JPH0246284A - Production of human alpha-phetoprotein - Google Patents
Production of human alpha-phetoproteinInfo
- Publication number
- JPH0246284A JPH0246284A JP63185312A JP18531288A JPH0246284A JP H0246284 A JPH0246284 A JP H0246284A JP 63185312 A JP63185312 A JP 63185312A JP 18531288 A JP18531288 A JP 18531288A JP H0246284 A JPH0246284 A JP H0246284A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- fetoprotein
- human
- albumin
- cells
- supernatant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 102000013529 alpha-Fetoproteins Human genes 0.000 claims abstract description 54
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 claims abstract description 54
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 25
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims abstract description 20
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 19
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims abstract description 11
- 101000827785 Homo sapiens Alpha-fetoprotein Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 101000848653 Homo sapiens Tripartite motif-containing protein 26 Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 102000046101 human AFP Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims abstract description 10
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 9
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 8
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 claims abstract description 8
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 claims abstract description 8
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 claims abstract description 8
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 claims abstract description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 claims abstract 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 31
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims description 26
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 claims description 18
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 13
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 claims description 13
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 claims description 8
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 5
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 3
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 2
- 102000004641 Fetal Proteins Human genes 0.000 claims 1
- 108010003471 Fetal Proteins Proteins 0.000 claims 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 abstract description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract description 3
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 abstract description 2
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 abstract description 2
- 102100027211 Albumin Human genes 0.000 abstract 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 abstract 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 abstract 1
- 229910003424 Na2SeO3 Inorganic materials 0.000 abstract 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 abstract 1
- 239000011781 sodium selenite Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 41
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 21
- 102100023635 Alpha-fetoprotein Human genes 0.000 description 17
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 4
- ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N ammonium persulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 4
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 4
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 3
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 229910001870 ammonium persulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 2
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 2
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 2
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002572 Alpha-Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010068307 Alpha-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001051742 Eacles Species 0.000 description 1
- BKAYIFDRRZZKNF-VIFPVBQESA-N N-acetylcarnosine Chemical compound CC(=O)NCCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 BKAYIFDRRZZKNF-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 101150085390 RPM1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010043276 Teratoma Diseases 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 208000001608 teratocarcinoma Diseases 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
るための方法及び手段、腫瘍に関連する抗原(特に診断
及び治療の分野に適する)に係る。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to methods and means for detecting tumor-associated antigens, particularly suitable for the fields of diagnosis and therapy.
α−フェトプロテイン(以下、AFPとして示す)は、
構造的にアルブミンに類似した胎児性αーグロプリンで
ある。α-fetoprotein (hereinafter referred to as AFP) is
It is a fetal alpha-globulin that is structurally similar to albumin.
AFPの多くは、胎児血清中に存在し、出生後急速に減
少し、健康な成人では1−6μ9/Qに減少するが、奇
形層、ヘパトパシー、原発性悪性肝癌の患者及び胎児性
病理体質(foetal pathologicsta
tus)の者では、ヒト体液中のAFP a度はかなり
増加する。Most of AFP exists in fetal serum and rapidly decreases after birth, decreasing to 1-6μ9/Q in healthy adults, but in patients with teratoma, hepatopathy, primary malignant liver cancer, and fetal pathologies ( fossil pathologica
tus), AFP a levels in human body fluids are significantly increased.
血清中又は他の体液中におけるAFPの定量は、上述の
病態の診断及び適切な治療の評価の基本的かっ実用的な
臨床上のパラメータである。Quantification of AFP in serum or other body fluids is a fundamental and practical clinical parameter for the diagnosis of the above-mentioned pathological conditions and evaluation of appropriate treatment.
AFPの定量に一般的に使用されている免疫法は、特殊
な抗体の調製用及び対照基準用に多量の純粋なα−フェ
トプロテインを必要とする。Immunization methods commonly used for the quantification of AFP require large amounts of pure α-fetoprotein for the preparation of specific antibodies and for control standards.
現在、α−フェトプロテインは謄帯中の血液、胎児の血
液及び原発性悪性肝癌の患者の腹水からの抽出及び精製
によって得られている。Currently, α-fetoprotein is obtained by extraction and purification from tracheal blood, fetal blood, and ascites fluid of patients with primary malignant liver cancer.
しかしながら、かかる方法は、特に使用する原料の点で
必ずしも満足できるものではない。However, such methods are not always satisfactory, especially in terms of the raw materials used.
実際、このような原料の使用には制限があり、しかも該
原料が変化しやすいものであるため、αフェトプロティ
ンを再現性をもって多量に調製することができない。さ
らに、これら原料中には、血清タンパク (特にアルブ
ミン)がAPPよりもかなり高い濃度で存在するため、
煩雑でありかつ必ずしも十分ではない精製法を使用する
必要がある。たとえば、イミュノアフィニティー(im
munoaff inity)を利用する精製法(B.
NoorgardPedersen rScard.
J. lmmunol. Suppl.J 4
(1976)M.M. Baig 「アナリティカ
ル・バイオケミストリー (Anal. Bioche
m.)J (1980)、101、200)では、良好
な純度を有するα−フェトプロテインを得ることが可能
となるが、なお抗−α−フェトプロテイン抗体と反応し
うる部分的に減成又は断片化された物質を精製物質から
除去することはできない。さらに、イミュノアフィニテ
ィーカラムからの溶出法では、溶出液中に存在するAF
Pを変性させる。In fact, there are limits to the use of such raw materials, and because they are easily variable, α-fetoprotein cannot be reproducibly prepared in large amounts. Furthermore, since serum proteins (particularly albumin) are present in these raw materials at much higher concentrations than APP,
It is necessary to use purification methods that are complicated and not always sufficient. For example, immunoaffinity (im
Purification method using munoaff inity (B.
