JPH0257179A - アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はアセチル−ＣｏＡのアセチル基にＣｏ２を結合
させ、脂肪酸の生合成の重要な中間体であるマロニル−
ＣｏＡを合成する反応を触媒する酵素であるアセチル−
ＣｏＡカルボキシラーゼに関する。

アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ［Ｃ０２リガーゼ（
ＡＤＰ形成）　、ＥＣ８，４，１，２，１はビオチンを
補酵素として共有結合している細胞質酵素で、ＡＴＰの
存在下アセチル−ＣｏＡの炭酸化を触媒しマロニル−Ｃ
ｏＡ１　即ち脂肪酸生合成に必要な２個単位の炭素原子
の活性化されたドナー（ｄｏｎｏｒ）を生成する。これ
までに蓄積された証拠はアセチル−ＣｏＡカルボキシラ
ーゼが長鎖脂肪酸の生合成の調節に決定的な役割を果た
していることを示している（文献１及び２）。

アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの細胞内含量は栄養
、ホルモン、発生及び遺伝等の様々な条件の中での脂肪
酸合成速度とともに変動する。動物の均一なアセチル−
ＣｏＡカルボキシラーゼの標品は、これまでラット（文
献３〜５）及びチキンリバー（ｃｈｉｃｋｅｎ　１ｉｖ
ｅｒ；文献６及び７）、ラット（文献８）、ウサギの乳
腺（文献９）及びガチョウの尾脂腺（文献１０）を含む
様々な組織から得られている。

この酵素は高度の１ｎｔｅｇｒａｔｅｄ　５ｔｒｕｃｔ
ｕｒｅを示し、分子量２２０，０００〜２１ｉ０，００
０を有する一種類のサブユニットからなる（文献３〜！
０）。この単一サブユニットは調節機能のみならずビオ
チンカルボキシルキャリアー蛋白質、ビオチンカルボキ
シラーゼ及びカルボキシルトランスフェラーゼからなる
三つの触媒機能ををしている（文献４）。

この酵素の調節の土台となる分子メカニズムを理解する
ために、該酵素の触媒ドメイン及び調節ドメインの構造
的な機構を解明することが重要である。

本発明者は最近、蛋白質化学及び分子クローニングの手
法を用いてチキンリバーのアセチル−ＣｏＡカルボキシ
ラーゼのビオチン結合部位近辺の一次構造を発表した（
文献１１）。本発明者は、ここにチキンリバーのアセチ
ル−ＣｏＡカルボキシラーゼの全アミノ酸配列を提供す
るものである。この配列はｃＤＮＡのヌクレオチド配列
から推定されたものである。これはビオチン依存性カル
ボキシラーゼに対して与えられた最初の完全なアミノ酸
配列である。

本発明者は先にエッダレイイングヘン　リバーから得た
ｐｏｌｙ（Ａ）’″ＲＮＡ　（文献１１）を用いて岡山
−バーブ法（文献１２）によりアセチル−ＣｏＡカルボ
キシラーゼに対する一つのｃＤＮＡクローンを分離した
。このクローンｐＡＣＣ３３は該酵素のポリペプチド配
列の限られた一部分のみをコードしていたので、本発明
者はこの最初のｃＤＮＡクローンをプローブとして用い
、該酵素の全蛋白をコードするヌクレオチド配列まで伸
びるｃＤＮＡクローン群を得ることを試みた（第１図参
照）。

ｐＡＣＣ３３のｃＤＮＡの３′部分はりｏ　−７ｐＡＣ
０２０６の配列とオーバーラツプする７Ｂ３ｂｐの配列
を含んでいるが、ヌクレオチド３９２１より下流のミス
マツチ部分を有していた（第１図の説明参照）。

