JPH02297042A - バイオプロセスの増殖率計測方法及び装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、バイオプロセスにおける菌体の増殖率を計測
する方法及び装置に関する。

［従来の技術］ 従来、バイオプロセスにおける菌体の形状を観察するに
は、培養器から培養液をサンプルし、顕微鏡を用いて目
視により菌体の個体数を数え、その値の経時的変化によ
って、増殖率を求めていた。

また、オンラインで計測する場合は、培養液に光を透過
し、透過率の変化から増殖率を求めていた。

［発明が解決しようとする課題］ しかしながら、前者の場合は、計測の手間が多く、カウ
ントの正確さに問題があり、後者では、菌体以外の培養
液の成分が測定誤差の原因となっていた。

即ち、前者では、菌体数を数える場合は、余程丁寧に菌
体を分離し、しかも、例えば、発芽している菌体を１．
２個というように、少数点以下まで数えないと精度が上
がらないことになり、その手間は膨大であり、観察者の
負担も大きく、実験室レベルの作業に限られてしまう。

さらに、いずれの場合も菌体が増殖する様子を直接定量
化しているわけではないので、必ずしも増殖率と正確に
対応しない欠点があった。

そこで、本発明の技術的課題は、バイオプロセスにおい
て菌体の増殖に対応した菌体の増殖率を計Ａ−１するこ
とができ、オンラインで増殖率をａ定できる実用的な増
殖率計測方法及び装置を提供することにある。

［課題を解決するための手段］ 本発明によれば、培養液中の菌体の増殖率を計Ｊｉする
方法であって、前記菌体の光学系を通じて得られた画像
パターンより生成した画像信号を、２値化し、前記２値
化した画像信号による画像パターンから増殖の度合いを
加味した方法により予め定められた時間における菌体数
を測定し、増殖率を計算することを特徴とするバイオプ
ロセスの増殖率計測方法が得られる。

本発明によれば、培養液中の菌体の光学系を通じて得ら
れた画像パターンを連続的にビデオ信号に変換する観察
部と、前記ビデオ信号から特徴口りを抽出し、該特徴ｆ
ｆ１Ｄに基づいて前記菌体の増殖率を計算する演算処理
部とを有することを特徴とするバイオプロセスの増殖重
訂４Ｉ１１装置が得られる。

［実施例］ 次に、本発明の実施例について、図１１＋１を参照して
説明する。

第１図は本発明の実施例に係る増殖率計測装置の全体の
構成を模式的に示す図である。

この図において、増殖率計測装置は、培養器１０に接続
されたローラポンプ１と、菌体観察器２と、光学系２０
を有する画像信号発生部３と、画像信号処理部４と、表
示部５とをＨする。

ローラポンプ１は、流路１２に沿って、培養器１０内の
菌体を培養液１１とともに菌体観察器２を通して再び培
養器１０内へと循環させる。

菌体観察５２は、光学系２０を存し、この光学系２０を
用いて、培養液１１中の菌体を観察する。

画像信号発生部３は光学系２０に連結されたカラービデ
オカメラからなり、光学系２０により採取された培養液
１１中の菌体の画像は、画像信号ｆｖに変換される。

画像信号処理部４は、マイクロコンピュータ（ＣＰＵ）
を有し、画像信号ｆｖを受けて、後述する形式で予め定
められた画像処理を行い、得られたデータから増殖率μ
を算出する。

また、画像信号処理部４は、ポンプ駆動信号ｆｐを送り
出す。

表示部５は画像信号処理部４に接続され画像信号処理部
４からの演算処理結果を表示するモニターテレビジョン
によって構成されている。

第２図は第１図の菌体観察器２をより具体的に説明する
ための平面図である。この図において、菌体観察器２は
中央に観察用の口部２ａと両端に培養液の入口２ｂ及び
出口２ｃを有する菌体観察用通路２ｄと、この菌体観察
用通路２ｄの口部２ａから両端よりの位置で互いに逆方
向に分岐し、上面まで連絡し口部２ｅ、２ｆを形成する
希釈水通水路２ｇ及び２ｈとを有する。

口部２ａには、顕微鏡の接眼レンズが挿入され、菌体を
観察する穴となっている。

第３図は本発明の菌体観察装置の菌体観察器のもう一つ
の例を示す平面図である。

この図において、菌体観察器２１は菌体観察用の口部２
１ａに連結された培養液試料の入口及び出口２１ｂ及び
２１ｃと、蒸留水用の入日及び出口２１ｄ及び２１ｅと
を有する。