NoorgardPedersen rScard.
J. lmmunol. Suppl. J4
(1976) M. M. Baig “Analytical Biochemistry (Anal.
m. ) J (1980), 101, 200) makes it possible to obtain α-fetoprotein with good purity, but with partially degraded or fragmented α-fetoprotein that can still react with anti-α-fetoprotein antibodies. Substances cannot be removed from purified materials. Furthermore, in the elution method from the immunoaffinity column, the AF present in the eluate
Denatures P.
このように、従来から、α−フェトプロテインの調製の
ための手段と共に、簡単で、再現性がありかつ安価な方
法(上述の問題点が解消される)が求められている。Thus, there has been a need for a simple, reproducible and inexpensive method (which eliminates the above-mentioned problems) as well as a means for the preparation of alpha-fetoprotein.
本発明によれば、主タンパク成分としてα−フェトプロ
テインを分泌するが、該α−フェトプロテインに比べて
無視できる量でのみアルブミンを分泌するヒト肝癌細胞
を使用して行う方法により、かかる要求を満足できる。According to the present invention, such requirements can be met by a method using human hepatoma cells that secrete α-fetoprotein as a main protein component, but secrete albumin only in an amount negligible compared to α-fetoprotein. .
さらに、本発明の目的は、炭素源、窒素源、無機塩及び
ビタミンを含有し、ペニシリンG1ストレプトマイシン
及びNa.SeOsを添加したウシ胎仔血清を含有しな
い液体培地で、主タンパク成分としてα−フェトプロテ
インを分泌するが、α−フェトプロテインに比べて無視
できる量でのみアルブミンを分泌するヒト肝癌細胞を培
養し、得られたα−フェトプロテインを非変性条件下で
分離、精製することからなるヒトα−フェトプロテイン
、腫瘍と関連する抗原(診断及び治療の分野で有用)の
調製法を提供することにある。Furthermore, the object of the present invention is to contain carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts and vitamins, penicillin G1 streptomycin and Na. Human hepatoma cells, which secrete α-fetoprotein as the main protein component, but only in negligible amounts compared to α-fetoprotein, were cultured in a liquid medium containing no fetal bovine serum supplemented with SeOs. The present invention provides a method for preparing human α-fetoprotein, a tumor-associated antigen (useful in the diagnostic and therapeutic fields), which comprises separating and purifying α-fetoprotein under non-denaturing conditions.
本発明の他の目的は、得られたα−フェトプロテインを
特殊なモノクロナール及びポリクロナール抗体の製造に
使用することにある。Another object of the invention is to use the obtained α-fetoprotein for the production of specific monoclonal and polyclonal antibodies.
本発明のさらに他の目的は、治療の分野において、原発
性肝性腫瘍に対する医薬組成物の調製のため、診断の分
野においてへパトパシー、原発性肝性腫瘍、奇形癌及び
胎児性フィジオパソロジーズ(physiopatho
logies)の決定のために、上記抗体を使用するこ
とにある。Yet another object of the invention is in the field of therapy for the preparation of pharmaceutical compositions against primary hepatic tumors, in the field of diagnostics against hepatopathy, primary hepatic tumors, teratocarcinomas and fetal physiopathologies. (physiopath
The objective is to use the above-mentioned antibodies for the determination of
さらに本発明の他の目的は、AFP及び上記抗体を使用
するヒト臨床サンプル中のα−フェトプロテインの定量
用キットを提供することにある。Yet another object of the present invention is to provide a kit for quantifying α-fetoprotein in human clinical samples using AFP and the above-mentioned antibodies.
本発明は、炭素源、窒素源、無機塩及びビタミンを含有
し、ペニシリンG、ストレプトマイシン及びNatSe
O3を添加したウシ胎仔血清を含有しない培地で馴化し
たヒト肝癌細胞は、主タンパク成分としてα−フェトプ
ロテインを分泌するが、AFPに比べて無視できる量で
のみアルブ′ミンを分泌するとの驚くべき知見に基づく
ものである。かかる細胞がこのような特性を得たことに
より、本発明の方法の実現が可能となる。The present invention contains carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts and vitamins, including penicillin G, streptomycin and NatSe.
Surprising finding that human hepatoma cells conditioned in O3-supplemented medium without fetal bovine serum secrete α-fetoprotein as the main protein component, but only in negligible amounts compared to AFP. It is based on The acquisition of such properties by such cells makes it possible to implement the method of the present invention.
本発明によるヒトα−フェトプロテインの製法は、
(a)炭素源、窒素源、無機塩及びビタミンを含有し、
ペニシリンG1ストレプトマイシン及びNatSeO+
を添加したウシ胎仔血清を含有しない液体培地中、主タ
ンパク成分としてα−フェトプロテインを分泌するが、
該α−フェトプロテインに比べて無視できる量でのみア
ルブミンを分泌するヒト肝癌細胞を約37℃で培養し、
(b)細胞破壊物質から粗製のα−フェトプロテインを
含有する上澄み液を分離し、
(c)該粗製のα−フェトプロテインを上澄み液から分
離し、調製ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動によ
って精製する、
各工程を包含する。The method for producing human α-fetoprotein according to the present invention comprises: (a) containing a carbon source, a nitrogen source, an inorganic salt and a vitamin;
Penicillin G1 streptomycin and NatSeO+
α-fetoprotein is secreted as the main protein component in a liquid medium containing no fetal bovine serum, but
culturing human hepatoma cells that secrete albumin in negligible amounts compared to the α-fetoprotein at about 37°C;
(b) separating a supernatant containing crude alpha-fetoprotein from the cell disruption material; (c) separating the crude alpha-fetoprotein from the supernatant and purifying it by electrophoresis on a preparative polyacrylamide gel; Includes each step.
