JPH02504589A - 自然環境下に植えるための不定胚の成熟方法 - Google Patents
自然環境下に植えるための不定胚の成熟方法Info
- Publication number
- JPH02504589A JPH02504589A JP50713589A JP50713589A JPH02504589A JP H02504589 A JPH02504589 A JP H02504589A JP 50713589 A JP50713589 A JP 50713589A JP 50713589 A JP50713589 A JP 50713589A JP H02504589 A JPH02504589 A JP H02504589A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- medium
- embryos
- somatic
- embryo
- aba
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
- A01H4/005—Methods for micropropagation; Vegetative plant propagation using cell or tissue culture techniques
- A01H4/006—Encapsulated embryos for plant reproduction, e.g. artificial seeds
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
炊 に えるための1 ・の 功 “藍血丘旦
本発明は、例えば作物、鑑賞植物、森林植物の生産のような、農業のための植物
の無性繁殖に広く関するものである。更に、具体的には、本発明は、本物の種子
と同様な方法で播種又は植付けることのできる組織培養由来の栄養繁殖体の開発
方法に関するものである。
主尻玖1景
栄養繁殖あるいは無性繁殖は、有史以来農業において利用されてきている。種子
繁殖に対する栄養繁殖の利点は有糸細胞分裂のみが起こることであり、そのため
それぞれの娘細胞は親細胞と全く同じ遺伝情報を持つことである。従って、子孫
は親のクローンである。
一方、種子繁殖では減数分裂と遺伝的組み換えがあるため、子孫は両方の親から
の遺伝情報を持つことになる。
無性繁殖は、とりわけ、バナナ、針葉樹、いちぢく、オレンジ、ぶどう、その他
多くの雑種性作物にとって重要である。)Iartmann+ H,T、及びり
、 Kesterの“植物増殖” (Plant Propagation、
Prentice−Hall、 Engle−wood C11ffs、 N
ew Jersey (1975))参照。しがながら、栄養繁殖は、通常、労
働集約的であり、遅く、しかも母木維持のための広大な温室あるいは圃場空間が
必要である。栄養繁殖は、いくつかの作物に対して使われているものの、単位当
の価値の高い作物に限られている。その結果、栄養繁殖のために他の方法、植物
組織培養が提唱され、利用されてきている。
組織培養法は、早い繁殖速度と植物の維持、生産のための空間がかなり少なくて
すむことから、開発された。組織培養技術は、不定胚形成及び器官形成を含め、
植物の栄養系繁殖のために広く利用されている。基本的な組織培養の過程には、
以下の段階が含まれるものである:
1)植物体から組織片を切り取り、
2)表面殺菌し、補足栄養素、シュークロースのような炭水化物及びその他の必
要な生長成分を含有する無菌条件下に組織を置床し、
3)組織そのものから又は、組織由来のカルスから器官形成あるいは不定胚形成
により植物を再分化させ、
4)その後、独立栄養による生長のための十分な葉が育つまで土ヱ旦上旦におい
て植物を生育し、5)調節された研究室、グロースチャンバー、湿度の調整でき
る温室条件下で植物をハードニングし、そして
特表千2−504589(3)
6)得られたハードニングした植物を作物生産のために温室あるいは圃場環境へ
移植する。
Evans、D、A、等纒による“植物細胞培養の手引き”(Handbook
of Plant Ce1l Cu1ture+ Vol、1. Macmi
llanPublishing Co、、 New York (1983))
参照。
栄養繁殖に関する組織培養技術は、多くの植物に有用であることは前記したとお
りである。しかしながら、組織培養の過程には様々の制約がある。即ち、様々な
独立した操作が求められること、未成熟期における水分不足、及び、萎凋を防ぐ
ために、植物生産はインビトロにおいて注意深くなされねばならないこと、栄養
繁殖はど金がかかるわけではないが、その過程は、広い範囲の様々な作物、とり
わけ、単位当の価値(例えば、種子の値段)が中程度から低いものにとっては、
高いものについてしまうことである。さらに、組織培養由来の器官形成栄養繁殖
体あるいは不定胚は、真正種子と同じようには、圃場に自然にかつ直接植えるこ
とができないのである。
最初の不定胚は、1958年にニンジンの組織から作られた。Re1nert、
J、による“ニンジンの培養における形態形成及びその調節” (Morp
hogenese und IhreKontrolle an Gewebe
kulturen aus Carotten、 Natur−wissens
chaft 45.344−345(1958))及びSteward、 F
。
等による゛培養細胞の生長及び体制の発達■、遊離懸濁細胞由来の培養における
体制” (Growth and Orga−nized Developme
nt of Cu1tured Ce1ls U、 Organiz−atio
n in Cu1tures Grown from Freely 5usp
endedCells、 Am、J、Bot、 45.705−708 (1
958)]参照。続いて、アルファルファ、とうもろこし、ねた、針葉樹、大豆
を含む多くの植物種から不定胚が作出されている。
Vasil、 1.の“植物の細胞培養及び体細胞遺伝学”〔皿Cu1ture
and Soa+atic Ce1l Genetics of Plant
s、 Vol−umes 1−4+ Academic Press、 0rl
ando、 Florida (1984+1985、1986 & 1987
) ]及びBonga、 J、及びり、 Durzanによる“林学における細
胞及び組織培養”[Ce1l and Ti5sue Cu1ture in
Forestr 、 Volu+nes 1−3+ l’1artinus N
1jhoff Publishers、 Dordrecht、 Ne’the
rlands (19B?) )参照。多くの種類の種において、不定胚は、作
出されてはいるものの、そのうちのわずかのものしか完全な植物に育っていない
。Redenbaugh、 K、rD、51ade、 J、Fujiiによる“
人工種子” (ArtificialSeeds+ In: Int、Con
f、on In Vitro 5election andPro a−ati
on c山Economic Plants (Ilahi、 1.and K
。
Hughes+ eds、)、 University of Peshawa
r、 Pakistan(198B) )参照。
さらに、組織培養由来の栄養繁殖体からの植物生産は(71?上二の環境下にお
いてのみ成功しているのである。明らかなことは、不定胚は多くの種で作出され
るものの、その胚の発達上の成熟度合は、不完全であり、真正種子中の接合胚の
成熟度合からは全くかけはなれていることである。不定胚は、形成後、適当な培
地に置けば、早期発芽の形態を示す。その結果、不定胚は、少数の植物が生産で
きたとの少数の例外を除けば、温室の条件下では、自然に取り扱い、植えること
はできないのである。Redenbaugh、 K、、 D、51ade、 P
。
Viss、 J、Fujiiによる“人工種子皮膜による不定胚のカプセル化”
(Encapsulation of Somatic Embryos 1
nSynthetic 5eed Coats、 Hortsci、22+ 8
03−809(1987)+Redenbaugh、 )[、B、Paasch
、 J、N1chol、 M、Kossler、 P。
Viss、 )[、Walkerによる“人工種子:無性胚のカプセル化” (
Somatic 5eeds:Encapsu−1ation of Asex
ualEmbryos、 Bio/lechnology 4.797−801
(1986)) 、今までのところ、圃場条件下にそのまま直接植えられた不定
胚から生産された植物は1つも知られていない。
不定胚の生産を促進するために、研究者は接合胚形成の研究から得られた知見を
応用した。その前提は、不定胚の胚形成は、接合体の胚形成に顕像しているある
いは類僚しているであろうとのことであった。重要な所見の1つは、多くの種に
おいて未成熟の接合胚を種子から取り出し、インビトロで培養すると早期に発芽
