagents such as phosphaamidite reagents were manufactured by AppIied Biosystems and used according to the attached operator's manual (available from Nikkaki Co., Ltd.). The synthesized NA was separated from the silica gel carrier and recovered with the nucleobase and 5' hydroxyl group protected and the phosphate protecting group deprotected. These protected DNA oligomers were added to 3 ml of 28% ammonia water.
By treating the oligomer at 60°C for 4 hours, an oligomer was obtained in which all but the dimethoxytrityl group at the 5' end were deprotected. The same oligomer was analyzed using a high-performance liquid chromatography reverse-phase carrier (Cosmosil 5C18: manufactured by Gyudon Kagaku Co., Ltd.) in a 0.1M acetic acid-triethylamine buffer (p
Purification was carried out by elution with a linear concentration gradient of acetonitrile in H6,5).
上記精製液を減圧留去にて約５００μＩに濃縮した後、
最終濃度８０％となるように氷酢酸を加え、室温１５分
間処理することによりジメトキシトリチル基を除去した
。これを上記の方法により高速液体クロマトグラフィー
で精製し、ｌＯ〜２００Ｄｔｓ。単位の完全に脱保護さ
れたオリゴマーを得た。After concentrating the purified solution to about 500 μI by distillation under reduced pressure,
Glacial acetic acid was added to give a final concentration of 80%, and the dimethoxytrityl group was removed by treatment at room temperature for 15 minutes. This was purified by high performance liquid chromatography according to the method described above to yield 1O~200Dts. A completely deprotected oligomer of units was obtained.
リン酸化及びフラグメントの連結反応
上記の化学合成した９個のフラグメントをＨＬＹＳＩＧ
ｌ〜５及びＨＬＹＳＩＧ６〜９の２つのブロックＡ及び
Ｂに分けて各ブロックを連結し更に２つのブロックを連
結して全体のシグナルペプチド対応ＤＮＡを合成した。Phosphorylation and fragment ligation reaction The nine chemically synthesized fragments above were HLYSIG
The DNA was divided into two blocks A and B, 1-5 and HLYSIG6-9, and each block was linked, and the two blocks were further linked to synthesize the entire DNA corresponding to the signal peptide.
９個のフラグメントのうち、両端に当るＨＬＹＳＩＧ−
１及びＨＬＹＳ ｒＧ−８を除く７個のフラグメントを
前記の２つのブロックＡ及びＢにまとめて、その５′端
の水酸基をリン酸化し、ひきつづいて連結反応を行った
。Among the nine fragments, HLYSIG-
The seven fragments excluding 1 and HLYS rG-8 were combined into the two blocks A and B, and the hydroxyl group at the 5' end was phosphorylated, followed by a ligation reaction.
リン酸化及び連結反応の詳細をＨＬＹＳＩＧ−１〜５を
含むブロックＡの場合について述べれば下記の通りであ
る。Details of the phosphorylation and ligation reactions for block A containing HLYSIG-1 to HLYSIG-5 are as follows.
リン酸化を行う４個のフラグメント（ＨＬＹＳ ＩＧ−
２〜５）各２μｇの混合物を１５単位のＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼ、２４ｐｍ０１ｅの〔γ−１２Ｐ ）
ＡＴＰ（２９００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、及びリン酸化緩衝
液（ｌ ｍＭスペルミジン、５０ｍＭジチオスレイトー
ル（ＤＴＴと略）、１００ｍＭ ＭｇＣ１，、５００ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）及び（１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ）を含む４５μｌの反応液中で３７℃、３０分間
インキュベートした後、８０ｎｍｏｌｅのＡＴＰ、 ２
４単位のＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼを添加し、３
７”Ｃで６０分間、更にインキュベートした。これを６
５℃で１０分間インキュベートした後水冷した。これを
フェノール抽出、エタノール沈澱によってＤＮＡを回収
した後、６０μｌの滅菌水に溶解した。これにフラグメ
ントＨＬＹＳＩＧ−１４μｇを加え、２０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）及び１０ｍＭ ＭｇＣ１ｔと
なるようにＩＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）及びＩ
Ｍ ＭｇＣＬを添加し、６５℃、１０分間インキュベ
ートした後、３７”Ｃ，２０分間、さらに室温（約２５
℃）、２０分間静置した。次に、ＡＴＰ及びＤＴＴを各
々０．４ｍＭ及びｌ ＯｍＭとなるように加え１６単位
のＴ、 −ＤＮＡリガーゼを加えて反応液量１００μｌ
として、冷蔵庫（約１０℃）中で１２時間反応させて連
結させた。反応終了後フェノール抽出、エタノール沈澱
を行いＤＮＡを回収して２０μｌのＴＥ緩衝液（ｌｏｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ７，５，１ｍＭ ＥＤＴＡ
）に溶解して一２０″Ｃで保存した。Four fragments that perform phosphorylation (HLYS IG-
2-5) Add 2 μg of each mixture to 15 units of T4 polynucleotide kinase, 24pm01e [γ-12P]
ATP (2900Ci/mmol), and phosphorylation buffer (lmM spermidine, 50mM dithiothreitol (abbreviated as DTT), 100mM MgCl, 500mM
M Tris-HCI (pH 7,5) and (1mM E
80 nmole of ATP, 2
Add 4 units of T4-polynucleotide kinase,
Further incubation was carried out for 60 minutes at 7”C.
After incubating at 5°C for 10 minutes, the mixture was cooled with water. The DNA was recovered by phenol extraction and ethanol precipitation, and then dissolved in 60 μl of sterile water. Add 14μg of fragment HLYSIG to this, and add 20mM Tri
s-HCI (pH 7,5) and IMTris-HCI (pH 7,5) and I
M MgCL was added and incubated at 65°C for 10 minutes, then at 37”C for 20 minutes, and then at room temperature (approximately 25°C).
℃) and left standing for 20 minutes. Next, add ATP and DTT to 0.4mM and 10mM, respectively, add 16 units of T-DNA ligase, and make the reaction volume 100μl.
The mixture was reacted for 12 hours in a refrigerator (approximately 10° C.) for ligation. After the reaction was completed, phenol extraction and ethanol precipitation were performed to recover the DNA, and the DNA was added to 20 μl of TE buffer (lom
M Tris-HCI pH7,5,1mM EDTA
) and stored at -20''C.