この口部２１ａに顕微鏡の接眼レンズが挿入され、菌体
が観察される。

この蒸留水入口及び出口２１ｄ及び２１ｃ間に蒸留水を
通じると、別車２１ｆが回転し、ポンプの役目と洗浄、
希釈の機能とを兼用させることができる。

第４図は本発明の菌体観察装置のさらにもう一つの例を
示す図である。

この図において、培養器１０には、覗き穴２２が設けら
れており、この部分に光源２３を取り付け、第２図及び
第３図で示した菌体観察器２及び２１を省略して直接培
養液１１を観察することも可能である。

次に、本発明の実施例に係る増殖小計Δｐ１方法を図面
を参照して説明する。

第５図（ａ）及び（ｂ）は表示部に表示された本観察装
置による顕微鏡観察画面を模式的に示す図である。バイ
オプロセスにおける菌体の増殖率μは、 μ−（１／Ｎ）　　（ｄＮ／ｄ　　ｔ）　　　・・・　
（１）によって、定義される。ただし、Ｎは菌体の個数
でｄＮ／ｄｔはその時間変化の割合（微分値）を表して
いる。

従来、画像信号発生部３を通して表示部５に写し出され
る第５図（ａ）の様な顕微鏡観察画面の一部５ａを人間
が目視し、培養液中の菌体３０の菌数を数えて、その求
められた値の時間変化から、（１）式によって、増殖率
を求めていた。

しかし、菌体が増殖しているときは、第５図（ｂ）のよ
うに、幾つかの菌体３０′は、発芽し、複雑な形状にな
っているのが通常である。

そして、第５図（ａ）のような場合には、菌数が多くて
も、非増殖期であると判断される計ΔＩＩＩシステムも
必要である。

そこで、先ず、第５図（ｂ）のように複雑な外形形状を
有する菌体３０′の画像を画像信号ｆｖに変換して、こ
の信号ｆｖを画像信号処理部に入力し、デジタル化した
後、第６図に示すような画像処理を行う。第６図は、第
５図（ｂ）の各画素ごとに隣接画素との輝度差分をとり
、その値が、適当な閾値以上の画素を残して、他の部分
を取り除いた時にできる画面で、第５図（ｂ）の菌体の
外周（エツジ）３１を抽出する画像処理を行っている。

即ち、画像信号発生部３で発生された第５図（ｂ）のよ
うな画像は、第７図のようなビデオ信号ｆｖで表わされ
る。

第７図において、横軸は時間ｔを示し、縦軸は画像信号
ｆｖの電圧を示す。

第７図のＡＢ間で一画面分の信号が、第８図のような対
応で、画像信号発生部３から画像信号処理部４へ転送さ
れる。

画像信号【Ｖは、ＡからＢまでの位置に応じて画像信号
処理部内でデジタル量Ｚ　（ｘ、ｙ）に変換される。こ
こで、ｘ、ｙは離散化された座標で、第８図のモニタ上
の位置に対応して。

Ｘ　　；　　　　ＸＩ　　＋　　　Ｘ２　　ｒ　　　Ｘ
　　１　＊　　”・＋　　　ｘ　　Ｍｙ；　　　　Ｖ＋
＋　　　Ｙ２１　　　Ｙ　　３　＋　　・・・＋ＹＮの
ような有限の値を持つ。

第９図は離散化された画面の一部を示し、（ｘ、ｙ、）
の点での画面の差分ｄ、とは、ｊ １−１−１．１＋ｌ：■−ｊ−１．ｊ＋１によって、計
算される。

即ち、第９図で示される画素の黒丸の点のＺの値と周り
の８点のＺの値の差の最大値をこの点の差分と定義する
。

この計算を全ての画素ｉ−１〜Ｍ、ｊ−１〜Ｎについて
行うと、１画面の差分が得られる。

更に、差分ｄ、ｊが閾値すよりも大きい点は、黒。

その他は白として演算結果を画像化すると前述の第６図
のような菌体のエツジ３１か黒く表されたデータ画面が
得られる。

第６図のデータは更に、フラクタル次元解析方法で、 ｌｏｇＰ　　（ｒ）−１ａｇａ Ｄ−・・・　（２） ｏｇｒ によって１つの数値に対応させることができる。

Ｄは画像の複雑さを表すための指数で、この値が大きい
程、画面上の模様（この場合は菌体の外形）が複雑であ
ることを表す。

そして、模様が複雑であれば、菌体は盛んに発芽し、増
殖していると推察することができるので、得られる増殖
率も大きくなる。

（２）式におけるＰ　（ｒ）は第１０図に示す画素（ｘ
、ｙｊ）を中心とした、半径ｒの円を描い■ たときに、円内に含まれる黒点の数を全ての画素につい
て、足し合わせた値である。ｒの値をいろいろ変えてＰ
　（ｒ）を求め両対数グラフにブロットすると第１１図
のようになる。

（２）式のｌｏｇ　ａは第１１図の切片である。また、
Ｄはグラフの傾きとして計算できる。実際には、いくつ
かの「について、第１１図の黒丸のようにＰ（ｒ）を求
めそれらを近似的に結んでできる直線の傾きとして、Ｄ
が求まる。

上記のように、ｒを用いてＰ（「）を計算すると第１２
図（ａ）及び（ｂ）のように、菌体の見掛の個数として
は、同程度の画像でも、ｒを小さくしたときに、（ｂ）
の方がＰ　（ｒ）が大きくなり、傾きＤも大きくなる。

複雑な図形であるほどＤは大きくなるので、Ｄを図形の
複雑さを表す指標とすることができる。

第１２図（ａ）、（ｂ）ともに、見掛の菌体の数（発芽
を無視した場合）は２４個で等しいが、（ａ）の場合は
画像データが単純な形状の集まりで構成されているので
、第１３図のように傾きＤが小さくなり、逆に（ｂ）の
場合は大きくなる。

本発明の実施例に係る増殖率計測方法によれば、発芽ま
で含めた菌体の数Ｎと、複雑さＤとの関係は、実験的に
は、第１４図のように表されるので、（１）式によって
、増殖率が映像信号処理部４により計算されることにな
る。

従来の単純な菌体の個数のみの場合に比べ、本発明の方
法は、菌体の形状、特に発芽があるか否かによって増殖
率が変わるため、直接的に菌体の増殖状態を計測するこ
とが可能になっている。

また、通常の増殖が盛んになると、第５図のように、菌
体３０′が分離している状態で観察されることはまれで
、むしろ密集して、重なりあっているのが普通である。

このような、場合にも、（２）式によって、複雑さを表
す指数が大きくなり、このことから菌体が密集しており
、且つ、増殖が盛んであることを判定できるとともに、
増殖率も正確に計算する増殖率測定方法の他の例につい
て説明する。

まず、画像信号処理部によって、画像信号を取り込み、
第１５図のように２値化し、−辺が、ｒの正方形で全画
像を分割する。

分割された正方形の中で黒い部分、即ち、菌体の一部が
含まれている正方形の数をＭ（ｒ）とする。種々のｒに
ついて、Ｍ（ｒ）を求め、フラクタル次元りを Ｉ）−−１ｏｇ　Ｍ　（ｒ）　／ｌｏｇ　ｒ−＝　（３
）で表す。

第１６図は酵母菌について、ｌｏｇＭ（ｒ）とｌｏｇ　
ｒの関係を求めたグラフである。

この図において、白丸が培養初期、黒丸が増殖が激しい
場合の計算値を示す。

Ｄはグラフの傾きに相当し、酵母菌の場合、図のように
、ｒによって、傾きが異なる。ｒが小さいときの傾きを
り、、ｒが大きいときの傾きをＤ２とすると、Ｄ、、Ｄ
２と菌体の数２形状は第１７図のように対応している。