することであった。インビトロにおいて培地へのアプシジン酸(以下、ABAと
略す)の添加は、この早期発芽を阻害することが知られている。ABAは、発達
している接合胚の中に自然に蓄積することから、ABAはインビボにおいては、
早期発芽を抑制する機能があるとの仮説が設けられている。Morris、 P
、C,等の“−4>旦上旦の培養における未成P殺粒胚の内生アブシジン酸量の
検出” [Determination of Endoge−nous A
bsci−sic Ac1d Levels in Immature Cer
eal Embryos Duringin Vitro Cu1ture、
Planta lJ3 : 110−116 (1988) )参照。
同様に、インビトロにおける高浸透圧状態(例えば、培地中の高濃度のマニトー
ルやシュークロース)も、接合胚の早期発芽を抑制することが知られている。
ABAとマニトールをインビトロでの接合胚の培養において並行して比較すると
、胚における形態学的変化、生重量、蛋白質含量、凝集素量において、両者は全
く同一の反応が観察された。Morris等による“インビボ。
インビトロにおける胚形成時及び発芽時における小麦、大麦の胚芽凝集素の量変
化” [Changes in the Levelsof Wheat an
d Barley−germ Agglutinin During Embr
yo−genesis In Vivo、In Vjtro and Duri
ng Germination。
Planta 担、407−413(1985) )参照。八BAと胚の発達
に関する重要な仮説の1つは、胚の発達の調節はABAによって直接仲介される
のではなく、水分吸収についての生長調節物質の作用を通して行なわれるという
ものである。さらにMorris等(同上)は、未成熟の胚が高浸透圧の状態の
培地にて培養されると、胚は内生ABA濃度を調整し、その結果、外部の浸透圧
と内生生長物質との合わさった影響によって早期発芽が抑制され、継続した胚の
発達が維持されると仮定している。
その結果、ABAと浸透圧試薬とは胚の発達に同様な効果をもつと思われている
。
さらに、胚形成の中、後期におけるABAの効果は、胚形成に関連しているらし
い特異的なメツセンジャーRNAの合成、翻訳の選択的阻害である。ABAは蛋
白質の蓄積を制限しないと報告されているが、これは多分、胚成形初期において
、蛋白質蓄積のためのメツセンジャーRNAが転写されるからであろう。その代
わり、ABAは光合成産物の分配に関与して、蛋白蓄積メツセンジャーRNAの
阻害に関与しておらず、接合胚の蓄積蛋白量を増加させる。(Ackerson
、 R,C,著“アブシジン酸による大豆胚形成の調節” (Regulat
ion of 5oy−bean Embryogenesis by Abs
cisic Ac1d、 J、Exp、Bot、 35403−413(198
4) ) )。
こうした観察に基づいて、研究者は、不定胚形成中に使用される細胞培養培地に
ABAを添加している。
Bonga、 J、及びり、Durzanによる“林学における細胞及び組織培
養” [Ce1l and Ti5sue Cu1ture in Fores
trv。
Volumes 1−3. Martinus N1jhoff Publis
hers Dordre−cht、 Netherlands (1987)
) +及びνasil、 Iによる“植物の細胞培養及び体細胞遺伝学” [C
e1l Cu1tureand Somatic Ce1l Genetics
of Plants、 Volumes 1−4+Academic Pre
ss 0rlando、 Florida(1984,1985,1986&
1987) :]参照。ABAを使用することによって、発達の同調化を含み、
不定胚の形態的な改善がもたらされることがわかった。
しかしながら、接合胚形成に対するABAを用いた研究が熱心に行われたにも拘
らず、ABAが実際に接合胚であれ不定胚であれ、インビトロ環境外での温室あ
るいは圃場における胚の発芽能力を高めるとの報告なり示唆はなされていない。
培地中のABAと高濃度のシュークロースが、カプセル化され、乾燥されたニン
ジンの不定胚の生存にとって重要な成分であることが報告された(Janick
、 J、及びS、Kitto+ ”無性植物胚のカプセル化方法” Proce
ss forEncapsulating Asexual Plant Em
bryos、 U、S、 Patent4、615.141)。しかし、これら
の成分は、ニンジンの組織培養において、その不定胚誘導期に加えられたハード
ニング処理剤として記載されたもので、早期発芽段階における再分化不定胚には
適用されていない。
さらに、この文献は乾燥後の胚の生存をハードニング処理剤は高めると報告して
いるにも拘らず、実施例は、実際の植物生産を示すことなく、単に乾燥に対する
胚の生存を示していた。このように、植物生産は公知文献には報告されていない
。Kitto、S、及びJ、Janickによる“ニンジンの無性胚のカプセル
化による人工種子の生産” [Production of 5ynteti
c 5eeds by Enca−psulating Asexual Em
bryos of Carrot、 J、Amer、Soc。
Hort、Sci、月、0.277−282(1985) )及びKitto、
S、及びJ。
Janickによる“ニンジンの人工皮膜無性胚のハードニング処理剤による生
存上昇” [Hardening TreatmentsIncrease
5urvival of 5ynthetically−Coated Ase
xualEmbryos of Carrot、 J、Amer、Soc、Ho
rt、Sci、LL!l+ 283−286 (1985))参照。結局、これ
らのハードニング処理剤が温室や圃場のような自然環境下において、不定胚の発
芽、コンバージョンに有効であるか否かについては明らかになっていない。
真正種子の発芽を高めるために用いられている接合胚形成における別の観点は、
種子を植える前にポリエチレングリコールやマニトールのような浸透圧試薬又は
ジベレリン酸で処理することである。また、種子の単なる浸漬も発芽に有利であ
ると報告されている。
BradfordJ、、 ”ストレス条件下の発芽を改良するための、浸透圧を
用いたブライミングによる種子と水との関連の操作[Manipulation
of 5eed Water Re1ationsVia Osmotic
Priming to Improve Germination Llnde
rStress Conditions、 Hortsci、 2L1105−
1112(1986))及びBewley、 J、D、及びM、BlackのP
h 5iolo and Bio−chemistr of 5eeds
、 Volume 2+ Springer−Verlag+New Yo
rk (1982)を参照。
こうした処理により、プライミング(Priming、種子が吸水し、完全な発
芽の準備ができているが、発根のような目に見える現象は起こっていない)又は
前発芽(PregerIIlination、幼根が種皮から出芽している)が
もたらされる。しかし、不定胚のプライミングも前発芽も報告されておらず、こ
れは、明らかに不定胚が発達の後、早期発芽段階にあり、本質的に既にプライミ
ングあるいは前発芽の段階にあるからである。まさに、プライミングあるいは前
発芽が早期発芽段階の未成熟接合胚に適用しうろことは考えられていなかったし
、不定胚にも通用しうるとは考えられていなかった。
このように、本発明の目的は、不定胚を成熟させ、インビトロにおける植付けの
環境を必要とすることなく、グロースチャンバー、温室、圃場に直接植付けるこ
とのできる技術を提供することにある。
本発明の他の1つの目的は、不定胚を本物の種子と同様な方法により植付けるこ
とのできる方法を提供することにある。
さらに、本発明の目的は、不定胚の成熟を改善することにある。
その上、本発明の目的は、不定胚の発芽を調節することにより、製品寿命(Sh
elf 1ife)を著しく伸ばすことにある。
また、本発明の別の目的は、グロースチャンバー、温室、圃場に直接植えられた
不定胚のコンバージョン(convers 1on)を促進するために不定胚の
前発芽を利用することにある。
1里■皿玉
これらの目的は、本発明によってもらたされるものであるが、本発明は、インビ
トロ環境という制約を受けることなく、グロースチャンバー、温室、圃場の環境
に、真正種子と同様に植付けることのできる成熟不定胚を生産する方法を提供す
るものである。
本発明の実施においては、早期発芽の発達段階にある植物不定胚が成熟処理に供
されるが、その処理は、不定胚を胚成熟を誘導するに十分なABAを含有した培
地に適当時間、適当条件にて置くことからなる。
本発明の成熟処理は、インビトロ環境下における不定胚発芽に驚く程効果的であ
る。本発明による成熟不定胚は、発芽及びコンバージョン(conversio
n)能力におけると同様その外見上未処理胚と全く異なっている。