同様にして）ＩＬＹＳＩＧ６〜９よりブロックＢを合成
した。但し、ブロックＢについては、ブロックＢを合成
後この連結反応物の全量を２０ｎｍｏｌｅ ＡＴＰ 。Block B was synthesized from ILYSIG6-9 in the same manner. However, for block B, after synthesizing block B, the total amount of this ligation reaction product was 20 nmole ATP.
１５単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ及び前述のリ
ン酸化緩衝液を含む３０μｌの反応液中で３７”Ｃ。37"C in a 30 μl reaction containing 15 units of T4 polynucleotide kinase and the phosphorylation buffer described above.
６０分間インキュベートして、後で添加したＨＬＹＳＩ
Ｇ−８の５°水酸基をリン酸化した。これを６５℃、１
０分間インキュベートした後、３７”Ｃ，２０分間、さ
らに室温（約２５°Ｃ）２０分間静置した。次に、ブロ
ックＡ及びブロックＢ （ＨＬＹＳＩＧ−８をリン酸化
したもの）の連結反応物のそれぞれ半量（１０μｌ）を
混合し、ブロックＡの連結反応に使用したものと同じ組
成の反応液中で冷蔵庫（約１０℃）内で、１２時間反応
させた。８．３Ｍ尿素を含む１０％ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動で生成物を分離して、目的の（Ａ十Ｂ）ブ
ロック即ち、シグナルペプチドに対応するＤＮＡフラグ
メント（６８ｍｅｒ及び７０ｍｅｒ）を調製した。Incubate for 60 minutes and add later HLYSI
The 5° hydroxyl group of G-8 was phosphorylated. This was heated to 65℃ for 1
After incubating for 0 minutes, the mixture was incubated at 37"C for 20 minutes and then at room temperature (approximately 25 degrees Celsius) for 20 minutes. Next, the ligation reaction product of block A and block B (phosphorylated HLYSIG-8) Half amounts (10 μl) of each were mixed and reacted for 12 hours in a refrigerator (approximately 10°C) in a reaction solution with the same composition as that used for the ligation reaction of Block A. The products were separated by acrylamide gel electrophoresis to prepare DNA fragments (68mer and 70mer) corresponding to the desired (A+B) block, ie, the signal peptide.
クローニング
シグナルペプチド対応ＤＮＡは、翻訳読取り枠が一致す
る様に制限酵素処理したヒトリゾチーム構造遺伝子ＤＮ
Ａと連結し、これをｐＢＲ３２２ベクターにクローニン
グした。以下にその詳細を記す。The DNA corresponding to the cloning signal peptide is human lysozyme structural gene DNA that has been treated with restriction enzymes so that the translation reading frames match.
A and cloned into pBR322 vector. The details are described below.
ヒトリゾチーム構造遺伝子を含むプラスミドｐＨＬＹ−
１５０μｇを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＭＣＩ（ｐＨ７，５
） 、５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｈ及び１９
０単位の制限酵素Ｓａｕ ３ＡＩを含む２００μｌの反
応液中で３７℃、４時間インキュベートした後、フェノ
ール抽出、エタノール沈澱を行った。この反応生成物を
５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってヒトリゾ
チーム遺伝子を含む４１８ｂｐのフラグメントを単離し
た。次にこのＤＮＡ断片を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
（ｐＨ７，５） ７ ｍＭ ＭｇＣ１ｔ、１０ｍＭ Ｎ
ａＣ１，７ｍＭβ−メルカプトエタノール、１００μｇ
／ｍｌのＢＳＡ、及び８４単位の制限酵素Ｔａｇ Ｉを
含む８２μｌの反応液中で６５°Ｃ５１２時間、インキ
ユベートシた。この反応液をフェノール抽出、エタノー
ル沈澱でＤＮＡを回収し、５％ポリアクリルアミドゲル
電気泳動で、３８５ｂｌ）（第６図でＨＬＹ−７及び５
上のＴａｇ−１部位からＨＬＹ−５５及び−５６上のＳ
ａｕ ａＡ部位までに相当する）のＤＮＡ断片を単離し
た。一方、プラスミドｐＢＲ３２２７，５μｇを１０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、１００ｍＭ Ｎ
ａＣ１，１０ｍＭ ＭｇＣＬ、８０単位の制限酵素５ａ
ｌｌ及び２４単位の制限酵素ＢａｍＨＩを含むｌＯＯμ
ｌの反応液中で３７”Ｃ，１２時間インキュベートした
後、フェノール抽出、エタノール沈澱を行った。この反
応物を５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行って４
．ＩＫｂのフラグメントを単離した。Plasmid pHLY- containing human lysozyme structural gene
150μg was added to 10mM Tris-MCI (pH 7,5
), 50mM NaCl, 10mM MgCh and 19
After incubation at 37° C. for 4 hours in 200 μl of a reaction solution containing 0 units of restriction enzyme Sau 3AI, phenol extraction and ethanol precipitation were performed. The reaction product was subjected to 5% polyacrylamide gel electrophoresis to isolate a 418 bp fragment containing the human lysozyme gene. Next, this DNA fragment was treated with 10mM Tris-HCI.
(pH 7,5) 7mM MgClt, 10mM N
aC1, 7mM β-mercaptoethanol, 100μg
The cells were incubated at 65° C. for 12 hours in a reaction solution of 82 μl containing BSA/ml and 84 units of restriction enzyme Tag I. This reaction solution was extracted with phenol, DNA was recovered with ethanol precipitation, and subjected to 5% polyacrylamide gel electrophoresis (385 bl) (Figure 6 shows HLY-7 and 5
S on HLY-55 and -56 from the Tag-1 site on
au (corresponding to the aA site) was isolated. On the other hand, 5 μg of plasmid pBR3227 was added to 10 m
M Tris-HCI (pH 7,5), 100mM N
aC1, 10mM MgCL, 80 units of restriction enzyme 5a
lOOμ containing ll and 24 units of restriction enzyme BamHI
After incubation at 37"C for 12 hours in a reaction solution of
．． A fragment of IKb was isolated.