Ｄ、はｒが小さいときの値であるから画面の局所的特徴
を表している。

増殖が盛んで発芽部分が多いと、Ｄｌは大きくなる。Ｄ
２は「が大きいときの値であるから画面全体の特徴を表
していると考えられ、菌体の数に比例している。

次に、Ｄ、、Ｄ、を用いて時刻ｔにおける単位体積あた
りの菌体数Ｎ　（ｔ）を、 Ｎ　（ｔ）＝ｆ　（ａＩ）＋　、ｂＤ２）／Ｖ・”　（
４）によって計算する。

ここで、ａ、ｂは微生物の種類によって、決まる定数で
、発芽の様子や発芽した菌体を１つの菌体の何分の１と
数えるかによって決まる。

■はサンプルの体積で、関数形ｆは、実験的に求める。

さらに、映像信号処理部４により、比増殖速度μは、（
１）式と同様に μ−（ΔＮ／Δｔ）／Ｎ・・・（１′）によって計算す
る。

以上のように、フラクタル次元を用いると複雑な計算を
せずに、菌体の発芽まで含めた増殖速度をもとめること
ができ、培養中の不純物等の雑音の除去も容易である。

更に、立体的な画像が得られれば、３次元的計測に拡張
することも簡単であり、より精密な計測が期待される。

これは、従来のように菌数を数える場合は、余程丁寧に
菌数を分離し、しかも、第５図（ｂ）の場合のように、
発芽している菌体を１．２個というように、小数点以下
まで数えないと精度が上がらないことになり、その手間
は膨大であり、観察者の負担も大きく、実験室レベルの
作業に限られてしまうというような種々の欠点を解決し
た極めて杓゛用な方法であるといえる。

［発明の効果］ 以上説明したように、本発明によれば、バイオプロセス
において正確に菌体の発芽まで含めた増殖率を計測する
ことができるバイオプロセスの増殖率計測方法及び装置
を提供することができる。

本発明によれば、オンラインで増殖率が測定できるとと
もに、培養液中の不純物等の雑音除去も容易である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の実施例に係る増殖率計測装置の全体の
構成を模式的に示す図、第２図は第１図の菌体観察器２
を示す平面図、第３図は本発明の菌体観察装置の菌体観
察器のもう一つの例を示す平面図、第４図は本発明の菌
体観察装置のさらにもう一つの例を示す図、第５図（ａ
）及び（ｂ）はモニターに表示された本観察装置による
顕微鏡観察画面を模式的に示す図、第６図は第５図（ｂ
）の各画素ごとに隣接画素との輝度差分をとり、その値
が、適当な閾値以上の画素を残して、他の部分を取り除
いた時にできる画面を示す図、第７図はビデオ信号を示
す図、第８図は第７図に対応するビデオ信号を示す図、
第９図は差分の説明に供する図、第１０図はフラクタル
次元の求め方の説明に供する図、第１１図はｌｏｇＰ（
ｒ）とｌｏｇｒとの関係を示す図、第１２図は菌体の個
数の多いときの画像データを示す図、第１３図は第１２
図の画像データ（ａ）、（ｂ）に対応する１０ｇＰ（ｒ
）と１０ｇ「との関係を示す図、第１４図は図形の複雑
さＤと菌体の数Ｎとの関係を示す図、第１５図は画像信
号を２値化した場合の説明に供する図、第１６図は酵母
菌について、１ａｇＭ（ｒ）とｌｏｇ　ｒの関係を求め
たグラフ、第１７図はり、とＤ２との対応関係を示す図
である。 図中、１はローラポンプ、２は菌体観察器、２ａは開口
部、２ｂは入口、２Ｃは出口、２ｄは菌体観察用通路、
２ｅ、２ｆは口部、２ｇ、２ｈは希釈水通水路、３は画
像信号発生部、４は画像信号処理部、５は表示部、１０
は培養器、１１は培養液、２０は光学系、２１は菌体観
察器、２１ａは菌体観察用の口部、２１ｂは入口、２１
Ｃは出口、２１ｄは入口、２１ｅは出口、２２は覗き穴
、２３は光源、３０．３０−は菌体、３１は菌体のエツ
ジである。 第３図 第４図 第５図 第９図 工Ｌ− ：ｃ′し 工し＋１ 第１０図 ４ユ 第１１図 １ｏｇ　／’ 第１５図 ｒ 第１６図 ｏｇ　ｒ 第１４図 図形の複雑さＤ 第１７図 フラクタルＤ、　（形状の子笈唯さ）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、培養液中の菌体の増殖率を計測する方法であって、
   前記菌体の光学系を通じて得られた画像パターンより生
   成した画像信号を、２値化し、前記２値化した画像信号
   による画像パターンから増殖の度合いを加味した方法に
   より予め定められた時間における菌体数を測定し、増殖
   率を計算することを特徴とするバイオプロセスの増殖率
   計測方法。 ２、培養液中の菌体の光学系を通じて得られた画像パタ
   ーンを連続的にビデオ信号に変換する観察部と、前記ビ
   デオ信号から特徴量Ｄを抽出し、該特徴量Ｄに基づいて
   前記菌体の増殖率を計算する演算処理部とを有すること
   を特徴とするバイオプロセスの増殖率計測装置。