成熟処理は、3つの植物種に対して有用であることが判明したが、他の種に対し
ても同じように応用できるものと期待されている。
l泗Ov’6−JL咀
本発明により、無菌のインビトロ環境又は生長と生存のための炭水化物の必要な
しに、グロースチャンバー、温室、圃場条件に植付けることができる不定胚の成
熟方法が提供される。このような成熟不定胚は、今まで真正種子のみが発芽、生
育した条件で完全な植物を形成しうるものである。
不定胚及びその他の分裂組織の作出は、現在、多くの種類の植物において、広く
行われている。多くの重要な作物、園芸植物、これらにはアルファルファ、セロ
リ−、ニンジン、レタスが含まれるが、では、組織培養及び不定胚形成を通して
の増殖が可能であることが示されている。こうした植物種の最近のリストについ
ては、以下の文献を参照。
Evans、D、A等による細胞培養の生育と挙動;不定胚形成と器官形成(G
rowth and Behavior of Ce1l Cu1−tures
: Embryogenesis and Organogenesis、”P
lantTissue eulture:Methods and A 1i
cations in A r’r−cj+1ture Thorpe 編、
Academic Press、 pg、 45.以下参照(1981)、Am
m1rato、P、による胚形成E+lIbryogene−sis、” )I
andbook of Plant Ce1l Cu1ture (Evans
、D、等り、Macmillan Publishing Co、、New Y
ork pp、82−123(1983)+ Redenbaugh、に、によ
る植物種子類イ以物” Ana−1ogs of Botanic 5eeds
、’U、S、Patent 4,562+663 、これらのリストは決して完
全なものではなく、本発明を実施することが、不定胚形成能を持つことが今後明
らかになる種の増殖にとって有利なものであることが判明するであろう。
不定胚は、接合胚の一般的な形態学的、外見的、生化学的特徴を有している。D
、5tuart、 J、Ne1sen、 C。
McCall、 S、5trickland、 K、Walkerによるアルフ
ァルファとセロリの細胞培養における不定胚の発達生理学′″Physiolo
gy of The Development of Somatic Emb
ryosin Ce1l Cu1tures of Alfalfa and
Ce1ery”Biotech−TIOlo in Plant 5cien
ce (Zaitlin、 l’1.等W)+ Aca−demic Pres
s+ Inc、、 NewYork、 pp、35−47(1985L及びり、
5tuart、 J、Ne1sen、 S、5trickland、J、N1c
holによる一アルファルファの細胞培養において発達段階に影響を及ぼす因子
″Factors Affecting Developmental Pro
−cesses in Alfalfa Ce1l Cu1tures、’ T
i5sue Cu1turein Forestr and A ricul
ture (Henke、 R,等纒)。
Plenum Publ、Corp、、New York、pp、59−73(
1985)参照。
不定胚からの発芽、植物生産はそれ程研究されておらず、大部分の種にとって、
不定胚からの植物生産すなわちコンバージョン(conversion)の度合
は低いものである。さらに、世界中で不定胚形成に関してかなりの努力がなされ
たにも拘らず、圃場に直接不定胚を植付けることに成功したことの報告はない。
真正種子と同じように不定胚を扱うことはこれまでのところ不可能であった。
不定胚の質及び外観は、環境状態及び培地成分のような外的な要因によって調節
されうると認識されている。しかし、今までの研究の焦点、及び目的は、接合胚
と同様な外観を有する均一な不定胚を同調生産することにあった。圃場のような
インビトロではない環境下で、高い割合で不定胚が発芽するかどうかは研究の対
象ではなかった。不定胚の商業的成功への基本的制約は、接合胚のような不定胚
が生産されたとしても、こうした不定胚の利用は、自然環境下では殆どできず、
インビトロの発芽、及びコンバージョンに限られてしまうということであった。
ここで使っているインビトロ環境とは、無菌性が保たれ、細胞への栄養素として
代謝可能な炭素源が加えられている環境を意味する。さらに、まわりの環境の変
化に伴う変動を防ぐために通常、温度、湿度及び/又は日照時間がインビトロ環
境内では調節される。
一方、自然な植え付は環境とは、無菌性を保つ努力がなされておらず、炭素源も
加えられて、いない環境を意味する。
ABAは、胚形成中の植物細胞培養培地に添加することにより、不定胚の質と外
観を改善するために使用される。ABAは胚成熟を促し、異常な二次胚の生産を
阻害し、早期発芽を抑制すると報告されている。Amm1ra−to、 P、に
よる胚形成″Embryoge−nesis、” Handbook ofPl
ant Ce1l Cu1ture (Evans、 D、等IJH)+ Ma
cmillanPublishing Co、、New York、pp、82
−123 (1983)参照。驚くべきことに、ABAの胚の性能に関する効果
については研究も、認識もされていなかった。実際、ABAをAmm1rato
(同上)の方法により試験すると、不ヱ旦上旦におけるコンバージョンには、
何ら有効な効果がなかった。アルファルファの不定胚の生産において、ABAを
濃度0.01〜10μ門にて使用したところ、インビト旦でのコンバージョン率
は7−24%であったが、ABAを使用しない対照においても率は17%であり
大差はなかった。Redenbaugt++ K、、 P、Viss、 D、5
lade+及びi。
Fuj ii らによるスケールアップ:人工種子5cale−up:Arti
ficial 5eeds+”Plant Ti5sue and Ce1l
Cu1ture(Green、 C,等に%) 、 Alan Li5s、
Inc、、 New York、 pp。
473−493 (1987)参照。ABAが不定胚形成に重要であることは知
られていたし、研究者はABAが早期発芽の抑制と胚が成熟過程をとり続けるこ
とに関与しているとは推測していたにも拘らず、驚くべきことに、本発明による
ABA処理Oよって胚の成熟がもたらされ、葉、二次根又は、生長した茎頂を持
たない不定胚に、真正種子と同じようにそのまま植えることを可能にすることは
知られていなかった。
本発明の別の観点によれば、この方法により調製された不定胚は、同時に又は引
き続いて、前発芽処理に供することができる。ここで使用する前発芽とは、一般
的な意味で、胚を植える前に発芽の生化学的又は生理学的過程を始めさせるため
のいずれの方法をも意味する。この過程に対して使われる他の用語としては、プ
ライミング(Pricing)、浸透圧処理(osmocondition−i
ng)、生長力付与(vigorizing)、芽ばえ処理(chitting
)がある。
前発芽が、早期発芽段階の未成熟の接合胚には通用できないと考えられていたよ
うに、前発芽は不定胚にも適用できないと考えられていた。予想外に、ABA成
熟処理により不定胚形成を成熟及び休止段階へと移し、前発芽によるABAの除
去は、ジベレリン酸の添加の有無に拘らず、不定胚の発芽を刺激し、植物生産の
割合を高めることが発見された。
発Elo o駁扱
本発明によれば、不定胚形成能を存する選択した植物種の、表面を殺菌した外植
片組織からカルスは誘導される。典型的には、葉柄が外植片組織の提供のために
使用される。カルス誘導に用いられるその他の外植片としては、未成熟の接合胚
、未受精の胚珠、朽、若い花房、葉鞘、不定胚である。
選ばれた外植片組織は、無機塩、炭素源、植物生長調節物質及び少なくとも1種
のオーキシンを含む培地中に置かれる。
この方法の様々な段階にて利用される培地とは、カルス組織から完全な植物へと
再分化するために知られ、開発されてきたすべての栄養培地を含むものである。
本発明において有用な培地は、−i的に無機塩、ビタミン、炭水化物及び不定胚
形成のある段階では、単独あるいは複数のホルモンからなるものである。
本発明の培地にて使用される無機塩は、従来からよく知られた物質であり、多量
成分と微量成分とから成る。誘導培地において用いられる無機塩の多量成分と微
量成分とは、以下の化合物から選ばれる一般的によく知られた物質である。硫酸
アンモニウム、硝酸カリウム、リン酸−カリウム、硫酸マグネシウム7水和物、
硫酸マンガン2水和物、硫酸亜鉛7水和物、ホウ酸、ヨードカリ、塩化カルシウ
ム2水和物、硫酸第一鉄7水和物、エチレンジアミン四酢酸(2Na) 、他の
無機塩の組み合わせも可能である。代表的な無機塩を含有する培地は以下のよう
なものだが、これに何ら限定されるものではないニジエンクーヒルデブランド塩
(SH)、5chenk、R,[1,及びA、C,Flildebrandt、
