JPH02502066A - ブリオスタチンによる幹細胞増殖の促進 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ブリオスタチンによる幹細胞増殖の促進Ｂｊレム区！」」Ｌ 本発明は造血細胞の増殖および活性化に促進効果を持つ化学薬品に関する。特に 、本発明は造血細胞の増殖および活性化を促進するためのブリオスタチンの使用 に関する。

発明の背景 ブリオスタチンは大環状ラクトンの系列でおり、海産テンの供給源でｂっだ。そ の他のものは海産動物エニ２１　コンボルタ（Ａ毒αＩｉａ　ｃｏｎｆｏＬｓｔ ａ）　（これもコケムシ門の一員でおる〕から単離された。

全てのブリオスタチンはプリオピラン環系から誘導さてが単一のマウス白血病細 胞株、Ｐ３８Ｂリンパ琢白血病系統に対して抗新生物性活性を持つと報告されて いる。

ブリオスタチンは試験管内でＰ３８８細胞増殖を実質的に阻害し、また？３８ｇ ！Ｊンパ球白血病細胞を注射されたマウスの寿命を延ばすことが可能でちる。ブ リオスタチン１−８はＰｇｔｔｉｔにより米国特許第４．５６０，７７４号およ び第４，６１１，０６６号に記載されている。

造血細胞の欠乏により生じる多くの健康状態がちる。

例えば、しばしば抗新生物薬剤での癌の治療において問題が生じる：これらの薬 剤は正常骨髄前駆細胞（幹細胞）に阻害効果を持つてもよい。さらＫ、後天性免 疫不全症候群（ＡＩＤｓ）のどとく好中球減少症により生じる多（の病気がある 。

また先天性貧血および７アンコニ貧血のごと（、赤芽球細胞が正常活性を保持す るには不十分でちる多（の状態がおる。慢性関節リウマチおよびエリテマトーデ スのごとき疾患ではしばしば血球細胞のある種の集団を抑制する。それ故、この 分野においては投与して安全で造血細胞の種々の型の発生を促進する薬剤に対す る引き続いた要求が存在する。

ｘｊｌす１１ 本発明の目的は試験管内で幹細胞を刺激して増殖および分化させ、顆粒球、マク ロ７アージまたは赤血球を形成させる方法を提供することにある。

本発明の別の目的は哺乳類において幹細胞の増殖および分化を促進する方法を提 供することにらる。

本発明のさらなる目的は腫瘍を持っ哺乳類において幹細胞の増殖および分化を促 進する方法を提供することにある。

本発明の別の目的は試験管内で好中球および例えばＴリンパ球およびマクロファ ージのごとき他の免疫調節細胞を活性化する方法を提供することＫもある。

本発明のさらに別の目的は哺乳類において好中球Ｓよび他の免疫調節細胞を活性 化する方法を提供することにもめる。

本発明のこれらおよび他の目的は以下に詳細に記載される。一つの実施態様にお いては幹細胞を刺激して顆粒球、マクロファージまたは赤血球を生成する方法が 提供され：幹ｍ胞を含む細胞調製試料を得、試験管内で細胞調製試料を顆粒球、 マクロファージまたは赤血球の形成を促進するのに有効量のアシル化されたＣ２ ０炭素を持つブリオスタチンとインキュベートシ、それにより前記の生成が促進 されることを特徴とする。

さらに別の本発明の実施態様においては、哺乳類において幹細胞を刺激して顆粒 球、好酸琢、好塩基球、血小板、マクロファージまたは赤血球を生成する方法が 提供され：ｌＩｉ！乳類九顆粒球、好＊ｇ、好塩基球、血小板、マクロファージ または赤血球の生成を促進するのに有効な霊のアシル化されたＣ２０炭素を待つ ブリオスタチンを投与し、それにより前記の生成が促進されることを特徴とする 。

本発明の更に他の実施態様においては、好中球および他の免疫調節細胞を活性化 する方法が提供され：好中球または他の免疫調節細胞調製試料を得、試験管内で 細胞調製試料を、好中球および他の免疫調節細胞の細胞毒性を活性化するのに有 効な量のアシル化されたｃ２ｏｓ素を待つブリオスタチンとインキュベートシ、 それにより前記細胞毒性が活性化されることを特徴とする。