次に、先に調製したシグナルペプチド対応ＤＮＡフラグ
メントの全量、ヒトリゾチーム構造遺伝子を含む３８５
ｂｐの制限酵素Ｔａｇ Ｉ ／Ｓａｕ ３Ａフラグメン
トの１／４量、及び４．ＩＫｂのプラスミドｐＢＲ３２
２の制限酵素ＢａｍＨＩ ／ Ｓａｔ Ｉ切断フラグメ
ントの半量の３者を混合し緩衝液Ｉ （５０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ ＭｇＣ１ｔ、
１０ｍＭ ＤＴＴ、 ｌ ｍＭスペルミジン、１ｍＭ
ＡＴＰ、 １００μｇ／ｍｌのＢＳＡ）及びｌＯ単位の
Ｔ、 ＤＮＡリガーゼを含む９５μｌの反応液中で冷蔵
庫（約１０″Ｃ）内で１２時間反応させた。この反応物
をフェノール抽出、エタノール沈澱により、ＤＮＡを回
収した。次にこのＤＮＡを用いてＥ、ｃｏｌｉ Ｃ６０
０株を形質転換し、アンピシリン抵抗性（６０μｇ／ｍ
ｌ）の形質転換体を得た。Next, the total amount of the previously prepared signal peptide-corresponding DNA fragment, 385 ml containing the human lysozyme structural gene
1/4 amount of bp restriction enzyme Tag I/Sau 3A fragment, and 4. IKb plasmid pBR32
Mix half of the restriction enzyme BamHI/Sat I cleavage fragments of 2 and add buffer I (50mM Tr
is-HCI (pH 7,5), 10mM MgClt,
10mM DTT, lmM spermidine, 1mM
ATP, 100 μg/ml BSA) and lO units of T, DNA ligase were reacted for 12 hours in a refrigerator (approximately 10"C). The reaction was extracted by phenol extraction and ethanol precipitation. The DNA was collected.Next, this DNA was used to infect E. coli C60.
0 strain was transformed, and ampicillin resistance (60 μg/m
A transformant of 1) was obtained.
組換えプラスミドの同定
上記の形質転換体をアンピシリン６０μｇ／ｍｌを含有
するＬＢ寒天培地（バクトドリブトンＩＯｇ／Ｉ 、バ
クトイ−ストエキステラクト５ｇ／ｌ 、 ＮａＣｌ
１０ｇ／ＩＤ１ｆｃｏ寒天１５ｇ／Ｉ 、水酸化ナトリ
ウムでｐＨ７，５に調製したもの）の上に載置したニト
ロセルロースフィルター上で増殖させた。３７”Ｃ，４
時間放置、クロラムフェニコール１７０μｇ／ｍｌ及び
アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含有するＬＢ寒天培地上
にフィルターを移した。１５時間の増幅後、ｉｎ ５ｉ
ｔｕのコロニースクリーニング法（例えば、Ｇｒｕｎｓ
ｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ。Identification of the recombinant plasmid The above transformant was cultured on LB agar medium containing 60 μg/ml of ampicillin (Bactodributon IOg/I, Bacto Yeast Extractact 5g/l, NaCl).
The cells were grown on nitrocellulose filters mounted on 10 g/I fco agar (15 g/I, adjusted to pH 7.5 with sodium hydroxide). 37”C, 4
After a period of time, the filters were transferred onto LB agar medium containing 170 μg/ml chloramphenicol and 50 μg/ml ampicillin. After 15 hours of amplification, in 5i
tu colony screening methods (e.g., Gruns
Tein et al., Proc.
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、 ７２．
３９６１（１９７５））を用いて目的プラスミドを含む
コロニーを検索した。ハイブリダイゼーションプローブ
としては、ｆｆ２Ｐ−標識したヒトリゾチーム構造遺伝
子の５°側約半分を含む２１０ｂｐのＤＮＡフラグメン
トを用いた。これは、ＰＨＬＹ １を制限酵素ＢａｍＨ
Ｉ ／Ｘｂａ Ｉ切断し、５％ポリアクリルアミドゲル
電気泳動によって２１０ｂｐの断片を単離したものを、
ニックトランスレーション法（例えば、Ｐ、 Ｗ、 Ｊ
、 Ｒｉｇｂｙら、Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、。Natl, Acad, Sci, USA, 72.
3961 (1975)) to search for colonies containing the target plasmid. As a hybridization probe, a 210 bp DNA fragment containing about half of the 5° side of the ff2P-labeled human lysozyme structural gene was used. This converts PHLY 1 to the restriction enzyme BamH
A 210 bp fragment was isolated by I/Xba I digestion and 5% polyacrylamide gel electrophoresis.
Nick translation method (e.g. P, W, J
, Rigby et al., J. Mo1. Biol.
１１３、２３７（１９７７））によって５ａｐ−標識し
た。ハイブリダイゼーシヨンは５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
ＣＩ（ｐＨ７，５）、４×５ＳＣ（Ｉ Ｘ５ＳＣ＝０．
１５Ｍ ＮａＣ１，０，０１５Ｍ （クエン酸ナトリウ
ム））、１ ｘＤｅｎｈａｒｄｔ’ ｓ溶液（０，０２
％ＢＳＡ。113, 237 (1977)). Hybridization was carried out in 50mM Tris-H.
CI (pH 7.5), 4×5SC (I X5SC=0.
15M NaCl (1,0,015M (sodium citrate)), 1 x Denhardt's solution (0,02
%BSA.
０．０２％フィコール４００ 、０．０２％ポリビニル
ピロリドン）、５０％ホルムアミド及び５０μｇ／ｍｌ
のＳａｌｍｏｎｔｅＳｔｅＳ ＤＮＡ中に、ｌ ＸＩＯ
’ ｃｐｍの５ｔｐ−プローブを加え、４２°Ｃで一晩
行なった。フィルターを４２°Ｃ１（２ＸＳＳＣ＋０．
１％５ＤＳ）中で、３０分、３回洗浄した。0.02% Ficoll 400, 0.02% polyvinylpyrrolidone), 50% formamide and 50 μg/ml
In the SalmonteSteS DNA of
'cpm of 5tp-probe was added and carried out overnight at 42°C. Heat the filter to 42°C1 (2XSSC+0.
Washed three times for 30 minutes in 1% 5DS).