Can、J、Bot、50:199−204 (1972)又はムラシゲ−スク
ーグ塩(?IS)、Murashige。
T、及びF、に、Skoog、Physiol、Plant、 15:473−
497(1962)。
例えば、SH無機塩は以下のように構成される:(■/ft、)
石肖酸カリウム(2500)
塩化カルシウム2水和物(200)
硫酸マグネシウム7水和物(400)
リン酸二水素アンモニウム(300)
ヨードカリ(1,0)
ホウ酸(5,0)
硫酸マンガン1水和物(1o)
硫酸亜鉛7永和物(1,0)
モリブデン酸ナトリウム2水和物<0.1)硫酸第二銅5水和物(0,2)
塩化コバルト6水和物(0,1)
硫酸第一鉄7永和物(15)
エチレンジアミン四酢酸2ナトリウム(2o)その他の例として、MS無機塩は
以下のように構成れる:
(mg/41り
硝酸アンモニウム(1650)
硝酸カリウム(1900)
塩化カルシウム2水和物(440)
g酸マグネシウム7水和物(370)
硫酸第二銅5水和物(0,025)
硫酸マンガンl水和物(16,9)
硫酸亜鉛7永和物(8,6)
リン酸カリウム(170)
ホウ酸(6,2)
ヨードカリ(0,83)
モリブデン酸ナトリウム2水和物(0,25)塩化コバルト6水和物(0,02
5)
エチレンジアミン四酢酸2ナトリウム(37,3)硫酸第1鉄7水和物(27,
8)
多量成分と微量成分とからなる無機塩の他の組合せも知られるようになり、また
今後発達し、本発明の実施に用いられるものと考えられる。
ビタミンもまた培地に通常加えられる。ビタミンとしては、イノシトール、ニコ
チン酸、ピリドキシン塩酸塩、チアミン塩酸塩らが典型的であり、植物の組織培
養用培地へ、公知の技術により添加される。
炭素源としては、通常、代謝可能な炭化水素からなるものが培地にまた加えられ
る。最も良く使われる炭素源は、二糖頻のシュークロースである。フルクトース
やマルトースを含む他の11類も培地に添加でき、例えば細胞培養の満足な生産
のためには、約5−100g/lである。本発明の培地で最もよく使われる炭素
源はシュークロースであり、濃度は約30g/ 1である。
サイトカイニンのような任意の植物生長調節物質もしばしば植物生長培地中に加
えられるが、その濃度は、植物組織の生長を刺激するのに十分な濃度である。典
型的なものとしては、カイネチン(シグマ社;ヘキスト社)が植物生長調節物質
として使用され、一般的に約0.1−20μhの濃度、通常好適な範囲として約
1−15μNにて使用される。
オーキシンのようなホルモンも不定胚形成中に有用であることが知られており、
本発明の培地にても使われており、例えば2.4−D (2,4−ジクロロフェ
ノキシ酢酸)、ピクロラム(4−アミノ−3,5,6−)ジクロロピコリン酸)
、 DICAMBA(2,6−ジクロロ−0−アニス酸)。
IAA (インドール−3−酢酸)、及びNAA (ナフタレン酢酸)らが、単
独であるいは組合せて、本発明の実施において用いられる。
において培地にて使用されているオーキシンは、ナフタレン酢酸のように通常知
られているものであり、約0.1−500t!Mの濃度、好適には1−50μガ
にて単独であるいは他のオーキシンとの組合せにて使用される。
細胞は、例えばSR培地+50μM 2.4−Dのような誘導培地にて約4日間
培養されることにより、胚形成が促され、その後細胞は再分化培地へ移される。
本発明で使用される胚再分化培地もまたこの分野において一般的によ(知られた
培地であり、上述の無機塩及び他の成分からなるが、通常はオーキシンを含まな
い。または、誘導培地に比べて、ずっと少ない貴のオーキシンを入れることもあ
る。5tuart、 D、及びS。
5tricklandによるアルファルファの細胞培養からの不定胚形成1.再
分化培地へのアミノ酸添加の役割”Somatic Embryogenesi
sFrom Ce1l Cu1tures of Medi−ca o 5at
iva L、1.The Role of Am1no Ac1d Addi
tionsto the Re−generation Medium″Pla
nt Sci、Lett44+165−174 (1984)及び5tuart
、 D、及びS、 5trick−1andによるアルファルファの細胞培養か
らの不定胚形成■、アミノ酸のアンモニアとの相互作用“Somatic Ea
−bryogenesis From Ce1l Cu1tures of h
虹姐肚5ativaL、 II 、The Interaction of A
o+ino Ac1ds with Ammonium″Plant Sci、
Lett、 34.175−18N1984)参照。
さらに、再分化培地には、植物細胞の生育、生長に望ましい有効なその他の物質
、例えば1あるいは複数のアミノ酸を含むこともできる。
アミノ酸はその性質から、通常、いくつかのサブグループに分けられることが知
られている。アミノ酸残基は通常、以下の4のサブグループに分けられるもので
ある:
酸 性−即ち、生理学的PHにおいて、水素イオンが失われ、残基が負の電荷を
もつ。
塩基性−即ち、生理学的pHにおいて、水素イオンと会合して、残基が正の電荷
をもつ。
中性/非極性−即ち、残基は生理学的p−Hで電荷をもたないで、水性溶媒に親
和性がない。
中性/極性−即ち、残基は生理学的pHで電荷をもたないで、水性溶媒に親和性
がある。
勿論、個々の残基分子の統計学的な集合の中で、ある分子は電荷を持ち、あるも
のは持たない。電荷をもつという定義に適合することは、個々の分子のかなりの
割合(少なくとも約25%)が生理学的pHにおいて、電荷をもつということで
ある。
自然界に存在する蛋白構成アミノ酸を前記体系により分類すると以下のようにな
る:
酸 性:アスパラギン酸、グルタミン酸塩基性:アルギニン、ヒスチジン、リジ
ン中性/極性ニゲリシン、セリン、システィン、スレオニン、アスパラギン、グ
ルタミン、チシロン中性/非極性:アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン
、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン
これらの適用に当たっては、光学異性体のL体のアミノ酸残基が、特段の指示が
ないかぎり、意図されている。
本発明のある好適な具体例においては、再分化培地に、中性/非極性アミノ酸の
1あるいは複数を添加することができる。こうしたアミノ酸の例としては、とり
わけ、L−プロリンとL−アラニンが好適である。
植物細胞は、再分化培地中にて約3週間培養され、形成された胚は、通常無菌状
態で固体のコンバージョン培地へ移される。コンバージョン培地は半分のイオン
強度の無機塩、炭水化物とりわけ1.5%(w/v)のマルトースのような炭素
源、及び低濃度オーキシンあるいはオーキシンを含有しない構成からなっている
。不定胚の質は、約30日後に最終的に根とシュートを有する植物を形成する胚
のパーセントを数えることで観察される。
本発明の1つの具体例では、1つの植物種カミ選ばれ、根(幼fl)端と茎頂か
らなり、両端間を導管(雄管)にて結んでいる両極構造を有する不定胚が形成さ
れた。
このような胚は早期発芽のおこる発育段階あるいはその近傍にある。この段階で
、この不定胚はインビトロにおいては発芽し、全植物体を形成することができる
が、しかし、制御されていない環境下、例えば圃場に見られるような環境下では
、これらの胚は、結果として高い頻度では、植物を生産しない。
早期発芽発達段階では、不定胚は、例えば寒天培地、液体サスペンション、湿潤
な環境のような培地中に置かれるが、この培地は、0.001〜1000μ門の
範囲の濃度のABAを、通常は0.01〜100μ門、さらに好適には0.1〜
10μHの濃度にて含有するものである。培地には、また、上述したような栄養
素と炭化水素が含まれており、特定の種の生長と生存力を促進している。通常、
培地は、組織培養物の基本的生長に必要な成分からなっており、例えば、ムラシ
ゲ・スクーグ培地(MS塩と上記列挙物質)、シェンク・ヒルデブランド(SH
塩と上記列挙物質)があげられる。
さらに、ABAは現在、本発明の成熟処理のための好適な具体的物質と考えられ
ているが、一方、ABA活性を有する他の物質がABAの代替物質又は補助物質
として使用されるということもたやすく認められるであろう。例えば、他のAB
A類似物は、以下のものを含むものである:
ファゼイン酸(Phaseic acid、PA)デヒドロファゼイン酸(DP
A)
6−ヒドロシキメチルアブシジン酸(HM−ABA)β−ヒドロキシアプシジン
酸
β−メチルグルタリルアブシジン酸
β−ヒドロキシ−β−メチルグルタリルヒドロキシアブシジン酸
4−デスオキシアブシジン酸
アブシジン酸β−D−グルコースエステル2−2 (2−p−クロロフェニル−
を−エチル)シクロプロパンカルボン酸
これらは、ABA様活性をいくらか有していることが知られており、したがって
、様々な成果の程度に応じて、本発明の実施において使用されうる。Ladym