本発明による方法に適する肝細胞は、ヒト肝癌細胞であ
る。Hepatocytes suitable for the method according to the invention are human hepatoma cells.
これらの中でも、大きい分化度を有し、最少量ではあっ
てもα−フェトプロテインを生産しうるヒト肝癌細胞で
ある。Among these are human hepatoma cells that have a high degree of differentiation and can produce α-fetoprotein, albeit in minimal amounts.
本発明によれば、公知の一般的方法に従って操作してか
かる細胞を膨張(expand)させ、ついでウシ胎仔
血清を含有しない培地中での培養によって馴化させる。According to the invention, such cells are expanded by manipulation according to known general methods and then conditioned by culturing in a medium containing no fetal bovine serum.
実際には、ウシ胎仔血清(10重量%)を添加した最小
培地(MEM)中、37℃、Co、 5%及び空気95
%を含有する雰囲気(湿度90%)下で少なくとも2週
間細胞を培養することによって細胞の膨張を行う。In practice, the culture was carried out at 37°C in minimal medium (MEM) supplemented with fetal bovine serum (10% by weight), Co, 5% and air 95%.
Expansion of the cells is performed by culturing the cells for at least 2 weeks under an atmosphere (90% humidity) containing %.
この間に、ウシ胎仔血清を添加した同量の同じ培地によ
って1週間光たり少なくとも2回培地を交換し、カンフ
ルエンス(conNuence)に達した細胞を、トリ
プシン0.25%、0.536 mM EDTA及び5
mM NaOHを含有するEarle塩溶液による室温
(20−25℃)、約20分間でのトリプシン処理によ
って分離する。During this time, the medium was changed at least twice every week with the same volume of the same medium supplemented with fetal bovine serum, and the cells that had reached confluence were incubated with trypsin 0.25%, 0.536 mM EDTA and 5
Separate by trypsinization with Earle's salt solution containing mM NaOH at room temperature (20-25° C.) for approximately 20 minutes.
このようにして分離した細胞を、ウシ胎仔血清をプラス
した同じ最小培地を収容するフラスコに、lCw”当た
り細胞5X to’個が分布するように接種する。The cells thus isolated are inoculated into flasks containing the same minimal medium plus fetal bovine serum at a distribution of 5X to' cells per lCw''.
膨張工程終了後、細胞を集め、炭素源、窒素源、無機塩
、ビタミンを含有し、ペニシリンG (50H/ff1
2)、ストレプトマイシン(501N9/MQ)、Na
2SeO3(3X 10−’ M)を添加したウシ胎仔
血清を含有しない液状培地を収容するフラスコに接種す
ることによって馴化させる。After the expansion step, the cells were collected and treated with penicillin G (50H/ff1) containing carbon source, nitrogen source, inorganic salts, and vitamins.
2), streptomycin (501N9/MQ), Na
Acclimation is achieved by inoculating flasks containing liquid medium without fetal bovine serum supplemented with 2SeO3 (3X 10-'M).
このような馴化工程は、37℃又はこれに近い温度、C
o、 5%及び空気95%を含有する雰囲気(湿度90
%)下で少なくとも3週間行なわれる。Such an acclimatization step may be carried out at a temperature of or near 37°C, C
o, 5% and an atmosphere containing 95% air (humidity 90%
%) for at least 3 weeks.
培地を定期的に同量の同じ培地で交換し、カンフルエン
スに達した細胞を、上述の組成を有するEarle塩溶
液による室温、約3分間でのトリプシン処理によって分
離する。The medium is periodically replaced with the same volume of the same medium, and cells that have reached confluence are separated by trypsinization for about 3 minutes at room temperature with Earle's salt solution having the composition described above.
この間に、培地中に分泌されたAFP及びアルブミンの
量をポリアクリルアミドゲル上での電気泳動分析によっ
て定量して、細胞の馴化をチエ”7りする。During this time, the amounts of AFP and albumin secreted into the medium are quantified by electrophoretic analysis on polyacrylamide gels to check the conditioning of the cells.
得られた結果(第1図及び第2図に示す)は、AFPが
15%から40%に増加し、アルブミンが40%から総
タンパク質の3%以下に減少したことを示す。The results obtained (shown in Figures 1 and 2) show that AFP increased from 15% to 40% and albumin decreased from 40% to less than 3% of total protein.
実際には、炭素源、窒素源、無機塩、ビタミンを含有し
、ペニシリンG1ストレプトマイシン及びNaxSe0
3を添加したウシ胎仔血清を含有しない液状培地を収容
する培養フラスコに細胞を接種し、37℃又ははこれに
近い温度で培養する。In fact, it contains carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts, vitamins, penicillin G1 streptomycin and NaxSe0
Cells are inoculated into culture flasks containing a liquid medium containing no fetal bovine serum supplemented with No. 3 and cultured at or near 37°C.