同様にｐＡＣＣ２０Ｂの３′末端部分（ヌクレオチド４
５９Ｂより下流）はｐＡＣｏ　２４９とｐＡＣｏ　２５
Ｂの配列と−致しなかった。

これらｐＡＣＣ３３及びｐＡＣＣ２０［ｉの前記ミスマ
ツチ部分はイントロン配列であった。

ｐａｃｅ　３３の蛋白をコードする配列の正確さを確認
するために、本発明者はｐＡＣＣ３３の蛋白をコードす
る領域から得たｃＤＮＡ断片［ＥｃｏＲＩ　（１４８０
）〜Ｋｐｎ　Ｉ　（２９２（ｉ）］によりオリゴ（ｄＴ
）をプライマーとして作成したＣＤＮＡライブラリー（
オリゴ（ｄＴ）プラムドｃＤＮＡライブラリー）をスク
リーニングした。このようにしてｐＡＣＣ２６３、ｐＡ
ＣＣ２６８、及びｐＡＣＣ２７１を含む１２個の陽性ク
ローンを得た。得られた全てのクローンには１）ＡＣＣ
３３の制限酵素地図との相違点が全く無かった。

５′末端領域のｃＤＮＡを保有するクローン群を単離す
るためにアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼをコードす
るｍＲＮＡに特異的なオリゴデオキシヌクレチドを用い
、プライマー伸長によりＣＤＮＡライブラリーを作成し
た。これらのＣＤＮＡライブラリーをスクリーニングし
てｐＡＣＣ７８、ｐＡｃｃ　９３、ｐＡＣＣ９４、ｐＡ
ｃｃ１５７、ｐＡｃｏ　１９Ｂ及びｐＡＣＣ２４３を含
むクローン群を得た（図１）。これらのクローンの内ｐ
ＡＣＣ１９１１ｉは最も上流のｃＤＮＡ配列を保有して
いた。クローンｐＡＣＣ７８のｃＤＮＡとクローンｐｉ
ｃｃ　９３、ｐＡＣＣ９４及びｐＡｃｃ３８７とを比較
すると、ｐＡＣＣ７８には９３Ｇｂｐ　（ヌクレオチド
５３１．−８８３に対応）の欠失が見られた。プライマ
ー伸長反応によるＣＤＮＡライブラリーから単離された
クローン群の中で分析された６クローンの内、ｐＡＣＣ
９３、ｐＡＣＣ９４及び一つのクローン（第１図には示
されていない）を含む３つのクローンは前記欠失部位が
存在しなかった。オリゴ（ｄＴ）プライムドｃＤＮＡラ
イブラリーから得たクローンＩＩＡＣＣ３８７のｃＤＮ
Ａにもこのような欠失は存在しなかった。ｃＤＮＡ配列
の読み取り枠を確認するために、本発明者はチキンリバ
ーアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの部分的なアミノ
酸配列を分析した。精製した該酵素をスタフィロコッカ
ルプロティナーゼで限定分解後、分離用５ＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動にかけ、ペプチド断片に分離
した。単離した３１ｋＤａ　（文献１１）のペプチドと
４１ｋＤａのペプチドのアミノ酸配列を分析した（表１
）。

又、精製した該酵素をアクロモバクタープロティナーゼ
Ｉで分解し、得られたペプチド断片を逆相ＨＰＬＣ（文
献１１）で分離した。配列が決定されたペプチドを第２
図及び表１に、ヌクレオチドと関連付けて示す。

分解されていない完全なまま（１ｎｔａｃｔ）での該酵
素のポリペプチドのアミン末端配列を、自動エドマン分
解により決定する試みは成功しなかった。

図２にチキンリバーアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ
に対するｃＤＮＡの７３６８ヌクレオチド配列を示す。

２３２４個のアミノ酸配列をコードするただ一つの読み
取り枠（ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｌｎｇ　ｆｒａｍｅ）が存
在する。