anらによる新しいアブシジン酸のアナログの生物活性“Thebiologi
cal activity of a no−vel analog of a
bsci−sic acid” Plant Physiol、88.68(1
988)及びWalton。
D、によるアブシジン酸の生化学と生理学“Biochemistryand
physiol−ogy of abscisic acid″Ann、Rev
、PlantPhysiol、31.453−489(1980)参照。従って
、ABAについての成熟処理の記載が文献になされているから、ABA様活性を
示すこのようなABA類似物もABAと等価と認められるであろう。
不定胚は、ABAにて、1日〜1年、通常は5日〜3ケ月、好適には7日〜2ケ
月の間成熟させられる。温度は0−40°C1通常は10−30°C2好適には
15−25°Cで、明暗いずれの状況下でも、好適には暗所で成熟させられる。
ABA成熟後、胚はより固く大きな外観を呈するようになる。もし、温室、圃場
が植付けに通さない状態であれば、さらに胚をABA培地上にて保存することが
できる。
植付けの前に、胚はABA培地から取り除かれ、例えば、寒天培地、液体サスペ
ンション、湿潤な環境のような培地中に置かれ、不定胚のプライミング、前発芽
が促がされる。また、この処理は、ABAを胚の外へ洗い出し、ABAによる阻
害作用のない発芽過程を始めるようにせしめるものである。培地は、SHやMS
のような基本的な培地である。一方、胚の発芽を促進するために、水だけからな
る培地でもよい。
本発明のある具体例では、本発明の成熟処理と同時にあるいは引き続いて行われ
る前発芽処理を含むものである。前発芽処理の1形態においては、根及びシュー
トの生長を抑制するのに十分な濃度の浸透圧試薬溶液が適当な時点で培地に添加
される。例えばマニトールのような典型的な浸透圧試薬を一般的には1〜15%
にて用いて、発根の調節に供することができる。他の公知の前発芽試薬は一価の
塩である。多くの一価の塩が有用であり、例えば、硝酸カリウム(KNOs)は
、0.3−1.0Mの濃度、好ましくは0.4−0.6 Mの濃度にて、発芽を
阻害する。低分子量の有機分子も浸透圧物質(oss+oticum)として役
に立つものである。
本発明の成熟培地の一成分として添加される任意の前発芽試薬として、1又は複
数のジベリレンがあげられる。好適にはGA3 、 GA、又はGA、であるが
、不定胚生産に用いられる植物の種に依る。ジベレリン成分は通常0.01−1
000 u M、より一般的には0.01−500 u M。
好適には0.1−300μHの濃度が添加される。
不定胚は、1時間〜1ケ月、通常は12時間〜1週間、好適には1〜5日の間、
プライム/前発芽させられる。温度は0〜40℃、通常は10〜30℃、好適に
は15〜25℃であり、胚は明暗いずれに置いてもよいが、好適には明所に置か
れる。
本発明により不定胚を調整した後、それらは通常、グロースチャンバー、温室ま
たは直接圃場に植付けられる。1つの好適な具体例としては、この不定胚は温室
又は圃場に植付けられ、半透明の 保湿バリアーでおおわれる。一般的にこれは
、 U、S、 Patent C612+725記載の開示によるが、この文献
から必要な開示箇所がここで取り上げられている。不定胚由来の小植物は、より
調節度合の少ない植付は環境にも耐えられるようになるまで保湿バリアーの下に
維持されることとなる。
本発明の様々な態様を示すために、以下の例示では数種類の植物について行って
いる。AHA及び前発芽の効果は、1種類、即ちアルファルファにのみ限られる
ものと思われたにも拘らず、引き続き、実験に供したすべての植物種に有用な普
遍的効果であることが判明した。その結果として、ABA及び前発芽の効果は示
された実施例にのみ限定すべきものであると解釈するのではなく、植物不定胚誘
導に広く応用できるものである。
!−脹
以下の実施例は、本発明の好適な具体例及び状況を示すために供されるものであ
って、本発明の範囲を何ら限定するものと解釈されるものではない。
以下の実験に関する開示においては、特別の指示がないかぎり、すべての重さは
、グラム(g)、又はミリグラム(■)、すべての濃度はミリモル(+M)又は
マイクロモル(tt 11)、すべての体積はリットル(f)又はミリリットル
(Ml)として示される。
1flA(アルファルファ、厘虹■肚 5ativa)A ル ル
1の ゛告カルスは、25μhのα−ナフタレン酢酸(NAA)及
び10μnのカイネチンを添加したジェンターヒルデブランド培地(SH)に置
床されたアルファルファ葉柄から製造された0次に、カルスは3週°間、硝酸カ
リウムの代わりに20mMクエン酸カリウムおよび25mMグルタミンを添加し
たSR培地にて培養された。
引き続き、カルスは50μHのジクロロフェノキシ酢酸(2,−4−D)及び5
μガのカイネチンを含むSR培地にて3日間培養されることにより、その発達上
の過程の変化がもたらされた。誘導されたカルスは、1oIIIMの硝酸アンモ
ニウム及び30IIIMのプロリンを含むSH培地に移され、24℃にて3週間
培養することで、多くの不定胚を生ずる。5tuart、 D、及びS、5tr
icklandによる”SomaticEmbryogenesis Fro
m Ce1l Cu1tures of 、h」1づ、Ls」1L−9
sativa L、 I 、 The Role of Am
1no Ac1d Additionsto the Regenerat
ion Medium″、 Plant Sci、Lett、、]。
]165−174(1984)、及び5tuart、 D、及びS、5tric
klandによる”Sos+atic Embryogenesis Fros
Ce1l Cu1turesof シ疫江」Ksativa L、 II 、
The Interaction of Am1n。
Ac1ds 51ith A+sw+oniua+″、 Plant Sci、
Lett、、34.175−181(1984)参照。
実施例A、1記載の方法により製造された不定胚を、シュークロースを添加する
ことなく、無菌の環境を維持することを格別行うことなく、真正種子に行うと同
様の過程により、鉢植え用混合±(potting n+ix)に植付けた。
(混合土はと一ト:バーミキュライト:バーライトが10:9:1であり、カル
フォルニアのサンホセMcCalif Growers 5upplies I
nc製)。
胚は、浅い溝に、子葉を上向きにして、鉢植え用混合土で覆うことなく置かれた
。鉢植え用混合土を入れた容器は、透明なプラスチックカバーで少し隙間をあけ
ておおわれ、25°C1蛍光燈照明下(12時間/日)のグロースチャンバーに
おがれた。胚がら形成される小植物の数は植付けられた後6週後に数えられた。
A、3.a、 実施例A、1記載のとおりに製造された不定胚は、4°C1暗
所で1日間貯蔵された。それから選ばれた胚は、ABAを0.1.2.5.5.
7,5.10μh含むSH培地(成熟培地)に置かれ、24°C3暗所で14日
間培養された。
14日後、不定胚はこの培地から取り出され、実施例A、2記載のコンバージョ
ン培地に置かれた。この時点で、ABAによる成熟不定胚は、色と外観でかなり
変化していた。胚は緑から白へと変わり、かさばり、重くなり、丈夫になってい
た。ABA処理を受けたすべての処理により、植付けられた総胚数の36−54
%の範囲で小植物が鉢植え用混合土上に形成された。これらの条件下での最適の
ABA濃度は、1〜7.5μnであった。
ABAに何らさらされなかった胚は、何ら小植物を形成−しなかった。
^、3.b、 実施例A、1記載のとおりに製造された不定胚は、最適の成熟
期間を決定するために、24°C暗所にてさまざまな期間、SH+2.5μM
ABA培地に置かれた。
胚は培地から取り出され、実施例A、2記載のコンバージョン培地に置かれた。
最高のコンバージョン率4〇−44%は、ABAにさらす期間が20−31日の
時に得られた。
最低のコンバージョン率8−14%は、ABAにさらす期間が14日以下の時で
あった。31日以上の成熟期間の場合、コンバージョン率はやや下がり(30−
37%)、20−31日が最適であることが示された。ABAによる処理なしで
は、何の植物も形成されなかった。
A、3.c、 不定胚は、実施例A、1の記載のとおりに製造された。胚は、
フラスコ中の液体SH培地十ABA (5,10,20t、t M)に置かれ、
24°C暗所で20日間ロータリーシェーカーにて振とうした。他の胚は、固体
S)I培地十ABA(5,10,20μM)に24°C1暗所で20日日間−た
。液体培地にて成熟させた胚はいずれの濃度においても、固体培地にて成熟させ
た胚と全く同等の、高い質と外観を呈し、このことは、ABAにさらすことによ
る効果は液体培地中において行われても、固体培地中にて行われても同等の効果
を示すことを示している。
A、3.d、 実施例A、1記戦のとおりに製造された不定胚を、以下の2つ
のインビトロの環境の1つにより成熟させた。即ち、室温におけるSH+5μ?