各フラスコから定期的に培地を集め、同量の同じ培地で
交換し、遠心分離して細胞破壊物質から上澄み液を分離
する。Periodically collect the medium from each flask, replace it with an equal volume of the same medium, and centrifuge to separate the supernatant from cell disruption material.
上澄み液(α−フェトプロテイン:アルブミンの重量比
=10:lないし20:1で粗製のα−フェトプロテイ
ン及びアルブミンを含有する)を併わせ、初期容量に比
べて約1/LO−1/20の容量に濃縮し、精製する。Combine the supernatant liquid (containing crude α-fetoprotein and albumin at an α-fetoprotein:albumin weight ratio of 10:1 to 20:1) and make a volume of approximately 1/LO-1/20 compared to the initial volume. Concentrate and purify.
上澄み液中に存在するアルブミンの量はAFPよりも少
ないため、簡単な精製法を使用し、温和な操作条件を利
用できる。Since the amount of albumin present in the supernatant is lower than that of AFP, simple purification methods can be used and mild operating conditions can be utilized.
本発明の方法では、調製ポリアミドゲル上での電気泳動
によってα−フェトプロテインを精製する。このように
して操作することにより、上澄み液中に存在するアルブ
ミン(電荷のため、APPとは異なった移動を示す)は
完全に分離され、マイナス条件下のα−フェトプロテイ
ンが得られる。In the method of the invention, α-fetoprotein is purified by electrophoresis on preparative polyamide gels. By operating in this manner, the albumin present in the supernatant (which exhibits a different migration than APP due to its charge) is completely separated and α-fetoprotein under negative conditions is obtained.
電気泳動による精製は、 0.024M )リス緩衝液
、0.19Mグリシン(pH8,3)にポリアクリルア
ミドゲル(組成を実施例2に示す)を入れ、1口ないし
15mAに相当する電位差を12ないし16時間印加す
ることによって行なわれる。Purification by electrophoresis was performed by placing a polyacrylamide gel (composition shown in Example 2) in 0.024 M Lys buffer and 0.19 M glycine (pH 8.3), and applying a potential difference of 1 to 15 mA to 12 to 15 mA. This is done by applying it for 16 hours.
この時間の経過後、α−フェトプロテインを含有するゲ
ル部分を同定し、単離し、11−2xの立法体に切断す
る。ついで、このゲル立法体を50mMトリス緩衝液(
pH8J)に入れ、温度的4℃で撹拌する操作を少なく
とも2回行うことにょてα−フェトプロテインを溶出す
る。After this period of time, the portion of the gel containing alpha-fetoprotein is identified, isolated, and cut into 11-2x cubes. This gel cube was then dissolved in 50mM Tris buffer (
α-fetoprotein is eluted by adding the mixture to pH 8J) and stirring at a temperature of 4° C. at least twice.
溶出液を併ゎせ、2回遠心分離して残留アクリルアミド
を分離し、約1/10の容量に濃縮し、最後に凍結乾燥
する。The eluates are combined, centrifuged twice to separate residual acrylamide, concentrated to about 1/10 volume, and finally freeze-dried.
このようにして、純度98%以上のα−フェトプロテイ
ンが得られる。ウェスタンプロット分析(抗ヒトアルブ
ミン抗体を使用する)では、得られたα−フェトプロテ
インが実際にアルブミンを含有していないことを示す。In this way, α-fetoprotein with a purity of 98% or more is obtained. Western blot analysis (using an anti-human albumin antibody) shows that the α-fetoprotein obtained does not actually contain albumin.
従来技術では、α−フェトプロテインの調製の問題が本
発明の如き簡単な方法によって解決されることは予測さ
れえない。In the prior art, it could not be foreseen that the problem of preparing α-fetoprotein would be solved by a simple method such as the present invention.
事実、肝癌細胞が主タンパク成分としてα−フェトプロ
テインを生産し、同時に無視できるほど少量のアルブミ
ンを分泌することは予測され得なかったことである。In fact, it could not have been predicted that hepatoma cells produce α-fetoprotein as the main protein component and at the same time secrete negligible amounts of albumin.
これまで知られていないこれらの特性を有する細胞の使
用によって、本発明の方法が初めて可能になった。The use of cells with these hitherto unknown properties made the method of the invention possible for the first time.
かかる方法は、当分野における現状に比べて顕著な利点
を示し、中でも、実施の容易性、α−フェトプロテイン
の高収率及び再現性が達成される。Such a method exhibits significant advantages over the current state of the art, among which ease of implementation, high yields of α-fetoprotein and reproducibility are achieved.
本発明によれば、後者の利点は、操作を唯一の一定した
AFP源を使用して行うとの事実によるものである。According to the invention, the latter advantage is due to the fact that the operation is performed using only one constant AFP source.
従って、本発明の方法に従って得られたα−フェトプロ
テインは、診断用キットの国際的標準化、及び公知の一
般的方法によって得られるモノクロナール及びポリクロ
ナール抗体(診断及び治療の分野で有用)の調製に特に
適している。The α-fetoprotein obtained according to the method of the invention is therefore particularly suitable for the international standardization of diagnostic kits and the preparation of monoclonal and polyclonal antibodies (useful in the diagnostic and therapeutic fields) obtained by known general methods. Are suitable.
図面について詳述する。The drawings will be explained in detail.