このアミノ酸配列は、それぞれのペプチドをエドマン分
解することによって決定されたアミノ酸配列と同一であ
る。

本発明者は翻訳開始コドンとして最初のＡＴＧ　（ヌク
レオチド１−３）を特定した。この推定上の開始コドン
の周辺のヌクレオチド配列はＫｏｚａｋ　（文献２Ｉ）
に記載された真核生物の開始コドンに対するコンセンサ
スシーケンス（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ　５ｅｑｕｅｎｃｅ
）とよく一致する。読み取り枠とは無関係である、ｃＤ
ＮＡの５”非翻訳領域には更にその上流のＡＴＧは全く
見られなかった。前記コンセンサスシーケンス（文献２
１）と一致する２番目のメチオニン（アミノ酸残基の１
３番目）ではなく、１番目のメチオニン（アミノ酸残基
の１番目）を翻訳開始コドンとして選んだことが正当で
あることを証明する蛋白解析のデータはないが、真核生
物においては第１番目のＡＴＧが開始コドンではないケ
ースは稀である。

チキンリバーから得た全ＲＮＡをｃＤＮＡ断片で調べた
ところ、大きさが約１２，０００ヌクレオチドであると
推定される、ハイブリダイゼーション陽性のＲＮＡが認
められた。この大きさはクローン化したｃ　ＤＮＡ　（
７３ｆ；８ヌクレオチド）の長さを考慮すると、アセチ
ル−ＣｏＡカルボキシラーゼをコードするｍＲＮＡの３
′側の非翻訳領域がかなり長いことを示唆するものであ
る。即ち第２図に示されている長さ２４２ｂｐの３′非
非翻訳列部分は、前記の３′非翻訳領域の上流の一部分
に相当しているに過ぎない。

チキンリバーのアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼは、
そのｃＤＮＡ配列から計算上の分子量が２６２゜７０８
であり、開始メチオニンを含む２３２４個のアミノ酸残
基からなることが予想される。チキンリバーのアセチル
−ＣｏＡカルボキシラーゼの考え得るビオチンカルボキ
シルキャリアー蛋白質の一次構造が報告されている（文
献１１）。本研究において、その領域の存在箇所は、以
前に提案されたビオチン結合部位（文献！ｌ）、即ち第
２図に示すアミノ酸残基７８６番目のＬｙｓを含む箇所
であることが解明された。

以下本発明を実施例に基づき説明する。

（実施例） ■ｃＤＮＡＣＤＮＡライブラリースクリーニングエッダ
レイイングヘン　リバー（ｅｇｇ−１ａｙｉｎｇ　ｈｅ
ｎｌ　１　ｖｅｒ　）から得たｐｏｌｙ（Ａ）”　ＲＮ
　Ａを用いて岡山−バーブ法（文献１２）によりＣＤＮ
Ａライブラリー（以下箱−岡山−バーグｃＤＮＡライブ
ラリーという）を作成した（文献１１）。更に６日齢チ
キンリバーから得たｐｏｌｙ（Ａ）”　ＲＮ　Ａ　１９
．２μｇとベクターブライマーＤＮＡ４．２μｇとによ
り上記と同様にＣＤＮＡライブラリー（以下以下第二岡
山−バーグｃＤＮＡライブラリーという）を作成した。

又、ｌＯμｇのオリゴ（ｄＴ）＋ｐ−＋ｓをプライマー
としてチキンリバーｐｏｌｙ（Ａ）’″ＲＮＡｌ０μｇ
を鋳型にしてｃＤＮＡライブラリー（以下第三のｃＤＮ
Ａライブラリーという）を作成した（文献１３）。

上流部位のヌクレオチド配列を持つＣＤＮＡ群をクロー
ニングするため、自動ＤＮＡ合成器により合成した三種
類のオリゴデオキシヌクレオチド（後述する）をプライ
マーとして逆転写により上流部分のＣＤＮＡ群を合成し
た。即ち、前記プライマー０．１〜ｌｎｍｏｌを用い、
チキンリバーから得たｐｏｌｙ（Ａ）’ＲＮＡ１００〜
２００μｇを鋳型にして一本鎖ＣＤＮＡを合成し、つい
で二本鎖とし、Ｓｌエンドヌクレアーゼで処理し、その
３′末端にｐｏｌｙ（ｄＣ）鎖を付加した。このｃＤＮ
Ａ断片をプラスミドｐＢＲ３２２の、ｐｏｌｙ（ｄＧ）
鎖を付加したＰｓｔ　Ｉ部位に挿入した。