I ABA処理、又゛4は、4°Cにおける、基本再分化培地にて30日間処理
である。胚はその後、培養処理から取り出され、ある胚は、新鮮及び乾燥重量の
測定に供し、その他の胚は実施側角、2の記載によりコンバージョンさせた。A
BA処理した胚は、新鮮重量において2mg/胚から6g/胚へ、乾燥重量にお
いて0.3■/胚から2■/胚への増加を示した。一方、低温処理した胚は新鮮
重量、乾燥重量いずれにおいても増加を示さなかった。ABA処理した胚は、そ
の平均乾物割合が14%から31%への増加を示したが、低温処理した胚は、何
ら増加を示さなかった。そして、ABA処理した胚は、47%のコンバージョン
率を示し、低温処理した胚は0%のコンバージョン率であった。
A、3.e、 実施例A、1記載のとおりに製造した不定胚を、実施例A、3
.d記載の方法にて、ただし、成熟期間を25日間として成熟させた。胚はでん
ぷん含量分析に供された。(Huber、 S、C,等による大豆及びタバコ葉
中の光合成産物の分配とシュークロースリン酸合成酵素のダイア−ナルリズムに
対する日照時間の効果 “Effectof Photoperiod on
Photosynthate Partitioning andDiurna
l Rhy−thms in 5ucrose Phosphate 5ynt
haseActivity in Leaves of 5oybean (G
l cine max L。
(Merr、))and Tobacco((Nicotiana’ taba
cum L、)”PlantPhysiol、 75.1080−1084(1
984)及びBoehringer Mannheim GMBR5tarch
Biochemical Analysis Catalog No。
207’748(1986)参照)
ABA 4こより成熟した胚では、でんぷん含量が10μg/胚(4μgでんぷ
ん/g新鮮重量)から164μg/胚(22μgでんぷん/g新鮮重量)に増加
したが、低温処理した胚では、でんぷん含量が10μg/胚(4μgでんぷん/
g新鮮重量)から16μg/胚(6gでんぷん/g新鮮重量)に増加するにとど
まった。不定胚は、実施例a、2によりコンバージョンさせた。ABAにより成
熟した胚は83%コンバージョンし、低温処理した胚は5%のコンバージョンで
あった。
A、3.f、 実施例A、1記載のとおりに製造された。不定胚は、SH培地
+5μM ABAにて3−12週間成熟させた。
胚を成熟培地から取り出し、実施例A、2記載のとおりに植物にコンバージョン
させた。コンバージョン率は、成熟期間中変わらず、56−66%であった。
A、4 グロースチャンバーにおしる ・コンバージョン仝互工し」頌復果
A、4.a、 不定胚を、50μMの2.4−Dを100 u Mの2−(2
,4−ジクロロフェノキシ)プロパン酸に取り替えた以外は、実施例A、1記載
のとおりに製造した。胚をSH培地+5μM ABAに、21日間24°Cにて
置いた。胚は、その後様々なレベルのcaz(0,25,50,100,150
μh)を含むS)I培地に移され24°Cにて2日間処理された(前発芽処理)
。
胚は、実施例A、2記載の鉢植え用混合土に植付け、さらに、鉢植え用混合土の
薄層により胚を覆った。この植付は方法は、胚が鉢植え混合土の覆いを通して、
発芽、生育することが求められることから、前記実施例に比べるより苛酷である
。
最高コンバージョン率(19%)は、St(培地+100μhGA3からなる前
発芽処理で得られた。高いレベルあるいは低いレベルのGA、処理をうけた不定
胚も植物にはコンバージョンするものの、 100μM GAI処理をうけたも
のに比べるとそのコンバージョン率は5−10%と低いものであった。前発芽処
理をうけなかった胚は、たとえABA成熟処理をうけたものであっても、全くコ
ンバージョンしなかった。
^、4.b、 実施例A、4.a記載のとおりに製造し、SH培地+5μM
ABAにて21日間処理した不定胚をロータリーシェーカー上にて振とうするか
あるいは振とうさせない液体SH培地+100μM GA、に置(か、または寒
天を含む固体培地に置いた。コンバージョンは、実施例A。
2の記載のとおり行い、その割合は、同様であり、64−78%であった。この
ことは、前発芽処理が液体培地と同様に固体培地においても有効であることを示
している。
A、5. グロースチャンバーにおしるコンバージョンに・ るABAびGA
へ ° 111 の六実施例A、1記載のとおりに不定胚を製造し、SR+
ABA(24日間、24℃、暗所)及びSH培地+100μM GA3 (2日
間、24℃、暗所)へ胚をさらす順序について検討した。胚は、実施例A、2記
載のように鉢植え用混合土にあるいはインビトロにて、シュークロースを含まず
、1.5%マルトース及び25μM GA、含有の0.5倍濃度のSH培地に植
付けた。
インビトロにおけるコンバージョン率は、それらの胚が、ABA処理のみ、GA
3処理のみ、あるいはABA処理に続いてGA3処理のいずれの処理をうけるか
否かに拘らず、すべての胚について同様であった。逆に、胚をグロースチャンバ
ーにおいて、鉢植え用混合土中にてコンバージョンさせた場合には、ABA処理
のみをうけた胚ではコンバージョン率10%、GA、処理のみをうけた胚ではコ
ンバージョン率0%、ABA処理に続いてGA、処理をうけた胚では32%のコ
ンバージョン率であった。このように、ABA及びGAS処理が単独で、あるい
は−緒に行われた場合に、インビトロでは、同じコンバージョン率であったが、
鉢植え用混合土におけるコンバージョンでは、へBA処理に続いたGA3処理の
場合に最高のコンバージョン率を示した。
A、6. グロースチャンバーにお【るコンバージョンに1 る’
(Osmoticaの3A、6.a、 実施例A、1の記載のとおりに製造し
た不定胚を、様々なレベルのABA及び8%マニトールを含有するSR培地に、
24°C1暗所で166日間置た。続いて、実施例A、2記載のとおりにコンバ
ージョンさせた。
ABAを含まないマニトールの単独使用の場合のコンバージョン率は16%に促
進された。しかし、マニトールを含まずに10μiのABAを用いた場合に、鉢
植え用混合土における最高のコンバージョン率32%が得られた。マニトールが
存在する時にはマニトールが存在しない時に比して、コンバージョン率が低いこ
とから、ABAの効果は、ABAによる浸透圧の調整によるものではなく、AB
A自身のもつ生育調節機能によるものであることが示された。
A、6.b、 実施例A、1の記載のとおりに製造した不定胚を、1μm1
ABA及び11%シェークロース、あるいはシュークロースを含まない5μM
ABAを含むSR培地に、24℃、暗所で211日間置た。引き続き、不定胚は
、実施例A、2の記載のとおりにコンバージョンさせた。
AHA単独使用の場合のコンバージョン率が48%であったのに対し、ABAと
共に、シェークロースを使用した場合には4%という低いコンバージョン率であ
った。
シェークロースは、胚成熟において、ABAの代替物として十分ではなかった。
A、7.: にお番 1コンバージヨンに・ る−■がλ法来
実施例A、1の記載のとおりに製造した不定胚を、SR培地+5μM ABAに
、24℃、暗所で211日間置た。胚を培地から取り出し、SH培地+100μ
M GA2ニ、24°C1明所で2−4日間、置いた。胚は、それから、直接、
温室内に、真正種子で通常行なわれる方法にて植付けた。胚は、保湿テント(高
湿度を維持するための給湿機を備えたもの)の中、McCalif混合土にまが
れた。
6週間後、コンバージョン率は64%であった。ABA処理をしなかった胚では
、0−18%のコンバージョン率であった。
A、8.!lにおりる・コンバージョンに・するー残厖λ肱来
実施例A、1の記載のとおりに製造した不定胚をSR培地+5μM ABAに、
24°C1暗所で211日間置た。胚を培地から取り出し、SR培地+100μ
M GAsに、24℃、明所で2−4日間置いた。胚は、それから、直接圃場内
に、真正種子を通常行う方法で植付けた。胚をまいて、覆い無し、又は発泡スチ
ロール製のカップ、白色のプラスチックシート、あるいは布(白色ポリエステル
製、McCalif Growers 5uppliers、Inc、製、カル
フォルニアサンホセ)で覆いをして放置した。6週間後、コンバージョンを測定
した。
コンバージョン率は、直接植付けた場合は3%、カップのもとでは29%、プラ
スチックのもとでは12%、布のもとでは13%であった。ABA処理していな
い胚は、これらのどの状況の場合でも、圃場では、生存しなかった。
実施例B(セロリ−1紅iu+n肛肛並旦旦)LL セロ1−\ ・の制゛告
カルスは、セロリ−の葉柄を25°C1暗所で3週間、7.5μM 2.4−D
及び0.5μHカイネチンが添加されたSH培地に置床することにより得られた
。外植片及びカルスはそれから2.25μM 2.4−D及び0.5μhカイネ
チンを含むSH培地に移され、さらに25℃、暗所で3週間培養された。
カルスは、さらに、1.0μM 2.4−D及び0.5μHカイネチンを含むS
H培地上にて25°C1暗所にして維持された。不定胚は、カルスを、アンモニ
ウムレベルを5ff1Mへ減らし、シュークロースを1%に減らし、8%マニト
ールを添加したSH培地にて、3週間、25°C1螢光燈のもとで培養すること
で形成された。
B、2.七ロツーへ−・のアクフメーション(acclimation)
実施例8.1の記載のとおりに製造された不定胚を1%シュークロース、3%マ
ニトール、5mMアンモニウムを含むSH培地(液体アクリメーション培地)の
入ったフラスコ中に置き、ロータリーシェーカーにのせ、24°Cで4日間振と
う培養させた。このアクリメーション処理により、インビトロにおいてセロリ−
のコンバージョン率はこの処理をうけていない胚に比べ、著しく増大した。
B、3. セロ1−λ8・のコンバージョン実施例8.1記載のとおりに製造
された不定胚を、鉢植え用混合±(potting mix、10:9:1=ビ
ート:バーミキュライト:バーライトの混合比、カルフォルニアサンホセ・Mc
Calif Growers 5upplies Inc製)に、シュークロー
スを添加することなく、無菌環境を特に維持することなく、真正種子に行うと同
様の過程により、植付けた。
胚は、浅い溝に、子葉を上向きにして、鉢植え用混合土で覆うことなく置かれた
。鉢植え用混合土を入れた容器は透明なプラスチックカバーで少し隙間をあけて
おおわれ、25°C,螢光燈照明下(12時間/日)のグロースチャンバーにお
かれた。
胚から形成される小植物の数は、植付けられた後6週間後に数えられた。
B、4. ・の畜 へのコンバージョンに・ るABAのカニ