本発明の他の実施態様においては、哺乳類における好中球および他の免疫調節細 胞を活性化する方法が提供され：好中球および他の免疫調節細胞を活性化するた めアシル化されたＣ２０戻累を持つブリオスタチンを哺乳類に投与し、それによ り前記細胞毒性が活性化されることを特徴とする。

本発明の方法は低水準の毒性を示す分子による幹細胞増殖の促進の手段を提供す る。３７の炭素の大環式ラクトン構造に基づいているブリオスタチン分子はある 種の目的のためには天然に存在するコロニー刺激因子に代わり５る。しかしなが ら、他の点ではブリオスタチンの活性は天然に存在するコロニー刺激因子の活性 と異っているように思われる。すなわち、ブリオスタチンは新生物性細胞の増殖 を促進することなく幹細胞分化を促進するが、コロニー刺激因子はそうはしない 。

図の簡単な説明 ■ｌはブリオスタチンの化学構造を表わしている。パネルＡ：ブリオスタテンｌ ；パネルＢ：ブリオスタテ／９：パネルＣ：ブリオスタテン８；パネルＤ：ブリ オスタテン３；パネルＥ：ブリオスタチン１３゜図２は試験管内における顆粒球 −マクロファージコロニー増殖に対するブリオスタチンの効果を示している。

図３は移植されたクローンの増殖に対するブリオスタチン１の効果を示している 。最初クローンをブリオスタチンｌの存在下増殖させ、その後各々ブリオスタチ ン１、組換え体と）Ｇ＃−Ｃ５Ｆを含む培地または培地単独のものへ移植する。

■４はヒト赤芽球前駆細胞の増殖に対するブリオスタチン１の効果を示している 。

図５はブリオスタチン１および１３、同様に組換え体ヒトＧＭ−Ｃ５Ｆおよびフ ォルポル１２−ミリステートエ３−アセテート（ＴＰＡ）と共にインキュベート した好中球による化学発光の発生を示している。

詳細な説明 本発明者は、らる徨のブリオスタチンが造血に影響を与えることができることを 発見している。ブリオスタチンにより刺激されたコロニーの形態的分析によると 、低密度、粘着欠損、正常ヒト骨髄細胞から主として顆粒球−マクロファージが 混合したコロニーおよび純粋な顆粒球コロニーが形成された。

とにより得ることができる。抽出？よびＷＩ製技術の記載−５３１，１９８３年 に見ることができる。これらの化合物の５ちのいくつかはまた米国特許第４，５ ６０，７７４号および米国特許第４．６１１，０６６号に記載されている。

一般的に、ブリオスタチンは溶媒抽出、分配クロマトグラフィー、シリカゲルク ロマトグラフィー、フレイブ装置中での液体−液体分配、レジン上での吸着およ び溶媒からの再結晶により単離およびＷＩ製できる。単離および精製法は各々の 工程で試験管内または生体内での抗腫瘍試験または、好中球の活性化または幹細 胞からの顆粒球、マクロファージまたは赤血球の生成の促進をみることによりモ ニターできる。

すべてのブリオスタチンが同じ量の活性を持っているわけではない。例えば、顆 粒球−マクロファージコロニー増殖検定においては、ブリオスタチン１は３より 強い活性を持ち、３は８より強い活性を待って２つ、８は９より強い活性を持り ℃いた。ブリオスタチン１３は本検足では完全に不活性であった。ブリオスタチ ンの構造−活性相関を調べると、その結果は好中球の機能活性化同様に造血コロ ニー刺激活性の両方とも炭素２０（図１参照）のアシル化に依存しているらしい 事を示唆している。