これらの操作は本質的に文献１４に記載された操作と同
様であった。形質転換とスクリーニングは文献１５に記
載されたものと同様に行なった。

他に特に指定しない限りスクリーニングはｃＤＮＡ断片
をプローブとして用い、ＧＯ’ＣでＩｎ　５ｉｔｕハイ
ブリダイゼ一シ日ンにより実施した。クローン選別のた
めのハイブリッド形成用プローブはこれラフローブの５
′末端を、Ｔ４ポリヌクレオキナーゼと［γ−”Ｐ］Ａ
ＴＰとにより標識するか（文献１Ｂ）、ニックトランス
レージロンにより標識するか（文献１７）、又は［γ−
３２ｐコｄＣＴＰによるランダムプライミング法（文献
１８）により標識した。

■ｃＤＮＡクローン群の単離 ｃＤＮＡクローン群の単離を第１図に基づき説明する。

クローンｐＡｃｃ　３３の３′末端部分から得た１、［
ｉｋｂのＫｐｎ　工断片を用いて第二岡山−バーグｃＤ
ＮＡライブラリーからの形質転換体７Ｘ１０’個をスク
リーニングしてクローンｐＡＣＣ２０Ｇを得た。コ１７
）　ｐＡｃｃ　２０ＧのｃＤＮＡフラグメント（ヌクレ
オチド４２１９４５９Ｂを含む）を用いて第三のｃＤＮ
Ａライブラリーからの形質転換体４Ｘ１０６個をスクリ
ーニングしてクローンＩ）ＡＣＣ２４９及びｐＡＣＣ２
５Ｂを含む７個の陽性クローンを得た。更にこのＩ）Ａ
ＣＣ２４９のｃＤＮＡインサートを用いて前記第三のｃ
ＤＮＡライブラリーからの形質転換体５ＸＩＰ個をスク
リーニングしてクローンｐＡＣＣ３１１ｉ７を含む約３
０個の陽性クローンを得た。前記クローンｐＡＣＣ２４
９の旧ｎｆ　Ｉ　（４７７２）−旧ｎｆＩ　（５２［１
１）ｃ　ＤＮＡ断片を用いて第二岡山−バーグｃＤＮＡ
ライブラリーからの形質転換体７×ｔＯＳ個をスクリー
ニングしてクローンｐＡＣＣ３２９を得た。前記同じフ
ィルターを、ｐＡｃｃ　３２９のＰｖｕ　ＩＩ（５５３
Ｂ）−ＰＶｕＩＩ　（Ｉｌｉ７１１ｉ３）を用いてスク
リーニングするために再使用した。その結果ｐＡＣ０３
９２を含む３個の陽性クローンを得た。クローンｐＡＣ
Ｃ４０３はｐＡＣＣ３２９のＰｖｕＩＩ　（５５３Ｇ）
−ＰＶｕｎ　（［ｉ７［ｉ３）断片による第三のｃＤＮ
Ａライブラリーからの形質転換体５Ｘ１０６個をスクリ
ーニングすることによって得られた。

ｐＡＣＣ３３のＥｃｏＲＩ　（１４８０）−Ｋｐｎ　Ｉ
　（２９２Ｇ）断片を用いて第三のｃＤＮＡライブラリ
ーからの形質転換体４Ｘ１０６個をスクリーニングして
クローンＩ）ＡＣＣ２６３、ｐＡＣＣ２６８及びｐＡＣ
Ｃ２７１を含む１２個の陽性クローンを得た。