B、4.a、 実施例8.1記載のとおりに製造した不定胚を実施例8.2記
載のアクリメーション培地にさらし、実施例8.3記載の鉢植え用混合土に植付
けた。何ら植物へのコンバージョンはみられなかった。
B、4.b、 実施例8.1記載のとおりに製造した不定胚を基本再分化培地
が入ったペトリ皿の上にて、4°C1暗所にして、3日間成熟させた。選出した
胚を、1.10又は100μM ABAを含むSH培地中にて、24°C1暗所
にして5日間、置いた。
ついで、不定胚を実施例B、3記載のとおりにコンバージョンさせた。すべての
ABA処理胚が鉢植え用混合上上にて7−40%のυ]合で、植物を形成したが
、最高の植物形成割合を示したのは、胚がSH培地+1μ1ABAにて成熟され
た時であった(最高割合40%)。ABAによる処理をうけなかった不定胚は鉢
植え用混合土中にて、何らコンバージョンしなかった。
B、4.c、 実施例8.1記載のとおりに製造した不定胚を基本再分化培地
が入ったペトリ皿の上にて、4°C1暗所で、3日間成熟させた。それから選出
した胚を、10.20.30.40又は50μM ABAを含むS)l培地中に
て、24”C。
暗所で5日間、置いた。
ついで、不定胚を実施例8.3記載のとおりにコンバージョンさせた。すべての
ABA処理胚が、鉢植え用混合土にて(15−23%の割合で)植物を形成した
が、最高の植物形成割合23%を示したのは、S)l培地+30μHABAにて
、セロリ−不定胚を成熟したときであった。
ABAによる処理をしなかった不定胚は、鉢植え用混合土でコンバージョンしな
かった。
B、5. ・の へのコンバージョンに・するGAのカニ
B、5.a、 実施例B、1記載のとおりに製造した不定胚をSH培地+40
μM ABAに、24°Cで21日間置いた。胚は、その後、様々なレベルのG
A3(0,50,100,150,250μM)を含むSH培地に移し、24°
Cにて2日間培養した(前発芽処理)。
ABA及びGA3処理の後、不定胚は、実施例8.3記載のとおりにコンバージ
ョンさせた。GAffによる前発芽処理をうけなかった胚のコンバージョン率は
8%であった。最高のコンバージョン率(54%)は、SH培地士250μM
GA3を使用した際に得られた。前発芽培地による処理をうけたすべての胚は、
いかなる前発芽処理をもうけなかった胚に比べて、著しく高いコンバージョン率
を示した。
B、5.b、 実施例8.1記載のとおりに製造した不定胚を、St(培地+
40uM ABAに、24°Cで21日間置いた。胚は、その後、様々なレヘ/
L/ )G A z (0,25,5o、100.150、又は200 tt
M)を含むS)l培地に移し、24°Cにて、2日間培養した。
ABA及びGA、処理の後、不定胚は、実施例8.3記載のとおりにコンバージ
ョンさせた。GA3の前発芽処理をうけなかった胚は、5%のコンバージョン率
であった。最高のコンバージョン率(56%)は、GA3を含まないS)l培地
を用いた場合に得られた。その他の、前発芽処理をうけたすべての胚も、いがな
る前発芽処理をもうけなかった胚に比べ て、著しく高いコンバージョン率を示
した。
B、6. コンバージョンに・するマニトールの六実施例B、1記載のとおり
に製造された不定胚を、様々なレベルのマニトール(0,2,4又は6%)を含
むSH培地+30μMABAにて、10日間、24°C1暗所にして置いた。胚
は、その後、Sl+培地にて、24°C1暗所で2日間前発芽させた。続いて、
不定胚は、実施例R,3記載のとおりにコンバージョンした。最高のコンバージ
ョン率52%は、4%マニトールを含むABA培地を使用した場合に得られた。
マニトールを添加していないABA培地にて成熟した胚は32%のコンバージョ
ン率を示した。
実施例Cにニンジン、h匹U匹肛虱紅
C01,ニンジン 1の制゛告
ニンジンの種子を表面殺菌し、MS培養液中に、25°C1暗所で、100日間
置た。葉柄を切り取り、1 pp+nの2.4−Dを含む、Lin & 5ta
ba培地(LS) (Fujimura、T及びA、Komao+insによる
”Effects of Various GrowthRegulator
s on the Embryogenesis in Carrot Ce
1lSuspension Cu1ture”+ Plant 5cience
Lett、 5 + 359−364(1975))で、25℃、暗所で、
1ケ月間液体静置培養した。
細胞群をふるいにかけ、300uI11以下のサイズの分画を、0.1ppa+
の2,4−Dを含む液体LS培地で、25°C1暗所で、1ケ月間ロータリーシ
ェーカー上80rpmの速度にて、培養した。300 u M以下の細胞を再び
集め、0.1pp−の2.4−Dを含む液体LS培地中で、2週間、懸濁培養し
た。
73μl’l〜37μHの細胞を集め、LS培地にて5回洗浄した。細胞を60
0rp−にて10分間遠心分離し、0.2ppmのゼアチン(ZEATIN)及
び0.2ppmのABAを含有するLS培地に置き、80rp+nにて、25°
Cで1ケ月間振とう培養した。3−4鵬長の胚を採取した。
C92,ニンジン1 ・のコンバージョン実施例C,1記載のとおりに製造され
た不定胚は、鉢植え用混合±(ビート、バーミキュライト、パーライトが5:2
:1の比、カリフォルニアサンホセ、!1cCalif Growers 5u
pplies Inc、製)に、シュークロースを添加することなく、無菌環境
を特に維持することなしに、真正種子に行うと同様の過程により、植付けた。
胚は、浅い溝に、子葉を上向きにして、鉢植え用混合土で覆うことなく置かれた
。鉢植え用混合土を入れた容器は透明なプラスチックカバーで隙間をあけておお
われ、25℃、螢光燈照明下(12時間/日)のグロースチャンバーにおかれた
。胚から形成される小植物の数は、植付けられた後6週間後に数えられた。
C03,グロースチャンバーにおしる ・のコンバージョンに・ るABAの六
C,3,a、 実施例C,1に記載されたとおりに製造された不定胚は、4°
C1暗所で、8日間成熟させられた。それから選ばれた胚は、1又は10μHの
ABAを含むSR培地中に、24゛C1暗所で7日間置かれた。これらの胚及び
ABAによる成熟処理をうけていない胚を実施例C,2記載のとおり、鉢植え用
混合土に植付けた。
鉢植え用混合土における最高の小植物へのコンバージョン率である26.7%は
、SH培地+1μM ABAによるABA処理の場合であった。 ABA処理を
うけなかった胚のコンバージョン率は3.3%であり、これはかなり低い値であ
った。ABAは、従って、鉢植え用混合土における不定胚のコンバージョンを増
大させるのに決定的なものであった。
本発明の実施にあたり、ここで開示された材料及び方法に対する様々な代替手段
が利用されるものと理解すべきである。本特許請求範囲は本発明を定義し、これ
らの特許請求の囲の範囲内の材料及び方法、及びそ国際調査報告
PCT/USk49102562
Claims (20)
- 1.(a)外植体材料を、無機塩、ビタミン、少なくとも1種類の炭素源、及び 少くとも1種類のオーキシンからなり、それぞれの成分は、カルス形成に十分な 量である誘導培地と接触するように置くことにより、外植体材料からカルスを製 造し、(b)カルスを、無機塩、ビタミン、少くとも1種類の炭素源、及び少く とも1種類のオーキシンからなり、それぞれの成分は、カルス増殖に十分な量で ある増殖培地と所望の組織量が製造されるに十分な時間、接触するように置くこ とにより、カルスを培養し、 (c)増殖したカルスを、無機塩、ビタミン、及び少くとも1種類の炭素源から なり、それぞれの成分は胚形成に十分な量である培地と所望の数の胚が製造され るに十分な時間、接触させることにより、このカルスから不定胚を再分化させ、 そして(d)この再分化不定胚を、組織の活性を維持するために必要な無機塩、 ビタミン及び栄養素と胚から植物へのコンバージョン(conversion) の割合を高めるために十分な量のアプシジン酸とからなる成熟培地と、不定胚を 成熟させるのに十分な時間と条件で、接触させることにより、不定胚を成熟させ る、 ことを有してなる植物の不定胚形成方法。
- 2.成熟培地が、0.001〜1000μMの範囲の濃度のアプシジン酸を含む ものである請求の範囲第1項の方法。
- 3.アプシジン酸の濃度範囲が0.01〜100μMである請求の範囲第2項の 方法。
- 4.アプシジン酸の濃度範囲が0.1〜10μMである請求の範囲第2項の方法 。
- 5.成熟培地が固体培地である請求の範囲第1項の方法。
- 6.成熟培地が液体培地である請求の範囲第1項の方法。
- 7.成熟培地の温度が0−40℃の範囲内で維持されている請求の範囲第1項の 方法。
- 8.成熟培地の温度が10−30℃の範囲内で維持されている請求の範囲第7項 の方法。
- 9.成熟培地の温度が15−25℃の範囲内で維持されている請求の範囲第8項 の方法。
- 10.さらに、 (e)成熟した不定胚を組織の活性を維持するために必要な無機塩、ビタミン、 栄養素と、胚から植物へのコンバージョンの割合を高めるために十分な量の少な くとも1種類の前発芽試薬とからなる前発芽培地と、この不定胚が前発芽するた めに十分な時間と条件のもとで同時にあるいは引き続き接触させることにより、 不定胚を前発芽させる、ことを有してなる請求の範囲第1項の方法。
- 11.試薬が、ジベレリン酸からなるグループから選択された、少なくとも1種 類を含んでなる請求の範囲第10項の方法。
- 12.ジベレリン酸がGA3、GA4及びGA7からなるグループから選択され た、少なくとも1種類からなる請求の範囲第11項の方法。
- 13.ジベレリン酸が、前発芽培地において、約0.001〜1000μMの範 囲の濃度にて存在する請求の範囲第12項の方法。
- 14.ジベレリン酸が、前発芽培地において、約0.01〜500μMの範囲の 濃度にて存在する請求の範囲第12項の方法。
- 15.ジベレリン酸が、前発芽培地において、約0.1〜300μMの範囲の濃 度にて存在する請求の範囲第12項の方法。
- 16.試薬が、一価の塩、シュークロース、マニトール及びポリエチレングリコ ールからなるグループから選択された、少なくとも1種類を含んでなる請求の範 囲第10項の方法。
- 17.試薬が、前発芽培地において、約1〜15%の範囲の濃度であるマニトー ルを含んでなる請求の範囲第16項の方法
- 18.(a)外植体材料からカルスを誘導し、(b)さらに、所望のカルス組織 量を形成するために増殖させ、そして(c)不定胚を形成するために誘導、再分 化させることからなるカルス組織から植物を再分化させる方法において、 (d)再分化した不定胚を、組織の活性を維持するために必要な無機塩、ビタミ ン及び栄養素と、胚から植物への、コンバージョンの割合を高めるために十分な 量のアプシジン酸とからなる成熟培地と、この不定胚を成熟させるのに十分な時 間と条件で、接触させることにより再分化した不定胚を成熟させる、 ことを有してなる改良方法。