第1図
分析用ポリアクリルアミドゲル(PAGE)に関して得
られた結果を示す。FIG. 1 shows the results obtained on analytical polyacrylamide gel (PAGE).
L: 馴化開始時の肝癌細胞から得られた上澄み
液は、AFP及びアルブミンに
相当する2つのバンドの存在を示す。L: Supernatant obtained from hepatoma cells at the beginning of acclimation shows the presence of two bands corresponding to AFP and albumin.
2: 馴化した細胞から得られた上澄み液ンドの
幅による)。2: depending on the width of the supernatant obtained from the conditioned cells).
10及び11:ミクロキャリヤー上の培養物からの馴化
していない肝癌細胞から得られ
た上澄み液は、アルブミンに相当す
るバンドを示す。10 and 11: Supernatants obtained from unacclimated hepatoma cells from cultures on microcarriers show bands corresponding to albumin.
12、13 馴化工程の間に肝癌細胞から得られ
及び14: た上澄み液は、アルブミンのバンドが
徐々に消失することを示す。12,13 The supernatant obtained from hepatoma cells during the conditioning step shows that the albumin band gradually disappears.
実施例1
肝癌細胞の馴化
肝癌細胞1ep G2 (Knowlesら[サイエン
ス(Science)j (1980)、 209.
p497−499)を、ウシ胎仔血清10%を含有する
最小培地MEM (Eacle H。Example 1 Acclimation of hepatoma cells Hepatoma cells 1ep G2 (Knowles et al. [Science (1980), 209.
p497-499) in minimal medium MEM (Eacle H) containing 10% fetal bovine serum.
「サイエンスJ (1959)、 130. p 43
2−437) 1011(2を収容する4個の培養フラ
スコに接種し、37℃、CO。“Science J (1959), 130. p 43
2-437) 1011 (2-437) inoculated into four culture flasks containing 2-437) at 37°C, CO.
5%及び空気95%でなる雰囲気(湿度90%)下で2
週間インキュベーションした。2 in an atmosphere consisting of 5% and 95% air (90% humidity)
Incubated for a week.
培地を1週間につき2回交換し、カンフルエンスに達し
た細胞を、トリプシン0.25%、EDTAO,536
mM及びNaOH5+nMを含有するEarle塩溶液
(J、R,Earle rJ、 Natl、 Canc
er In5tl (1943)。The medium was changed twice a week, and cells that reached confluence were treated with trypsin 0.25%, EDTAO, 536
Earle salt solution containing mM and NaOH5+nM (J, R, Earle rJ, Natl, Canc
er In5tl (1943).
p 165.4) 5翼Qを使用する37℃、20分間
でのトリプシン処理によって分離した。p 165.4) Separated by trypsinization using a 5-wing Q at 37°C for 20 minutes.
このようにして分離した細胞を、同じ培地25村を収容
する4個のフラスコ(175cx″)に、1cjI″当
たり細胞5.0000個が分布するように再度接種した
。The cells thus isolated were re-inoculated into 4 flasks (175cx'') containing 25 cells of the same medium at a distribution of 5.0000 cells per cjI''.
上述の如く操作することによって、さらに2週間後に、
肝癌細胞を収容する4個のフラスコ(175cJI”)
を得た。By operating as described above, after another two weeks,
4 flasks containing liver cancer cells (175cJI”)
I got it.
ついで、上述と同じ条件下でのトリプシン処理によって
細胞を解放し、RPMI 1640培地(GIBCO)
(Na2SeO33x10−”M、ペニシリンG5o1
19/11Q及びストレプトマイシン50x9h(lを
添加し、ウシ胎仔血清を含有しないもの) 25tnQ
を収容する8個ノフラスコ(175cR″)ニ、lcR
″当たり細胞50000個が分布するように接種した。Cells were then released by trypsinization under the same conditions as described above and placed in RPMI 1640 medium (GIBCO).
(Na2SeO33x10-”M, penicillin G5o1
19/11Q and streptomycin 50x9h (added with l and without fetal bovine serum) 25tnQ
8 flasks (175cR″) containing 2, lcR
The cells were inoculated so that 50,000 cells per cell were distributed.
上述と同じ条件下、37℃に少なくとも3週間維持し、
その間に、1週間当たり2回、培地を同量の同じ培地で
交換した。maintained at 37° C. for at least 3 weeks under the same conditions as described above;
During that time, the medium was replaced with the same volume of the same medium twice per week.
カンフルエンスに達した細胞を、室温、3分間でのトリ
プシン処理によって分離し、同じRPM11640培地
を収容する他のフラスコに再度接種した。Cells that reached confluence were detached by trypsinization for 3 minutes at room temperature and re-inoculated into another flask containing the same RPM11640 medium.
さらに2週間後、肝癌細胞は完全に馴化された。After another two weeks, the hepatoma cells were completely acclimatized.
すなわち、培地中に多量のα−フェトプロテインを分泌
し、AFPに比べて無視できる量でのみアルブミンを分
泌するようになった。That is, a large amount of α-fetoprotein was secreted into the medium, and albumin was secreted only in an amount negligible compared to AFP.
各種の馴化工程の間に生産されたα−フェトプロテイン
及びアルブミンの農度の変化を、Laeml i(rN
atureJ 227. p 6g0−685. (1
970) )に従い、硫酸ナトリウムドデンル(SDS
)の不存在下、非変性条件下での電気泳動によって定量
し、得られた結果を第1図及び第2図に示した。The changes in the yield of α-fetoprotein and albumin produced during various acclimatization steps were measured using Laemli (rN
atureJ 227. p 6g0-685. (1
Sodium sulfate (SDS)
) was quantitated by electrophoresis under non-denaturing conditions, and the results are shown in FIGS. 1 and 2.