クローンｐＡｃｃ　３８７はｐＡＣＣ３３のｃＤＮＡイ
ンサートの５′側に位置するＰｓｔ　Ｉ部位から旧ｎｄ
ｎＩ（１２２９）へ延びる３５１ｂｐの断面を用いて、
第三のｃＤＮＡライブラリーからの形質転換体５Ｘ１０
６個から単離されｐＡＣＣ３３のヌクレオチド１１２４
−１１３７に相補的な第一の合成オリゴヌクレオチド５
　’−ＧＧＡＧＣＡＡＴＣＣＣＧＡＣ−３′をプライマ
ーとして、ヘンリバー（ｈｅｎ　１１ｖｅｒ）ｐｏｌｙ
（Ａ）”ＲＮＡを鋳型にして逆転写により一本鎖ｃＤＮ
Ａを合成した。二本鎖ｃＤＮＡとした後、ｐＢＲ３２２
に導入し、クローン化した。得られたクローンを２回ス
クリーニングした（１４Ｘ１０’個の形質転換体を２回
）。その５ａｕ３ＡＩ　（９２７）−Ｓａｕ３ＡＩ　（
１０８３）断片はｐＡＣｏ　７Ｂを含む５個の陽性クロ
ーンを与えた。そしてこのｐＡＣＣ７８のヌクレオチド
２７７−４７１を含むｃＤＮＡフラグメントはｐＡＣＣ
９３とｐＡｃｅ　９４を含む６個の陽性クローンを与え
た。ヌクレオチド４１８−４３４に相補的な第二の合成
オリゴヌクレオチド５’−ＡＡＣＡＴＣＴＣＡＴＡＧＧ
ＡＣＣＡ−３’をプライマーとして、６日齢チキンリバ
ーｐｏｌｙ（Ａ）◆ＲＮＡを鋳型にしてＣＤＮＡを合成
し、得られた５　Ｘ　１０Ｇ個の形質転換体を、ＣＤＮ
Ａでスクリーニングして約３９０個の陽性クローンを得
た。これらのクローンの中で分析された１０２個のクロ
ーンの内、ｐＡＣＣ１５７とＩ）ＡＣＣ１９［ｉが−１
４＝ 最も上流に伸長しているようであった。

第三の合成ヌクレオチド５　’−ＴＯＣＡＣＴＴＣＣＡ
ＡＡＡＴＧＡＡ−３′（ヌクレオチド−７３−−５７に
相補的）をブライマーとして６日齢のチキンリバーｐｏ
ｌｙ（Ａ）◆ＲＮＡを鋳型とし、プライマー伸長反応に
よりｃＤＮＡを合成した。得られたクローン３Ｘ１０ｓ
個の形質転換体を、ヌクレオチド−１５４−−７８を含
むｃＤＮＡフラグメントでスクリーニングしてクローン
Ｉ）ＡＣＣ２４３を得た。

■ｃＤＮＡの配列分析 色々な制限酵素断片又はＢＡＬ　３１ヌクレアーゼによ
り連続して短く切断した断片をプラスミドｐＵＣＩ８又
はｐＵｃｌＢにサブクローニングした。ヌクレオチドの
配列決定はジデオキシチエインターミネータ−法（文献
１９．２０）を用いて二本鎖プラスミ゛ドＤＮＡから直
接決定した。又は、色々の制限酵素断片の５′末端をＴ
４ポリヌクレオキナーゼと［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを用い
て標識し、マキサム・ギルバート法により決定した。こ
の結果を第１図に示す。

■ペプチド分離とアミノ酸配列決定 表１ チキンリバーアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼをアク
ロモバクタープロテイナーゼＩ又はスタフイロコッ力ル
セリンプロテイナーゼによって消化して得られたペプチ
ドの配列分析。

アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼをチキンリバーから
精製した（文献７）。該酵素をスタフィロコッ力ルセリ
ンブロテアーゼ（Ｓｔａｐｈｙ　１ｏｃｏｃｃａ　１ｓ
ｅｒ１ｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）又はアクロモバク
タープロティナーゼＩ　（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ
　ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｉ）で２旧ヒし、ついで各ペ
プチド断片に分離した。ペプチドの断片とネイティブ（
ｎａｔｉｖｅ）なアセチル−ＣｏＡカルボキラーゼのア
ミノ末端配列はガスフェイズシークエンサー（（ｉａｓ
−ｐｈａｓｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅｒ）とＰＴＨ−アミノ
酸分析器（バイオシステム社製、モデル４７０Ａ及び１
２ＯＡ）を用いて分析した。その結果を表１に示す。

ａ　、ＰＴＨ−アミノ酸の生成量は（）内にｐｍｏ　ｌ
で示す。

ｂ、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの推定−次構造
における各アミノ酸残基の位置番号を示す。

以上に記したように、チキンリバー由来のアセチル−Ｃ
ｏＡカルボキシラーゼのｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを
クローニングしてその配列分析をした結果から推定され
た全アミノ酸配列は該酵素の部分的なアミノ酸配列分析
とよく一致した。

（以下余白） 引用文献 １、Ｎｕｍａ、　Ｓ、、　ａｎｄ　Ｔａｎａｂｅ、　Ｔ
、　（１９８４）　ｉｎ　ＦａｔｔｙＡｃｉｄ　Ｍｅｔ
ａｂｏｌｉｓｍ　ａｎｄ　Ｉｔｓ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏ
ｎ　（Ｎｕｍａ。

Ｓ、、　ｅｄ、）　Ｎｅｗ　Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖ
ｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

ｖｏｌ、　７　ｐｐ、　１−２７．　Ｅｌｓｅｖｌｅｒ
　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｕｌｌｓｈｅｒｓ　Ｂ、　Ｖ
、、　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ２、Ｗａｋｌｌ、　ｓ、　Ｊ
、ｌ　５ｔｏｏｐｓ、　Ｊ、　Ｋ、、　ａｎｄ　Ｊｏｓ
ｈｌ、　ｖ。

Ｃ，（１９８３）　Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｂｌｏｃｈ
ｅｍ、　５２．５３７−５７９３、Ｓｏｎｇ、　Ｃ，Ｓ
、、　ａｎｄ　Ｋｉｍ、　Ｋ、　Ｂ、　（１９８１）　
Ｊ、　Ｂｌｏｌ。

ＣｈｅＩａ、　２５１Ｅ、　７７８Ｂ−７７８８４、Ｔ
ａｎａｂｅ、　Ｔ、、　Ｗａｄａ、　Ｋ、、　０ｋａｚ
ａｋ１．　Ｔ、、　ａｎｄ　ＮｕｍａＳ、　（１９７５
）　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｌｏｃｈｅｍ、　５７．１５−
２４５、Ｔｉｐｐｅｒｓ、　Ｊ、　Ｐ、、　ａｎｄ　Ｗ
ｌｔｔｅｒｓ、　Ｌ、　Ａ、　（１９８２）Ｂｌｏｃｈ
ｌｍ、　Ｂｌｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　７１５．１１Ｅ
２−１６９Ｇ、Ｂｅａｔｙ、　Ｎ、　Ｂ、、　ａｎｄ　
Ｌａｎｅ、　Ｍ、　Ｄ、　（１９Ｂ２）　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２５７．９２４−９２９７、
Ｗａｄａ＋　Ｋ、、　ａｎｄ　Ｔａｎａｂｅ、　Ｔ、　
（１９８３）　Ｅｕｒ、　Ｊ。

Ｂｌｏｃｈｅｍ、　１３５．１７−２３８、Ｍａｎｎｌ
ｎｇ、　Ｒ，、Ｄｌｌｓ、　Ｒ，、ａｎｄ　Ｍａｙｅｒ
、　Ｒ，Ｊ。

（１９７Ｇ）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　１５３．４８
３−４ｔｉ８９、■ａｒｄｌｅ、　Ｄ、　Ｇ、、　ａｎ
ｄ　Ｃｏｈｅｎ、　Ｐ、　（１９７８）　Ｅｕｒ、　Ｊ
。