- 19.さらに、 (d1)成熟した不定胚を、組織の活性を維持するために必要な無機塩、ビタミ ン、栄養素と、胚から植物へのコンバージョンの割合を高めるために十分な量の 少なくとも1種類の前発芽試薬とからなる前発芽培地と、この胚が前発芽するた めに十分な時間と条件のもとで、同時にあるいは引き続き接触させることにより 成熟した不定胚を前発芽させる、 ことを有してなる請求の範囲第18項の方法。
- 20.さらに(e)からなる請求項18記載の方法。 (e)葉、二次根または伸長した茎頂をもたない成熟した不定胚を、無菌性が維 持されることもなく、炭素源が加えられていない環境に、少なくともこの胚の2 5%が植物にまで生育するに十分な時間及び環境にて、植付ける、 ことを有してなる請求の範囲第18項の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US20661188A | 1988-06-14 | 1988-06-14 | |
US206,611 | 1988-06-14 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH02504589A true JPH02504589A (ja) | 1990-12-27 |
Family
ID=22767148
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP50713589A Pending JPH02504589A (ja) | 1988-06-14 | 1989-06-13 | 自然環境下に植えるための不定胚の成熟方法 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH02504589A (ja) |
AU (1) | AU3842589A (ja) |
WO (1) | WO1990000002A1 (ja) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5183757A (en) * | 1989-08-01 | 1993-02-02 | British Columbia Research Corporation | Process for the production, desiccation and germination of conifer somatic embryos |
WO1993011660A2 (en) | 1991-12-19 | 1993-06-24 | University Of Saskatchewan | Maturation, desiccation and encapsulation of gymnosperm somatic embryos |
US6340594B1 (en) | 1991-12-19 | 2002-01-22 | Cellfor, Inc. | Production of desiccation-tolerant gymnosperm embryos |
US5334530A (en) * | 1992-03-10 | 1994-08-02 | Woods Susan H | Method and media for the somatic embryogenesis and regeneration of bamboo |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NL8101680A (nl) * | 1981-04-03 | 1982-11-01 | Royal Sluis Koninkl Zaaizaadbe | Werkwijze voor het in verzaaibare en gedurende enige tijd houdbare vorm brengen van voorgekiemd zaad. |
US4615141A (en) * | 1984-08-14 | 1986-10-07 | Purdue Research Foundation | Process for encapsulating asexual plant embryos |
-
1989
- 1989-06-13 AU AU38425/89A patent/AU3842589A/en not_active Abandoned
- 1989-06-13 JP JP50713589A patent/JPH02504589A/ja active Pending
- 1989-06-13 WO PCT/US1989/002562 patent/WO1990000002A1/en unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO1990000002A1 (en) | 1990-01-11 |
AU3842589A (en) | 1990-01-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
George et al. | Plant propagation by tissue culture: volume 1. the background | |
US6444467B1 (en) | Process for production and subsequent ex vitro sowing and propagation of pre-germinated plant somatic embryos | |
Onay | In Vitro organogenesis and embryogenesis of pistachio, Pistacia vera L. | |
Bapat et al. | Bioencapsulation of somatic embryos in woody plants | |
Solangi et al. | Optimizing tissue culture protocol for in vitro shoot and root development and acclimatization of date palm (Phoenix dactylifera L.) plantlets | |
Atak et al. | Micropropagation of Anthurium spp | |
Badrelden | Establishment of in Direct Propagation of Mandarin (Citrus reticulata L) using tissue culture | |
JPH02504589A (ja) | 自然環境下に植えるための不定胚の成熟方法 | |
Şaşkın et al. | The usage of node culture in vitro conditions | |
Gomes et al. | Micropropagation of selected trees of Arbutus unedo L. through axillary shoot proliferation and somatic embryogenesis | |
Johnson et al. | In vitro propagation of Blandfordia grandiflora (Liliaceae) | |
Karim | An overview of oil palm cultivation via tissue culture | |
Webb et al. | Eastern white pine (Pinus strobus L.) | |
Kant et al. | Micropropagation of orchids through leaf culture | |
Thiha | Effects of Explants and Growth Regulators on In Vitro Regeneration of Dragon Fruit (Hylocereus undatus Haworth) | |
Shatnawi et al. | Tissue culture and salt stress in Chrysanthemum morifolium | |
Elaziem et al. | In Vitro Propagation of Date Palm (Phoenix Dactylifera L.)“Lakramat” Date Palms in Aswan Governorate | |
Sunian | Development of sterilisation procedures and in vitro studies of Nymphaea lotus | |
Ahmad | Vegetative propagation of Acacia mangium Wild. by stem cuttings and tissue culture techniques | |
RU2333633C2 (ru) | Способ получения высоких урожаев зиготоподобных семядольных зародышей сосны с использованием сред, содержащих дисахарид и глюкозу (варианты) | |
Chen | Development of A Liquid Micropropagation System for Asparagus officinalis L. | |
SU1761057A1 (ru) | Способ микроклонального размножени ели обыкновенной ин витро | |
Sreedevi et al. | SELECTION AND IN VITRO MULTIPLICATION OF HIGH YIELDING CLONES OF PLECTRANTHUS BARBATUS [SYN.: COLEUS FORSKOHLII (WILLD.) BRIQ.] | |
McKellar | Micropropagation and in vitro studies of Pinus patula Scheide et Deppe. | |
Habib | Microtuberization and dormancy breaking in potato (Solanum tuberosum L.) |