乾燥したフィルターを８０°Ｃで、Ｄｕｐｏｎｔ Ｌｊ
ｇｈｔｎｉｎｇ−ＰｌｕｓＭａｍスクリーンを用いてＫ
ｏｄａｋ ＸＡＲ−５Ｘ線フィルムに露出した。組換え
プラスミドを含有するコロニー約１２００個を、２ｔｐ
−標識ＤＮＡフラグメントを用いるｉｎ ５ｉｔｕハイ
ブリダイゼーシヨンで調べた結果、約３分の１のコロニ
ーがハイブリダイズした。これらのうち１２個のコロニ
ーから少量のプラスミドＤＮＡをＢｉｒｎｂｏｉｍ ａ
ｎｄ Ｄｏｌｙの方法（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ、、 ２．１５１３（１９７９））で調製した。こ
れらプラスミドＤＮＡを制限酵素Ｘｂａ Ｉ ／Ｓａｌ
Ｉ切断、及びＥｃｏＲＩ ／Ｓａｔ Ｉ切断によって
解析した。その結果１２個のコロニーは、いずれも５％
ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって各々２４４ｂ
ｐ、 ８２９ｂｐのフラグメントを与える目的プラスミ
ドを保有していることが判明した。このプラスミドをＰ
ＨＬＹＳＩＧと命名した（第１図参照）。Dry the filter at 80°C in a Dupont Lj
K using the lightning-PlusMam screen
Exposure to odak XAR-5 X-ray film. Approximately 1200 colonies containing recombinant plasmids were transferred to 2tp
- As a result of in 5 in situ hybridization using labeled DNA fragments, approximately one-third of the colonies hybridized. A small amount of plasmid DNA from 12 of these colonies was collected from Birnboim a
nd Doly's method (Nucleic Acids R
es, 2.1513 (1979)). These plasmid DNAs were digested with the restriction enzyme Xba I/Sal.
Analyzed by I cleavage and EcoRI/Sat I cleavage. As a result, all 12 colonies were 5%
244b each by polyacrylamide gel electrophoresis.
It was found that the target plasmid provided a fragment of 829 bp. This plasmid is
It was named HLYSIG (see Figure 1).
発現用プラスミドの作成
プラスミドＹＥｐ５１２０μｇを緩衝液ＩＩ（１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５） 、１００ｍＭ Ｎ
ａＣｌ５１０ｍＭ ＭｇＣ１ｔ、１ｍＭＤＴＴ）、５０
単位の制限酵素５ａｉｌ及び４０単位の制限酵素Ｈｉｎ
ｄ［ＩＩを含む７０μｌの反応液中で３７°Ｃ，５時間
反応させた後、０．７％アガロースゲル電気泳動を行い
、ＧＡＬＩＯブロモずターを含む約６．９Ｋｂの断片を
回収した。一方、プラスミドＰＨＬＹＳＩＧ ３０μｇ
を上記緩衝液Ｉｆ、 ７０単位のＳａｔ Ｉ及び８４単
位のＨｉｎｄＩＩＩを含む２００μｌの反応液中で３７
°Ｃ，５時間反応させた後、５％ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動を行い、融合プレリゾチーム遺伝子を含む８
００ｂｐの断片を回収した。上記の約６．９ Ｋｂ Ｄ
ＮＡ断片の半量と８００ｂｐ ＤＮＡ断片の半量を緩衝
液Ｉ及び６単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼを含む１００μ
ｌの反応液中で、冷蔵庫（約１０℃）内で、１２時間反
応して連結させた。次にこの反応液を用いてＥ、ｃｏｌ
ｉ Ｃ６００株を形質転換しアンピシリン（６０μｇ／
ｍｌ）抵抗性の形質転換体を得た。これらの形質転換体
よりプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素Ｓａｌ Ｉ
／ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ／Ｘｂａ Ｉ等の切断パ
ターンの解析を行って第１図に示されるような組み換え
プラスミドＹＥｐ−ＨＬＹＳ ＩＧを含む形質転換体を
選び出した。Preparation of expression plasmid 120μg of plasmid YEp5 was added to buffer II (10mM
Tris-HCI (pH 7,5), 100mM N
aCl510mM MgClt, 1mM DTT), 50
5 units of restriction enzyme 5ail and 40 units of restriction enzyme Hin
After reacting for 5 hours at 37°C in a 70 μl reaction solution containing d[II, 0.7% agarose gel electrophoresis was performed, and a fragment of about 6.9 Kb containing GALIO bromo atom was recovered. On the other hand, 30 μg of plasmid PHLYSIG
37 in a 200 μl reaction containing the above buffer If, 70 units of Sat I and 84 units of HindIII.
After incubation at °C for 5 hours, 5% polyacrylamide gel electrophoresis was performed.
A 00bp fragment was recovered. Approximately 6.9 Kb D above
Add half of the NA fragment and half of the 800 bp DNA fragment to 100μ of Buffer I and 6 units of T4 DNA ligase.
1 of the reaction solution in a refrigerator (approximately 10° C.) for 12 hours to perform ligation. Next, using this reaction solution, E, col
i Transform C600 strain and add ampicillin (60 μg/
ml) resistant transformants were obtained. Plasmid DNA was prepared from these transformants, and restriction enzyme Sal I
The transformants containing the recombinant plasmid YEp-HLYS IG as shown in FIG. 1 were selected by analyzing the cleavage patterns such as /HindIII and EcoRI/XbaI.
発現用組み換え体の調製
プラスミドＹＥ９−ＨＬＹＳＩＧ ５ μｇを用いて、
Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＫＫ４株（α、ｕｒａ３
． ｈｉｓｌ ｏｒ ｈｉｓ３、ｔｒｐ ｌ 。Preparation of recombinant for expression Using 5 μg of plasmid YE9-HLYSIG,
S. cerevisiae strain KK4 (α, ura3
．． hisl or his3, trp l.
ｌｅｕ ２、ｇａ１８０）を既知の酢酸リチウム法（例
えば、Ｉｔｏら、Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、 １５
３．１６３（１９８３）参照）で形質転換しロイシン非
要求性の形質転換体を得た。この形質転換体をＫＫ４（
ＹＥｐ−ＨＬＹＳＴＧ）と命名した。leu 2, ga 180) using known lithium acetate methods (e.g. Ito et al., J. Bacteriol., 15).
3.163 (1983)) to obtain a leucine non-auxotrophic transformant. This transformant was transformed into KK4 (
YEp-HLYSTG).
ヒトリゾチームの分泌発現
前記組み換え体Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＫＫ４（
ＹＥｐ−ＨＬＹＬＳＩＧ）及び本発明者らにより既に日
本特許出願６０−１３９７１０号明細書に開示した組み
換え体Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＫＫ４（ＹＥｐ Ｈ
ＬＹ−１）を用いて炭素源としてガラクトース或いはグ
ルコースを含む培地で増殖させ、培地中へのヒトリゾチ
ームの分泌の有無について調べた。培養はロイシンを除
いた各種アミノ酸（終濃度２０〜３７５ｍｇ／ｌ）、ア
デニンサルフエイト（終濃度２０ｍｇ／ｌ） 、ウラシ
ル（終濃度２０ｍｇ／ｌ）を含む最小培地（Ｄｉｆｃｏ
社製、アミノ酸不含バクト酵母窒素塩基） （Ｓｈｅｒ
ｍａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ、 ６２頁、Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｕｒ（１９８２）参照） ２００ｍ１に炭素源と
して、２％ガラクトース或いは２％グルコースを加えて
３０℃で行なった。Secretory expression of human lysozyme The recombinant S, cerevisiae KK4 (
YEp-HLYLSIG) and the recombinant S, cerevisiae KK4 (YEp HLYLSIG) already disclosed in Japanese Patent Application No. 60-139710 by the present inventors.
LY-1) was grown in a medium containing galactose or glucose as a carbon source, and the presence or absence of secretion of human lysozyme into the medium was examined. The culture was carried out using a minimal medium (Difco®) containing various amino acids except leucine (final concentration 20-375 mg/l), adenine sulfate (final concentration 20 mg/l), and uracil (final concentration 20 mg/l).
Bacto yeast nitrogen base (amino acid-free) (Sher)
Mann et al., Methods in Yeast Gen
etics, 62 pages, Cold Spring Ha
(see Rbour (1982)) 2% galactose or 2% glucose was added as a carbon source to 200ml, and the reaction was carried out at 30°C.
組み換え体Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＫＫ４（ＹＥ
ｐ−ＨＬＹＳＩＧ）の場合、炭素源としてガラクトース
（ＳＧａｌ）或いはグルコース（ＳＤ）を含む培地を用
い、培養液のＫｌｅｔｔ値が３６０〜３８０に達した時
、培地中のヒトリゾチーム活性は各々、１８ｕｎｉｔ／
ｍｌ、２２ｕｎｉｔ／ｍｌを示した（第２図参照）。但
し、リゾチーム活性の測定はＭｏｒｓｋｙの方法（Ａｎ
ａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 １２８．７７（１９８３
）参照）に準じて、以下の方法で行った。Ｍｉｃｒｏｃ
ｏｃｃｕｓｌＹｓＯｄｅｉｋｔｉｃＵｓ菌体懸濁液（凍
結乾燥菌体１５ｍｇ／１００ｍ１５０ｍＭリン酸ナトリ
ウム緩衝液（１）Ｈ６，４））８００μＩに、試料２０
０μｌを添加し、すばやく混合後、光路長１ｃｍの石英
セル中で菌体懸濁液の濁度減少を４５０ｎｍの吸光度を
測定することにより追跡した。Recombinant S, cerevisiae KK4 (YE
p-HLYSIG), using a medium containing galactose (SGal) or glucose (SD) as a carbon source, when the Klett value of the culture solution reached 360-380, the human lysozyme activity in the medium was 18 units/1, respectively.
ml, 22 units/ml (see Figure 2). However, lysozyme activity was measured using Morsky's method (An
al. Biochem, 128.77 (1983
)), the following method was used. Microc
20 μl of sample 20
After adding 0 μl and mixing quickly, the decrease in turbidity of the bacterial cell suspension was monitored by measuring the absorbance at 450 nm in a quartz cell with an optical path length of 1 cm.
酵素活性はこの測定系で反応１分後から１１分後までの
１０分間における吸光度減少を室温（２５°Ｃ）で測定
し、１ユニツトは１分間当たり０．００１の吸光度（４
５０ｎｍ）減少を示す値として定義した。炭素源として
グルコースを用いた場合にはガラクトースを用いた場合
に比べてヒトリゾチーム活性の培地中への分泌の遅延が
見られたが、これは、発現に使用したＧａｌ １０プロ
モーターの誘導が最少培地中のグルコースにより抑制さ
れ、菌体の増殖とともにグルコースが消費されたために
抑制が解除されたためであると思われる。一方、組み換
え体Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＫＫ４（ＹＥｐ Ｈ
ＬＹ−１）を炭素源としてガラクトースを含む培地（Ｓ
Ｇａｌ）を用いて増殖させた場合、ヒトリゾチーム活性
は全く培地中に分泌されなかった（第２図）。このこと
は、ヒトリゾチーム活性の培地中への分泌には、前記シ
グナルペプチド部分が必須のものであることを示してい
る。Enzyme activity is determined by measuring the decrease in absorbance over a 10-minute period from 1 minute to 11 minutes after reaction at room temperature (25°C), and one unit corresponds to an absorbance of 0.001 (4
50 nm) was defined as the value indicating a decrease. When glucose was used as a carbon source, the secretion of human lysozyme activity into the medium was delayed compared to when galactose was used, but this was because the induction of the Gal 10 promoter used for expression was minimal in the medium. This is thought to be because the inhibition was suppressed by the glucose in the cells, and the suppression was released as the glucose was consumed as the bacterial cells multiplied. On the other hand, recombinant S, cerevisiae KK4 (YEp H
LY-1) as a carbon source and a medium containing galactose (S
No human lysozyme activity was secreted into the medium when the cells were grown using (Figure 2). This indicates that the signal peptide portion is essential for secretion of human lysozyme activity into the medium.
発現ヒトリゾチームの局在性
ロイシンを除いた各種アミノ酸（終濃度２０〜３７５ｍ
ｇ／ｌ）アデニンサルフエイト（終濃度２０ｍｇ／ｌ）
、ウラシル（終濃度２０ｍｇ／ｌ）及び炭素源として２
％のガラクトースを含む上記の最少培地（ＳＧａｌ）２
００ｍｌ中で前記組み換え体Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ ＫＫ４（ＹＥｐ−ＨＬＹＳＩＧ）を３０°Ｃで増殖
した。培養開始後、１８．５時間、２３．３時間、３８
．８時間、６１．８時間、８５．８時間及び１３４゜３
時間の培養液１０ｍ１を１５００Ｏｒｐｍ、 ２分間の
遠心分離により菌体と上清に分離した。上記上清を「細
胞外画分（Ｍｅｄｉｕｍ）Ｊとした。上記菌体を１．２
Ｍソルビトールおよび１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ６
，８）よりなる緩衝液１ｍｌで２回洗浄後、２ｍｌの１
．２Ｍソルビトール、ｌｏｍＭ ＫＨ，ＰＯ，（１）［
（６，８）および０．６％Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ１００Ｔ
（キリンビール社製）を含む緩衝液中で３０°Ｃ１３
０分間インキュベートした後３０００ｒｐｍ ２分間の
遠心で菌体と上溝に分離した。上記上清をペリプラズム
画分（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ５ｐａｃｅ） Ｊとし
た。上記菌体を１ｍｌの１．２Ｍソルビトールおよび１
０ｍＭ ＫＨｔＰＯ。Various amino acids (final concentration 20-375 m
g/l) adenine sulfate (final concentration 20 mg/l)
, uracil (final concentration 20 mg/l) and 2 as carbon source.