上澄み液中のAPP及びアルブミンは、総タンパク質の
15%から40%へ、及び40%から3%以下へとそれ
ぞれ変化した。APP and albumin in the supernatant varied from 15% to 40% and from 40% to less than 3% of total protein, respectively.
実施例2
a)馴化肝癌細胞からヒトα−フェトプロテインの調製
実施例1に記載の如くして馴化したHep G2細胞を
、RPMl 1640培地(GIBCO)(NazSe
Os 3x10−8M。Example 2 a) Preparation of human α-fetoprotein from conditioned hepatoma cells Hep G2 cells conditioned as described in Example 1 were cultured in RPM1 1640 medium (GIBCO) (NazSe
Os 3x10-8M.
ペニシリンG 50m9hQ及びストレプトマイシン5
0mg/mQを添加したもの) 30mQを収容する1
00個のフラスコ(175cx”)に接種した。Penicillin G 50m9hQ and streptomycin 5
0mg/mQ added) 1 containing 30mQ
00 flasks (175cx'') were inoculated.
フラスコを37℃、0025%及び空気95%でなる雰
囲気(湿度90%)下で45日間インキュベートし、そ
の間に、培地を定期的に集め、細胞破壊物から物質を除
去するため遠心分離し、同じ培地で交換した。上澄み液
を併わせ、−30℃で保存した。The flasks were incubated for 45 days at 37°C under an atmosphere consisting of 0.0025% and 95% air (90% humidity), during which time the medium was periodically collected, centrifuged to remove material from cell debris, and the same Replaced with medium. The supernatants were combined and stored at -30°C.
このように操作して、最初の15日間で、粗製αフラス
コ43mg/Q及びアルブミン約219/Qを含有する
上澄み液2012を集めた。Operating in this manner, 2012 supernatants containing 43 mg/Q of crude alpha flask and approximately 219/Q of albumin were collected during the first 15 days.
b)α−フェトプロテインの精製
上述の工程a)で得られた上澄み液5Q (粗製AFP
215xyを含有する)を、Minitanシステム
(M i l l 1pore社)、排除力(excl
usion power)10000ドルトン以下のス
ラブを使用して、最終容量的400πQに濃縮した。つ
いで、濃縮物を、変性剤の不存在下、調製ポリアクリル
アミドゲル(PAGE)上に量12mQ’として充填し
た。b) Purification of α-fetoprotein Supernatant 5Q obtained in step a) above (crude AFP
215xy), the Minitan system (M.
A slab of less than 10,000 daltons was used to concentrate to a final volumetric volume of 400πQ. The concentrate was then loaded in a volume of 12 mQ' onto a preparative polyacrylamide gel (PAGE) in the absence of denaturing agents.
この調製ゲル(170x 135x 4.5mm)は、
アクリルアミド10%、ビスアクリルアミド0.266
%、トリス(pHL3) OJ74M、過硫酸アンモニ
ウム0.05%、TEMED (N、N、N’、N’−
テトラメチル−エチレンジアミン) 0.083%であ
る。This prepared gel (170x 135x 4.5mm) is
Acrylamide 10%, bisacrylamide 0.266
%, Tris (pHL3) OJ74M, ammonium persulfate 0.05%, TEMED (N, N, N', N'-
Tetramethyl-ethylenediamine) 0.083%.
これらゲル上に、アクリルアミドゲル3.75%、ビス
アクリルアミド0,1%、トリス(pH6,8)0.1
25M、過硫酸アンモニウム0.05%、TEMEDO
,083%でなるゲル(25x 130x 4.5mm
)を積層した。On these gels, acrylamide gel 3.75%, bisacrylamide 0.1%, Tris (pH 6,8) 0.1
25M, ammonium persulfate 0.05%, TEMEDO
,083% gel (25x 130x 4.5mm
) were laminated.
0.0247M トリス緩衝液、0.19Mグリシン(
pH8,3)中、15 mA/ゲルで16時藺泳動させ
た。0.0247M Tris buffer, 0.19M glycine (
The gel was run for 16 hours at 15 mA/gel in pH 8.3).
電気泳動終了後、緩衝液からゲルを取出し、両辺から約
1ciのストリップ及び約0.3cMの中央部ストリッ
プを切出し、残りのゲルを一20℃で保存した。ストリ
ップ中のα−フェトプロテインをクマシーブルーで染色
後、これらストリップを残りのゲルと整合し、AFP含
有ゲル部分を同定した。After the electrophoresis was completed, the gel was removed from the buffer, a strip of approximately 1 ci from both sides and a central strip of approximately 0.3 cM was cut out, and the remaining gel was stored at -20°C. After staining the α-fetoprotein in the strips with Coomassie blue, the strips were aligned with the rest of the gel to identify the AFP-containing gel portion.
これらのゲル部分を分離し、1−2Hの立法体に切断し
、ゆるやかに撹拌しながら50mM )リス緩衝液(p
H8,3) 6’mQ/ゲル中で2回溶出した(合計2
0時間)。These gel parts were separated, cut into 1-2H cubes, and added to 50mM) Lys buffer (p
H8,3) Eluted twice in 6'mQ/gel (total 2
0 hours).