すなわち、ブリオスタチン１の炭素２０が短鎖の飽和酪醗で置換されると、得ら れるブリオスタチン９は顆粒球−マクロファージコロニー形成単位（ＧＭ−ＣＦ Ｕ）（ｒ）より弱い刺激剤である。この活性の減少はブリオスタチン８のごと（ 炭素７上により長いアシル基を含む置換をする事により回復される。しかしなが ら、ブリオスタチン１３のとと（炭素２０上のアシル置換基を完全に除去した場 合、コロニー刺激活性および好中球活性化能の両者とも失われる。さらに、ブリ オスタチン１とブリオスタテ７１３を混合した場合、ブリオスタチン１単独によ り得られると予想される程度の顆粒法−マクロファージコロニー形成が観察され たので活性の減少はブリオスタチン１３の毒性効果から生じるものではない。こ こで報告されている造血刺激活性において不活性であるブリオスタチン１３は他 の者により強力な抗新生物活性を保持しブリオスタチン１，３．８および９（図 １参照）は顆粒球およびマクロファージコロニー形成単位（ＣＦＵ−ＧＭ）の用 量依存性促進を媒介することが観察されている。最大有効濃度は約１と１００　 ｎＭの間である。ブリオスタチン１および８は試験された４つの活性同族体の５ ち最も強力でおった。それらは０．０１　ｎＨのような低い濃度でコロニー刺激 活性を示す。ブリオスタチン３はブリオスタチンｌおよび８はど強力ではないが 約１０と１０　Ｏｎ−Ｖの間に最大応答を持っている。ブリオスタチン９は正常 コロニー増殖のより弱い促進剤であり、ブリオスタチン１３は完全に不活性でら る。すなわちブリオスタテ／活性の体系は、ブリオスタチン１が最も活性であり 、ブリオスタチン３．８および９の順に活性が弱くなり、ブリオスタチン１３は 完全に不活性である。

幹細胞を含む細胞調製試料は骨髄または末梢血細胞から得ることができる。これ らは密度勾配遠心分離のごときこの分野で既知の技術を用いて精製でき赤血球細 胞が除去される。もしくは、幹細胞抗原に特異的な抗体を用イムノミジー　１３ ３巻、ｐ１５９．１９８４年を参照されたい）。

造血促進または好中球および他の免疫調節細胞活性化に有効なブリオスタチンの 量はこの分野で知られている任意の検定を用いて決定できる。例えば初期および 後期」二４４巻、ｐ５１７ｅ１９７４年）凝固血漿法を用いて数え上げることが できる。そのような赤血球前駆細胞の刺激にはエリスロボイエデンの存在を必要 とする。ブリオスタチンｌに対する、赤血球の最適促進は約１０−１１Ｍから約 ｌＯ″″１０Ｍで見られた。

顆粒球Ｓよびマクロファージコロニー形成のためのブリオスタチンの有効濃度を 決定するため、低密度、粘着欠損ヒト骨髄細胞が入手できるであろ５゜Ｐｉｋｇ らＫより（ジャーナル・オブ・セル・フィジオロジー、７６巻。

ｐｐ　７７−８３．１９７０年）記載されているごとく、細胞は０．３チ寒天を 含む補充マツコイ５Ａ培地のごとき適した培地中に懸濁でき、３５絽ペトリ皿４ Ｃ［ｉされる。

試験の結果有効であると見い出されたブリオスタチン（即ちｌ、３．８および９ ）に対して、最大促進濃度は約１０−’ＭとｌＯ″″１０　Ｍの間である。

好中球活性化のためのブリオスタテ７の有効量を決定するため、正常ヒト末梢血 好中球がフィコール勾配のごとき密度勾配により精製され５る。Ｔ−リンパ琢お よびマクロファージのごとき他の免疫調節細胞は既知の常法により単離されうる 。好中球はカルクラムおよびマグネシウムを補充したダルベツコのりン阪塩−緩 衝化塩溶液に懸濁され５る。好中球活性化をモニターする一つの方法は化学発光 を観察することである。好中球をブリオスタチンと約１５分間インキュベートし ５る。その後ルミノール（５−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジン ジオン）を約１０μＭの濃度で添加し５る。化学１９７６年）発光計量器中で測 定されうる。

もしくは好中球活性化は細胞毒性検定を用いて検定され５る。ＷＩ製さｎた好中 球は種々の濃度のブリオスタチンと１当り約３Ｘ１０’細胞の密度でインキュベ ートし５る。細胞を洗浄し、放射性標識された標的細胞を添加しうる。Ｋ５６２ 腫瘍細胞および５１Ｃデー標識が細胞毒性の測定に使用され５る。標的細胞は放 射性標識物質と前もってインキュベートして放射標識の取り込みを引き起こさせ る。標的細胞は好中球と種々のニフエクタ一対標的細胞比で（約５０：ｌから５ ：１の間）混合され５る。