The above minimal medium (SGal) containing % galactose 2
The recombinant S, cerevisiae in 00 ml
e KK4 (YEp-HLYSIG) was grown at 30 °C. After the start of culture, 18.5 hours, 23.3 hours, 38
．． 8 hours, 61.8 hours, 85.8 hours and 134°3
10 ml of the culture solution was centrifuged at 1500 rpm for 2 minutes to separate the bacterial cells and supernatant. The above supernatant was designated as extracellular fraction (Medium) J.
M sorbitol and 10mM KH2PO4 (pH 6
, 8) After washing twice with 1 ml of buffer, 2 ml of 1
．． 2M Sorbitol, lomM KH, PO, (1) [
(6,8) and 0.6% Zymolyase 100T
(manufactured by Kirin Brewery) at 30°C13
After incubation for 0 minutes, the cells were separated into bacterial cells and the upper groove by centrifugation at 3000 rpm for 2 minutes. The above supernatant was designated as periplasmic fraction (periplasmic 5pace) J. The above bacterial cells were mixed with 1 ml of 1.2 M sorbitol and 1
0mM KHtPO.
（ｐＨ６，８）よりなる緩衝液で２回洗浄後、２ｍｌの
同一組成よりなる緩衝液に懸濁した。上記懸濁液中の菌
体を３分間の超音波処理により破砕後、１５Ｋｒｐｍ、
２分間の遠心分離により、沈澱物と上溝に分離した。上
記上清を「細胞内画分（Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ）
Ｊとした。「細胞外画分」、「ペリプラズム画分」お
よび「細胞内画分」のそれぞれに含まれるヒトリゾチー
ム活性をＭ、 ｒｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓを用いる前
記溶菌法により測定した。各面分におけるヒトリゾチー
ム活性の局在性は菌体の増殖とともに変化したが、菌体
増殖定常期以降ではほぼ「細胞外画分（Ｍｅｄｉｕｍ）
Ｊ ６０％、「ペリプラズム画分（Ｐｅｒｉｐｌａｓｍ
ｉｃｓｐａｃｅ）」１０％、「細胞内画分（Ｉｎｔｒａ
ｃｅｌｌｕｌａｒ） Ｊ３０％の分布を示した（第３図
）。また、市販のヒトリゾチーム精製標品（Ｓｉｇｍａ
社製）を用いて、定量した結果、上記測定法で１ ｕｎ
ｉｔは培地中に換算して０．０２μｇ／ｍｌの生成量で
あることが判明した。After washing twice with a buffer solution consisting of (pH 6, 8), the cells were suspended in 2 ml of a buffer solution having the same composition. After crushing the bacterial cells in the above suspension by ultrasonication for 3 minutes,
The precipitate and the upper groove were separated by centrifugation for 2 minutes. The above supernatant was divided into “intracellular fraction”.
I made it J. The human lysozyme activity contained in each of the "extracellular fraction,""periplasmicfraction," and "intracellular fraction" was measured by the bacteriolytic method described above using M. rysodeikticus. The localization of human lysozyme activity in each area changed with the growth of the bacterial cells, but after the stationary growth phase of the bacterial cells, it was mostly found in the extracellular fraction (Medium).
J 60%, “Periplasm fraction (Periplasm
icspace)" 10%, "Intracellular fraction (Intra
cellular) J30% distribution (Figure 3). In addition, a commercially available purified human lysozyme preparation (Sigma
As a result of the quantitative analysis, 1 un
It was found that the amount produced in the medium was 0.02 μg/ml.
分泌されたヒトリゾチーム蛋白質の精製Ｓ、 ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ ＫＫ４（ＹＥｐ−ＨＬＹＳＩＧ）を２％
ガラクトースを含む上記の最小培地（５ＧａＬ培地）
４００ｍ１中で３０℃、■昼夜通気培養した。Ｋｌｅｔ
ｔ ４００〜５００まで増殖した培養物を１０．００Ｏ
ｒｐｍ 、 １０分間遠心して酵母細胞を除き、培養上
清画分を得た。上清画分は凍結乾燥の後、少量（１，０
〜２０ｍ１）の５０ｍＭ ！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ８，０
）に溶かし、同緩衝液に対して充分に透析した。透析後
、濃縮された上清画分はＦＰＬＣ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
社）を用い陽イオン交換カラムＭｏｎｏ Ｓ ＨＲ５１
５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）で分離した。活性面分はカ
ラムを１ｍｌ／分の流速で、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ８，０）存在下２０分間のＯ−ＩＭ ＫＣＩ直線濃度
勾配にかけることによって溶出された。この段階で溶菌
活性で見たリゾチームの溶出パターンは０．２５ＭＫＣ
ｌ付近で溶出されてくる唯一の主要ピークと完全に一致
した（１４図）。また同じように市販の精製ヒトリゾチ
ーム（Ｓ ｉ ｇｍａ社）をＭｏｎｏ Ｓカラムにかけ
るとカラムでの保持時間はこの主要ピークと完全に一致
し、０．２５ＭＫＣｌ付近で単一の溶出ピークを示した
。この段階で、はとんど単一のリゾチーム標品を得るこ
とも可能であるが、さらに純度の確認及び溶出画分の脱
塩の目的から逆相系のカラムを用いた高速液体クロマト
グラフィー（ＨＰＬＣ）によってさらに精製した。Ｍｏ
ｎｏ Ｓカラムでリゾチーム活性を持った画分を全てプ
ールし、直接ＯＤＳ逆相カラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５
Ｃ１８半井化学）で精製した。Purification of secreted human lysozyme protein S, cere
visiae KK4 (YEp-HLYSIG) at 2%
The above minimal medium containing galactose (5GaL medium)
Culture was carried out in 400 ml at 30° C. with aeration day and night. Klet
Cultures grown to t 400-500 were incubated at 10.00O
The yeast cells were removed by centrifugation at rpm for 10 minutes to obtain a culture supernatant fraction. After freeze-drying, the supernatant fraction was collected in a small amount (1,0
~20m1) of 50mM! J acid buffer (pH 8,0
) and thoroughly dialyzed against the same buffer. After dialysis, the concentrated supernatant fraction was subjected to FPLC (Pharmacia
cation exchange column Mono S HR51
5 (Pharmacia). The active surface was prepared by injecting 50mM phosphate buffer (p
20 minutes of O-IM KCI linear gradient in the presence of H8,0). At this stage, the elution pattern of lysozyme based on bacteriolytic activity was 0.25MKC.