Ｂｌｏｃｈｅｍ、　９２．２５−３４ １０、Ｒａｉｎｗａｔｅｒ、Ｄ、Ｌ、、ａｎｄ　Ｋｏｌ
ａｔｔｕｋｕｄｙ、Ｐ、Ｅ。

（１９８２）　Ａｒｃｈ、　Ｂｌｏｃｈｅｍ、　Ｂｌｏ
ｐｈｙｓ、　２１３．３７２−３８３１１．７ａｋａ１
．　Ｔ、、　Ｗａｄａ、　Ｋ、、　　ａｎｄ　Ｔａｎａ
ｂｅ、　Ｔ、　（１９８７）ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、、２
１２．９８−１０９１２、Ｏｋａｙａｍａ、　Ｈ，、ａ
ｎｄ　Ｂｅｒｇ、　Ｐ、　（１９８２）　Ｍｏ１．　Ｃ
ｅ１ｌ。

Ｂｌｏｔ、　３＋　１６１−１７０ １３、Ｍａｎｌａｔｌｓ、　Ｔ、、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ、
　Ｅ、Ｆ、、　ａｎｄ　Ｓａｍｂｒｏｏｋ。

Ｊ、　　（１９８２）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎ
ｌｎｇ：　Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｎｕａｌ、
ｐｐ、２３０−２４１．Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ
ｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｌ
ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ１４、Ｎｏｄ
ａ、　Ｍ、、　Ｆｕｒｕｔａｎｆ、　Ｙ、、　Ｔａｋａ
ｈａｓｈｌ、■、。

Ｔｏｙｏｓａｔｏ、　ＭＢ旧ｒｏｓｅ、　Ｔ、、　Ｉｎ
ａｙａｍａ、　Ｓ、。

Ｎａｋａｎｌｓｈｌ、　　Ｓ、、　　ａｎｄ　　Ｎｕｍ
ａ、　　Ｓ、　　（夏９８２）　　Ｎａｔｕｒｅ。

釘喝、　２０２−２０１１ｉ １５、Ｔａｋａｌ、　Ｔ、、　Ｎｏｄａ、　Ｍ、、　Ｆ
ｕｒｕｔａｎｌ、　　Ｙ、、　Ｔａｋａｈａ−ｓｈｌ、
Ｈ，、Ｎｏｔａｋｅ、Ｍ、、Ｓｈｉｍｌｚｕ、Ｓ、、Ｋ
ａｙａｎｏ。

Ｔ、、　Ｔａｎａｂｅ、　Ｔ、、旧ｒｏｓｅ、　Ｔ、、
　Ｉｎａｙａｍａ、　Ｓ、。

ａｎｄ　Ｎｕｍａ、　Ｓ、　（１９８４）　Ｅｕｒ、　
Ｊ、　Ｂｌｏｃｈｅｍ、　１４３゜１Ｅｉ、Ｍａｘａｍ
、　Ａ、　Ｍ、、　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ、　Ｗ、　
　（１９８０）　Ｍｅｔｈ−ｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、
　［ｉ５．４９９−５［１０１７Ｊｅｌｎｓｔｏｃｖｋ
、Ｒ，、Ｓｗｅｅｔ、Ｒ，、ＷｅＩｓｓ、Ｍ、。

Ｃｅｄａｒ、　Ｈ，、ａｎｄ　Ａｘｅｌ、　Ｒ，（１９
７８）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７５．　１２９９
−１３０３１８、Ｆｅｌｎｂｅｒｇ、　Ａ、　Ｐ、、　
ａｎｄ　Ｖｏｇｅｌｓｔｅｌｎ、　Ｂ、　（１９８３）
Ａｎａｌ、Ｂｌｏｃｈｅｍ、１３２．Ｂ−１３１Ｂ、Ｓ
ａｎｇｅｒ、Ｆ、、Ｎ１ｃｋｌｅｎ、Ｓ、、ａｎｄ　Ｃ
ｏｕｌｓｏｎ、Ａ、Ｒ。