溶出液(主タンパク成分としてAFPを含有する)を2
回遠心分離して残留アクリルアミドを除去し、減圧フィ
ルターMillipore CX 30を使用して約1
710に濃縮し、凍結乾燥した。The eluate (containing AFP as the main protein component) was
Centrifuge twice to remove residual acrylamide and use a vacuum filter Millipore CX 30 to remove ca.
710 and lyophilized.
このようにして、上澄み液1eから、純度9899%を
有するα−フェトプロテイン19mgが得られた(収率
45%)。In this way, 19 mg of α-fetoprotein with a purity of 9899% was obtained from the supernatant 1e (yield 45%).
抗ヒトアルブミン抗体を使用したウェスタンプロット分
析では、得られたα−フェトプロテインがアルブミンを
含有しないことを示した。Western blot analysis using an anti-human albumin antibody showed that the resulting α-fetoprotein did not contain albumin.
第2図に、調製分析用ゲル(PAGE)によって得られ
た結果を、上述の如く精製した各種の量のα−フェトプ
ロテイン(2,3,4及び5)を市販のα−フェトプロ
テイン(6,7,8)と比較して示す。Figure 2 shows the results obtained by preparative analytical gel (PAGE), comparing various amounts of α-fetoprotein (2, 3, 4 and 5) purified as described above with commercially available α-fetoprotein (6, 7). , 8).
これにより、わずかな不均一性が認められる。This allows slight non-uniformity to be observed.
第1図及び第2図は、本発明の方法に従って操作する際
における馴化によるAFP及びアルブミンの量の変化及
び精製による効果を示すポリアクリルアミドゲル電気泳
動の結果を示す写真である。
(ほか1名)FIGS. 1 and 2 are photographs showing the results of polyacrylamide gel electrophoresis showing changes in the amounts of AFP and albumin due to acclimatization and the effects of purification when operating according to the method of the present invention. (1 other person)
Claims (1)
するが、該α−フェトプロテインに比べて無視できる量
でのみアルブミンを分泌するヒト肝癌細胞。 2 請求項1記載のものにおいて、分泌されるα−フェ
トプロテイン及びアルブミンの重量比が10:1ないし
20:1である、ヒト肝癌細胞。 3 請求項1又は2記載のものにおいて、炭素源、窒素
源、無機塩及びビタミンを含有し、ペニシリンG、スト
レプトマイシン及びNa_2SeO_3を添加したウシ
胎仔血清を含有しない液状培地中、37℃又は37℃付
近の温度、α−フェトプロテイン及びアルブミンを相互
比10:1ないし20:1で得るに必要な時間でヒト肝
癌細胞を馴化して得られたものである、ヒト肝癌細胞。 4 ヒトα−フェトプロテインを製造する方法において
、 (a)請求項1ないし3記載のヒト肝癌細胞を、炭素源
、窒素源、無機塩及びビタミンを含有し、ペニシリンG
、ストレプトマイシン 及びNa_2SeO_3を添加したウシ胎仔血清を含有
しない液体培地中、約37℃で培養し、 (b)細胞破壊物質を培地から分離し、主タンパク成分
として粗製のα−フェトプロテインを含有する上澄み液
を回収し、 (c)該粗製のα−フェトプロテインを上澄み液から分
離し、調製ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動によ
って精製する ことを特徴とする、ヒトα−フェトプロテインの製法。 5 請求項4記載の製法において、前記工程(a)で使
用する培地がRPMI1640である、ヒトα−フェト
プロテインの製法。 6 請求項4記載の製法において、前記工程(b)にお
ける上澄み液の分離を3000rpm.10分間の遠心
分離によって行う、ヒトα−フェトプロテインの製法。 7 請求項4記載の製法において、前記工程(c)にお
ける電気泳動を、トリス緩衝液(pH8.3)中、20
−25℃、電流10ないし15mA/ゲル、12ないし
16時間で行う、ヒトα−フェトプロテインの製法。 8 請求項4−7記載の製法によって得られたα−フェ
トプロテインを、特殊なモノクロナール及びポリクロナ
ール抗体の調製に使用する、ヒトα−フェトプロテイン
の使用法。9 請求項8記載の抗体を、ヒト原発性肝癌
の治療用組成物の調製に使用する、モノクロナール及び
ポリクロナール抗体の使用法。 10 請求項8記載の抗体を、ヒト体液中においてα−
フェトプロテインの増加を生ずる疾患の診断に使用する
、モノクロナール及びポリクロナール抗体の使用法。 11 生物学的ヒトサンプル中におけるα−フェトプロ
テインの定性及び定量用の診断キットにおいて、請求項
4−8記載の方法によって得られたα−フェトプロテイ
ン及び特殊なモノクロナール及びポリクロナール抗体を
使用したものであることを特徴とする、α−フェトプロ
テイン診断用キット。[Scope of Claims] 1. A human hepatoma cell that secretes α-fetoprotein as a main protein component, but secretes albumin only in an amount negligible compared to α-fetoprotein. 2. The human hepatoma cell according to claim 1, wherein the weight ratio of secreted α-fetoprotein and albumin is 10:1 to 20:1. 3. In the product according to claim 1 or 2, in a liquid medium containing a carbon source, a nitrogen source, an inorganic salt, and a vitamin, and containing no fetal bovine serum and supplemented with penicillin G, streptomycin, and Na_2SeO_3, at or around 37°C. human hepatoma cells, which are obtained by acclimatizing human hepatoma cells at a temperature of 10:2 and for a time necessary to obtain α-fetoprotein and albumin in a mutual ratio of 10:1 to 20:1. 4. A method for producing human α-fetoprotein, wherein (a) the human liver cancer cells according to claims 1 to 3 are mixed with a carbon source, a nitrogen source, an inorganic salt, and a vitamin, and penicillin G
, cultured at about 37°C in a liquid medium containing no fetal bovine serum supplemented with streptomycin and Na_2SeO_3, (b) cell-disrupting substances are separated from the medium, and a supernatant containing crude α-fetoprotein as the main protein component is obtained. (c) separating the crude α-fetoprotein from the supernatant and purifying it by electrophoresis on a preparative polyacrylamide gel. 5. The method for producing human α-fetoprotein according to claim 4, wherein the medium used in step (a) is RPMI1640. 6. In the manufacturing method according to claim 4, the supernatant liquid in step (b) is separated at 3000 rpm. A method for producing human α-fetoprotein by centrifugation for 10 minutes. 7. In the manufacturing method according to claim 4, the electrophoresis in step (c) is performed in Tris buffer (pH 8.3) at 20%