It completely coincided with the only major peak eluting around 1 (Figure 14). Similarly, when commercially available purified human lysozyme (Si gma) was applied to a Mono S column, the retention time on the column completely matched this main peak, and a single elution peak was observed around 0.25M KCl. . At this stage, it is possible to obtain a single lysozyme sample, but for the purpose of confirming purity and desalting the eluted fraction, high-performance liquid chromatography ( Further purification was performed by HPLC). Mo
All fractions with lysozyme activity were pooled on a no S column and directly applied to an ODS reverse phase column (Cosmosil 5
C18 (Hawai Chemical).
活性画分は１ ｍｌ／分の流速で、０．１％、トリフル
オロ酢酸（ＴＦＡ）存在下４５分間の５−７０％アセト
ニトリル直線濃度勾配でカラムから溶出された。約５０
％アセトニトリル（カラム保持時間約３０分）の位置に
単一の主要ピークとして溶出されたピークは、別に対照
としてＯＤＳカラムにかけた市販の精製ヒトリゾチーム
の溶出位置と完全に一致した。The active fraction was eluted from the column with a 45 min linear gradient of 5-70% acetonitrile in the presence of 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) at a flow rate of 1 ml/min. Approximately 50
The peak eluted as a single major peak at the position of % acetonitrile (column retention time of approximately 30 minutes) completely coincided with the elution position of commercially available purified human lysozyme, which was separately run on an ODS column as a control.
またリゾチームのＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ溶菌活性の溶
出パターンとも完全に一致した。以上の操作により、単
一なヒトリゾチーム標品を培養上清から約７０％の収率
で得ることができた（表−１）。単離されたヒトリゾチ
ーム標品はＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓの溶菌活性において
市販の精製ヒトリゾチームとほぼ同じ代謝回転速度を示
した。このことは、雑種プレリゾチーム人工遺伝子によ
って酵母で発現したリゾチーム蛋白は触媒活性上も天然
のヒトリゾチームと差がないことを示している。It also completely matched the elution pattern of Micrococcus bacteriolytic activity of lysozyme. Through the above operations, a single human lysozyme preparation could be obtained from the culture supernatant at a yield of about 70% (Table 1). The isolated human lysozyme preparation showed approximately the same turnover rate as commercially available purified human lysozyme in Micrococcus lytic activity. This indicates that the lysozyme protein expressed in yeast by the hybrid prelysozyme artificial gene has no difference in catalytic activity from natural human lysozyme.
表−１
ステップ
蛋白（ｍｇ） 活性（Ｕ）比活性（Ｕ／ｍｇ）培地（
４００ｍｌ） ６．７６
Ｍｏｎｏ Ｓ Ｏ，２４１
０ＤＳ ０．１８２
２８４００ ４２０１
２３０００ ９５４００
１９６００ １０８０００
回収率（％）
酵母培養上清より精製されたヒトリゾチーム蛋白質のア
ミノ酸配列はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社
の気相アミノ酸シーケンサ−４７ＯＡで分析した。アミ
ノ末端は順次エドマン分解によってＰＴＨ−アミノ酸と
して回収された。次にＰＴＨ−アミノ酸は逆相系カラム
を用いた高速流体クロマトグラフィーによって分離され
、標準ＰＴＨ−アミノ酸の保持時間との比較により同定
した。その結果、この精製標品のＮ末端アミノ酸は、リ
ジンのみが検出された。またＮ末端より２０番目のアミ
ノ酸までその配列を決定した結果、ＨｓＮ−Ｌｙｓ−Ｖ
ａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅ
ｕ−Ａ ｌａ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒ
ｇ−Ｌｅｕ−Ｇ ｌｙ−Ｍｅ ｔ−Ａｓ ｐ−Ｇ １ｙ
−Ｔｙｒ・・・・であり、既に天然のヒトリゾチームに
ついて報告されているアミノ酸配列と完全に一致した。Table-1 Step protein (mg) Activity (U) Specific activity (U/mg) Medium (
400ml) 6.76 Mono S O,241 0DS 0.182 28400 4201 23000 95400 19600 108000 Recovery rate (%) The amino acid sequence of human lysozyme protein purified from the yeast culture supernatant was determined using the Applied Biosystems gas phase amino acid sequencer. -47OA It was analyzed in The amino terminus was subsequently recovered as PTH-amino acids by Edman degradation. PTH-amino acids were then separated by high performance fluid chromatography using a reversed-phase column and identified by comparison with the retention times of standard PTH-amino acids. As a result, only lysine was detected as the N-terminal amino acid of this purified sample. Furthermore, as a result of determining the sequence from the N-terminus to the 20th amino acid, HsN-Lys-V
al-Phe-Glu-Arg-Cys-Glu-Le
u-A la-Arg-Thr-Leu-Lys-Ar
g-Leu-G ly-Me t-As p-G 1y
-Tyr..., and completely matched the amino acid sequence already reported for natural human lysozyme.
このことはニワトリ卵白リゾチームの分泌シグナルペプ
チドをＮ末端に付加したヒトリゾチーム蛋白をコードし
ている化学合成遺伝子（雑種プレリゾチーム遺伝子）が
酵母内で正確に翻訳され、プロセシングされ、分泌され
たことを示している。This indicates that the chemically synthesized gene (hybrid prelysozyme gene) encoding the human lysozyme protein with the secretory signal peptide of chicken egg white lysozyme added to the N-terminus was accurately translated, processed, and secreted in yeast. It shows.
第１図は発現用プラスミドＹＥｐ−ＨＬＹＳ ＩＧの作
成法を示した図、
第２図は雑種プレリゾチーム遺伝子の酵母での分泌発現
を示した図、
第３図は酵母で発現したヒトリゾチームの局在性を示し
た図、
第４図は酵母で分泌発現したヒトリゾチームのＭｏｎｏ
Ｓカラムによる精製を示した図、第５図は酵母で分泌
発現したヒトリゾチームの逆相カラムによる精製を示し
た図、
第６図はヒトリゾチーム構造遺伝子のヌクレオチド配列
を示す図、及び
第７図はニワトリリゾチームシグナルペプチドをコード
するＤＮＡのヌクレオチド配列を示す因である。
第２図において、１はＳＧａ ｌで培養したＫＫ４（Ｙ
Ｅｐ−ＨＬＹＳ ＩＧ）の菌体増殖性、２はＳＤで培養
したＫＫ４（ＹＥｐ−ＨＬＹＳ ＩＧ）の菌体増殖性、
３はＳＧａ ｌで培養したＫＫ４（ＹＥｐＨＬＹ−１）
の菌体増殖性、４は５Ｇａｌで培養したＫＫ４（ＹＥｐ
−ＨＬＹＳＩＧ）の酵素活性、５はＳＤで培養したＫＫ
４（ＹＥｐ−ＨＬＹＳＩＧ）の酵素活性及び６はＳＧａ
ｌで培養したＫＫ４（ＹＥｐＨＬＹ−１）の酵素活性
を示すプロットである。
又、第３図において、７はＳＧａ ｌで培養したＫＫ４
（ＹＥｐ−ＨＬＹＳＩＧ）の菌体増殖性、８は細胞内画
分におけるリゾチームの活性の局在性、９は細胞外画分
におけるリゾチーム活性の局在性、及び１０はペリプラ
ズム画分におけるリゾチーム活性の局在性を示すプロッ
トであり、棒グラフは全リゾチーム活性を示す。Figure 1 shows the method for creating the expression plasmid YEp-HLYS IG. Figure 2 shows the secretory expression of the hybrid prelysozyme gene in yeast. Figure 3 shows the location of human lysozyme expressed in yeast. Fig. 4 shows the Mono of human lysozyme secreted and expressed in yeast.
Figure 5 shows the purification using an S column, Figure 5 shows the purification of human lysozyme secreted and expressed in yeast using a reverse phase column, Figure 6 shows the nucleotide sequence of the human lysozyme structural gene, and Figure 7. indicates the nucleotide sequence of the DNA encoding the chicken lysozyme signal peptide. In Figure 2, 1 is KK4 (Y
Ep-HLYS IG), 2 is the bacterial growth of KK4 (YEp-HLYS IG) cultured in SD,
3 is KK4 (YEpHLY-1) cultured in SGa1
The cell growth rate of 4 is KK4 (YEp) cultured in 5Gal.
-HLYSIG) enzyme activity, 5 is KK cultured in SD
Enzyme activity of 4 (YEp-HLYSIG) and 6 is SGa
1 is a plot showing the enzyme activity of KK4 (YEpHLY-1) cultured in L. In addition, in Fig. 3, 7 is KK4 cultured in SGa1.
(YEp-HLYSIG), 8 is the localization of lysozyme activity in the intracellular fraction, 9 is the localization of lysozyme activity in the extracellular fraction, and 10 is the localization of lysozyme activity in the periplasmic fraction. The bar graph shows total lysozyme activity.
Claims (10)
る領域とヒトリゾチーム構造遺伝子領域からなる雑種プ
レリゾチーム遺伝子と、酵母プロモーターを含有する組
み換えＤＮＡを保持する酵母の形質転換体を培養するこ
とを特徴とするヒトリゾチームの製造方法。(1) Human lysozyme, which is characterized by culturing a yeast transformant carrying a hybrid prelysozyme gene consisting of a region encoding a chicken lysozyme signal peptide and a human lysozyme structural gene region, and a recombinant DNA containing a yeast promoter. manufacturing method.
ヌクレオチド配列を有するものである請求項１記載のヒ
トリゾチームの製造方法。 【遺伝子配列があります】(2) The method for producing human lysozyme according to claim 1, wherein the region encoding the signal peptide has the following nucleotide sequence. [There is a gene sequence]
プロモーターの下流側で、かつ前記構造遺伝子の上流に
あり、いずれもこれらと解読枠が一致していることを特
徴とする請求項１記載のヒトリゾチームの製造方法。(3) The human according to claim 1, wherein the signal peptide-encoding region is located downstream of the yeast promoter and upstream of the structural gene, and both have the same reading frame. Method for producing lysozyme.
チド配列を有するものである請求項１記載のヒトリゾチ
ームの製造方法。 【遺伝子配列があります】(4) The method for producing human lysozyme according to claim 1, wherein the hybrid prelysozyme gene has the following nucleotide sequence. [There is a gene sequence]
素切断部位（Ｓａｌｌ部位）を、また３′端に２個の翻
訳終止信号（ＴＡＡ ＴＧＡ）と制限酵素切断部位（Ｓ
ａｕ ３ＡＩ部位）を有するものである請求項１記載の
ヒトリゾチームの製造方法。(5) The hybrid prelysozyme gene has a restriction enzyme cleavage site (Sall site) at the 5' end, and two translation termination signals (TAA TGA) and a restriction enzyme cleavage site (Sall site) at the 3' end.
The method for producing human lysozyme according to claim 1, wherein the human lysozyme has an au 3AI site).
る請求項１記載のヒトリゾチームの製造方法。(6) The method for producing human lysozyme according to claim 1, wherein the recombinant DNA is a plasmid pHLYSIG.
である請求項１記載のヒトリゾチームの製造方法。(7) The method for producing human lysozyme according to claim 1, wherein the promoter is a yeast GAL10 promoter.
ある請求項１記載のヒトリゾチームの製造方法。(8) The method for producing human lysozyme according to claim 1, wherein the promoter is from plasmid YBp51.
Ｇである請求項１記載のヒトリゾチームの製造方法。(9) Recombinant DNA is plasmid YEp-HLYSI
The method for producing human lysozyme according to claim 1, wherein the human lysozyme is G.
４（ＹＥｐ−ＨＬＹＳＩＧ）である請求項１記載のヒト
リゾチームの製造方法。(10) The transformant is S. cerevisiae KK
4 (YEp-HLYSIG), the method for producing human lysozyme according to claim 1.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33282790A JPH03183479A (en) | 1985-11-28 | 1990-11-29 | Method for secreting and producing human lysozyme |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60268218A JPS62248488A (en) | 1985-11-28 | 1985-11-28 | Recombinant dna, transformed yeast containing same and secretion and production of human lysozyme using same |
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