JPH02463A - ストレプトミセス属発現ベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、異棒ターミネーター配列を有する新規ストレ
プトミセス属発現へフタ−に関する。

発明のｈ清 ゲうムｌ１ＭｔｌＥｌｆｆｉのストレプトマイシート（
ｓｔｒｅｐｔｏ口ｙｃｅｉｅ）は複雑な形態的分化のサ
イクルを経る。

ストレプトマイシートにおける分化の機構に関与する調
節・シグナルの性質はまだ完全には理解されていない。

ストレプトマイシート ＋Ｃ含ｆｉｔ（約７３％）を有するが、ストレプトマイ
シートは、ストレプトミセス属のプロモーター配列がし
ばしば工ンエリヒア・コリＣＥｓｃｈｅｒＩｃｈｉａ　
ｅｏｌｉ）の−３５８よび−１０コンセンサス配列に関
し相同性を示さないという事実にかかわらず、イー・コ
リ（Ｅ．ｃｏｌ　ｉ）のプロモーターを認識でさかつそ
れを使用できるＲ　Ｎ　Ａポリメラーゼを有する。いく
つかのストレプトミセス属プロモーター配列は今や公知
である。

ゲノム陽性で胞子を形成する細菌ビイ・ズブチリス（Ｂ
．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）においては、−・連のＲＮＡポリ
メラーゼシグマ因子が産生されるため、ＲＮＡポリメラ
ーゼの鋳型特異性は分化の間！．：変化する。

ストレプトミセス・ケリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓｅｏｅｌ　ｉｅｏｌｏｒ＞は１以上のＲ　Ｎ　Ａポ
リメラーゼホロ酵素を含有するので、ニス・ケリカラー
における分化の調節は、バチラス属種ニス・ケリカラー
において、イー・コリのものと異なる一：３５および１
０コンセンサスを有するエス・リビダンスプロ七ーター
をＲＮＡポリメラーゼがｉｎ　　ｖｉｊｒＯで認識する
点で似ている。加えて、２′）のビイ・ズブチリスブ＋
７モーター、すなわち１つはイー・コリー３５１３よび
−１０コンセンサス配列を何するもの、も−）１つはイ
イさないもの、は異な５ニス・ケリカラーＲ　Ｎ　Ａポ
リメラーゼによって認識さ！する。かくして、ストレプ
トマイシートに存在するＲＮＡポリメラーゼホロ酵素は
同−属の異な５種間のみならず異なる翼間に８いても類
似性を何し得る。

ニス・リヒダンスプロモーターーグローブブラスミドに
８いてクローン化さＪｌだ主要な即時型および遅延型ウ
ィルスプロモーターを含有するビイ・ズブヂリスファー
ジＩ２９からのＳＮＡフラグメントは、ビイ・ズブチリ
スＲ　Ｎ　Ａポリメラーぜの場合と同一の部位でｌ　ｎ
　　Ｖ　Ｉ　Ｖ　ｌ）　ｌこて転写を開始するのに利用
することができる。これらのウィルスプロモーターはエ
ス・リビダンスにｊｉいて高活性を示す。

しかしながら、共にキャラクタライゼーシ１ンが行われ
かつ推定さｎたストレプトマイシートのターミネータ−
配列は、高Ｇ＋Ｃ含量を有する７％ツムｌこついてＴ−
ｉｌｌＩＪさＦＬ５ご．！：＜、自由工率ルキーが低い
（−３０ないし　８０ｋｃａ１１モル）大きなスデムー
ルーブ構造を有し、ウリジンに富むテール部を有り，な
い点で区別される。

ストレプトミセス属遺伝子ａｐｈ、ｔｑｒｊ；よびｖｐ
ｈ，ｈｙｇおよびｓｐｈおよびａ（に至る３゛領域は、
転写停止シグナルであると提案さｉｔたｌまたはそれ以
上のＩＲＳ　（逆反復配列）を含有し、ａｐｈ遺伝子の
ＩＲＳはストレプトミセス・リヒダン′ス（Ｓｔｒｅｐ
Ｌｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｖｉｄａｎｓ）において転写停止
活性を有することが示された。加えて、ストレプトミセ
ス属プラスミドｐｌＪ１０１からのＩ　Ｒ　Ｓ　ｉ含有
する２０５ｂｐＤＮＡフラグメントはエス・リビダンス
およびイー・コリ双方において１０　ｖｉｖθターミネ
ータ−として作用する。

他のストレプトミセス属遺伝子のこれらの２つのターミ
ネータ−または推定されるターミネータ−のＩＲＳいず
れにも、チミジンに富む配列、イー・コリ４こＢけるほ
とんどのＲｈｏ−非依存性ターミネーターの特許な特徴
は伴わない。

従って、ストレプトマイン−Ｉ・でいかにして転写か停
止されるかはまだほとんど知られていない。

イー・コリ染色体からのａｍｐＣターミネータ−および
イー・コリ７アージｆｄからの主要ターミネータ−はス
トレプトミセス属において　１ｎｖｉｖｏで活性なター
ミネータ−であるが、これらの場合、このプロセスがい
かにして起こるかについてその他のことはほとんど知ら
れていない。

発明の開示 本発明者らは、今回、２方向転写ターミネータ−ＴＤｌ
を含有するビイ・ズブチリスファージ−２９からのＤＮ
Ａフラグメントを確立したが、そこでは即時型転写およ
び遅延型ウィルス転写のターミネートがストレプトミセ
ス名種１こおいて効果的に認識され、ビイ・ズブチリス
ＲＮＡポリメラーゼと同一の部位で転写が停止される。

かくして、本発明のｗｃＩの態様において、少なくとも
１つの異種Ｒｈｏ−非依存性ターミネータ−を含有する
ストレプトミセス属発現ベクターが提供される。特に、
ビイ・ズブチリス７アージー２９に由来する少なくとも
１つのＲｈｏ−非依存性ターミネーターを含有するベク
ターが提供され本明細書中で用いる「発現ベクター」な
る語は発現配列を含有するいずれのベクターも、あるい
はかかる配列を含有するのに適合し！こいずれのベクタ
ーもいう。

１２９由米のターミネータ−配列は好ましくはｒＴＤＩ
Ｊとして公知の配列である。当該分野の性質により、本
発明はかかる配列の同等物あるいはいずれかの機能性突
然変異体形も包含する。「同等」とは元の配列に類似で
あるが必ずしもそれから由来しない機能性配列を意味す
る。すなわち、同等な配列は部分的にまたは全体的に合
成されたものであってよい。「突然変異体」とは必要な
特徴はなお保持しているがある程度それから変化した元
のまたは同等のいずれかの配列の形態を意味する。かか
る変化は、例えば、挿入、転換、欠失または突然変異誘
発によって行うことができる。

エス・リビダンスは〆２９プロモーターを非常に効率的
に認識することが示されているが、〆２９ターミネータ
−は天然に生じるストレプトミセス属ターミネータ−と
は全く異なる構造を有するので、−２９ターミネータ−
が認識されることは驚くべきことである。

ストレプトミセス名種が異種Ｒｈｏ−非依存性ターミネ
ータ−を認識する能力により、ストレプトマイシートを
大規模な蛋白製造に使用する道が開かれた。

異種プロモーターと一緒での前記ターミネータ−の使用
は、特に両者がビイ・ズブチリスファージ−２９に由来
する場合が好ましい。プロモーターは適当な同等物また
は突然変異体形であってよいことも理解されるであろう
。

ファージ−２９転写についての研究は、即時型プロモー
ター、ＣＩおよびＣ２双方で開始した、および主要遅延
型プロモーター、Ａ３、で開始した転写が停止する領域
の（ＥｃｏＲＩフラグメントにおける）存在を示す。こ
のターミネータ−領域はＩ２９ゲノムのｎｔ１７２６５
および１７３０４間に正確に位置し、−２９に感染した
ビイ・ズブチリスにおいて、いずれかの向きであるＲｈ
ｏ−非依存性ターミネーターングナルとして作用する。

その間にコーディング配列を有する少なくとも１つのプ
ロモーターおよび少なくとも１つのターミネータ−を含
有するストレプトミセス属ベクターが、コード付けされ
る蛋白の高発現レベルを得るのに特に有用である。コー
ディング配列を何さないがプロモーターおよびターミネ
ータ−配列間に少なくとも１つのユニーク制限部位を有
するプラスミドは選択したコーディング配列が必要とさ
れるとおりに挿入されることを可能とする。

本明細書中で例示するプラスミドは、−２９ＴＤＩター
ミネータ−に対しいずれかの向きであるｕ２９即時型プ
ロモーターＡ２ａ％Ａ２ｂおよびＡ２ｃならびにＩ２９
遅延型プロモーターＡ３を含有する。親のプラスミドは
ｐｌＪ４８６であり、それには、２つの制御配列間にＸ
ｂａＩ。

Ｂａｍ１ｌＩおよび５ｓｔｌについての３つのユニーク
制限酵素部位が存在する。これらのプラスミドは本発明
の特に好ましい具体例をなす。

実施例 次に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。

実施例１ 既知配列のメ２９ＤＮＡの７６３−ｂｐＨｉｎｄｍ　−
Ｈフラグメントは、即時型プロモーターＡ２ａ。

Ａ２ｂおよびＡ２ｃならびに遅延型プロモーターＡ３を
有する。異種プロモーターを認識するストレプトマイシ
ートからのＲＮＡポリメラーゼの能力を試験するために
、１ｌ１２９ＤＮＡのＨｉｎｄ［［−Ｈフラグメントを
、ユニークＨｉｎｄｌＩ［部位にてストレプトミセス属
プロモーター−プローブプラスミドｐｌＪＪ８６に挿入
した。この部位は、グラスミドにより担持されるＴｎ５
−由来のｎｅｏ遺伝子より上流に位置するリンカ−配列
に存在する。Ｉ２９ＤＮＡの即時型転写はＬ鎖から起こ
り、遅延型転写はＨ鎖から起こるため、１ｌｆ３Ｑ遺伝
子はウィルスＤＮＡフラグメントのいずれかの向きであ
るＩ２９プロモーターにより制御されると予想される。

ｎｅｏ遺伝子の発現は、カナマイシン耐性（Ｋｍゝ）を
４１与する。プラスミドｐｌＪ４８６はチオストレプト
ン タープロモーターからｎｅｏ遺伝子への転写読み取りを
防げるイー・コリファージｆｄの主転写ターミネータ−
もＨする。遅延型および即時型Ｉ２９プロモーターの制
御下にある、口ｅＯ遺伝子を有する組換体プラスミドｐ
ＳＨ３およびｐＳＨ５を、各々、第１Ｅ図に示す。両プ
ラスミドは選択培地にＪｉける増殖について安定である
ことが示され、その分子サイズのバラツキは検知されな
かった（結果は示さず）。

Ｉ２９転写の以前の研究から、転写が、　１ｎｖｉｖｏ
にて、Ｈｉｎｄｎｌ−Ｈ７ラグメント内のＡ２ａ。

Ａ２ｂ％Ａ２ＣおよびＡ３プロモーターで開始すること
は公知である。エス・リビダンスＲＮＡポリメラーゼが
、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいてＩ２９プロモーターを認識す
るか否かを調べるｔ；め、ウィルス性ＨｉｎｉＪＩｕ−
Ｈフラグメントを精製し、５′−突出末端を［γ−”Ｐ
ｌ　ＡＴＰで放射能標識し、分離した鎖をクロラムフエ
ーコール（ｅｈ　ｌｏｒａｍｐｈｅｎ　ｉｃｏ　ｌ　）
（Ｃｍ）（初期（ｅａｒｌｙ）鎖）の存在下または薬剤
の不在下（後期（　ｌａｔｅ）鎖）で、Ｉ２９で感染し
たビイ・ズブチリスから抽出したＲＮＡでハイブリダイ
ズした。遅延型転写はＩ２９即時型遺伝子４、夕〉バク
？ｔｐ４産土物の合成に依存しているため、Ｃｍの存在
下においては、即時型ウィルス転写のみが起こり得るが
、Ｃｍの不在下においては、即時型１３よび遅延型ＲＮ
Ａが共に生成され１！Ｊる。組換体プラスミドｐ　Ｓ　
Ｈ　３またはｐ　Ｓ　Ｈ　５を担持するエス・リビダン
ス６６の培養物から抽出したＲＮＡを、同様にして、Ｉ
　２　９ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｈフラグメントの放射能標識
鎖にハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションの後
、該試料をＳｌ消化に付し、保護オリボデオキシスクレ
オチドを変性Ｐ　Ａゲル上で分画した　（第１Ａ図およ
び第Ｃ図）　ｏ　ｎｅｏ遺伝子をＩ２９即時型（第１ｃ
図、ｌおよび」）または遅延型（第１Ａ図、第り図およ
び第Ｅ図）プロモーターいずれかによって制御する場合
、Ａ２ａ，Ａ２ｂ，Ａ２ｃおよびＡ３Ｉ２９プロモータ
ニにて開始する転写が、エス・リビダンスで見いだされ
た。第１Ａ図、第８図および第Ｃ図に示めすごとく、Ｉ
２９に感染させたビイ・スブチリスの初期鎖からの転写
が、主としてＡ２ｂプロモーターから起こり、さらに少
ない程度でＡ２ａおよびＡ２ｃプロモーターから起こり
、後期鎖からの転写か遅延型Ａ３プロモーターから起こ
る。ビイ・ズブチリスまたはエス・リビダンスＲ　Ｎ　
ＡポリメラーゼによるＩ２９転写の正確な位置は、同一
部位にて起こり、Ａ３プロモーターにて開始するＲＮＡ
により保護されたオリボデオキシスクレオチドは、すべ
ての場合、配列決定反応の一連の産生物産物と並んで変
性ＰＡゲル上を移動した．ｌｄ２９ＤＮＡからの転写は
組換体プラスミＦｐｓＨ３（第１Ｂ図、ｒおよびｇ）お
よびｐＳＨ５　（第１Ｄ図、ｋＪｉよび１）からの転写
と一致し、これは、エス・リビダンスＲＮＡポリメラー
ゼか異種４２９プロモーターを特異的に認識でさること
を明らかに示す。

（ｂ）組換体プラスミドに８けるｎｅｏ遺伝子のエス・
リビダンスにおけるＩ２９プロモーターの効率を決定す
るために、ｎｅｏ遺伝子の発現により付与されるＫｍ’
レベルを立証した。ｎｅｏ遺伝子が〆２９即時型プロモ
ーター（プラスミドｐＳＨ５）の制御下にある場合、耐
性は３００μｇ／ｍｌと観察されたのに対して、Ａ３プ
ロモーター（プラスミドｐＳＨ３）の制御下では、エス
・リビダンスは、１５０μｇ／ｍｌのＫｍ耐性コロニー
を形成した。ストレプトミセス属プロモーターを有する
同様のマルチコピープラスミドにより付与されるＫｍ”
レベルと比較した場合、これらのＫｍ”レベルは高いと
考えられる。これらの結果に一致して、ＡＨＰ　Ｉ　＋
活性は、プラスミドｐＳＨ５を保持するエス・リビダン
スのほうが、プラスミドｐｓＨ３を含有する株よりも高
かった（第」表）。かくして、プラスミドｐＳＨ５を担
持するエス・リビダンスで合成されたｎｅｏ遺伝子産生
物の量は、生じた総蛋白のほぼ６％であり、プラスミド
ｐ　Ｓ　Ｉ３を担持する細胞では２％であった。これら
のレベルは、総細胞タンパク質を分画した後、染色した
Ｉ’Ａゲルのデンシトメトリーによって測定した。

実施例２ 区　　区　　区　　区　　・・　　　　　・・？ｌｌ（
？ｌ）（帽　　　　ク ブラスミドｐｓＨ３およびｐｓＨ５（実施例１）は、唯
一のＥｃｏＲ１部位に挿入された、ウィルス性のＴＤＩ
ターミネータ−を含む、既知の配列〔ガーベイ（Ｇａｒ
ｖｅｙ）等、１９８５］の、／２９　　ＤＮＡの９１２
０ｂｐ　ＥｃｏＲＩ−Ｄ７ラグメントヲ含ンテいた（第
２Ａ図）。この部位は、これらプラスミド中に担持され
ているＴｎ５由来のｎｅｏ遺伝遺伝フキＩ２９プロモー
ターのリンカ−配列中に含まれている。ｎｅｏ遺伝子が
発現すると、親プラスミドｐＳＨ３またはｐＳＨ５を保
持している細胞にＫｍ耐性を付与する。有効なターミネ
ータ−配列を挿入するとこの耐性を減少させるか、また
は無くしてしまうはずである。

また、これらの組換えプラスミドは、元のプラスミドｐ
ｌＪ４８６に存在している推定のプロモーターからｎｅ
ｏ遺伝子への転写読み取りを妨げる、イー・コリ（Ｅ、
ｃｏｌｉ）ファージｆｄの主転写ターミ不一ター、なら
びに遺伝子Ｔ　ｓｒ”を含有している。

Ｉ２９　　ＤＮＡ　ＥｃｏＲＩ−Ｄフラグメントを挿入
しうる２つの可能性ある配向のうち、８２の形質転換体
をスクリーニングした後、そノ１ぞれの場合について１
つだけを得た。これは、おそらく、適切な配向において
はＲＮＡポリメラーゼがウィルス性ターミネータ−配列
に達する前に転写されることもある、ウィルスタンパク
Ｎｐ１６の一部をコードしてい５オーブンリーデイング
フレームの存在によるものであろう；ｐ１６フラグメン
トの合成は宿主細胞に害を及ぼし、この特定の配向での
ＥｃｏＲＩ−Ｄフラグメントの挿入を生存できないよう
Ｉこｒる。

組換えプラスミ白）ＳＨ３およびｐＳＨ５、ならびに−
２９ＴＤｌターミネータ−を含有しているそのそれぞれ
の誘導体ｐＳＨＴ３およびｐＳＨＴ５を第２Ａ図に示す
。これらプラスミドのすべては、選択培地での増殖に対
して安定であることがわかり、その分子の大きさの変化
は全く観察されなかった（結果は示していない）、。

一２９転写に関する以前の研究から、ＴＤｌターミネー
タ−での右側初期転写終止はＥｃｏＲ［−Ｄフラグメン
トの右側末端からｎｔ１０７〜１１２の間で起こること
がわかっていた。エス・リビダンス（Ｓ　、　ｌ　１ｖ
ｉｄａｎｓ）もこの位置で終止するかどうかを調べるた
め、ウィルスのＥｃｏＲＩ　−Ｄ７ラグメントを精製し
、その３′末端をＰｏ１ｌｋの存在下、［σ−３１ｐｌ
ｄＡＴＰで放射活性標識化し、そして分離した鎖を、組
換えプラスミドｐＳＨＴ３またはｐＳＨＴ５を歯付して
いるエス・リビダンス（Ｓ　．ｌｉｖｉｄａｎｓ）　６
６の培養物から抽出したＲＮＡとハイブリダイズさせた
。

ハイブリダイゼーシヨンの後、この試料をＳ】消化に付
し、保護したオリゴデオキシヌクレオチドを変性ＰＡゲ
ルで分画した。ハイブリダイゼーションはＥｃｏＲＩ−
Ｄフラグメン・トの鎖の１つとで起こったが、その他の
ものとでは起こらず、ｐＳＨＴ３およびｐＳＨＴ５の両
方で約１１０ｎｔの大きさを有する一部のオリゴデオキ
シヌクレオチド、Ｊｉよび完全なりＮＡ鎖を保護する結
果になった（結果は示していない）。これは、終止ング
ナルを通ってＤＮＡフラグメントの末端に達するいくつ
かの転写体を含むＤ　Ｎ　Ａフラグメント内で転写終止
が起こるときに予想される結果である。

この終止部位を正確に配置するため、Ｉ２９プロモータ
ーから始まるＲＮＡによって保護されたオリゴデオキシ
ヌクレオチドを、−群のＤＮＡ配列決定反応産物ととも
ｌ二、変性ＰＡゲルにかけた。

エス・リビダンス（Ｓ　、　ｌ　１ｖｉｄａｎｓ）では
ウィルス性プロモーターから始まる転写体は、両ケース
のＩ２９　　ＥｃｏＲＩ−Ｄフラグメントの右側末端か
らｎｔ１０８−１１４の間で停止しく第２Ｂ図、レーン
ａおよびｂ）、その位置はＩ２９に感染させたビイ・ス
ブチリス（Ｂ　、５ｕｂｔｉｌｉｓ）培養物のＴＤＩタ
ーミネータ一番こＪｉいて転写が終止する位置と一致し
、Ｉ２９　　ＴＤ１転写終止シグナルもｉｎ　　ｖＩＶ
＋）でエス・リビダンス（Ｓ　．ｌｉｖｉｄａｎｓ）に
よ−）で認識されることがわかった。

エス・リビダンス（Ｓ　、　ｌ　１ｖｉｄａｎｓ）での
ＴＤＩ配列の転写終止効率を調べるため、ｎｅｏ（Ｋ　
ｍｌ′）遺伝子の発現によって付与されるＫｍ耐性のレ
ベルを測定した。第２表は、ターミネータ−配列が存在
すると（プラスミドｐＳＨＴ３およびｐＳＨＴ５）、親
プラスミドｐＳＨ３およびｐＳＨ５によって付与される
Ｋｍ耐性のレベルと比べてＫｍ耐性のレベルかそ１１ぞ
ｔ１約１／７に低下したことを示している。

これらの結果と一致して、プラスミドｐＳＨＴ３１３よ
びｐＳＨＴ５を保持している細胞ではＡ　Ｐ　ＨＩＩ活
性も著しく減少した（第２表）。

プラスミドｐｓＨ５またはｐＳＨ３を保持しているエス
・リビダンス（Ｓ　、　ｌ　１ｖｉｄａｎｓ）で合成さ
れるτ１ｅｏ遺伝子産物は、リポソームを含まない１；
清のしタンパク質のそれぞれほぼ６％Ｂよび２．５゛％
であったが、一方、Ｓ　、　Ｉ　ｉｖ　１ｄａｎｓがプ
ラスミドｐＳ　ＨＴ　５およびｐＳＨＴ３を保持してい
るとこれらの値はそれぞれ０．９％および０．５％であ
った（？１２　表’）。これらのレベルは、総細胞タン
パク質を分画した後の染色ＰＡゲルのデンシトメトリー
（写真濃度法）によって測定した（第３図）。プラスミ
ドｐｓ＋（Ｔ３またはｐＳＨＴ５が付与するＫｍ耐性の
レベルの減少は、第３図に示したプラスミド−特異的な
タンパク質の相対量から推定しうるプラスミドコピー数
の減少によるものではなかった。

９組換えグラスミドにコードされているｎｅｏ遺伝子Ｓ
．ｌｉｖｉｄａｎｓ　　６６　　　　　　　　　　　＜
２　　　　　　　　　５０Ｓ、１ｉｖｉｄａｎｓ［ｐｌ
Ｊ４８６１　　　　　　＜５　　　　　　　　１２５Ｓ
．ｌｉｖｉｄａｎｓ［ｐＳＨ３］　　　　１５０　　　
９００　　　　２．５Ｓ、１ｉｖｉｄａｎｓ［ｐＳＨＴ
３］　　　２０　　　１６０　　　０．５Ｓ、１ｉｖｉ
ｄａｎｓ［ｐＳＨ５］　　　３００　　２２００　　　
６．０測定［ホップウッドＱｌｏ−α沁）、＋９６７１
゜ゝ他で記載されている方法で測定［）・−スおよびダ
ウディング（Ｈａａｓ　ａｎｄ　Ｄｏｖｄｉｎｇ）、１
９７５］　；　ｌ　ｍｕは、１分間あたり、タンパク質
１■あたりのホスホリル化したにｌｌｌｐモルと等価で
ある。

’　５０Ｓ−１２ＳＰ＾ゲルで分画した総細胞タンパク
質のデンシトメトリーによって測定。

Ｓ、１ｉｖｉｄａｎｓ株［ｐＳＨＴ３］および［ｐＳＨ
Ｔ５］は、１９８７年９月３０田こドーリ−〇リサーチ
・ステーション（Ｔｏｒｒｙ　Ｒｅ５ａａｒｃｈ　５ｔ
ａｔｉｏｎ、　Ａｂｅｒｄｅｅｎ）に寄託され、それぞ
れ寄託番号ＮＣＩＢ　１２５５０およびＮＣＩＢ　１２
５５１を取得している。

第２図において、拡大図の縦棒は／２９プロモーターを
示している。転写の方向を矢印で示している；白い矢じ
りの矢印は転写終止を示し、一方、黒い矢じり矢印は転
写開始を示している。・はＥｃｏＲＩ　；○はＨｉｎｄ
ｌｌｌ、変性６％ＰＡ−７Ｍ尿素ゲルでの電気泳動で分
画した、プラスミドｐＳＨＴ３（レーンａ）またはｐＳ
ＨＴ５（レーンｂ）を保持しているＳ　、　ｌ　１ｖｉ
ｄａｎｓで作られたＲＮＡによってＳｌ消化からＤＮＡ
フラグメントを保護した。

Ｓｌ−保護したフラグメントの大きさをｎｔで示す。

配列決定反応Ｆサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）等、１９７７
］は、既知配列の１２９　　ＤＮＡの右側末端Ａｃｃ＋
７ラグメントからであり［ニスカルミスおよびサラス（
Ｅｓｃａｒｍｉｓ　ａｎｄ　５ａｌａｓ）、１９８１；
ヨシカワ（Ｙｏｓｈｉｋａｖａ）等、！９８１］、これ
を大きさの標準として用いた。　Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ
の定常期培養物からのＲＮＡをジャウリンおよびコーエ
ン（Ｊａｕｒｉｎ　ａｎｄ　Ｃｏｈｅｎ。

１９８４）の記載のようにして調製した。

第３図は、組換えプラスミドにコードされているｎｅｏ
遺伝子産物の合成を示すものである。ベクターｐｘ４８
６Ｃレーンｂ）、または組換えプラスミドｐＳＨ３（レ
ーンＣ）、ｐＳＨＴ３（レーンｄ）、ｐＳＨ５（レーン
ｅ）、ｐＳＨＴ５（レーンｆ）を保持しているか、また
はプラスミドを全く保持していない（レーンａ　）Ｓ　
．ｌｉｖｉｄａｎｓで作られたタンパク質を、対応する
５１００抽出物から、０．１％５ＤＳ−１２％ＰＡゲル
での電気泳動によって分画した［スキンナーおよびカン
ドリッ７工（Ｓｋ　１ｎｎｅｒａｎｄ　Ｃｕｎｄｌｉｆ
ｆｅ）、１９８０１゜右余白の数字はｋＤで示した分子
量マーカーである。マーカーは上から下へ、ウシアルブ
ミン、卵アルブミン、グリセルアルデヒド　３−ホスフ
ェート　デヒドロゲナーゼ、炭酸脱水酵素、トリプシノ
ーゲン、大豆トリプシン阻害剤およびα−ラクトアルブ
ミンである。

ＡＰＲＩ！タンパク質の推定の分子！（２７，６ｋＤ）
は、以前に報告されているもの［ベック（Ｂｅｃｋ）等
、１９８２］と一致する。

第４図は、プラスミドｐＳＨＴ３およびｐＳＨＴ５のあ
る種の特徴の配置および配向を示す模式図である。Ｆｄ
はファージｆｄの主転写ターミネータ−の位置を、ＴＤ
ｌは／２９の主転写ターミネータ−の位置を示している
。ムは／２９の即時型プロモーター（Ａ　２ａ、　Ａ　
２ｂ、　Ａ　２ｃ）であり、△はＩ２９の遅延型プロモ
ーター（Ａ３）である。

【図面の簡単な説明】

第１Ａ図、第１Ｂ図、第１Ｃ図および＠ｌＤ図は保護オ
リゴデオキシヌクレオチドの変成ＰＡゲル分画図であり
、 第１Ｅ図は組換体プラスミドｐＳＨ３およびｐＳ　Ｈ５
の転写開始を示す図面であり、第２Ａ図は組換体プラス
ミドｐｓＨ３およびｐＳＨ５の転写開始を示す図面であ
り、 第２Ｂ図は保護オリゴデオキシヌクレオチドの変成ＰＡ
ゲル分画図であり、 第２Ｃ図は塩基配列図であり、 第３図はｎｅｏ遺伝子産生タンパク質のＰＡゲル分画図
であり、 第４図はプラスミドｐ　Ｓ　ＨＴ　３およびｐＳ　ＨＴ
５の配置および配向を示す図面である。

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）少なくとも１つの異種Ｒｈｏ−非依存性ターミネ
   ーター配列を含有することを特徴とするストレプトミセ
   ス属発現ベクター。
2. （２）該ターミネーター配列がビイ・ズブチリス（Ｂ．
   ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ファージφ２９に由来するものであ
   るか、またはそれと同等のものであるか、あるいはそれ
   らのいずれかの機能性突然変異体形であることを特徴と
   する特許請求の範囲第（１）項記載のベクター。
3. （３）該停止配列がφ２９のＴＤ１配列に対応すること
   を特徴とする特許請求の範囲第（１）項または第（２）
   項記載のベクター。
4. （４）該停止配列がφ２９ゲノムのｎｔ１７２６５およ
   びｎｔ１７３０４間に位置するターミネーター領域に対
   応することを特徴とする特許請求の範囲第（１）項〜第
   （３）項いずれか１項に記載のベクター。
5. （５）さらに異種プロモーターを含有することを特徴と
   する特許請求の範囲第（１）項〜第（４）項いずれか１
   項に記載のベクター。
6. （６）該プロモーターがφ２９に由来するものであるか
   、またはそれに同等のものであるか、あるいはそれらの
   いずれかの機能性突然変異体形であることを特徴とする
   特許請求の範囲第（５）項記載のベクター。
7. （７）プロモーターを含有し、該プロモーターとターミ
   ネーターの間に位置する発現配列を有することを特徴と
   する特許請求の範囲第（１）〜第（６）項いずれか１項
   に記載のベクター。
8. （８）プロモーターを含有し、該プロモーターとターミ
   ネーターの間に少なくとも１つの制限部位を有すること
   を特徴とする特許請求の範囲第（１）項〜第（７）項い
   ずれか１項に記載のベクター。
9. （９）プラスミドｐＳＨＴ３またはｐＳＨＴ５。
10. （１０）特許請求の範囲第（１）項〜第（９）項いずれ
    かに記載のベクターまたはプラスミドを含有するストレ
    プトミセス属宿主細胞。
11. （１１）エス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）で
    あることを特徴とする特許請求の範囲第（１０）項記載
    の宿主細胞。
12. （１２）特許請求の範囲第（１０）項または第（１１）
    項記載の宿主を用いることを特徴とする蛋白についての
    発現系。