A method for producing human α-fetoprotein, carried out at −25° C., current 10 to 15 mA/gel, 12 to 16 hours. 8. A method for using human α-fetoprotein, which comprises using α-fetoprotein obtained by the production method according to claims 4-7 for the preparation of special monoclonal and polyclonal antibodies. 9. A method of using monoclonal and polyclonal antibodies, wherein the antibody according to claim 8 is used for preparing a composition for treating primary human liver cancer. 10. The antibody according to claim 8 is α-
Methods of using monoclonal and polyclonal antibodies for the diagnosis of diseases causing increased fetoprotein. 11. A diagnostic kit for the qualitative and quantitative determination of α-fetoprotein in biological human samples, using α-fetoprotein obtained by the method according to claims 4-8 and specific monoclonal and polyclonal antibodies. An α-fetoprotein diagnostic kit characterized by the following.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63185312A JPH0246284A (en) | 1988-07-25 | 1988-07-25 | Production of human alpha-phetoprotein |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63185312A JPH0246284A (en) | 1988-07-25 | 1988-07-25 | Production of human alpha-phetoprotein |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0246284A true JPH0246284A (en) | 1990-02-15 |
Family
ID=16168647
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63185312A Pending JPH0246284A (en) | 1988-07-25 | 1988-07-25 | Production of human alpha-phetoprotein |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0246284A (en) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002534077A (en) * | 1999-01-06 | 2002-10-15 | アトランティック バイオファーマシューティカルズ インコーポレイティッド | Expression of secreted human alpha-fetoprotein in transgenic animals |
-
1988
- 1988-07-25 JP JP63185312A patent/JPH0246284A/en active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002534077A (en) * | 1999-01-06 | 2002-10-15 | アトランティック バイオファーマシューティカルズ インコーポレイティッド | Expression of secreted human alpha-fetoprotein in transgenic animals |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Sandberg‐Wollheim | Immunoglobulin synthesis in vitro by cerebrospinal fluid cells in patients with multiple sclerosis | |
Kunkel et al. | Relation between certain myeloma proteins and normal gamma globulin | |
EP0138222A2 (en) | Preparation of monoclonal anti-protein C antibodies | |
US4558005A (en) | Monoclonal anti-erythropoietin | |
US4301064A (en) | Ubiquitary tissue protein PP8 | |
Joshi et al. | Properties of the progestagen-dependent protein of the human endometrium | |
JPH07108915B2 (en) | Human-macrophage migration inhibitory factor protein | |
EP0003173A1 (en) | Process for producing human antibodies and composition containing them | |
US5024946A (en) | Human monoclonal antibody to antigen of gastric cancer and B-cell line for producing this antibody, method for preparing this B-cell line and antibody, antigen and method of preparation of this antigen | |
JPH0246284A (en) | Production of human alpha-phetoprotein | |
Tockstein et al. | A simple purification procedure for adenovirus type 12 T and tumor antigens and some of their properties | |
EP0267601B1 (en) | Anti-pci monoclonal antibody | |
EP0175310B1 (en) | A substantially pure rheumatoid arthritis specific protein and an antibody against the same | |
CA1330768C (en) | Monoclonal anti-human granulocyte colony stimulating factor antibody | |
DE68922340T2 (en) | Polyfunctional protease. | |
Korngold | Antigenic specificity of γ2-myeloma globulins | |
Tarng et al. | Isolation of antihemorrhagic factors in opossum (Didelphis virginiana) serum using a monoclonal antibody immunoadsorbent | |
Bergmann et al. | Cerebrospinal fluid γ‐globulins in subacute sclerosing leucoencephalitis | |
RU2489440C1 (en) | Method to produce estrogen-binding protein associated with malignant tumors | |
Koch et al. | Fractionation of PHA by crossed immunoelectrophoresis and specific immunosorption | |
EP0351458A1 (en) | Process for preparing human alpha-foetoprotein | |
Tanigaki et al. | Purification and separation of subsets of human Ia molecules by papain digestion. | |
El-Sewefy et al. | Immunoelectrophoretic pattern changes in asbestosis | |
RU2283131C1 (en) | Method for preparing preparation dry alpha-fetoprotein | |
JPH0228195A (en) | Isolation of physiologically active substance by immune affinity chromatograph method using anti-idiotype antibody as eluent |