標的細胞からの標識の放出は遠心分離後の上澄み液かまたは細胞を検定すること により測定されうる。もちろん、免疫調節細胞毒性の他の検定を使用するよ５な 、この分野で知られている他の方法も使用され５る。ブリオスタチン１は好中球 に対して第１０″″１０から１０−’Ｍで活性を持ち、Ｋ５６２標的細胞の好中 球細胞毒性の最大活性化効果は約１０−’Ｈの濃度であった。

細胞または哺乳類を処置するのにブリオスタチンおよび化学療法剤または電離放 射線を付随させるのが都合が良いであろう。例えば、造血前駆細胞の生存および 増殖を維持する一方、全ての悪性腫瘍細胞の細胞懸濁物を一掃するのが望ましい でらろ５゜この事は、アドリアマイシン、シトシンアラピノシト、ビンクリスチ ン、フクロホスファミド、ブサルファン、プレドニソンおよび、Ｖ−ＡＭＳＡの ごときこの分野では既知の化学薬剤を使用することにより達成される。パージは 腫瘍特異性抗体によっても達成され５る。多（のそのような抗体がこの分野では 仰られている。もしくは、化学療法剤または抗−腫瘍性抗体を、ブリオスタチン を受け取っている哺乳類に直接投与してもよい。ブリオスタチンは化学療法剤ま たは抗体の抗新生物性活性を促進させるでろろう。もしくは、ブリオスタチンを 用（・ると、造血に対する有害効果が減少するためより多（の抗新生物性薬剤の 使用が許容されるであろう。

ブリオスタチンは多（の型の疾患の影響を中和するのに使用されるでらろ５゜例 えば、赤芽球細胞集団が少い貧血はしばしば輸血を必要とする。赤芽球細胞形成 を促進するためにブリオスタチンを使用すると輸血の必要をなくすことができる 。そのよ５な貧血としては、慢性疾患貧血、先天性貧血、後天性再生不能貧血、 後天性または先天性汎血球減少症およびファンコニ貧血が含まれる。

同様に、長期間の化学療法後またはその間に、ＬＪ’ｌ’Ｌば造血細胞が消耗さ れる。すなわち、ブリオスタチンはそのよ５な細胞集団を維持するために働（こ とができる。

さらに、免疫抑制薬かまたは免疫抑制疾患のため免疫系が危険にさらされている 患者においては、感染と戦っため患者の白血球を刺激するのにブリオスタチンが 使用できる（好中球の活性化による）。ブリオスタチンが部会長（使用できるそ の他の状況は、ヒトおよび他の哺乳類の集団が核兵器からの、または原子力発電 所から環境漏出した放射線に身をさらさｎたよ５な状況である。これらの場合に おいて、ブリオスタチンの投与は造血細胞への放射線の有害な、およびしばしば 致命的な影響から救うことができる。

ブリオスタチンはこの分野の既知の任意の手段により投与できる。ブリオスタチ ンの目的の標的は主として骨髄および血液系に存在するので、ブリオスタチンが これらの組織へ到達できるのを可能にする投与方法が望ましい。ブリオスタチン は注射、急速注入、上咽頭吸着皮膚吸着による非経口でまたは経口で投与できる 。ブリオスタチン投与の一つの好適な方法は連続的注入である。例えば浸透性マ イクロポンプを皮下に差し込むとブリオスタチンが１日以上にわたって注入され ５る。造血細胞の刺激には一般的に１日、体重キログラム当り１０から１０００ μ２の間に望ましい。

以下の実施例は前記の発明の例示にすぎず本発明を制限するものではない。本発 明は以下に付随する特許請求の範囲により特定的に定義される。

本冥尻例は顆粒琢−マクロ７アージコロニー形成に及ぼすブリオスタチンの促進 効果を示し℃いる。顆粒球−マクロファージコロニーｆｆＨＲ単位ｃｃＦＵ−Ｇ Ｍ）コロニーは低密度粘着欠損正常ヒト骨髄細胞から計数される。

Ｐｉｋ−うにより記載されたごと（（ジャーナル・オブ・セル命フイジオロジー 、７６巻、ｐｐ７７−８３゜１９７０年）、細胞を０．３％寒天を含む補充マツ コイ５Ａ培地に懸濁し、３５ＩＥｍのペトリ皿Ｋｌ！布する。結果を図２に示し た。骨髄細胞を５　Ｏｎ？／ｗＬｔのデ五ＧＭ　−Ｃ５Ｆ（ジエネテイツクスイ ンステイテユート）または示されている濃度のブリオスタチン１（・）、ブリオ スタテ／３　（０）、ブリオスタチン８（◇）、ブリオスタチン９（＋）または ブリオスタチン１３（ム）とインキュベートした後コロニーを計数する。７．５ ％ＣＯ２を含む給温した大気中、３７℃で１４日培養した後、細胞数が５０と等 しいかまたはより大きなコロニーの数を記録する。い（つかの実験の５ちの１つ からの代表的結果が４つ処分けた同じ試料からの平均コロニー数として報告され ている。ＳＥＮは平均値の１０％以内であった。

ブリオスタチン１．３．８および９は１から１００研の間の最大有効濃度でＣＦ Ｕ−ＧＭ　の用量依存性促進を開始するのが観察された。試験された４つの活性 同族体のうち最も強力であるブリオスタチン１および８においては０．０１７Ｌ ＩＶの低い濃度でコロニー促進活性が観察された。一方、高濃度では（即ち、１ ０−１００　？ＬＪ／）、顆粒球−マクロファージコロニ一応答の程度はブリオ スタチン３に対しても同じであったが、この薬剤はブリオスタチン１および８よ りも明らかに効力は下である。ブリオスタチン９は正常コロニー増殖のほんの弱 い促進剤でおり、他方ブリオスタチン１３は完全に不活性でおった。

コロニー形態学の分析はデｈＧＭ−Ｃ５Ｆ同様ブリオスタチン１は７および１４ 日間の培養で主として混合顆粒球−マクロファージおよび純粋顆粒球コロニーを 刺激したことが明らかとなった。

実施例２゜ この実施例はブリオスタチンがその効果を直接的に細胞に及ぼすことを示すもの である。

検定はＭａｔｃａＥｆｂによるブラッド、６７巻、ｐｐ３７−４５．１９８６年 、に記載されているとと（して事冥上笑施された。簡単に記すと、正常ヒト骨髄 の培養細胞を１０　ｎＨのブリオスタチン１を含む培地中で開始する。

４日増殖させた後、取囲んでいる細胞の夾雑を避けるためガラスピペットを用い て４−８ケの細胞のクローンを注意深（除き、Ｃ５Ｆ源としテｒｋ　ＧＭ−Ｃ５ Ｆ　（５０ｎｌ／ａ）かまたはブリオスタチン１（１０ｔＬＪＯを含む第２のプ レートへ移す。さらにｌＯ日日間培養の後、増殖して４０細胞またはそれ以上の コロニーを形成したコロニー数を決定する。Ｃ５Ｆが添加されていないプレート へ移されたコロニーではさらなる増殖は観察されなかった（図３参照）。

各々の記号（・）はコロニーを表わす。各々のカラムにおけるその高さはそのコ ロニー内の細胞数に比例している。カラム中、項Ｇのすぐ上のデータは全部顆粒 球から成っているコロニーを表わしている。カラム中、項ＧＭの上のデータは顆 粒球および単球細胞の両方から成っているコロニーを表わしている。マクロ７ア ー込単琢細胞のみから放るコロニーは２次プレートにおいては検出されなかった 。各々のカラムの一番上の分数の分子は２次プレート上で発生したコロニーの数 を表わしており、分母は移されたコロニーの総数を表わしている。ブリオスタチ ンで始められた１次プレートからのクローンはブリオスタチンまたはｒｋ　ＧＭ 　−ＣＳ　Ｆが加えられている２次プレート上でのみ十分な大きさのコロニーを 産生した。

このことはブリオスタチンおよびデｈＧＭ−Ｃ５Ｆの刺激効果は直接的に働（こ とを示唆している。

さらに、ブリオスタチン存在下の骨髄細胞からならし培地を製造する試みは失敗 でらった。前駆細胞に加えて補助的紙、抱の混合物から成る非粘着欠損ヒト骨髄 細胞を最大刺激濃度のブリオスタチン（即ち１−１０？ＬＭ）を含む培養培地中 ５日間インキュベートする。上澄み液を吸引し、ブリオスタチンを除去するため セファデックスＧ−２５濾過カラムを通過させることによる分画化後（即ち、Ｍ ｙ、８８４）ＧＭ−Ｃ５Ｆの存在を試験する。得られる空隙容量（大きな分子量 のポリペプチド増殖因子を含む〕のＣ５Ｆ活性を評価する。培養プレート中１０ ％および５０チ（容量／容量）の最終濃度でこの上澄み液を試験したがＧＭ−Ｃ ＦＵ　増殖を促進しなかった。

この実施例はヒト赤血球前駆細胞に対するブリオスタチン１の刺激効果を示して いる。

凝固血漿法および至適濃度のエリスロポイエデンを用い、ＭａＬａｏｄらによる ＬｉＬ、４４巻、ｐ５１７（１９７４）に記載されているとと（して初期（ＢＦ Ｕ−Ｅ）および後期（ＣＦＵ−Ｅ）前駆細胞のための検定が計数された。ブリオ スタチン１は凝固血漿中初期ＢＦＵ−Ｅおよび後期ＣＦＵ−Ｅヒト赤芽球前駆細 胞両方の増殖を促進した。図４を参照されたい。最大促進濃度は１から１０ｐＭ の間でちり、約１ｎＭ以上の濃度で阻害効果が認められた。

３−男一匹一丸 この実施例はルミノール存在下、ブリオスタチン１は好中耘よる化学発光を起こ させるが１３は起こさせないことを示している。さらに、ブリオスタチンＩＫよ り好中球が活性化され、Ｋ５６２標的細胞を殺すことが示される。

正常ヒト末梢血好中球を二重フィコール密度勾配で高度にｍＷし、　Ｃａｔ＋お よびＭｇ　を補給したダルベツコのリン酸塩−緩衝化塩溶液中に懸濁する。最初 、試験される物質な好中球と１５分間インキュベートする。この時点で各々の試 料にＩＯｐＭのルミノール（５−アミノ−２゜３−ジヒドロ−１，４−フタラジ ンジオン）を添加する。

発光計量器中、２０分まで１．２５分の間隔で化学発光の発生を測定する。

ブリオスタチン１は好中球化学発光（オキシドラジカル形成の測定）の強力な活 性化剤でろることが観察されたが、ブリオスタチン１３はそうではなかった。活 性化は既知の活性化剤フォルポル１２−ミリステート１３−アセテートと同じ時 間変化をたどった。図５を参照されたい。ＴＰＡは１５０　ｎＭであり、組換え 体ヒトＧＭ−Ｃ５Ｆは５９　＠ｆ　／ｍｊ”Ｃ”　６つだ。

さらに、″Ｃｒ−標識に５６２謄瘍標的細胞を殺すことにより測定された好中球 細胞毒性の活性化もまたブリオスタチンＩＫより促進された（表１）。好中球は 前記のとと（して精製された。好中球はｖ当り３Ｘ１０’細胞の密度で最初種々 の濃度のブリオスタチン１（０，１／’Ｍから０．１ｓＡｆ）、ｒｈＧＭ−Ｃ５ Ｆ（５０μＦ／Ｍ）とまたは培地単独で２時間インキュベートする。２度洗浄後 、細胞なＩＩＣ，−標＠に５６２標的細胞へ示されているとと（エフェクター／ 標的細胞比３０：１．１５：１．または７．５；ｌで添加する。ｓ＋ｃｒ−標Ｒ Ｋ５６２ｍ胞およびブリオスタチンかまたは培地単独を含む対照プレートなＦＦ １ｉｉｊＬ。

放射性同位元素の自発的放出を決定する。細胞を含むプレートを２５０Ｘｆで２ 分間遠心分離した後３７℃で３時間インキュベートする。各々のウェルから１０ ０マイクロリツトルの上澄み液を採取し、ガンマシンナレーションカウンター中 で存在する放射能の量を決定する。６ＭＨＣｌで完全に溶解された細胞を含むウ ェルから得られた上澄み液を検定することＫよりｓｌＣデの最大尿量が決定され る。

好中球活性化は１０から１０　ＯｎＨのブリオスタチンｌの間で最大であり、そ の濃度範囲は骨髄造血細胞の増殖を促進できる。デｈＧＭ−Ｃ５Ｆが好酸法およ び好中球を活性化すると報告されているが、顆粒球−マクロファージ−コロニー 形成のための最大刺激濃度でわる５０ｎｆ　７ｇのｒｈ　ＧＭ　−ＣＳ　Ｆ濃度 では化学発光の誘導または好中球の細胞毒性ともに検出できなかった。

実施例５゜ この実施例は哺乳類に対してブリオスタチンｌが無毒であり、生体内で多能性造 血前駆細胞を刺激することを示している。

６週令メスＢＤＦ、ｖウスの皮下に差し込まれた浸透性マイクロポンプ（アルゼ ット）を用い、７日間注入されたブリオスタチンは用いられたどの用量において も主要な臓器毒性効果を持たなかった。多能性造血前駆細胞に対する用量依存性 刺激効果が見いだされた。担体のみを注入した対照動物と比較して１４４μｆ／ Ｃ９／ｄｃ最大量）の投与によりＣＦＵ−５，ＣＦＵ−ＧＭおよびＢＦＵ−Ｅが 増加した。処置動物の膵臓細胞からのＣＦＵ−５は２倍に増加したが（注入され た１０’細胞当り１９対３９）、一方骨髄ＣＦＵ−５は変化しなかった。同様に 、膵臓細胞からのＣＦＵ−０Ｍコロニーは３．６倍増加しく注入された１０”細 胞当り５２対１８８）、および骨髄では２倍に増加した（１０Ｓ細胞当り７３対 １５０）。膵臓細胞からの赤芽球ＢＦＵ−Ｅ’コロニーもまた２倍の増加（１０ ６細胞当り２８対５８）を示したが、骨髄ＢＦＵ−Ｅ　前駆細胞には変化は観察 されなかった。この前駆細胞の増加は末梢白血球細胞分画、ヘモクリット、骨髄 細胞質または膵臓重量の有意な変化を伴っていない。

これらの結果はブリオスタチンの連続注入は無毒でちり、生体内でマウス多能性 造血前駆細胞を効果的に刺激できることを示している。このブリオスタチンの刺 激効果は試験管内での多能性前駆細胞に対するその効果と同様であり、ｒｌＬ− ３およびデＧＭ−Ｃ５Ｆの報告されている効果をまねている。

表　１ に５６２標的細胞に対する活性化好中球細胞毒性好中球プラスブリオスタチン１ １０−’Ｍ　１０２．８　１８．１　７．８１０”＃　８．４　２．４　０ １０−・Ｍ　Ｏ，９１，８０ １０””Ｍ　−０，８１，００，９ 培地単独　０．９　１．０　−０．８ ｒＨＧＭ−ＣＳＦ　（５０ｎｆ／ｉｉｊ　）　１．６　０．９　０．７ブリオス タテン １０−”Ｍ　１．５　０．３　−０．６１０＝Ｍ　Ｏ，９１，００，３ ブリオスタチン１により誘導された好中球細胞毒性の評価。Ｋ５６２細胞はＨａ ”Ｃｒ、０．で標識され、ＲＰＭＩ１６４０培地１当り１０’細胞の濃度に調整 する。活性化された好中球細胞毒性が決定された。結果は示されたエフェクター ／標的細胞比での特異的同位元素放出のパーセントとして表現され、以下のとと （計算される：チ特異的溶解−〔（試料の平均Ｃｐｔｈ−自発的放出の平ｊ！Ｊ ｃｐｍ）／〔最大平均ｃｐｔｌＬ−自発的放出の平均ｃｐｔｈ）〕Ｘ１００最大 誘導ｃｐｍは７３６４±１４９のごとく放出された。

代表的実験から３重に決定された最大平均％特異的溶解を示している。

浄書（内容に変更なし） 凹　２ クローン＃復 １！７４ −Ｌｏｂ（７＋）イスタナンコ ）９　５　じｑ イＬ’ｆＪ！九ｆｌイトも虹 手続補正書（扶 ２、発明の名称 ブリオスタチンによる幹細胞増殖の促進３、補正をする者 国際調査報告 Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　ｔｏ　ｆｏｒ＋ｅ　ＰＣＴ／：Ｓ入／２１０゜Ｐａｒｔ 　ＺＬ　Ｆｉｅｌｄｓ　５ｅａｒｃｈｅｄＥｏｉｉｎｏｐｈｉｌ シ＋ｓｏｐｈｉ１ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ シアｔｈｒｏｃｙｔｅ ＦＩｅａ＋ｏｐｌｏｉｅｔｉｃ　ｃｅｌｌ

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. １．刺激および分化するように幹細胞を刺激して顆粒球、マクロファージまたは 赤血球を形成するための方法であり： 幹細胞を含む細胞調製試料を得；そして顆粒球、マクロファージまたは赤血球の 形成を促進するためアシル化されたＣ２０炭素を持つブリオスタチンの有効量と 試験管内で細胞調製試料をインキュベートし、それにより前記形成が促進される ことを特徴とする、前記方法。
2. ２．幹細胞が骨髄から得られる請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．幹細胞が末梢血細胞から得られる請求の範囲第１項記載の方法。
4. ４．ブリオスタチンの濃度が約１０−１２Ｍから約１０−７Ｍである請求の範囲 第１項記載の方法。
5. ５．ブリオスタチンの濃度が約１０−１０Ｍから約１０−１２Ｍであり、エリス ロポイエチンが細胞調製試料とインキユベートされ、および形成される細胞が赤 血球である請求の範囲第４項記載の方法。
6. ６．ブリオスタチンの濃度が約１０−９Ｍから約１０−７Ｍであり、および形成 される細胞が顆粒球およびマクロファージである請求の範囲第４項記載の方法。
7. ７．悪性腫瘍細胞を殺すのに影響を及ぼす量の化学療法剤もまた細胞調製試料に 添加されている請求の範囲第１項記載の方法。
8. ８．細胞調製試料から悪性腫瘍細胞を除去するためモノクローナル抗体が使用さ れる請求の範囲第１項記載の方法。
9. ９．化学療法剤がブリオスタチン１３である請求の範囲第７項記載の方法。
10. １０．化学療法剤がアドリアマイシン、シトシンアラビノシド、ビンクリスチン 、シクロホスフアミド、ブサルフアン、プレドニソンおよびＭ−ＡＭＳＡから成 る群から選択される請求の範囲第７項記載の方法。
11. １１．細胞調製試料を顆粒球、マクロファージまたは赤血球を形成するたりイン キュベートした後哺乳類に投与される請求の範囲第１項記載の方法。
12. １２．ブリオスタテンが１、３、８および９から成る群より選択される請求の範 囲第１項記載の方法。
13. １３．細胞調製試料が悪性腫瘍細胞を殺すのに有効量の電離放射線で処理される 請求の範囲第１項記載の方法。
14. １４．哺乳類において幹細胞分化を促進して顆粒球、好酸球、好塩基球、血小板 、マクロファージまたは赤血球を形成する方法であり： 顆粒球、好酸球、好塩基球、血小板、マクロファージまたは赤血球の形成を促進 するのに有効量のアシル化されたＣ２０炭素を持つブリオスタチンを哺乳類に投 与し、それにより前記形成が促進されることを特徴とする、前記方法。
15. １５．腫瘍の増殖を休止するのに有効量のブリオスタチン１３を哺乳類に投与し ；そして 顆粒球、マクロファージまたは赤血球の形成を促進するのに影響を及ぼす量のブ リオスタチン１を哺乳類に投与することを特徴とする請求の範囲第１４項記載の 方法。
16. １６．ブリオスタナンが連続注入により投与される請求の範囲第１４項記載の方 法。
17. １７．ブリオスタテンが皮下に投与される請求の範囲第１４項記載の方法。
18. １８．ブリオスタチンが１、３、８および９から成る群より選択される請求の範 囲第１４項記載の方法。
19. １９．好中球および他の免疫調節細胞の細胞毒性を活性化する方法であり： 好中球または他の免疫調節細胞を含む細胞調製試料を得；そして 好中球または他の免疫調節細胞を活性化するりに有効なアシル化されたＣ２０炭 素を持つブリオスタチンの量と試験骨内で細胞調製試料をインキュベートし、そ れにより前記細胞の細胞毒性が活性化されることを特徴とする、前記方法。
20. ２０．ブリオスタチンの濃度が約１０−１Ｍと１０−１０Ｍの間である請求の範 囲第１９項記載の方法。
21. ２１．ブリオスタチンが１、３、８および９から成る群より選択される請求の範 囲第１９項記載の方法。
22. ２２．哺乳類において好中球および他の免疫調節細胞を活性化する方法であり： 好中球または他の免疫調節細胞の細胞毒性を活性化するため哺乳類にアシル化さ れたＣ２０炭素を持つブリオスタチンを投与し、それにより前記細胞毒性が促進 されることを特徴とする、前記方法。
23. ２３．ブリオスタチンが１、３、８および９から成る群より選択される請求の範 囲第２２項記載の方法。