（１９７７）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　
Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７４゜５４［１３−５４６７ ２θ、Ｆｕｒｕｔａｎｉ＋　ｙ、、Ｎｏｔａｋｅ、　Ｍ
、、Ｆｕｋｕｉ、　Ｔ、ｌ　０ｈｕｅ。

Ｍ、、　Ｎｏｍｕｒａ、　Ｈ，、Ｙａｍａｄａ、　Ｍ、
、　ａｎｄ　Ｎａｋａｍｕｒａ。

Ｓ、　（１９８Ｇ）　Ｎｕｃｌｅｌｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ
ｅｓ、　１４．３１６７−３１７９２１、Ｋｏｚａｋ、
　Ｍ、　（１９８１）　Ｎｕｃｌｅｌｃ　Ａｃ１ｄｓ　
Ｒｅｓ、　旦。

（以下余白）

【図面の簡単な説明】

第１図はチキンリバー由来のアセチル−ＣｏＡカルボキ
シラーゼに対するｃＤＮＡの配列決定戦略と制限酵素地
図。 第２図はチキンリバーアセチル−ＣｏＡカルボキシラー
ゼのクローン化したｃＤＮＡのヌクレオチド配列と該酵
素蛋白の推定アミノ酸配列である。 出 願 人 明 治 乳 業 株 式 手続補正書 （方式） 事件の表示 昭和６ ３年特許願第２０８１７０号 発明の名称 アセチル ｏＡ カルボキシラーゼ 補正有する者 事件との関係

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、第２図に示すヌクレオチド配列とアミノ酸配列を有
   するチキンリバー（ｃｈｉｃｋｅｎｌｉｖｅｒ）由来の
   アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ。 ２、請求項１記載のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列
   の一部が、下記のヌクレオチド及びアミノ酸に置換され
   たヌクレオチド配列とアミノ酸配列を有するチキンリバ
   ー由来のアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ。 ３１番目のＣがＴ；１２３番目のＣがＧ又はＴ；１４１
   番目のＧがＡ；１６８番目のＣがＧ又はＡ；１８７番目
   のＧがＡ；６５７番目のＡがＧ；６６３番目のＴがＧ；
   ７８２番目のＡがＧ；９６５番目のＧがＡ；１５８４番
   目のＡがＧ；１７００番目のＧがＡ；３０９３番目のＴ
   がＣ；３１７７番目のＣがＧ又はＡ；４００８番目のＴ
   がＣ；４３３９番目のＧがＡ；４５０４番目のＧがＡ；
   ４５４０番目のＧがＡ；４７１２番目のＧがＡ；４８８
   １番目のＧがＡ；４９５７番目のＧがＡ；５３０２番目
   のＧがＡ；５３６７番目のＧがＡ；６０４０番目のＧが
   Ａ；６４４７番目のＧがＡ；６５６１番目のＧがＡ；６
   ７０６番目のＧがＡ６３番目のＧｌｙがＡｒｇ；２６１
   番目のＡｓｎがＳｅｒ；３２２番目のＡｒｇがＬｙｓ；
   ５６７番目のＡｒｇがＨｉｓ；１４６７番目のＧｌｕが
   Ｌｙｓ；１５０２番目のＡｌａがＴｈｒ；１５１４番目
   のＧｌｙがＳｅｒ；１５７１番目のＧｌｙがＧｌｕ；１
   ６５３番目のＡｓｐがＡｓｎ；１７６８番目のＧｌｙが
   Ａｒｇ；２０１４番目のＧｌｙがＡｒｇ；２２３６番目
   のＶａｌがＩｌｅ ３、請求項１記載のヌクレオチド配列５３１−６８３番
   目及びアミノ酸配列の１９８−２２８番目が削除された
   ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を有するチキンリバー
   由来のアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ。