JPH02291944A - 重合体分子等の特性化法 - Google Patents
重合体分子等の特性化法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は重合体分子等を特性化すること、例えば、個々
の粒子の寸法を？ｉ！測しかつ決定することそして種々
の寸法の粒子を含有する試料の重量分布を決定すること
の方法に関する。更に特に、本発明は粒子を特性化する
ため、例えば、外部力を受ける時に位置及びコンフオメ
ーシコン変化を測定することによる、そしてその艮さ及
び直径又は半径を測定することによる、顕微鏡及び／又
は分光分析法と組合わせた顕微鏡の使用を含む。この測
定は外部力を受けて、弛緩の速度、再配向及び粒子の回
転そして外部力を受ける前、間又は後での粒子の艮さと
直径の測定を含む。
の粒子の寸法を？ｉ！測しかつ決定することそして種々
の寸法の粒子を含有する試料の重量分布を決定すること
の方法に関する。更に特に、本発明は粒子を特性化する
ため、例えば、外部力を受ける時に位置及びコンフオメ
ーシコン変化を測定することによる、そしてその艮さ及
び直径又は半径を測定することによる、顕微鏡及び／又
は分光分析法と組合わせた顕微鏡の使用を含む。この測
定は外部力を受けて、弛緩の速度、再配向及び粒子の回
転そして外部力を受ける前、間又は後での粒子の艮さと
直径の測定を含む。
他の応用の中で、これらの測定は粒径を決定するために
使用される。本発明は粒子がある種の媒体中に置かれた
時に、ポリ分散試料（例えば、種種の寸法の粒子を含有
する試料）中の重合体分子を寸法決定するのに特に十分
に適しており、そして非常に大きな分子、例えば、従来
の方法を使用して顕微鏡スライド上に置いた時に壊れ易
い大きな核酸分子を測定するために有用である。
使用される。本発明は粒子がある種の媒体中に置かれた
時に、ポリ分散試料（例えば、種種の寸法の粒子を含有
する試料）中の重合体分子を寸法決定するのに特に十分
に適しており、そして非常に大きな分子、例えば、従来
の方法を使用して顕微鏡スライド上に置いた時に壊れ易
い大きな核酸分子を測定するために有用である。
粒子のポリ分敗試料の分子憬分布を測定する方法は種々
の異なる分野で有用である。例えば、重合体化学におい
て、オリゴマーの性質はしばしばその分子量分布に依存
している。特定の物質が有益な性買を示すことが判明し
そしてオリゴマーの正確な組成が知られていない時には
、重合体の分子量分布の分析が確認のために使用される
。分子生物学では、ポリ分敗試料、例えば、ＤＮＡ制限
酵素分解物の分子量分布はＤＮＡの構造について価値あ
る情報を供する。この情報は染色体地図及び広範な分子
遺伝学特性化を作るために使用できる。
の異なる分野で有用である。例えば、重合体化学におい
て、オリゴマーの性質はしばしばその分子量分布に依存
している。特定の物質が有益な性買を示すことが判明し
そしてオリゴマーの正確な組成が知られていない時には
、重合体の分子量分布の分析が確認のために使用される
。分子生物学では、ポリ分敗試料、例えば、ＤＮＡ制限
酵素分解物の分子量分布はＤＮＡの構造について価値あ
る情報を供する。この情報は染色体地図及び広範な分子
遺伝学特性化を作るために使用できる。
伝統的には、摂動する力を受ける粒子が適当な媒体、例
えば、粒子が寸法によって分離することを引起こす媒体
を通して動く速度を測定することによって、粒子の試料
の分子唇分布が決定ざれている。粒子の寸法と特定の力
が加えられる時に媒体を通るその移動速度に関連する数
学的関係が計算される。例えば、周知の技術のゲル透過
クロマトグラフィーでは、特性化ざれるべき重合体は溶
媒に溶解され、次に安定相中に架橋された又は多孔性の
ゲル重合体を有するカラムを通して結果の溶液が送られ
る。大きな分子はゲルを迅速に通過し、一方より小さな
分子の運動は安定相を構成する物質の孔の中に入ること
によって阻害されよう。
えば、粒子が寸法によって分離することを引起こす媒体
を通して動く速度を測定することによって、粒子の試料
の分子唇分布が決定ざれている。粒子の寸法と特定の力
が加えられる時に媒体を通るその移動速度に関連する数
学的関係が計算される。例えば、周知の技術のゲル透過
クロマトグラフィーでは、特性化ざれるべき重合体は溶
媒に溶解され、次に安定相中に架橋された又は多孔性の
ゲル重合体を有するカラムを通して結果の溶液が送られ
る。大きな分子はゲルを迅速に通過し、一方より小さな
分子の運動は安定相を構成する物質の孔の中に入ること
によって阻害されよう。
カラムからの流出液の含唱を測定することによつて、例
えば、一定期間にわたって流出液の屈折率を測定するこ
とによて試料の分子量分布が決定される。ゲル透過クロ
マトグラフイーの幾つかの限界は約５ｋｂ以上の大きな
ＤＮＡ分子を分＠するためにこれを使用できないこと、
そして限られた数の好適な溶媒（少なくともその一つ》
に可溶性である試料に対してのみ使用できることにある
。
えば、一定期間にわたって流出液の屈折率を測定するこ
とによて試料の分子量分布が決定される。ゲル透過クロ
マトグラフイーの幾つかの限界は約５ｋｂ以上の大きな
ＤＮＡ分子を分＠するためにこれを使用できないこと、
そして限られた数の好適な溶媒（少なくともその一つ》
に可溶性である試料に対してのみ使用できることにある
。
沈降は粒径を測定するため周知の技術であるが、重合体
に適用した時に、この方法は約５０〜１００キロベース
（ｋｂ）の最大寸法を有する分子に限定ざれる。この技
術により大きな分子を測定する試みは多分分子寸法の過
少評価を生じ、主として沈降係数が遠心速度に鋭敏であ
るからである。
に適用した時に、この方法は約５０〜１００キロベース
（ｋｂ）の最大寸法を有する分子に限定ざれる。この技
術により大きな分子を測定する試みは多分分子寸法の過
少評価を生じ、主として沈降係数が遠心速度に鋭敏であ
るからである。
（参照、κａｖｅｎｏｆｆ等、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｓ ｉｐＱｕａｎｔｉｔ． Ｂｉｏ
ｌ、３８、１ （１９７４））。
Ｈａｒｂｏｒ Ｓ ｉｐＱｕａｎｔｉｔ． Ｂｉｏ
ｌ、３８、１ （１９７４））。
寸法により重合体粒子を分離する別の普遍的な方法はゲ
ル電気泳動であり（参照、例えば、Ｆｒｅｉｆｅｌｄｅ
ｒ， Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ （１９７６） ） 、これ
は＠眼分解物を分離するために特に有効である。要約す
ると、重合体粒子が溶解されるアガロース又はポリアク
リルアミドゲルに電場を適用すると小さな粒子がより大
きな粒子より迅速な速度でゲルを通して移動することを
引起こす。各帯域中の重合体の分子量は公知の長さの重
合体フラグメントの移動度と未知物質の移動速度を比較
することによって計算される。各帯域中の重合体の量は
着色の帯域の幅及び／又は色彩強度（光学濃度）に基づ
て推定できるが、しかしながら、この種の推定は通常に
非常に正確ではない。
ル電気泳動であり（参照、例えば、Ｆｒｅｉｆｅｌｄｅ
ｒ， Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ （１９７６） ） 、これ
は＠眼分解物を分離するために特に有効である。要約す
ると、重合体粒子が溶解されるアガロース又はポリアク
リルアミドゲルに電場を適用すると小さな粒子がより大
きな粒子より迅速な速度でゲルを通して移動することを
引起こす。各帯域中の重合体の分子量は公知の長さの重
合体フラグメントの移動度と未知物質の移動速度を比較
することによって計算される。各帯域中の重合体の量は
着色の帯域の幅及び／又は色彩強度（光学濃度）に基づ
て推定できるが、しかしながら、この種の推定は通常に
非常に正確ではない。
米国特許第４．４７３．４５２号に記載されるパルス場
電気泳勤は通常の電気泳勤を使用ずる分離とは比較して
ゲル中の大きなＤＮＡ分子の分離が改良される電気泳動
技術である。この技術により、従来公知の電気泳動法で
使用される連続電場より、ゆっくりと交番する電場を使
用して粒子を分離する。更に特に、お互い横方向であり
、粒子の質量に関連した周波数でお互いに相から高い強
度と低い強度で交番する、等しい強度の電場を使用して
粒子が分離ざれる。この力は電場の各方向に横の全方向
に粒子を動かす。ここで使用する用語の゛横の″は９０
°の角度又はそれに近い角度に限定されず、交差の他の
ほとんどの角度を含む。
電気泳勤は通常の電気泳勤を使用ずる分離とは比較して
ゲル中の大きなＤＮＡ分子の分離が改良される電気泳動
技術である。この技術により、従来公知の電気泳動法で
使用される連続電場より、ゆっくりと交番する電場を使
用して粒子を分離する。更に特に、お互い横方向であり
、粒子の質量に関連した周波数でお互いに相から高い強
度と低い強度で交番する、等しい強度の電場を使用して
粒子が分離ざれる。この力は電場の各方向に横の全方向
に粒子を動かす。ここで使用する用語の゛横の″は９０
°の角度又はそれに近い角度に限定されず、交差の他の
ほとんどの角度を含む。
前記のような間接測定技術による分子量を測定すること
で最も顕著な問題の一つは直接に測定されるパラメータ
、例えば、移動速度は分子寸法における小さな差に比較
的鋭敏でないことにある。
で最も顕著な問題の一つは直接に測定されるパラメータ
、例えば、移動速度は分子寸法における小さな差に比較
的鋭敏でないことにある。
かくして、粒度分布の正確な決定は得ることが難しい。
不安定である傾向を示しかつインチ長さの単一分子を含
有する生物学的重合体試料が含まれる時に正確さの欠除
が特に問題である。
有する生物学的重合体試料が含まれる時に正確さの欠除
が特に問題である。
ポリ分散試料中の粉度分布を決定する公知方法のあるも
のは他のものより良好な分解能を供する一方、従来公知
の方法は、あるとしても、殆ど同一の寸法の粒子を柩別
するために必要な高い分解能を供するものはほとんどな
い。ゲル透過クロマトグラフィー及び沈降は約Ｍ１″の
みの分解能を供する（Ｍ一分子Ｉ！）。標準のアガロー
スゲル電気泳動及びポリアクリルアミドゲル電気泳妨は
一１０９Ｍとして変動する分解能を供する。パルス化電
気泳動技術は驚くほど大きな分子を分離するために有効
であるが、標準の電気泳勤よりずっと良好な分解能を供
しない。かくして、類似の寸法の粒子、例えば、バーセ
ント以下だけ長さの異なる粒子の間を区別する性能は前
記の測定技術を使用する時には権めて限定される。
のは他のものより良好な分解能を供する一方、従来公知
の方法は、あるとしても、殆ど同一の寸法の粒子を柩別
するために必要な高い分解能を供するものはほとんどな
い。ゲル透過クロマトグラフィー及び沈降は約Ｍ１″の
みの分解能を供する（Ｍ一分子Ｉ！）。標準のアガロー
スゲル電気泳動及びポリアクリルアミドゲル電気泳妨は
一１０９Ｍとして変動する分解能を供する。パルス化電
気泳動技術は驚くほど大きな分子を分離するために有効
であるが、標準の電気泳勤よりずっと良好な分解能を供
しない。かくして、類似の寸法の粒子、例えば、バーセ
ント以下だけ長さの異なる粒子の間を区別する性能は前
記の測定技術を使用する時には権めて限定される。
特別の実験環境下で、ＤＮＡゲル電気泳動は重合体混合
物をＭ１の分解能まで分解する。しかしながら、この程
度の正確さはゲル濃度及び電場強度のような変数が注意
深く調整される時にのみ得られる。
物をＭ１の分解能まで分解する。しかしながら、この程
度の正確さはゲル濃度及び電場強度のような変数が注意
深く調整される時にのみ得られる。
より高い質量（即ち、約６００ｋｂまで）の粒子は０．
０３５％ほどに低くゲル濃度を下げることそして電場強
度を下げることによる従来のゲル電気泳動を使用して分
解できるが、しかしながら、この方法には欠点がある。
０３５％ほどに低くゲル濃度を下げることそして電場強
度を下げることによる従来のゲル電気泳動を使用して分
解できるが、しかしながら、この方法には欠点がある。
最も顕著には、ゲル濃度の劇的な減少は機械的に不安定
であるゲルを生じ、そしてより少ない試料を負荷できる
。減少したゲル濃度と電Ｖ！強度を使用して非常に大き
なＤＮＡ分子を分解する電気泳動ランは完了するには一
週間又はそれ以上を要する。更に、減少したゲル濃度は
広範囲の粒径を有する試料中の分子を分離づ゛るために
有用ではなく、その理由は小さな分子の分離が得られな
いからである。かくして、広範囲の寸払を有する分子を
含有する試料が分離されるべき場合には、幾つかの電気
泳動ランが必要であり、例えば、第一に、大きな分子の
分離そして次により小さい分子のその上の分離である。
であるゲルを生じ、そしてより少ない試料を負荷できる
。減少したゲル濃度と電Ｖ！強度を使用して非常に大き
なＤＮＡ分子を分解する電気泳動ランは完了するには一
週間又はそれ以上を要する。更に、減少したゲル濃度は
広範囲の粒径を有する試料中の分子を分離づ゛るために
有用ではなく、その理由は小さな分子の分離が得られな
いからである。かくして、広範囲の寸払を有する分子を
含有する試料が分離されるべき場合には、幾つかの電気
泳動ランが必要であり、例えば、第一に、大きな分子の
分離そして次により小さい分子のその上の分離である。
当業者に公知の他の精子測定技術はバルク試料に存在す
る特定の分Ｐ（例えば、試料中の最大の分子、又は平均
分子寸・法）を寸法決めするために有用であるが、与え
られた試料中で異なる長さの多くの重合体を測定するこ
とは実行不能である。
る特定の分Ｐ（例えば、試料中の最大の分子、又は平均
分子寸・法）を寸法決めするために有用であるが、与え
られた試料中で異なる長さの多くの重合体を測定するこ
とは実行不能である。
当業者に周知である、粘弾性リコイル技術（参照、Ｋａ
ｖｅｎｏｆｆ等、’ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ−ｓｉｚｅ
ｄ Ｄ Ｎ Ａｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｆｒｏｌＩＩＤ
ｒｏｓｏｐｈｉｌａ ” Ｃｈｒｏｎ＋ｏｓｏＩＩｌａ
４ １、１ （１９７３））は溶媒フロー電場（例えば
、流体が二つの移動するプレートの間で摂動する時に生
ずる場）の中でコイルした分子を延伸すること、そして
最大の分子が弛緩した状態に戻るために必要な時間を測
定することを含む。弛緩時間は弛緩の時の間に動く同心
ローターの回転を見張ることにより測定される。この技
術は大きなＤＮＡ分子１．６６ に適用゛した時に試料測定がＭ として変わる点で
極めて正確である一方、試料中の最大の分子以外の分子
を寸法決めするために有用でない。
ｖｅｎｏｆｆ等、’ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ−ｓｉｚｅ
ｄ Ｄ Ｎ Ａｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｆｒｏｌＩＩＤ
ｒｏｓｏｐｈｉｌａ ” Ｃｈｒｏｎ＋ｏｓｏＩＩｌａ
４ １、１ （１９７３））は溶媒フロー電場（例えば
、流体が二つの移動するプレートの間で摂動する時に生
ずる場）の中でコイルした分子を延伸すること、そして
最大の分子が弛緩した状態に戻るために必要な時間を測
定することを含む。弛緩時間は弛緩の時の間に動く同心
ローターの回転を見張ることにより測定される。この技
術は大きなＤＮＡ分子１．６６ に適用゛した時に試料測定がＭ として変わる点で
極めて正確である一方、試料中の最大の分子以外の分子
を寸法決めするために有用でない。
当業者に公知である、光分散技術（例えば、擬似一弾性
光分散）を使用して、粒子の寸法と形状がＺｉｍｍプロ
ット、当業者に公知であるデータ分析法により決定され
る。これらの技術では、寸法依存性はＭ１として異なる
。光分散は測定されるべき分子が入れられる溶液が純粋
であり、即ち、ダスト又は他の汚染物のないことが必要
であり、それ故にＤＮＡ試料を寸法決めするには不適当
である。更に、多くのＤＮＡ分子程度に大きな分子を寸
法決めするために有用でなく、そして種々の寸法の粒子
を有する試料の重量分布ではなく、試料中の粒子の劫重
量を測定するためにのみ有用である。
光分散）を使用して、粒子の寸法と形状がＺｉｍｍプロ
ット、当業者に公知であるデータ分析法により決定され
る。これらの技術では、寸法依存性はＭ１として異なる
。光分散は測定されるべき分子が入れられる溶液が純粋
であり、即ち、ダスト又は他の汚染物のないことが必要
であり、それ故にＤＮＡ試料を寸法決めするには不適当
である。更に、多くのＤＮＡ分子程度に大きな分子を寸
法決めするために有用でなく、そして種々の寸法の粒子
を有する試料の重量分布ではなく、試料中の粒子の劫重
量を測定するためにのみ有用である。
個々の分子を測定するため当業者に公知であるなお別の
粒子測定技術は限られた正確さを有する粒径の測定を供
する。個々の弛緩したＤＮＡ分子の平均寸法と形状は蛍
光顕微鏡下で分子をｉｕｍｔることそしで球形又は楕円
形の分子の艮軸及び短軸を測定することにより決定され
る（参照、Ｙａｎａｇｉｄａ等、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍ＋）． Ｑｕａｎｔｉｔ，Ｂ
ｉｏｌ． ４ ７、１７７（１９８３））。前記に引用
した参照に記載した技術は分子の摂動なしに、遊離溶液
中で行なわれる。
粒子測定技術は限られた正確さを有する粒径の測定を供
する。個々の弛緩したＤＮＡ分子の平均寸法と形状は蛍
光顕微鏡下で分子をｉｕｍｔることそしで球形又は楕円
形の分子の艮軸及び短軸を測定することにより決定され
る（参照、Ｙａｎａｇｉｄａ等、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍ＋）． Ｑｕａｎｔｉｔ，Ｂ
ｉｏｌ． ４ ７、１７７（１９８３））。前記に引用
した参照に記載した技術は分子の摂動なしに、遊離溶液
中で行なわれる。
雷気泳動中小さなＤＮＡ分子の運動が観察されＴいる（
巻照、Ｓｗｉｔｈ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ １２ ４ ３、
２０３ （１９８９））。この刊行物に開示される方法
は非常に大きなＤＮＡ分子の観察に不適であり、そして
分子を測定する技術は論議されない。
巻照、Ｓｗｉｔｈ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ １２ ４ ３、
２０３ （１９８９））。この刊行物に開示される方法
は非常に大きなＤＮＡ分子の観察に不適であり、そして
分子を測定する技術は論議されない。
重合体分子のような粒子の実際の重量測定は直接に測定
されたパラメータの寸法依存性を最大にすることに依存
するのみでなく、また必要とされる試料の量、分析を完
了するために必要な時間そして測定の正確さのような要
因にも依存することに注目される。ゲル透過クロマトグ
ラフイーは時問を要しそして多是の試料を必要とする。
されたパラメータの寸法依存性を最大にすることに依存
するのみでなく、また必要とされる試料の量、分析を完
了するために必要な時間そして測定の正確さのような要
因にも依存することに注目される。ゲル透過クロマトグ
ラフイーは時問を要しそして多是の試料を必要とする。
従来のゲル電気泳動のような方法は比較的時間を要し、
中程度の量の試料を必要としそして非常に大きなＤＮＡ
分子を寸法決めできない。
中程度の量の試料を必要としそして非常に大きなＤＮＡ
分子を寸法決めできない。
従って、本発明の目的ｔ＠重合体分子等を有効に特性化
すること、例えば、個々の粒子の寸法又は粒子のポリ分
散の重量分布を決定することの方法を供することにある
。
すること、例えば、個々の粒子の寸法又は粒子のポリ分
散の重量分布を決定することの方法を供することにある
。
本発明の別の目的は従来技術で公知の方法より良好な分
解能を供する方法を使用して粒径を決定することにある
。
解能を供する方法を使用して粒径を決定することにある
。
本発明のなお別の目的は大きな分子又は他の大きな粒子
（あまり大きすぎて他の方法論を使用して寸法決めでき
ない分子を含む）を観測すること、その寸法を決定する
ことそして大きな分子を含有する試料の分子量分布を決
定する方法を供することにある。
（あまり大きすぎて他の方法論を使用して寸法決めでき
ない分子を含む）を観測すること、その寸法を決定する
ことそして大きな分子を含有する試料の分子量分布を決
定する方法を供することにある。
本発明の別の目的は個々粒子の寸法及び粒子の試料のｉ
ｆｆｌ分布を決定する迅速なかつより有効な方法を供す
ることにある。
ｆｆｌ分布を決定する迅速なかつより有効な方法を供す
ることにある。
本発明の別の目的は極めて鋭敏な方法、例えば、単一粒
子と１４じように少ない量の試料を使用できる方法を使
用して一つ又はそれ以上の粒子を寸法決めすることにあ
る。
子と１４じように少ない量の試料を使用できる方法を使
用して一つ又はそれ以上の粒子を寸法決めすることにあ
る。
本発明のなお別の目的は広範囲の寸法を有する粒子を含
有するポリ分散試料のための正確な寸法情報を供するこ
と、そして従来公知の技術を使用することより更に迅速
にこの情報を供することにある。
有するポリ分散試料のための正確な寸法情報を供するこ
と、そして従来公知の技術を使用することより更に迅速
にこの情報を供することにある。
本発明のこれらの目的及び他の目的は下記の論議から明
らかになろう。
らかになろう。
広義に）ホベると、本発明の方法はポリ分散試料中の変
形可能なそして変形不能な粒子を含む個々の粒子を媒体
に配置すること、この粒子に外部力を適用し、これによ
って物理的変化、特にコンフオメーション及び位置の変
化を引起こすこと、そして次にこれらの変化を観察しか
つ測定することによって前記の粒子を特定化することを
含む。この方法は適当な顕微鏡（この顕微鏡は任意に分
光分析装置に連結して、従って小さすぎて可視化できな
い分子が更に検出できる）により検出される最小の分子
、及びリニアコンフォメーションに延伸される時に長さ
で数インチまである大きな分子を含む、種々の寸法の重
合体分子を特性化するために有用である。従来の技術を
使用する時顕微鏡スライドの上には破壊するので置くこ
とができない、せん断に鋭敏な分子（例えば、大きな分
子）はこれらを媒体に入れる前に分子を折たたみ《凝縮
〉そして次に媒体に入れた後にひろげることにより本発
明により測定される。本発明は光学顕微鏡下で可視化さ
れ又は検出できる多くの型式の笹子を特性化するために
有用である。幾つかの非限定例は多糖類、ポリベブチド
及びタンパク質を含む。
形可能なそして変形不能な粒子を含む個々の粒子を媒体
に配置すること、この粒子に外部力を適用し、これによ
って物理的変化、特にコンフオメーション及び位置の変
化を引起こすこと、そして次にこれらの変化を観察しか
つ測定することによって前記の粒子を特定化することを
含む。この方法は適当な顕微鏡（この顕微鏡は任意に分
光分析装置に連結して、従って小さすぎて可視化できな
い分子が更に検出できる）により検出される最小の分子
、及びリニアコンフォメーションに延伸される時に長さ
で数インチまである大きな分子を含む、種々の寸法の重
合体分子を特性化するために有用である。従来の技術を
使用する時顕微鏡スライドの上には破壊するので置くこ
とができない、せん断に鋭敏な分子（例えば、大きな分
子）はこれらを媒体に入れる前に分子を折たたみ《凝縮
〉そして次に媒体に入れた後にひろげることにより本発
明により測定される。本発明は光学顕微鏡下で可視化さ
れ又は検出できる多くの型式の笹子を特性化するために
有用である。幾つかの非限定例は多糖類、ポリベブチド
及びタンパク質を含む。
変形可能な粒子はこれが外部力を受ける時にコンフォメ
ーション（形状）並びに位置を変化する傾向を有する粒
子である。変形不能な粒子は外部力を受ける時でさえか
なり安定なコンフォメーシ］ンを有する傾向を示すが、
位置では変化を受ける。変形可能な粒子は通常には可逆
的に変形可能であり、例えば、これは外部力を受ける時
にフンフォメーションを変化しモしてノノの適用が終了
した時に元の形状に匹敵し得る構造に戻る。
ーション（形状）並びに位置を変化する傾向を有する粒
子である。変形不能な粒子は外部力を受ける時でさえか
なり安定なコンフォメーシ］ンを有する傾向を示すが、
位置では変化を受ける。変形可能な粒子は通常には可逆
的に変形可能であり、例えば、これは外部力を受ける時
にフンフォメーションを変化しモしてノノの適用が終了
した時に元の形状に匹敵し得る構造に戻る。
本発明は特に折曲げられ、コイルされ又は多分弛緩され
た状態の時にスーパーコイルされ、そして延伸、屈曲、
捩れ、収縮等のコンフォメーション変化及び回転、移転
等の位置変化を受ける重合体分子を測定するために有用
である。本発明は特にある種の媒体中にある分子に外部
力が適用される時に有用である。しかしながら、遊離溶
液が使用される時には、分子にコンフォメーシコン又は
位置を変化させることを引起こすために外部力の適用は
必要でない。
た状態の時にスーパーコイルされ、そして延伸、屈曲、
捩れ、収縮等のコンフォメーション変化及び回転、移転
等の位置変化を受ける重合体分子を測定するために有用
である。本発明は特にある種の媒体中にある分子に外部
力が適用される時に有用である。しかしながら、遊離溶
液が使用される時には、分子にコンフォメーシコン又は
位置を変化させることを引起こすために外部力の適用は
必要でない。
顕微鏡を使用して見るのに十分に大きい粒子は可視化、
例えば、顕微鏡像の直接ＩＩ寮により測定される。別法
として、好適な分光分析技術と組合わせた顕微鏡を使用
して、特に粒子が像形成される（受入れられる分解能で
見られる）には小さすぎる場合、粒子が測定される。
例えば、顕微鏡像の直接ＩＩ寮により測定される。別法
として、好適な分光分析技術と組合わせた顕微鏡を使用
して、特に粒子が像形成される（受入れられる分解能で
見られる）には小さすぎる場合、粒子が測定される。
有用な分光分析法の幾つかの非限定例は屈折率又は蛍光
二色性の測定と組合わせたレーザーにより生じた偏光放
射線を使用すること、又は冷加伺電結合装置、シリコン
強化ターゲット装置、及びマイクロチャンネルプレート
検出器のような′Ｒ！感性ビデオカメラを使用すること
を含む。
二色性の測定と組合わせたレーザーにより生じた偏光放
射線を使用すること、又は冷加伺電結合装置、シリコン
強化ターゲット装置、及びマイクロチャンネルプレート
検出器のような′Ｒ！感性ビデオカメラを使用すること
を含む。
小さな粒子と大きな粒子、例えば、小さな及び大きなＤ
ＮＡ分子の両方の混合物を含有する試料が迅速に寸法決
めされ、試料中の各粒子は同時に測定される。本発明の
方法は試料をバルクで特性化する従来公知の方法と対照
的に個々の、不連続な分子（又は他の粒子）のコンフォ
メーシコン及び位置の変化を測定することを含む。本発
明の方法は単一粒子から多数の粒子の範囲に及ぶ、任意
の数の粒子を測定するために適用される。多数の粒子を
含有する試料が測定される場合には、一時に観察される
粒子の数は一部には顕微鏡の視界の場及び粒子が互いに
分離される程度に依存する。
ＮＡ分子の両方の混合物を含有する試料が迅速に寸法決
めされ、試料中の各粒子は同時に測定される。本発明の
方法は試料をバルクで特性化する従来公知の方法と対照
的に個々の、不連続な分子（又は他の粒子）のコンフォ
メーシコン及び位置の変化を測定することを含む。本発
明の方法は単一粒子から多数の粒子の範囲に及ぶ、任意
の数の粒子を測定するために適用される。多数の粒子を
含有する試料が測定される場合には、一時に観察される
粒子の数は一部には顕微鏡の視界の場及び粒子が互いに
分離される程度に依存する。
不連続な個々の粒子を見ること又は外部力を適用した後
にその弛緩の役割を測定することが完全なデコンボリュ
ーション又は測定したパラメータの分離を許す。
にその弛緩の役割を測定することが完全なデコンボリュ
ーション又は測定したパラメータの分離を許す。
本発明に使用する媒体は任意の適当な物質である。好ま
しくはこの媒体は弛緩した粒子を比較的安定な位置に保
ら、なお外部力を受ける粒子の運動を許す。しかしなが
ら、″ｉ離溶液も使用できる。
しくはこの媒体は弛緩した粒子を比較的安定な位置に保
ら、なお外部力を受ける粒子の運動を許す。しかしなが
ら、″ｉ離溶液も使用できる。
分子運動の測定のために、好適な媒体はその寸法、及び
多分その化学的組成に応じて、異なる速度で異なる粒子
がコンフオメーションと位置を変えることができる媒体
である。
多分その化学的組成に応じて、異なる速度で異なる粒子
がコンフオメーションと位置を変えることができる媒体
である。
本発明の多くの用途に対して、好適な媒体はゲル又は液
体である。好ましくは、この媒体は非対流性であるが、
これは絶体には必要ではない。適当な媒体の選択は一部
には測定される粒子の寸法、粒子が位置と形状を変える
傾向、及び測定の所望の正確さに応じて異なる。例えば
、大きな分子（又は類似の寸法の他の粒子）が測定され
る時には、大きな孔径を有するゲルが使用ざれることが
好ましい。
体である。好ましくは、この媒体は非対流性であるが、
これは絶体には必要ではない。適当な媒体の選択は一部
には測定される粒子の寸法、粒子が位置と形状を変える
傾向、及び測定の所望の正確さに応じて異なる。例えば
、大きな分子（又は類似の寸法の他の粒子）が測定され
る時には、大きな孔径を有するゲルが使用ざれることが
好ましい。
粒子に加えられる外部力は変形不能な又は変形可能な粒
子がコンフオメーション又は位置の変化を受けることを
引起こす任意の力である。例えば、この力は電場、溶媒
フロー場又は磁場であるが、これらの型式に限定されな
い。粒子を摂動する特に有用な方法は電気泳動を使用す
ることにある。
子がコンフオメーション又は位置の変化を受けることを
引起こす任意の力である。例えば、この力は電場、溶媒
フロー場又は磁場であるが、これらの型式に限定されな
い。粒子を摂動する特に有用な方法は電気泳動を使用す
ることにある。
本発明で測定される変化の型式は主として延伸及び弛緩
速度、並びに長さ及び直径（又は半径冫測定を含むコン
フォメーション又は形状における変化、モして配向及び
回転、並びに媒体内で移動における変化を含む位置の変
化を含む。種々の型式の変化が本発明の種々の具体例に
より測定される。
速度、並びに長さ及び直径（又は半径冫測定を含むコン
フォメーション又は形状における変化、モして配向及び
回転、並びに媒体内で移動における変化を含む位置の変
化を含む。種々の型式の変化が本発明の種々の具体例に
より測定される。
コンフォメーション及び位置の変化を測定する技術は、
必ずしも限定されないが、顕微鏡（単一で）及び分光分
析器と組合わせた顕微鏡を含む。
必ずしも限定されないが、顕微鏡（単一で）及び分光分
析器と組合わせた顕微鏡を含む。
有用な分光分析技術の幾つかの非限定例は複屈折、直線
偏光又は円偏光二色性、及び蛍光強度の検出を含む。
偏光又は円偏光二色性、及び蛍光強度の検出を含む。
顕微鏡下見ることができるのに十分に大きい粒子は粒子
を可視化する（像形成する）ことにより測定できる。非
限定例として、光顕微鏡又は走査／トンネル顕微鏡を便
用できる。粉子が直接に見られる一方、コンピューター
化像プロセッサー（下記に詳細に記載する）に接続され
た低光増感性ビデオカメラにＩＡＷｉａを結合すること
が有用であり、これは受取られる像をディジタル化する
ことにより、一連の写真、映画さえも記録する。この像
プロセッナーはそれ自体コンピューターを含み、又は像
に基づいたデータを処理するコンピューターに結合でき
る。コンピューター化装置の使用は各個々の分子の運動
が１４時に測定されることを可能にする。更に、他のも
のに対する分子の関係が検出でき、そして単一粒子の幾
つかの異なるパラメータが同時に測定できる。
を可視化する（像形成する）ことにより測定できる。非
限定例として、光顕微鏡又は走査／トンネル顕微鏡を便
用できる。粉子が直接に見られる一方、コンピューター
化像プロセッサー（下記に詳細に記載する）に接続され
た低光増感性ビデオカメラにＩＡＷｉａを結合すること
が有用であり、これは受取られる像をディジタル化する
ことにより、一連の写真、映画さえも記録する。この像
プロセッナーはそれ自体コンピューターを含み、又は像
に基づいたデータを処理するコンピューターに結合でき
る。コンピューター化装置の使用は各個々の分子の運動
が１４時に測定されることを可能にする。更に、他のも
のに対する分子の関係が検出でき、そして単一粒子の幾
つかの異なるパラメータが同時に測定できる。
任意に、この顕微鏡及び増プロセッサーは分光分析装置
に接続される。この技術は可視化されるに小さづ“きる
粒子に対して特に有用であるが、同様により大きな粒子
を寸法決めするために有用である。
に接続される。この技術は可視化されるに小さづ“きる
粒子に対して特に有用であるが、同様により大きな粒子
を寸法決めするために有用である。
コンフォメーションと位置における変化を寸法測定に変
換するために、一般に粒子が外部力を受ける時に公知の
寸法の粒子の物理的変化に関するデータを生ずる（又は
別に得る）ことが必要である。分子量と測定される特定
のコンフオメーションと位置の変化間の関係を確立する
ためにこの情報をコンピューターに入力する。好ましく
は、マーカーは未知の寸法の粒子に類似の構造の粒子で
あり《例えば、両粒子は類似の化学成分を含有する）、
その理由は弛緩の速度、再配向及び回転は粒子組成に依
存するからである。しかしながら、これは幾つかの変数
、例えば、重合体寸法、組成等によって異なり、従って
゛１マーカー“が未知の寸法の粒子の組成と類似の組成
を有することは必ずしも必要ではない。
換するために、一般に粒子が外部力を受ける時に公知の
寸法の粒子の物理的変化に関するデータを生ずる（又は
別に得る）ことが必要である。分子量と測定される特定
のコンフオメーションと位置の変化間の関係を確立する
ためにこの情報をコンピューターに入力する。好ましく
は、マーカーは未知の寸法の粒子に類似の構造の粒子で
あり《例えば、両粒子は類似の化学成分を含有する）、
その理由は弛緩の速度、再配向及び回転は粒子組成に依
存するからである。しかしながら、これは幾つかの変数
、例えば、重合体寸法、組成等によって異なり、従って
゛１マーカー“が未知の寸法の粒子の組成と類似の組成
を有することは必ずしも必要ではない。
せん断に鋭敏な粒子は従来の方法を使用してこれを顕微
鏡スライド上に置く時に破壊を受ける粒子である。本発
明の別の特徴により、粒子を顕微鏡スライド上に＠着す
る時に破壊を阻止するために、これを媒体に入れる時に
この粒子をより高い密度コンフォメーションに折たたむ
。これらが一度媒体中に入れられると、これらはひろげ
られて、より小さい分子と同じ方法により測定される。
鏡スライド上に置く時に破壊を受ける粒子である。本発
明の別の特徴により、粒子を顕微鏡スライド上に＠着す
る時に破壊を阻止するために、これを媒体に入れる時に
この粒子をより高い密度コンフォメーションに折たたむ
。これらが一度媒体中に入れられると、これらはひろげ
られて、より小さい分子と同じ方法により測定される。
本発明の第一の具体例では、コイルざれ、折曲げられ又
は別に弛緩した、自然のコンフォメーションで形成され
る、蛍光で着色され、変形可能な分子は媒体に入れられ
、そして外部力を加えることによって一時的に変形され
又は延伸ざれる。力の適用を停止する時に、分子の弛緩
時間（例えば、分子が本来の弛緩した状態に戻るのに必
要な時間）は分子運動の直接の顕微鏡観察により又は顕
微鏡と分光分析器の組合わせによ、り測定される。別法
として、延伸の動力学は外部力の開始後に分子の延伸を
追跡することによって測定される。速度測定は種々の方
法、例えば、単位時間当り変化の潰を測定することによ
り計算される。未知の寸法の分子に対する変化の速度は
補間又は外挿によるように、公知の寸法の分子の速度に
基づいて測定ざれる。
は別に弛緩した、自然のコンフォメーションで形成され
る、蛍光で着色され、変形可能な分子は媒体に入れられ
、そして外部力を加えることによって一時的に変形され
又は延伸ざれる。力の適用を停止する時に、分子の弛緩
時間（例えば、分子が本来の弛緩した状態に戻るのに必
要な時間）は分子運動の直接の顕微鏡観察により又は顕
微鏡と分光分析器の組合わせによ、り測定される。別法
として、延伸の動力学は外部力の開始後に分子の延伸を
追跡することによって測定される。速度測定は種々の方
法、例えば、単位時間当り変化の潰を測定することによ
り計算される。未知の寸法の分子に対する変化の速度は
補間又は外挿によるように、公知の寸法の分子の速度に
基づいて測定ざれる。
当業者に公知の粘弾性技術で、この具体例によ１．６６
る液体中の粒子の弛緩時間は約Ｍ として変わる。
ゲル中では、分解能はＭ２−４程度に高いと？われる。
これは分子がゲル又は限定するマトリックスに変形して
そしてその弛緩時間が溶液中よりもゲル中でずっと大き
いことを示す理論的原理に基づいている（ ＤｅＧｅｎ
ｎｅＳ， Ｐ．Ｅ．ＳＣａｌｉｎ（ＩＣｏｎｃｅｐｔｓ
ｉｎ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｐｈｙｓｉｃｓ， Ｃｏｒｎ
ｅｌｌ ！Ｊｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ． Ｎ．Ｙ． （
１ ９ ７ ９ ） ）第二の具体例では、変形可能
な又は変形不能な粒子の再配向時間が測定される。粒子
は最初に一方向に摂動力を受けそしてこの摂動の方向が
、例えば、９０°だけ変化される時に、小さな粒子は迅
速に再配向されそして新しい通路に沿って新しい■移動
を開始する。他方、より大きな分子はこれらが電場の方
向に再配向されるまで実質上不動のままである。次に、
これらも新しい方向へ動き始める。この時までには、よ
り小さい粒子は先に動いたであろう。外部力に関して分
子の位置が変化する速度の測定は、例えば、単位時間当
り位置における変化《例えば、側方の及び／又は回転の
運動）を測定することによって行なわれる。
そしてその弛緩時間が溶液中よりもゲル中でずっと大き
いことを示す理論的原理に基づいている（ ＤｅＧｅｎ
ｎｅＳ， Ｐ．Ｅ．ＳＣａｌｉｎ（ＩＣｏｎｃｅｐｔｓ
ｉｎ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｐｈｙｓｉｃｓ， Ｃｏｒｎ
ｅｌｌ ！Ｊｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ． Ｎ．Ｙ． （
１ ９ ７ ９ ） ）第二の具体例では、変形可能
な又は変形不能な粒子の再配向時間が測定される。粒子
は最初に一方向に摂動力を受けそしてこの摂動の方向が
、例えば、９０°だけ変化される時に、小さな粒子は迅
速に再配向されそして新しい通路に沿って新しい■移動
を開始する。他方、より大きな分子はこれらが電場の方
向に再配向されるまで実質上不動のままである。次に、
これらも新しい方向へ動き始める。この時までには、よ
り小さい粒子は先に動いたであろう。外部力に関して分
子の位置が変化する速度の測定は、例えば、単位時間当
り位置における変化《例えば、側方の及び／又は回転の
運動）を測定することによって行なわれる。
第三の具体例では、一連の外部力を加える時に粒子が回
転する速度が測定される。この方法は特に棒状分子、例
えば、小さなＤＮＡ分子、及び比較的均一なコンフオメ
ーションで保たれるｍ良い分子に適用可能である。本発
明による６回転時間“は特定の一連の外部力を加える時
に、分子が、例えば、３６０゜の特定の角度増分の位置
回転を受けるために必要な時間の量である。
転する速度が測定される。この方法は特に棒状分子、例
えば、小さなＤＮＡ分子、及び比較的均一なコンフオメ
ーションで保たれるｍ良い分子に適用可能である。本発
明による６回転時間“は特定の一連の外部力を加える時
に、分子が、例えば、３６０゜の特定の角度増分の位置
回転を受けるために必要な時間の量である。
周期的にパルス、方向、強度及び長さをスイッチするこ
とにより、分子は回転するにつれて僅かに前後に動くこ
とが引起こされる。これは回転を容易にし、そして自動
車が前方運動と後方運動を交互にすることにより平行な
パーキングスペースの中へ又は外へ操作される方法に類
似している。
とにより、分子は回転するにつれて僅かに前後に動くこ
とが引起こされる。これは回転を容易にし、そして自動
車が前方運動と後方運動を交互にすることにより平行な
パーキングスペースの中へ又は外へ操作される方法に類
似している。
しかしながら、自動車と異なって、棒状又はコイル分子
は回転するにつれて若干曲がる。パルス化ルーチンはま
た有用な測定、例えば、回転時間を分子寸法に関係させ
る測定を供するために、一般に一貫したコンシステンシ
ーに変形可能な粒子を保つ作用をする。
は回転するにつれて若干曲がる。パルス化ルーチンはま
た有用な測定、例えば、回転時間を分子寸法に関係させ
る測定を供するために、一般に一貫したコンシステンシ
ーに変形可能な粒子を保つ作用をする。
公知の寸法の粒子に対する再配向及び／又は回転速度の
データを使用して再配向及び／又は回転速度と分子寸法
間の関係を明らかにし、次にこれを使用して、ポリ分散
試料に存在するもののような、類似の組成と未知の寸法
の種々の重合体分子の寸法を決定できる。再配向及び回
転速度は位置変化を直接に観察する顕微！ＩＩ（好まし
くは漁処理と組合わせて》を使用して、又は分光分析測
定と顕微鏡を組合わせて測定できる。かくして、この具
体例は中程度及び大きい分子に対して有用であるのみで
なく、また容認し得る分解能で像形成するには小さすぎ
る分子にも有用である。
データを使用して再配向及び／又は回転速度と分子寸法
間の関係を明らかにし、次にこれを使用して、ポリ分散
試料に存在するもののような、類似の組成と未知の寸法
の種々の重合体分子の寸法を決定できる。再配向及び回
転速度は位置変化を直接に観察する顕微！ＩＩ（好まし
くは漁処理と組合わせて》を使用して、又は分光分析測
定と顕微鏡を組合わせて測定できる。かくして、この具
体例は中程度及び大きい分子に対して有用であるのみで
なく、また容認し得る分解能で像形成するには小さすぎ
る分子にも有用である。
本発明のなお別の具体例では、媒体中に置かれている分
子又は他の粒子の長さが顕微鏡を使用して直接に測定さ
れる。この技術は任意の数の分子の分子寸法の直接測定
を供する。この方法は一般に、例えば、外部力の通用の
間又は分子を延伸した力の終了のすぐ後に、延伸された
状態にある変形された分子の曲線の長さを測定すること
を含む。
子又は他の粒子の長さが顕微鏡を使用して直接に測定さ
れる。この技術は任意の数の分子の分子寸法の直接測定
を供する。この方法は一般に、例えば、外部力の通用の
間又は分子を延伸した力の終了のすぐ後に、延伸された
状態にある変形された分子の曲線の長さを測定すること
を含む。
しかしながら、この方法はまた細長い形状を有する変形
不能な分子に適用でき、そしてこの分子の測定は測定を
行なう前に外部力の適用を必要としない。好ましくはこ
の具体例は前記のものと同一の顕微鏡と像形成装買を使
用する。
不能な分子に適用でき、そしてこの分子の測定は測定を
行なう前に外部力の適用を必要としない。好ましくはこ
の具体例は前記のものと同一の顕微鏡と像形成装買を使
用する。
第五の具体例では、媒体に懸濁された分子又は他の粒子
の直径（又は半径）が測定される。摂動力の適用は任意
であり、その理由は分子が弛緩状態にあり、そして分子
が球形、楕円形である時に変形可能な分子の直径が測定
されることが好ましいからである。この具体例は変形町
能又は変形不能である粒子を測定するために使用できそ
してコンピューター化像形成装置に結合された光顕微鏡
の使用を含む。
の直径（又は半径）が測定される。摂動力の適用は任意
であり、その理由は分子が弛緩状態にあり、そして分子
が球形、楕円形である時に変形可能な分子の直径が測定
されることが好ましいからである。この具体例は変形町
能又は変形不能である粒子を測定するために使用できそ
してコンピューター化像形成装置に結合された光顕微鏡
の使用を含む。
これらの五つの具体例は前記のパラメータのあるもの又
はすべては一つ又はそれ以上の分子に対して同時に測定
されるように組合わせることができる。
はすべては一つ又はそれ以上の分子に対して同時に測定
されるように組合わせることができる。
本発明の第六の具体例は従来の方法を使用して顕微鏡ス
ライドの上に装着される場合に破壊する傾向を示す非常
に大きな粒子を寸法決めするために特に向けられる。要
約すると、この新規な技術はこれらを環果させることを
引起こす試剤を使用して、これらを媒体に入れる前に粒
子を折たたむこと、次にこれらを媒体に入れた後に粒子
をひろげることを含む。次に１から５の具体例の方法に
より分子を寸法決めする。小さな区域に非常に多数の分
子を入れることが望ましい時に、例えば、ミクロ注入に
おけるように、分子が大きくなく又はせん断に鋭敏でな
い場合さえも、また分子を化学的に折たたむ方法を使用
できる。
ライドの上に装着される場合に破壊する傾向を示す非常
に大きな粒子を寸法決めするために特に向けられる。要
約すると、この新規な技術はこれらを環果させることを
引起こす試剤を使用して、これらを媒体に入れる前に粒
子を折たたむこと、次にこれらを媒体に入れた後に粒子
をひろげることを含む。次に１から５の具体例の方法に
より分子を寸法決めする。小さな区域に非常に多数の分
子を入れることが望ましい時に、例えば、ミクロ注入に
おけるように、分子が大きくなく又はせん断に鋭敏でな
い場合さえも、また分子を化学的に折たたむ方法を使用
できる。
本発明は核酸分子を地図化するための新規な技術を供す
る。例えば、核酸がマトリックスに入れられそして分解
される時に、そのフラグメントはコンピューター化装置
により配列ざれ、そして前記の方法により寸法決めされ
る。かくして、分解物の順序が迅速にかつ正確に決定さ
れる。
る。例えば、核酸がマトリックスに入れられそして分解
される時に、そのフラグメントはコンピューター化装置
により配列ざれ、そして前記の方法により寸法決めされ
る。かくして、分解物の順序が迅速にかつ正確に決定さ
れる。
本発明の別の特徴は分子の部分にプローブをハイブリッ
ド化することによって核酸分子を順序に並べることを供
する。核酸が媒体に入れられ、そこに所望のブＯ−プを
加える。必要に応じて、再結合酵素を加えてもよい。反
応は適当な手段、例えば、ＡＴＰ（アデノシントリホス
フエート）及びマグネシウムイオンの添加により開始さ
れる。
ド化することによって核酸分子を順序に並べることを供
する。核酸が媒体に入れられ、そこに所望のブＯ−プを
加える。必要に応じて、再結合酵素を加えてもよい。反
応は適当な手段、例えば、ＡＴＰ（アデノシントリホス
フエート）及びマグネシウムイオンの添加により開始さ
れる。
プローブがハイブリッド化した後に、前記の方法、即ち
、顕微鏡（単一で）又は分光分析器と組合わけた顕微鏡
により検出される。
、顕微鏡（単一で）又は分光分析器と組合わけた顕微鏡
により検出される。
従って、本発明は個々の粒子の寸法及び粒子のポリ分散
試料の重量分布を測定する正確な方法を供する。従来技
術に優る本発明の別の重要な利点はまさに最大の粒子で
はなく、ポリ分散中のポ１子の８４．に対して測定可能
なパラメータが決定されることにある。付加の利点は（
１）一分子のみが必要であり、そして試料は非常に小さ
く、例えば、ただ一つ又はごく僅かの分子からなるもの
でよく、（２）測定は試料中の各寸法に対して一つの代
表的な粒子に基づき、（３）この技術は非常に大きな粒
子（従来技術法により測定するには大きすぎる粒子）に
対して使用でき、（４）データはコンピューターにより
有効に処理でき、（５）測定は従来技術で公知の方法よ
り迅速に行なわれ（例えば、特に数週間を要する遅い電
気泳動法と比較すると）そして（６）測定が極めて正確
である。
試料の重量分布を測定する正確な方法を供する。従来技
術に優る本発明の別の重要な利点はまさに最大の粒子で
はなく、ポリ分散中のポ１子の８４．に対して測定可能
なパラメータが決定されることにある。付加の利点は（
１）一分子のみが必要であり、そして試料は非常に小さ
く、例えば、ただ一つ又はごく僅かの分子からなるもの
でよく、（２）測定は試料中の各寸法に対して一つの代
表的な粒子に基づき、（３）この技術は非常に大きな粒
子（従来技術法により測定するには大きすぎる粒子）に
対して使用でき、（４）データはコンピューターにより
有効に処理でき、（５）測定は従来技術で公知の方法よ
り迅速に行なわれ（例えば、特に数週間を要する遅い電
気泳動法と比較すると）そして（６）測定が極めて正確
である。
これらの利点と他の利点は下記の詳細な説明から容易に
明らかであろう。
明らかであろう。
本発明の方法は媒体に粒子を入れてこれらを観察しそし
てその寸法を測定する。幾つかの具体例では、粒子が外
部力により変形され又は再配置される問又はその後の何
れかに粒子が測定される。
てその寸法を測定する。幾つかの具体例では、粒子が外
部力により変形され又は再配置される問又はその後の何
れかに粒子が測定される。
本発明の方法は特にコイル化され又はそれが弛緩したく
摂動しな（１）フンフォメーシコンにある時に、多分ス
ーパコイル化ざれる。核酸及び他の重合体の試験に適し
ている。
摂動しな（１）フンフォメーシコンにある時に、多分ス
ーパコイル化ざれる。核酸及び他の重合体の試験に適し
ている。
粒子は媒体、例えば、溶媒、粉末、ガラス又はゲルに配
置される。他の好適な媒体も使用できる。
置される。他の好適な媒体も使用できる。
粒子を含む媒体は顕微鏡スライド上に置かれ又は分子が
顕微鏡下見られることができるように何か他の方式で配
置ざれる。特定の媒体の好適性は一部には使用されるべ
き測定技術に応じて異なる。
顕微鏡下見られることができるように何か他の方式で配
置ざれる。特定の媒体の好適性は一部には使用されるべ
き測定技術に応じて異なる。
摂動を必要とする測定技術は変形可能な粒子がコンフォ
メーション又は位置を変えることができる媒体の使用を
必要とする。光顕微鏡下で直接に観察される時には、好
′ｌ！４な媒休は粒子が明確に見ることができるもので
ある。順微鏡が複屈折測定と組合わされる時には、好適
な媒体は対流を阻止しそして観察された信号の寸法依存
性を高める。更にこの媒体自体は好ましくは実験条件の
間著しい複屈折を比較的含まない。
メーション又は位置を変えることができる媒体の使用を
必要とする。光顕微鏡下で直接に観察される時には、好
′ｌ！４な媒休は粒子が明確に見ることができるもので
ある。順微鏡が複屈折測定と組合わされる時には、好適
な媒体は対流を阻止しそして観察された信号の寸法依存
性を高める。更にこの媒体自体は好ましくは実験条件の
間著しい複屈折を比較的含まない。
蛍光強度の測定に基づく粒子の特性化は媒体としてマト
リックス（例えば、粒子運動を一部ｍｌ１限する媒体）
を使用して大いに高められる。本発明の方法に対して、
媒体は好ましくは溶液又はゲルである。アガロース及び
ポリアクリルアミドは本発明で使用に十分に適している
。好適な溶媒の例はグリセロール／水、ポリデキストラ
ン／水、及び有機溶媒を含む。しかしながら、これらの
例は本発問を限定するものとして解釈されるべきではな
い。
リックス（例えば、粒子運動を一部ｍｌ１限する媒体）
を使用して大いに高められる。本発明の方法に対して、
媒体は好ましくは溶液又はゲルである。アガロース及び
ポリアクリルアミドは本発明で使用に十分に適している
。好適な溶媒の例はグリセロール／水、ポリデキストラ
ン／水、及び有機溶媒を含む。しかしながら、これらの
例は本発問を限定するものとして解釈されるべきではな
い。
好適具体例では、アガロース、約１００．０００ダルト
ンの平均分子漫を有する寒天から得られる多糖類が水性
緩衝液（代表的には１％溶液）に溶解され、そして冷却
するままにされてゼラチンに似た剛性ゲルを形成する（
Ｊｅｌｈｏに見られるように）。このゲルマトリックス
は水素結合を通してお互いにア二一ルされたアガロース
屯合休鎖の三次元網目構造からなる。このアガロースゲ
ルを加熱すると流体状態に戻り、このためこのゲルは丁
度ゼラチンのように可逆性であると右われる。
ンの平均分子漫を有する寒天から得られる多糖類が水性
緩衝液（代表的には１％溶液）に溶解され、そして冷却
するままにされてゼラチンに似た剛性ゲルを形成する（
Ｊｅｌｈｏに見られるように）。このゲルマトリックス
は水素結合を通してお互いにア二一ルされたアガロース
屯合休鎖の三次元網目構造からなる。このアガロースゲ
ルを加熱すると流体状態に戻り、このためこのゲルは丁
度ゼラチンのように可逆性であると右われる。
アガロースゲルの重要な特徹はその途方もなく大きな平
均孔径である。アガロースゲル中の孔ボイドは現在完全
に特性化されていないけれど、これらは幅約０．３ミク
ロンであると思われ、かつまたより小さいボイドを含む
。その大きな孔径と不活性の故に、アガ臼一スはＤＮＡ
ゲル電気泳動に使用され、これはＤＮＡ分子がゲル中で
延沖しかつ運！ＩＩすることができるからである。
均孔径である。アガロースゲル中の孔ボイドは現在完全
に特性化されていないけれど、これらは幅約０．３ミク
ロンであると思われ、かつまたより小さいボイドを含む
。その大きな孔径と不活性の故に、アガ臼一スはＤＮＡ
ゲル電気泳動に使用され、これはＤＮＡ分子がゲル中で
延沖しかつ運！ＩＩすることができるからである。
蛍光顕微鏡が使用されるべき場合には（又は蛍光強度が
他の手段により測定されるべき場合には）、この粒子は
一般に着色される。肴色［程は当業者に周知である。本
発明で有用なスティン又は発色団はエチジウムブロマイ
ド及び４′ ６−ジアミジノ−２−フェニルーインドー
ルジヒドロクロリド（ＤＡＰ Ｉ ）を含むが、これに
限定されない。殆どの型式の粒子はこれらが像形成され
る前のある時に着色されそしてこれらが媒体に入れられ
る前又はその後に看色される。
他の手段により測定されるべき場合には）、この粒子は
一般に着色される。肴色［程は当業者に周知である。本
発明で有用なスティン又は発色団はエチジウムブロマイ
ド及び４′ ６−ジアミジノ−２−フェニルーインドー
ルジヒドロクロリド（ＤＡＰ Ｉ ）を含むが、これに
限定されない。殆どの型式の粒子はこれらが像形成され
る前のある時に着色されそしてこれらが媒体に入れられ
る前又はその後に看色される。
変形可能な粒子が媒体に入れられそしてスライド上に装
着される時には、粒子を摂動するために幾つかの可能な
方法がある。幾つかの非限定方法は下記の通りである：
（１）粒子が電場の適用により摂動され、これはマトリ
ックスを通してＤＮＡのような荷電粒ｆを動かし、クッ
キーねり粉形成機を通して動くにつれて変形するように
コイルコンフ４メーションを歪める。これはゲル電気泳
勤に含まれる現象である、（２）フロー場が液体アガロ
ース／ＤＮＡ （又は選択の重合体）中に作られそして
次に著しいコイル弛緩を阻止するのに十分に速く、粒子
含有液体が低温急冷で急速にゲル化される。この方法は
粒子が荷電されても、されなくても有川である．（３）
電気泳動効果を使用して、場勾配（位置と共に強度を変
化する電場）を有する非荷′電粒子が分子電子雲を歪ま
せることにより動かされ、かくして吸引できる双橿子を
誘導する。
着される時には、粒子を摂動するために幾つかの可能な
方法がある。幾つかの非限定方法は下記の通りである：
（１）粒子が電場の適用により摂動され、これはマトリ
ックスを通してＤＮＡのような荷電粒ｆを動かし、クッ
キーねり粉形成機を通して動くにつれて変形するように
コイルコンフ４メーションを歪める。これはゲル電気泳
勤に含まれる現象である、（２）フロー場が液体アガロ
ース／ＤＮＡ （又は選択の重合体）中に作られそして
次に著しいコイル弛緩を阻止するのに十分に速く、粒子
含有液体が低温急冷で急速にゲル化される。この方法は
粒子が荷電されても、されなくても有川である．（３）
電気泳動効果を使用して、場勾配（位置と共に強度を変
化する電場）を有する非荷′電粒子が分子電子雲を歪ま
せることにより動かされ、かくして吸引できる双橿子を
誘導する。
電気泳動はアガロースのようなマトリックス中で使用で
きると思われる。
きると思われる。
電気泳動を使用することで利点の一つはＤＮＡ分子がＤ
ＮＡ含有媒体中にある他の粒子から区別されることで、
その理由は非荷電粒子が電場の適用に応じて肋かないか
らである。他のちのからＤＮＡ粒子を区別する別の可能
な方法はＤＮＡを増大することである。
ＮＡ含有媒体中にある他の粒子から区別されることで、
その理由は非荷電粒子が電場の適用に応じて肋かないか
らである。他のちのからＤＮＡ粒子を区別する別の可能
な方法はＤＮＡを増大することである。
測定前に、分子が摂動されるべき、例えばコンフォメー
ション及び位置の変化を受けるべき程度が変わる。例え
ば、コイル化された分子が一部のみアンコイルされるよ
うにコイル化された分子が摂動される時でさえ分子弛緩
に関して有用なデータが得られる。
ション及び位置の変化を受けるべき程度が変わる。例え
ば、コイル化された分子が一部のみアンコイルされるよ
うにコイル化された分子が摂動される時でさえ分子弛緩
に関して有用なデータが得られる。
前記のように、本発明により分子を摂動する好適方法の
一つは電気泳勤である。顕微鏡と共に使用に適する電気
泳動法が粒子を摂動する本発Ｉ１により使用できる．雷
気泳勅は任意に本発明で別の機能に役立つ。試料寸法が
あまり大きく又は複雑ですべてを一時に顕微鏡下で見る
ことができない時には、分子をサブ試料に分離し、次に
これを別別に像形成できる。
一つは電気泳勤である。顕微鏡と共に使用に適する電気
泳動法が粒子を摂動する本発Ｉ１により使用できる．雷
気泳勅は任意に本発明で別の機能に役立つ。試料寸法が
あまり大きく又は複雑ですべてを一時に顕微鏡下で見る
ことができない時には、分子をサブ試料に分離し、次に
これを別別に像形成できる。
見ることそして測定することの目的で分子の電気泳勤は
任意に米国特許第４．６９５，５４８号に記載されるよ
うなパルス化場電気泳動に使用に適し又は下記のパルス
化配向電気泳動に使用に適している室を使用する。これ
らの技術は場角度を制御する性能の故に、再配向及び／
又は回転時間を測定することが望ましい場合に特に有用
である。
任意に米国特許第４．６９５，５４８号に記載されるよ
うなパルス化場電気泳動に使用に適し又は下記のパルス
化配向電気泳動に使用に適している室を使用する。これ
らの技術は場角度を制御する性能の故に、再配向及び／
又は回転時間を測定することが望ましい場合に特に有用
である。
パルス化配向電気泳動（ＰＯＥ）は場角度を生じかつ変
える短い電気パルスを使用することにより試料中のポリ
分散重合体分子の分離を改良し、この有効な場角度は持
続時間、強度及び方向で変わる一連のパルスのベクトル
合計により形成される。パルス時間及びパルス強度は分
離を行なうように変調される。ＰＯＥはまた像形成中有
効な場角度を生ずるために有用である。必要な計為は顕
微鏡に容易に適合される。
える短い電気パルスを使用することにより試料中のポリ
分散重合体分子の分離を改良し、この有効な場角度は持
続時間、強度及び方向で変わる一連のパルスのベクトル
合計により形成される。パルス時間及びパルス強度は分
離を行なうように変調される。ＰＯＥはまた像形成中有
効な場角度を生ずるために有用である。必要な計為は顕
微鏡に容易に適合される。
ＰＯＥのための例示の実験室計器を第１図に示しそして
略字図を第２図に示す。
略字図を第２図に示す。
第１図に例示される計器は米国特許第４．４７３．４５
２号に記載されるものの縮小物に類似しているが、ＰＯ
Ｅ計器が不連続電極配列の一極動作を可能にづる２セッ
トのダイオード３４を有する点で異なる。このダイオー
ト３４を複連動継電器（図示せず）に置き換えて同様な
電気分離を供することができる。しかしながら、非常に
速い（１秒以下）パルス化が必要である時にはダイオー
ド３４を使用することが最良である。
２号に記載されるものの縮小物に類似しているが、ＰＯ
Ｅ計器が不連続電極配列の一極動作を可能にづる２セッ
トのダイオード３４を有する点で異なる。このダイオー
ト３４を複連動継電器（図示せず）に置き換えて同様な
電気分離を供することができる。しかしながら、非常に
速い（１秒以下）パルス化が必要である時にはダイオー
ド３４を使用することが最良である。
第１図及び第２図に示すように、本発明に使用される縮
小電気泳動室５０は標準カバースリップの寸法について
測定する。ダイオード３４に接続ずる電極４２′がある
（第２図）。所望の電場を生ずるために、白金電極４２
′が第２図に示されるように内部接続される。特にｄ−
ｃ電源２８は継電器３０１．：ｄ−Ｃ電力を供給し、こ
れは電！９１２８からのｄ−ｃ電力に選択された出力を
接続するようにコンピューター３２により制御される。
小電気泳動室５０は標準カバースリップの寸法について
測定する。ダイオード３４に接続ずる電極４２′がある
（第２図）。所望の電場を生ずるために、白金電極４２
′が第２図に示されるように内部接続される。特にｄ−
ｃ電源２８は継電器３０１．：ｄ−Ｃ電力を供給し、こ
れは電！９１２８からのｄ−ｃ電力に選択された出力を
接続するようにコンピューター３２により制御される。
コンピューター３２はまたｌｆｔｌｉの゛１圧が変えら
れるようにｄ−ｃ電源２８を制御する。継電器３０へ出
力は各電極に対する各ダイオード３４を通して１！極４
２′に接続される。
れるようにｄ−ｃ電源２８を制御する。継電器３０へ出
力は各電極に対する各ダイオード３４を通して１！極４
２′に接続される。
第１図に示すように縮小ＰＯＥ装置はホルダー５２を有
し、これは顕微鏡ステージの上に適合する。アガロース
ゲルを保持するスライド５４はホルダーの中に配置され
そして電極４２はアガロース電気接続性ウィック４４で
３０％グリセロールーアガ口ースの小滴を置くスライド
５４／ゲル／カバースリップのサンドインチと電気接触
する。
し、これは顕微鏡ステージの上に適合する。アガロース
ゲルを保持するスライド５４はホルダーの中に配置され
そして電極４２はアガロース電気接続性ウィック４４で
３０％グリセロールーアガ口ースの小滴を置くスライド
５４／ゲル／カバースリップのサンドインチと電気接触
する。
ホルダー５２の一部である電気コネクタ４６は双極性ダ
イオード３４及び第２図に示すパルス化計器に中継を供
する。第１図では、電気コネクタ４６はダイオードバス
及びパルスコントロール４８に接続する。
イオード３４及び第２図に示すパルス化計器に中継を供
する。第１図では、電気コネクタ４６はダイオードバス
及びパルスコントロール４８に接続する。
米国特許第４，４７３．４５２号に記載された計器の場
合のように、現在例示される計器は互いに直角である電
場を発生し、これは下記のような選択されたパルス化ル
ーチンにより互いに関して相において高い強度と低い強
度の間で交代し、しかも発生した電場の各方向に対して
横の全方向でゲルに増分的に通して粒子を移して分離を
行なう。
合のように、現在例示される計器は互いに直角である電
場を発生し、これは下記のような選択されたパルス化ル
ーチンにより互いに関して相において高い強度と低い強
度の間で交代し、しかも発生した電場の各方向に対して
横の全方向でゲルに増分的に通して粒子を移して分離を
行なう。
電極設計のこの新規な二極性により、なんら著しい電極
誘導場歪みなしに高強度と低強度を交代させる外に、所
望に応じて、同時に極性を変えることが可能である。
誘導場歪みなしに高強度と低強度を交代させる外に、所
望に応じて、同時に極性を変えることが可能である。
電極配列の配置よりむしろパルス化ルーチンによる有効
な場角度の測定が他では困難であろう分子配向（及び分
離）を許す。下記の例４に示すように、ＰＯＥＧ．ｔＤ
ＮＡ像形成実験に使用されている。第１図、第２図に示
しそして例４に使用する電気泳動装置は米国特許第４．
６９５．５４８号のものより好適であり、その理由は従
来のパルス化場電気泳動に教示されるように電極を動か
すように場角度を変えることは顕微鏡ステージの物理的
限界により実際的でないからである。しかしながら、Ｐ
ＯＥ装置の使用は分子が他の装置により十分に摂動でき
る時には本発明を実施するために必要ではない。大略顕
微鏡スライドの寸法である装置を使用する従来の電気泳
動は荷電粒子を摂動する別の好適な方法である。
な場角度の測定が他では困難であろう分子配向（及び分
離）を許す。下記の例４に示すように、ＰＯＥＧ．ｔＤ
ＮＡ像形成実験に使用されている。第１図、第２図に示
しそして例４に使用する電気泳動装置は米国特許第４．
６９５．５４８号のものより好適であり、その理由は従
来のパルス化場電気泳動に教示されるように電極を動か
すように場角度を変えることは顕微鏡ステージの物理的
限界により実際的でないからである。しかしながら、Ｐ
ＯＥ装置の使用は分子が他の装置により十分に摂動でき
る時には本発明を実施するために必要ではない。大略顕
微鏡スライドの寸法である装置を使用する従来の電気泳
動は荷電粒子を摂動する別の好適な方法である。
本発明の好適な具体例では、重合体粒子を含有する小さ
な電気泳動室が顕微鏡スライド上に置かれそして重合体
粒子が光顕微鏡の下で見られる。
な電気泳動室が顕微鏡スライド上に置かれそして重合体
粒子が光顕微鏡の下で見られる。
第３ａ図に示すように、単一分子の像形成は低い光レベ
ル増感性ビデオカメラに結合した蛍光像形成用水銀灯（
励起光はレーザー６０，蛍光のためのアルゴン、複屈折
のための２一周波数ヘリウムーネオンからのように前記
の試料から生ずる）、ビデオディジタル化エレクトロニ
ックスを含む像プロセスサー６６に接続され、これが次
にビデオモニタ６８に接続されるＳＩＴ又はマイクロ一
チャンネルプレートを備えたエビ蛍光顕微鏡６２を用い
て行なわれる。本発明でここでエビ蛍光顕微鏡の使用は
Ｙａｎｉｇｉｄａ等、Ａｐｌ）ｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ
Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｍ
ｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ｅｄｓ． Ｔａｙｌｏ
ｒ， Ｄ．Ｌ． ｅｔ ａｌ） ３ ２ １ − ３
４ ５（＾ｆａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ． Ｈｅｗ
Ｙｏｒｋ， １ ９ ８ ６ ）により最初に開発さ
れた方法論の拡張である。高パワー化油浸対物レンズ５
８が好ましくは顕微鏡に使用される。重要な要件は光を
有効に集める高い数字の口径を有する対物レンズを使用
することにある。シリコン強化ターゲット（ＳＩＴ）カ
メラ又はマイクロ一チャンネルプレート検出器が使用さ
れて光感度をカウントするフォトンの点まで押し上げる
。像プロセッサーはビデオカメラからの像をディジタル
化し、処理しそして記憶することを目的とするコンピュ
ーターである。この種の像プロセッサーは当業者に公知
である。像は根本的に増強ざれてコントラストを生じ、
灰色レベルの擬似色表示を供し（色彩は′着色する″昔
の黒色映画で行なわれるものと異なることなく、任意に
像を増強するように指定できる）そして視界の中で対象
物をカウントすることを含する特性分析を供する。エビ
蛍光顕微鏡を使用して、４′，６−ジアミジノ−２−フ
エニルインドールジヒドロクロリド（ＤＡＰ １ ）の
ような適当な発色団で着色された単一ＤＮＡ分子を見る
ことができる。
ル増感性ビデオカメラに結合した蛍光像形成用水銀灯（
励起光はレーザー６０，蛍光のためのアルゴン、複屈折
のための２一周波数ヘリウムーネオンからのように前記
の試料から生ずる）、ビデオディジタル化エレクトロニ
ックスを含む像プロセスサー６６に接続され、これが次
にビデオモニタ６８に接続されるＳＩＴ又はマイクロ一
チャンネルプレートを備えたエビ蛍光顕微鏡６２を用い
て行なわれる。本発明でここでエビ蛍光顕微鏡の使用は
Ｙａｎｉｇｉｄａ等、Ａｐｌ）ｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ
Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｍ
ｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ｅｄｓ． Ｔａｙｌｏ
ｒ， Ｄ．Ｌ． ｅｔ ａｌ） ３ ２ １ − ３
４ ５（＾ｆａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ． Ｈｅｗ
Ｙｏｒｋ， １ ９ ８ ６ ）により最初に開発さ
れた方法論の拡張である。高パワー化油浸対物レンズ５
８が好ましくは顕微鏡に使用される。重要な要件は光を
有効に集める高い数字の口径を有する対物レンズを使用
することにある。シリコン強化ターゲット（ＳＩＴ）カ
メラ又はマイクロ一チャンネルプレート検出器が使用さ
れて光感度をカウントするフォトンの点まで押し上げる
。像プロセッサーはビデオカメラからの像をディジタル
化し、処理しそして記憶することを目的とするコンピュ
ーターである。この種の像プロセッサーは当業者に公知
である。像は根本的に増強ざれてコントラストを生じ、
灰色レベルの擬似色表示を供し（色彩は′着色する″昔
の黒色映画で行なわれるものと異なることなく、任意に
像を増強するように指定できる）そして視界の中で対象
物をカウントすることを含する特性分析を供する。エビ
蛍光顕微鏡を使用して、４′，６−ジアミジノ−２−フ
エニルインドールジヒドロクロリド（ＤＡＰ １ ）の
ような適当な発色団で着色された単一ＤＮＡ分子を見る
ことができる。
この可視化技術の最小寸法測定は顕微鏡分解能により限
定され、これはこの時にはＤＮＡ分子中で約０．１ミク
ロン又は約３００ヌクレオチド塩基である。この長さは
小さなバクテリア遺伝子に対応するが、しかしながら若
干のＤＮＡ分子は人の染色体のように長さで数インチで
ある。試料中の幾つかの分子を同時に見ることができる
ので、また多くの不連続な分子の寸法を同時に測定する
ことができる。
定され、これはこの時にはＤＮＡ分子中で約０．１ミク
ロン又は約３００ヌクレオチド塩基である。この長さは
小さなバクテリア遺伝子に対応するが、しかしながら若
干のＤＮＡ分子は人の染色体のように長さで数インチで
ある。試料中の幾つかの分子を同時に見ることができる
ので、また多くの不連続な分子の寸法を同時に測定する
ことができる。
本発明により粒子を寸法決めする別法は分光分析で粒子
を測定することを含む。顕微鏡と組合わせた時にこの技
術はあまり小さいので満足すべき分解能で像形成できな
い分子を寸法決めするために特に有用である。また中程
度又は大きい寸法の粒子のためにも使用できる。これら
の技術を使用する分解能はフォトンカウント化により測
定されるように信号／Ｍｆｌにより単純に限定される。
を測定することを含む。顕微鏡と組合わせた時にこの技
術はあまり小さいので満足すべき分解能で像形成できな
い分子を寸法決めするために特に有用である。また中程
度又は大きい寸法の粒子のためにも使用できる。これら
の技術を使用する分解能はフォトンカウント化により測
定されるように信号／Ｍｆｌにより単純に限定される。
本発明の好適具体例により測定される寸法パラメータは
摂動された粒子の弛緩又は延伸速度、異なる方向で摂動
力を受ける粒子の再配向速度及び／またはＩｑ転速度、
摂動された粒子の曲線の長さ、そして球形又は楕円形の
粒子の直径を含む。各具体例は測定されるパラメータと
分子寸法間の数学的関係に基づいている。
摂動された粒子の弛緩又は延伸速度、異なる方向で摂動
力を受ける粒子の再配向速度及び／またはＩｑ転速度、
摂動された粒子の曲線の長さ、そして球形又は楕円形の
粒子の直径を含む。各具体例は測定されるパラメータと
分子寸法間の数学的関係に基づいている。
第一の好適具体例は外部力の適用が終了した後に摂動ざ
れた分子が弛緩した状態に戻るために要した時間の測定
を含む。弛緩動力学の測定は例１−４に記載される。こ
の具体例は一部には弛緩時間と分子寸法を数学的に関連
させる原理に基づいている。
れた分子が弛緩した状態に戻るために要した時間の測定
を含む。弛緩動力学の測定は例１−４に記載される。こ
の具体例は一部には弛緩時間と分子寸法を数学的に関連
させる原理に基づいている。
曲線の長さを測定するような他の方法よりむしろ弛緩を
使用してフラグメント寸法を測定することの重要な利点
はＤＮＡ分子が正確な測定を得るために全部延伸される
必要がないことにある。測定された弛緩時間はコイル伸
長の程度に無関係である。これは粘弾性技術を使用して
ＤＮＡ弛緩時間を測定することに対して明らかに示され
ている（Ｈａｓｓａ， Ｄ．Ｊ． Ｂｉｏｐｏ±Ｌ！ヒ
エ１ ２ ： １ ０ ７ １ − １０８１ （１９
７３））。
使用してフラグメント寸法を測定することの重要な利点
はＤＮＡ分子が正確な測定を得るために全部延伸される
必要がないことにある。測定された弛緩時間はコイル伸
長の程度に無関係である。これは粘弾性技術を使用して
ＤＮＡ弛緩時間を測定することに対して明らかに示され
ている（Ｈａｓｓａ， Ｄ．Ｊ． Ｂｉｏｐｏ±Ｌ！ヒ
エ１ ２ ： １ ０ ７ １ − １０８１ （１９
７３））。
第二の好適具体例は少なくとも一つの外部力、例えば、
異なる方向で順次の電場を受けた分子の再配向の測定を
含む。これは例６で下記に示されかつ第４｛ａ｝図及び
第５（ｊ）図に示される。再配向が基づいている原理は
蛍光顕微鏡／＠プロセツシングを使用して発明者により
研究されている。
異なる方向で順次の電場を受けた分子の再配向の測定を
含む。これは例６で下記に示されかつ第４｛ａ｝図及び
第５（ｊ）図に示される。再配向が基づいている原理は
蛍光顕微鏡／＠プロセツシングを使用して発明者により
研究されている。
例に記載のようにこの方法を使用して、パルス化場電気
泳動の間、ＤＮＡ分子のブロブ（球状小塊）トレインは
非常に複雑な方式でかつこの工程の間適用された電場で
配向し、整合が完了するまで、例えば、分子が適用され
た場で整合されるまで、電気泳動移動度が遅延される。
泳動の間、ＤＮＡ分子のブロブ（球状小塊）トレインは
非常に複雑な方式でかつこの工程の間適用された電場で
配向し、整合が完了するまで、例えば、分子が適用され
た場で整合されるまで、電気泳動移動度が遅延される。
場方向が変化すると、ブロブトレインは幾つかの新しい
方向に同時に動ク（即ち、このブロブは若干独立して動
いているようである）。結果として、ブＯブトレインの
ある部分は適用場で再配向することに支配されそしてブ
ロブの残りをゲルを通して生じた通路に沿って引張る。
方向に同時に動ク（即ち、このブロブは若干独立して動
いているようである）。結果として、ブＯブトレインの
ある部分は適用場で再配向することに支配されそしてブ
ロブの残りをゲルを通して生じた通路に沿って引張る。
完全なブロブトレイン整合のために必要な時間は寸法と
共に直接に変わる；即ら１０ｍｂ（１ ｍｂ − １
． Ｏ Ｏ Ｏｋｂ）分子は再配向するために１時間要
し、一方１０ｋｂ分子は同様な場強度を使用して、単に
１０秒を要する。この現像を第４図に示す。再配向は光
顕微鏡及び分光分析法と組合わせた顕微鏡を含めて、種
々の方法で測定される。
共に直接に変わる；即ら１０ｍｂ（１ ｍｂ − １
． Ｏ Ｏ Ｏｋｂ）分子は再配向するために１時間要
し、一方１０ｋｂ分子は同様な場強度を使用して、単に
１０秒を要する。この現像を第４図に示す。再配向は光
顕微鏡及び分光分析法と組合わせた顕微鏡を含めて、種
々の方法で測定される。
本発明の第三の具体例は異なる方向で順次の電場を受け
た分子の回転時間の測定を含む。ある意味で、分子の回
転は一連の増分再配向段階を必要とし、その各々は粒子
が特定の角度増分、例えば、３６０゜の回転を受けるま
で、粒子が同一方向で更に回転することを引起こす。こ
の具体例は外部力の適用で著しくコンフォメーションを
変えない、小さいＤＮＡ分子のような硬い、棒状粒子を
特性化するために特によく適している。しかしながら、
分子のコンフオメーションがかなり一定に保たれ、好ま
しくは棒状又は細長いコンフオメーションである場合に
は、大きな分子もこの方法により寸法決めできる。これ
はパルス化ルーチンを適用することにより行なわれ、こ
れは分子の寸法、形状及び多分また組成に適している。
た分子の回転時間の測定を含む。ある意味で、分子の回
転は一連の増分再配向段階を必要とし、その各々は粒子
が特定の角度増分、例えば、３６０゜の回転を受けるま
で、粒子が同一方向で更に回転することを引起こす。こ
の具体例は外部力の適用で著しくコンフォメーションを
変えない、小さいＤＮＡ分子のような硬い、棒状粒子を
特性化するために特によく適している。しかしながら、
分子のコンフオメーションがかなり一定に保たれ、好ま
しくは棒状又は細長いコンフオメーションである場合に
は、大きな分子もこの方法により寸法決めできる。これ
はパルス化ルーチンを適用することにより行なわれ、こ
れは分子の寸法、形状及び多分また組成に適している。
非限定例として、分子はお互いに９０゜で適用される正
弦波で変化する電場の存在で回転する。
弦波で変化する電場の存在で回転する。
硬い、棒状分子又は延伸された長軸又は短軸の周りで回
転する。長軸の周りの回転は最大の分子量依存性を有し
、回転拡散は約Ｍ３として変わる。
転する。長軸の周りの回転は最大の分子量依存性を有し
、回転拡散は約Ｍ３として変わる。
ボートブロベラが水中で回転するように分子を単純に回
転しようと試みるならば、ゲル又は何か他の限定物の中
に浸漬された棒状分子の回転運動は困難となる。ゲルが
使用ざれる時には、海草がボートプロペラの回転に影響
するようにマトリックスが分子の回転に影響する。かく
して、パルス化ルーチンが適用され、これはまた粒子の
前後運動を与え、これによって回転を容易にする。
転しようと試みるならば、ゲル又は何か他の限定物の中
に浸漬された棒状分子の回転運動は困難となる。ゲルが
使用ざれる時には、海草がボートプロペラの回転に影響
するようにマトリックスが分子の回転に影響する。かく
して、パルス化ルーチンが適用され、これはまた粒子の
前後運動を与え、これによって回転を容易にする。
このパルス化ルーブンはアルゴリズムにより定義できる
。一般的に述べると、このアルゴリズムは角度増分、時
間、電場強度等の変数に依存し、そして次にこれらは異
なる変数の関数である。かくして、使用できるアルゴリ
ズムの型式は無数である。
。一般的に述べると、このアルゴリズムは角度増分、時
間、電場強度等の変数に依存し、そして次にこれらは異
なる変数の関数である。かくして、使用できるアルゴリ
ズムの型式は無数である。
本発明に対する好適なパルス化ルーチンは次の通り定義
される： Ｐ ＝ｋ１・Ｅ１（ｔ）， ｋ２・Ｅ２（ｔ＞， ｋ１・Ｅ
１（ｔ＞た電場ベクトルであり（ボルト・秒／α）であ
り：θｉはラジアン又は度で、場角度であり、ｉ＝ｌ→
ｎ１ここで完全な回転には ｎ Δｔは秒でパルス長さであり； ｔは秒で時間であり； ｋ１及びｋ２、は連続した同一パルスの数であり；そし
て Ｐはパルス化ルーチンであり、これは繰返される） 前記のルーティンを使用して、各セットのバルスＰが開
始される時に適当なパルスが加えられるる。また、この
分子はＥ （ｔ）及びーＥ （ｔ）の方向で移され（側
方へ動ク）、これによって回転を容易にする。
される： Ｐ ＝ｋ１・Ｅ１（ｔ）， ｋ２・Ｅ２（ｔ＞， ｋ１・Ｅ
１（ｔ＞た電場ベクトルであり（ボルト・秒／α）であ
り：θｉはラジアン又は度で、場角度であり、ｉ＝ｌ→
ｎ１ここで完全な回転には ｎ Δｔは秒でパルス長さであり； ｔは秒で時間であり； ｋ１及びｋ２、は連続した同一パルスの数であり；そし
て Ｐはパルス化ルーチンであり、これは繰返される） 前記のルーティンを使用して、各セットのバルスＰが開
始される時に適当なパルスが加えられるる。また、この
分子はＥ （ｔ）及びーＥ （ｔ）の方向で移され（側
方へ動ク）、これによって回転を容易にする。
前記の等式で、Δｔは一定であるが、しかしながら、こ
れはこの場合に必要ではない。Ｅは何れかの変数又は一
連の変数の関数である。例えば、Ｅは全経過時間及び／
又は角度増分の関数である。
れはこの場合に必要ではない。Ｅは何れかの変数又は一
連の変数の関数である。例えば、Ｅは全経過時間及び／
又は角度増分の関数である。
また、すべての角度増分の合計が３６０゜である必要は
なく、一部又は全部の回転の何れかの数でよく、これが
十分な正確さの測定を供する。
なく、一部又は全部の回転の何れかの数でよく、これが
十分な正確さの測定を供する。
分子の回転速度を測定するための特定のセットの条件を
例７に記載する。
例７に記載する。
本発明の第四の好適具体例により、儲合体分子のような
粒子の寸法を測定する有用な方法は光顕微鏡を使用して
粒子を可視化しそしてその曲線の長さを測定する（ロー
ブの長さを測定することに等価）ことにある。蛍光顕微
鏡が適当な発色団で着色された単一重合体分子を像形成
できることが下記の例４及び第４図と第５図に示される
。信じ難いことには、この重合体直径寸法が僅か丁度２
０オングストロームであるとして、単一分子が容易に町
視化される。分子が延伸されそしてコンビューター化像
形成装置が使用されて可視化分子の長さを測定するなら
ば、測定の寸法依存性は約Ｍ１として変わる。長さの測
定は例１０で詳細に記載するように制限分解物のような
ＤＮＡフラグメントを寸法決めしそして配列するのに特
に有用である。
粒子の寸法を測定する有用な方法は光顕微鏡を使用して
粒子を可視化しそしてその曲線の長さを測定する（ロー
ブの長さを測定することに等価）ことにある。蛍光顕微
鏡が適当な発色団で着色された単一重合体分子を像形成
できることが下記の例４及び第４図と第５図に示される
。信じ難いことには、この重合体直径寸法が僅か丁度２
０オングストロームであるとして、単一分子が容易に町
視化される。分子が延伸されそしてコンビューター化像
形成装置が使用されて可視化分子の長さを測定するなら
ば、測定の寸法依存性は約Ｍ１として変わる。長さの測
定は例１０で詳細に記載するように制限分解物のような
ＤＮＡフラグメントを寸法決めしそして配列するのに特
に有用である。
第五の好適具体例は弛緩した粒子の直径を測定すること
を含む。曲線の長さの測定と同様に分子を着色すること
、媒体中に分子を入れること等の工程により分子直径の
測定を行なった。しかしながら、測定の前に分子を摂動
することは必要でない。代りに、球形又はｍ長い楕円形
を有する分子が弛緩した状態にある時にこの分子が測定
される。
を含む。曲線の長さの測定と同様に分子を着色すること
、媒体中に分子を入れること等の工程により分子直径の
測定を行なった。しかしながら、測定の前に分子を摂動
することは必要でない。代りに、球形又はｍ長い楕円形
を有する分子が弛緩した状態にある時にこの分子が測定
される。
球の容積はＲ ，ｗ（−でＲは半径、に比例しモし２
一 一 て楕円体の容積はａｌ） ＳＬｗでａは長軸の半径、
そしてｂは短軸の半径、の比例しているので、こ０．３
３ の技術に対して分解能は約Ｍ として変わる。
一 一 て楕円体の容積はａｌ） ＳＬｗでａは長軸の半径、
そしてｂは短軸の半径、の比例しているので、こ０．３
３ の技術に対して分解能は約Ｍ として変わる。
この技術により測定される粒子は変形可能である必要は
ない。この技術はすべての刈法のＤＮＡ分子を寸法決め
するために有用であり、そして現在顕＠鏡スライド上に
うまく装着される大きなＤＮＡ分子を寸法決めするため
、並びに密にバックされた分子を寸法決めするために有
用である。
ない。この技術はすべての刈法のＤＮＡ分子を寸法決め
するために有用であり、そして現在顕＠鏡スライド上に
うまく装着される大きなＤＮＡ分子を寸法決めするため
、並びに密にバックされた分子を寸法決めするために有
用である。
大きなＤＮＡ分子のような大きな粒子は破壊を引起こす
ことなく順微鏡スライドの上に装着することが難しく、
そして発明者は新規な技術を使用してこの問題を提示し
、これは本発明の別の面である。代表的な人の染色体は
長さでインチに延伸する単一ＤＮＡ分子を含む。自然は
直径で僅か数ミクロンと測定されるｍ胞の中に大休６フ
ィートのＤＮＡを適合させる賢明なバッケージング機構
を供する。しかしながら、これらの大きなｌ）ＮＡは破
壊に対して非常に鋭敏である。例えば、大きなＤＮＡ分
子の溶液は注入され、ビベットが用いられ、又はかきま
ぜられると必ず分子を破壊する。
ことなく順微鏡スライドの上に装着することが難しく、
そして発明者は新規な技術を使用してこの問題を提示し
、これは本発明の別の面である。代表的な人の染色体は
長さでインチに延伸する単一ＤＮＡ分子を含む。自然は
直径で僅か数ミクロンと測定されるｍ胞の中に大休６フ
ィートのＤＮＡを適合させる賢明なバッケージング機構
を供する。しかしながら、これらの大きなｌ）ＮＡは破
壊に対して非常に鋭敏である。例えば、大きなＤＮＡ分
子の溶液は注入され、ビベットが用いられ、又はかきま
ぜられると必ず分子を破壊する。
従って、大きなＤＮＡ分子を用いた操作は非常に困難で
ある。数年前、発明者が破壊なしに大きなＤＮＡ分子を
ｗａ製するゲルをベースとした方法を開発し、これはま
たそのままの分子を使用する生化学を可能にする、（参
照、米国特許第４．６９５，５４８号）。この工程は挿
入法と称されそして下記のように操作する；細胞を洗浄
しそして３７℃に保った低ゲル化温度アガロースと混合
する。
ある。数年前、発明者が破壊なしに大きなＤＮＡ分子を
ｗａ製するゲルをベースとした方法を開発し、これはま
たそのままの分子を使用する生化学を可能にする、（参
照、米国特許第４．６９５，５４８号）。この工程は挿
入法と称されそして下記のように操作する；細胞を洗浄
しそして３７℃に保った低ゲル化温度アガロースと混合
する。
このｉｎ−アガロース混合物をモールドにピペットで入
れ、（スラブゲルのウエルに適合する小ブロックを製造
する）そしてゲル化するままにする。
れ、（スラブゲルのウエルに適合する小ブロックを製造
する）そしてゲル化するままにする。
生成するブロック又はこれらが名付けられる“挿入体″
は次にＥＤＴＡ，プロテアーゼ及び洗剤を含有するリン
ス溶液に入机られる。このリシス溶液は挿入体の中に拡
散し、ｍａを溶解しそしてそのままの裸のＤＮＡ分子を
結合したタンパク質からストリップする。このＤＮＡ分
子はマトリックスから拡散せず、その理由は非常に大き
いコイルは一般に拡散できないからである。
は次にＥＤＴＡ，プロテアーゼ及び洗剤を含有するリン
ス溶液に入机られる。このリシス溶液は挿入体の中に拡
散し、ｍａを溶解しそしてそのままの裸のＤＮＡ分子を
結合したタンパク質からストリップする。このＤＮＡ分
子はマトリックスから拡散せず、その理由は非常に大き
いコイルは一般に拡散できないからである。
液体アガロース中に懸濁された時少なくともメガベース
（１メガベース＝１ミリオンベース＝６６０×１０６ダ
ルトン）までのＤＮＡ分子は顕微鏡スライド上に装着さ
れた時せん断に対して保護されることが判っている。し
かしながら、２又は３メガベースより大きい分子に対し
て又は分子の１００％の一体性が確保されねばならない
状態に対してこの工程は有効ではない。
（１メガベース＝１ミリオンベース＝６６０×１０６ダ
ルトン）までのＤＮＡ分子は顕微鏡スライド上に装着さ
れた時せん断に対して保護されることが判っている。し
かしながら、２又は３メガベースより大きい分子に対し
て又は分子の１００％の一体性が確保されねばならない
状態に対してこの工程は有効ではない。
本発明の第六の具体例は顕微鏡スライド上に１メガベー
スより大きい分子を置くことを含む前記の問題を改良す
る。１疑縮剤を使用してゲル結合ＤＮＡ （挿入体から
得られるような）を小さな耐せん断性球に折りたたみ、
これがイオン性化合物、例えば、塩化ナトリウム又は塩
化マグネシウムのような塩の添加で、一度装着されると
折り曲げられない、プロトコールが開発されている。好
ましくは、この凝縮剤はスペルミンである。更に例１０
に記載するこのスペルミンブロトコールは何ら検出し得
るせん断媒介破壊なしに、ｔ Ｑ／％． （７）ＤＮ
Ａ分子をそして大きな分子さえも容易に装着することが
できる。スペルミンの使用が好ましいが、分子を折たた
むために好適な物質は特定の粒子に折たたみを引起こす
何れかの物質、例えば、粒子に選択的にそれ自体を溶媒
化合物にすることを引起こｔｉ縮剤を含む。この物質の
例はスペルミジン、アルコール及びヘキサミンコバルト
を含むが、これらに限定されない。
スより大きい分子を置くことを含む前記の問題を改良す
る。１疑縮剤を使用してゲル結合ＤＮＡ （挿入体から
得られるような）を小さな耐せん断性球に折りたたみ、
これがイオン性化合物、例えば、塩化ナトリウム又は塩
化マグネシウムのような塩の添加で、一度装着されると
折り曲げられない、プロトコールが開発されている。好
ましくは、この凝縮剤はスペルミンである。更に例１０
に記載するこのスペルミンブロトコールは何ら検出し得
るせん断媒介破壊なしに、ｔ Ｑ／％． （７）ＤＮ
Ａ分子をそして大きな分子さえも容易に装着することが
できる。スペルミンの使用が好ましいが、分子を折たた
むために好適な物質は特定の粒子に折たたみを引起こす
何れかの物質、例えば、粒子に選択的にそれ自体を溶媒
化合物にすることを引起こｔｉ縮剤を含む。この物質の
例はスペルミジン、アルコール及びヘキサミンコバルト
を含むが、これらに限定されない。
本発明の第七の好遺具体例は制限酵素を使用してＤＮＡ
分子を地図化するため本発明の前記の具体例の特別な適
用に関する。制限を構成するための従来公知の方法は制
限酵素と共にＤＮＡをインキユベートすることそして通
常のゲル電気泳動又はパルス化電気泳動を使用して結果
のフラグメントを寸法で分離することを含む。寸法分離
はノラグメントの数と寸法に関する情報を供するが、フ
ラグメントの相対位置又は未切［ＩｉＤＮＡ分子上の切
断部位に関する情報は供されない。制限酵素により分解
を受ける分子を像形成する顕微鏡を使用することによっ
て、（１）寸法分解能は弛緩動力学を測定することによ
り正確に決定され、（２）お互いに対するフラグメント
の位置が決定でき、そして（３）単に一つの分子が分解
されることを要する（しかしながら、多くの分子が平行
して像処理されることができる）。唯一の限界は試料ホ
ルダー上の空間である。
分子を地図化するため本発明の前記の具体例の特別な適
用に関する。制限を構成するための従来公知の方法は制
限酵素と共にＤＮＡをインキユベートすることそして通
常のゲル電気泳動又はパルス化電気泳動を使用して結果
のフラグメントを寸法で分離することを含む。寸法分離
はノラグメントの数と寸法に関する情報を供するが、フ
ラグメントの相対位置又は未切［ＩｉＤＮＡ分子上の切
断部位に関する情報は供されない。制限酵素により分解
を受ける分子を像形成する顕微鏡を使用することによっ
て、（１）寸法分解能は弛緩動力学を測定することによ
り正確に決定され、（２）お互いに対するフラグメント
の位置が決定でき、そして（３）単に一つの分子が分解
されることを要する（しかしながら、多くの分子が平行
して像処理されることができる）。唯一の限界は試料ホ
ルダー上の空間である。
要約すると、鶏微鏡を使用して制限地図化は顕微鏡スラ
イド上に大きなゲル埋込みＤＮＡ分子を装着すること、
これらをある程度に延伸すること（分子が完全に延伸さ
れることは必要でな（１）、そして次に開裂を誘導する
ことを含む。可視化又は分光分析法を使用して、フラグ
メント位置が注意されモして１から４の具体例で概説し
た方法を使用してその寸法が測定される。本発明のこの
特徴による好適具体例を例１１に詳細に記載する。
イド上に大きなゲル埋込みＤＮＡ分子を装着すること、
これらをある程度に延伸すること（分子が完全に延伸さ
れることは必要でな（１）、そして次に開裂を誘導する
ことを含む。可視化又は分光分析法を使用して、フラグ
メント位置が注意されモして１から４の具体例で概説し
た方法を使用してその寸法が測定される。本発明のこの
特徴による好適具体例を例１１に詳細に記載する。
本発明の第八の好適具体例はハイブリッド化プローブを
使用して’ｔｔＦａ順序を地図化することに関する。こ
の技術を用いて、核酸、プローブ（特性化核酸）及び特
定の条件下で、組換え酢素がマトリックス中で組合わさ
れる。このプローブは実際的な良さのものでありそして
任意の適当なラベル化剤でラベルされる。組換え酵素が
使用される場合にはく例えば、プローブが制限酵素の使
用なしでターゲット分子に侵入できない場合）、これは
任意の適当な酵素、例えば、ＤＮＡプローブの従来のラ
ベル化のため当業者に公知のものでよい。
使用して’ｔｔＦａ順序を地図化することに関する。こ
の技術を用いて、核酸、プローブ（特性化核酸）及び特
定の条件下で、組換え酢素がマトリックス中で組合わさ
れる。このプローブは実際的な良さのものでありそして
任意の適当なラベル化剤でラベルされる。組換え酵素が
使用される場合にはく例えば、プローブが制限酵素の使
用なしでターゲット分子に侵入できない場合）、これは
任意の適当な酵素、例えば、ＤＮＡプローブの従来のラ
ベル化のため当業者に公知のものでよい。
非限定特定例として、有用な組換え酵素はｒｅｃＡであ
る。
る。
ハイブリッド化は任意の適当な手段、例えば、顕微鏡ス
ライドの中にＡ Ｔ Ｐ及びマグネシ『クムイオンを拡
散させることにより開始できる。
ライドの中にＡ Ｔ Ｐ及びマグネシ『クムイオンを拡
散させることにより開始できる。
プローブはターゲット分子にハイブリッド化されそして
少なくとも二つの異なる方法で可視化される。第一には
、このブローグが上分に大きい場合には直接に可視化で
きる。例えば、１ ｋｂより大きいプローブは多分現在
利用できる顕微鏡装置を使用して可視化できる。第二に
、発色団又は他の適当なラベル化剤がプローブに結合さ
れそして可視で又は分光分析で検出できる。例えば、テ
キサスレッド又はローダミン、並びに他の発色団を使用
できる。
少なくとも二つの異なる方法で可視化される。第一には
、このブローグが上分に大きい場合には直接に可視化で
きる。例えば、１ ｋｂより大きいプローブは多分現在
利用できる顕微鏡装置を使用して可視化できる。第二に
、発色団又は他の適当なラベル化剤がプローブに結合さ
れそして可視で又は分光分析で検出できる。例えば、テ
キサスレッド又はローダミン、並びに他の発色団を使用
できる。
このプローブがターゲット分子にハイブリッド化された
後に、プローブの位置を地図化するために少なくとも二
つの好適な方法がある。しかしながら、他の方法も本発
明の範囲内である。第一の好適な別法として、ターゲッ
ト分子の曲線の長さが測定される。光顕微鏡を使用する
時には、全体に延伸されない線状区域を配置しかつ定量
するために蛍光強度測定できる。プローブの位置はその
特性化特徴、例えば、発色団、ＩＩｉ射性タグ、及び／
又は寸法に基づいて定められる。
後に、プローブの位置を地図化するために少なくとも二
つの好適な方法がある。しかしながら、他の方法も本発
明の範囲内である。第一の好適な別法として、ターゲッ
ト分子の曲線の長さが測定される。光顕微鏡を使用する
時には、全体に延伸されない線状区域を配置しかつ定量
するために蛍光強度測定できる。プローブの位置はその
特性化特徴、例えば、発色団、ＩＩｉ射性タグ、及び／
又は寸法に基づいて定められる。
第二の好適な別法として、ターゲット分子が制限酵素で
切断されそしてフラグメントのすべてが本発明の方法に
よって寸法決めされかつ測定される。ハイブリッド化フ
ラグメントの位置は前記の方法の一つ、例えば、分子の
直接可視化又は分光分析技術と組合わせた顕微鏡により
決定される。
切断されそしてフラグメントのすべてが本発明の方法に
よって寸法決めされかつ測定される。ハイブリッド化フ
ラグメントの位置は前記の方法の一つ、例えば、分子の
直接可視化又は分光分析技術と組合わせた顕微鏡により
決定される。
フラグメントのすべてが寸法決めされ、そしてターゲッ
ト分子の何れかのｆｉ部までラベル化フラグメントから
の距離が次に容易に計ｔｉｔれる。特定の制限分解物上
のプローブの正確な位置が更に一層の分解のための新し
い酵素の添加で地図化でき、そしてこれらのフラグメン
トが次に可視で地Ｍ化できる。
ト分子の何れかのｆｉ部までラベル化フラグメントから
の距離が次に容易に計ｔｉｔれる。特定の制限分解物上
のプローブの正確な位置が更に一層の分解のための新し
い酵素の添加で地図化でき、そしてこれらのフラグメン
トが次に可視で地Ｍ化できる。
要約すると、本発明の媒体をベースとする寸法決め法は
顕微鏡を使用ずる粒子の特性化を含む。
顕微鏡を使用ずる粒子の特性化を含む。
粒子、特に小さい又は中程度の寸法の分子が媒体中に入
れられそして従来の技術を使用スライド上に８着される
。大きい分子はスペルミン凝縮を使用して顕微鏡スライ
ド上に装着され、これは破壊問題を避ける。ある点で分
子を着色してもよい。
れられそして従来の技術を使用スライド上に８着される
。大きい分子はスペルミン凝縮を使用して顕微鏡スライ
ド上に装着され、これは破壊問題を避ける。ある点で分
子を着色してもよい。
この分子は電場の適用により媒体中で摂動される。
次にこの場を遮断し、分子が平均して球形又は楕円形で
ある平衡のコンフォメーションに弛緩し、又は特定の位
置をとるにまかせる。ビデオカメラに接続された像ブＯ
セッサーは分子をカウントしそしてその形状変化を追跡
する。分子の弛緩、再配向及び回転の動力学、並びにそ
の良さ及び直径は自動的に計算され、そして像形成され
た分子のすべてに対する分子量が確立された関係から計
算される。
ある平衡のコンフォメーションに弛緩し、又は特定の位
置をとるにまかせる。ビデオカメラに接続された像ブＯ
セッサーは分子をカウントしそしてその形状変化を追跡
する。分子の弛緩、再配向及び回転の動力学、並びにそ
の良さ及び直径は自動的に計算され、そして像形成され
た分子のすべてに対する分子量が確立された関係から計
算される。
本発明を更に十分に示すために下記の例を提示するが、
その範囲を限定するものとして意図するものではない。
その範囲を限定するものとして意図するものではない。
例１
顕微鏡のためのＯＮ を ることＧ．バクテリオ
ファージをＦａｎｇｌｌａｎ， １４． Ｌ．Ｎｕｃｌ
． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、． ５、６５３−６６５（
１９７８）に記載されるように成長させそしてそのまま
のウィルスを１／ＺｘＴＢＥ！！ｉ衝液（ＩＸ：８５ｍ
Ｈ Ｔｒｉｚｍａ Ｂａｓｅ ， Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ社、セントルイスＭＯ）、８９ｍＭホウ酸及び２
．５ｍＨジナトリウムＥＤＴＡ）に溶解させ、次にエタ
ノール沈殿させることによりＤＮＡを調製した；この工
程はパルス化電気泳動及び顕微鏡分析により判断してＤ
ＮＡをせん断しなかった。
ファージをＦａｎｇｌｌａｎ， １４． Ｌ．Ｎｕｃｌ
． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、． ５、６５３−６６５（
１９７８）に記載されるように成長させそしてそのまま
のウィルスを１／ＺｘＴＢＥ！！ｉ衝液（ＩＸ：８５ｍ
Ｈ Ｔｒｉｚｍａ Ｂａｓｅ ， Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ社、セントルイスＭＯ）、８９ｍＭホウ酸及び２
．５ｍＨジナトリウムＥＤＴＡ）に溶解させ、次にエタ
ノール沈殿させることによりＤＮＡを調製した；この工
程はパルス化電気泳動及び顕微鏡分析により判断してＤ
ＮＡをせん断しなかった。
ＤＮＡ溶液（０．１マイクログラム／マイクロリットノ
レ、１／２ＸＴＢＥ中）を１／２×ｆＢＥ中の１．０％
低ゲル化温度アガロース（ ＳｅａＰｌａｑｕｅ． Ｆ
Ｍ Ｃ社、Ｒｏｃｋｐｏｒｔ Ｍ Ｅ ） 、０ ．
３ ７イクログラム／ ｍｌ Ｄ Ａ Ｐ Ｉ （
Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）、１．０％２＝メル
カブトエタノールで希釈し（約０．１〜０．２ナノグラ
ム／ｄｉアガＯ−ス）そして６５℃に保った，ＤＮＡ以
外のすべての物質を０．２ミクロンフィルターに通して
蛍光デブリを減じた。パルス化電気泳動を使用して実験
条件により融解することが可能なＤＮＡをチェックしそ
して問題がないことが判明した。
レ、１／２ＸＴＢＥ中）を１／２×ｆＢＥ中の１．０％
低ゲル化温度アガロース（ ＳｅａＰｌａｑｕｅ． Ｆ
Ｍ Ｃ社、Ｒｏｃｋｐｏｒｔ Ｍ Ｅ ） 、０ ．
３ ７イクログラム／ ｍｌ Ｄ Ａ Ｐ Ｉ （
Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）、１．０％２＝メル
カブトエタノールで希釈し（約０．１〜０．２ナノグラ
ム／ｄｉアガＯ−ス）そして６５℃に保った，ＤＮＡ以
外のすべての物質を０．２ミクロンフィルターに通して
蛍光デブリを減じた。パルス化電気泳動を使用して実験
条件により融解することが可能なＤＮＡをチェックしそ
して問題がないことが判明した。
例２
゛ル の ＤＮＡ
例１の試料を顕微鏡スライドの上に置いた。試料を封入
するために、ピペットマンとせん断を減ずるために端部
を切り離したピペットチップを使用して予熱したスライ
ドとカバースリップに約３ミク臼リットルのＤＮＡ−ア
ガロース混合物を注意深く移した。第１図及び第２図に
示すような縮小パルス化電気泳ｖＪ装置にＩＩしたスラ
イドを配置した。すべての残りの工程をｖ温で行なった
。
するために、ピペットマンとせん断を減ずるために端部
を切り離したピペットチップを使用して予熱したスライ
ドとカバースリップに約３ミク臼リットルのＤＮＡ−ア
ガロース混合物を注意深く移した。第１図及び第２図に
示すような縮小パルス化電気泳ｖＪ装置にＩＩしたスラ
イドを配置した。すべての残りの工程をｖ温で行なった
。
試料を数分間予備電気泳肋しそしてデータが回収される
前に弛緩するにまかせた。クロント１コールタイム（
Ｃｈｒｏｎｔｒｏｌ社、サンディゴ、ＣＡ）又はＩＢＭ
ＡＴコンピューターに収められそして１１ｅｗｌｅ
ｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ６ １ １ ５ Ａ精密電源に
より入力されるアドロンデータ発生ボードの何れかでパ
ルス化場を生じた。フルークデイジクルマルチメーター
（ Ｊ． Ｎｕｋｅ社、エバレット、ＷＡ）に接続され
た補助電極で場強度を測定した。ＤＡＰ １蛍光のため
に適したエビ蛍光光学機器を備えたツアイスアクシオプ
ラン顕微ｍ （Ｃａｒｔ Ｚｅｉｓｓ．西ドイツ）及び
ツアイス１００×ブラネオクルアール油浸対物レンズを
試料可視化のため使用した。蛍光的にラベルしたＤＮＡ
に光損傷を避けるため中程度密度フィルターを使用して
励起光を減衰した。（２４００シリコン補強ターゲット
（ＳＩＴ）カメラ（ ＨａｍａｎｔａｔＳｕ社、ミドル
セックス、ＮＪ）をＩＣ１像プロセッシングシステム（
Ｉｎｏｖｉｓｉｏｎ社、リサーチトライアングルパー
ク、ＮＣ）と結合させて使用して顕微鏡からビデオ像を
経て処理した。
前に弛緩するにまかせた。クロント１コールタイム（
Ｃｈｒｏｎｔｒｏｌ社、サンディゴ、ＣＡ）又はＩＢＭ
ＡＴコンピューターに収められそして１１ｅｗｌｅ
ｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ６ １ １ ５ Ａ精密電源に
より入力されるアドロンデータ発生ボードの何れかでパ
ルス化場を生じた。フルークデイジクルマルチメーター
（ Ｊ． Ｎｕｋｅ社、エバレット、ＷＡ）に接続され
た補助電極で場強度を測定した。ＤＡＰ １蛍光のため
に適したエビ蛍光光学機器を備えたツアイスアクシオプ
ラン顕微ｍ （Ｃａｒｔ Ｚｅｉｓｓ．西ドイツ）及び
ツアイス１００×ブラネオクルアール油浸対物レンズを
試料可視化のため使用した。蛍光的にラベルしたＤＮＡ
に光損傷を避けるため中程度密度フィルターを使用して
励起光を減衰した。（２４００シリコン補強ターゲット
（ＳＩＴ）カメラ（ ＨａｍａｎｔａｔＳｕ社、ミドル
セックス、ＮＪ）をＩＣ１像プロセッシングシステム（
Ｉｎｏｖｉｓｉｏｎ社、リサーチトライアングルパー
ク、ＮＣ）と結合させて使用して顕微鏡からビデオ像を
経て処理した。
各５又は６秒の割合で連続して像を得て、２００ほどの
ディジタル像を時間コース当り記憶できた。
ディジタル像を時間コース当り記憶できた。
各ディジタル化時間経過像は３ＱＨＺで得られた８フレ
ームの一体化から役立ち、これはコイル運動によるスト
リーキンを避けるために十分に速かった。時間経過取得
が完了した後に、顕微鏡を焦点外に導きそして背景像を
得た。背景像のコピーを最初に減衰することによって各
時間経過像を処理し、そのためには平均背景強度は平均
時間経過像強度の８２％であった。この減衰した背景を
時間経過像から引きそして次に結果の像に線状延伸コン
トラスト増強アルゴリズムを行なった。ポラロイドフリ
ーズフレームビデオ像レコーダー（ Ｐｏｌａｒｏｉｄ
社、ケンブリッジ、ＭＡ）を使用して処理像の写真を得
た。
ームの一体化から役立ち、これはコイル運動によるスト
リーキンを避けるために十分に速かった。時間経過取得
が完了した後に、顕微鏡を焦点外に導きそして背景像を
得た。背景像のコピーを最初に減衰することによって各
時間経過像を処理し、そのためには平均背景強度は平均
時間経過像強度の８２％であった。この減衰した背景を
時間経過像から引きそして次に結果の像に線状延伸コン
トラスト増強アルゴリズムを行なった。ポラロイドフリ
ーズフレームビデオ像レコーダー（ Ｐｏｌａｒｏｉｄ
社、ケンブリッジ、ＭＡ）を使用して処理像の写真を得
た。
例３
ゲル中で分 を すること
例２の分子をＰＯＥにより摂動した。選択された比の一
連の比較的短いノーマルパルスを使用することによりＰ
ＯＥを行ないそして長時間の後に、この場の一つの極性
をスイッチした。このスイッチ時間とノーマル場比はパ
ルス時間と場角度のパルス化電気泳動変数に類似してい
る。
連の比較的短いノーマルパルスを使用することによりＰ
ＯＥを行ないそして長時間の後に、この場の一つの極性
をスイッチした。このスイッチ時間とノーマル場比はパ
ルス時間と場角度のパルス化電気泳動変数に類似してい
る。
ＰＯＥ実験を記載するために使用した命名法は次の通り
である：３．５−８０秒パルス、３ボルト／ＣＭ．”３
．５−８０秒″とは３秒のバルス南一北、続い５秒のパ
ルス東一西：この３．５秒サイクルの８０秒後に５秒の
パルスの極性を別に８０秒間（西一束）変え、そして含
まれる分子に対してジグザグ階段を形成する。パルス強
度は３ボルト／ｃＭであった。
である：３．５−８０秒パルス、３ボルト／ＣＭ．”３
．５−８０秒″とは３秒のバルス南一北、続い５秒のパ
ルス東一西：この３．５秒サイクルの８０秒後に５秒の
パルスの極性を別に８０秒間（西一束）変え、そして含
まれる分子に対してジグザグ階段を形成する。パルス強
度は３ボルト／ｃＭであった。
本例ではエビ蛍光顕微鏡をＰ Ｏ ＩＥ法と結合して電
気泳勤中ＤＮＡコンフォメーション及び位置の変化の一
般的研究を可能にする。第２図に示す適合した顕微鏡室
を使用するＰＯＥ法を本実験に使用した一方、オンとオ
フにスイッチされる通常の電場を使用した。長軸の周り
で分子を回転するため必要であるように、電場を種々の
角度で適用する時にはＰＯＥは特定の利点を供する。
気泳勤中ＤＮＡコンフォメーション及び位置の変化の一
般的研究を可能にする。第２図に示す適合した顕微鏡室
を使用するＰＯＥ法を本実験に使用した一方、オンとオ
フにスイッチされる通常の電場を使用した。長軸の周り
で分子を回転するため必要であるように、電場を種々の
角度で適用する時にはＰＯＥは特定の利点を供する。
第１図及び第２図は適合したＰＯＥ室の線図をボす。
例４
ゲル中で を観 しそして ることＰＯＥを
６００秒（３．５−８０秒パルス、３ポルト／１）間行
なった後に例１−３のＧバクテリオファージＤＮＡの弛
緩を観察した。
６００秒（３．５−８０秒パルス、３ポルト／１）間行
なった後に例１−３のＧバクテリオファージＤＮＡの弛
緩を観察した。
像プロセッサーを使用して、例えば”特性分析″を通し
て、弛緩工程の像形成を定憬化しそして自動化する。第
３（ａ）図に示すように、連続した像をディジタル化し
そして記憶した後に特性分析を操作する。次にこの像プ
ロセッサーが像中の不連続対象物を確認し、これらを数
え、そして形状により特性化する。例えば、コンピュー
ターは歪んだコイルの回収のために有効な楕円軸（長軸
及び短軸）を測定しそして弛緩工程中コイルが球状フン
フォメーションに近づくにつれて時間の関数としてこれ
らの特性を計算する。他の型式のコンピューター化測定
も行なってＤＮＡを特性化できる。
て、弛緩工程の像形成を定憬化しそして自動化する。第
３（ａ）図に示すように、連続した像をディジタル化し
そして記憶した後に特性分析を操作する。次にこの像プ
ロセッサーが像中の不連続対象物を確認し、これらを数
え、そして形状により特性化する。例えば、コンピュー
ターは歪んだコイルの回収のために有効な楕円軸（長軸
及び短軸）を測定しそして弛緩工程中コイルが球状フン
フォメーションに近づくにつれて時間の関数としてこれ
らの特性を計算する。他の型式のコンピューター化測定
も行なってＤＮＡを特性化できる。
１２秒間隔で得られた第５図に示す像は９６秒時間スパ
ンにわたって幾つかの分子の弛緩を示す。
ンにわたって幾つかの分子の弛緩を示す。
（ａ）では、幾つかのコイルは適用された場が切られた
後に３秒で示される。このコイルは顕微鏡分解能の限界
まで測定されるように、適用電気パルスにより形成され
た同じ波形階段通路（矢印でマークされた分子を見よ）
を介して弛緩するように児える。（Ｃ）では分子は二つ
の分割するものとして示され、モして（ｊ）ではすべて
のコイルは丸い、細長くないコンフォメーションに弛緩
した。（ｊ）に示す棒は長さ１０ミクロンである。
後に３秒で示される。このコイルは顕微鏡分解能の限界
まで測定されるように、適用電気パルスにより形成され
た同じ波形階段通路（矢印でマークされた分子を見よ）
を介して弛緩するように児える。（Ｃ）では分子は二つ
の分割するものとして示され、モして（ｊ）ではすべて
のコイルは丸い、細長くないコンフォメーションに弛緩
した。（ｊ）に示す棒は長さ１０ミクロンである。
例５
例１−３の工程により像形成のため公知の分子量の分子
を調製し、そして例１−４の方、法により分子の弛緩時
間を測定する。像形成により弛緩時間データを回収しそ
して分子量と類似の組成のＤＮＡ分子の弛緩時間の間の
数学的関係を計算するために使用する。次に未知の寸法
の分子の試料の弛緩時間を測定し、そして公知の寸法の
分子に基づいて決定した数学的関係を使用して分子の寸
法を計算する。
を調製し、そして例１−４の方、法により分子の弛緩時
間を測定する。像形成により弛緩時間データを回収しそ
して分子量と類似の組成のＤＮＡ分子の弛緩時間の間の
数学的関係を計算するために使用する。次に未知の寸法
の分子の試料の弛緩時間を測定し、そして公知の寸法の
分子に基づいて決定した数学的関係を使用して分子の寸
法を計算する。
例６
ゲル中で再配向速度を測定することにより二つ適用され
た電場により誘起されるような再配向を測定することに
よってアガロース又はポリアクリルアミドゲルのような
マトリックス中で、任意の寸法の重合体、しかし特に小
さすぎて像形成できないものを寸法決めする。遊離溶液
中で再配向測定を行なえるが、マトリックスが不必要な
重合体対流及び運動を阻止するのでこれが適している。
た電場により誘起されるような再配向を測定することに
よってアガロース又はポリアクリルアミドゲルのような
マトリックス中で、任意の寸法の重合体、しかし特に小
さすぎて像形成できないものを寸法決めする。遊離溶液
中で再配向測定を行なえるが、マトリックスが不必要な
重合体対流及び運動を阻止するのでこれが適している。
更に、マトリックスの存在は一部には再配向構造が異な
るので寸法感度を高める。その実験の汎用性及び多分１
５から２０メガ塩基の非常に高い寸法分解能の故にＰＯ
Ｅは再配向時間を測定するために特に有用である。ＤＮ
Ａ分子のような硬い重合体（１５０以下の塩基対の寸法
）は棒として溶液で存在しそして回転拡散係￥ｉ（長軸
の周りにスピンしようとすると棒により感知される摩擦
）はＭ３として変わる。顕微鏡を使用して、大きすぎて
像形成できない分子を可視化し、そして像からその再配
向時間を決定する。任意の寸法の分子、特に小さすぎて
可視化できないものに対して、分光分析法により視界の
中で各棒の再配向を測定するとよい。二つのこの方法を
下記に詳細に記載し、即ち蛍光二色性及び複屈折である
： １）立体的に予知できる方法で結合する発色団（エヂジ
ウムブロマイドをＤＮＡ分子の中に挿入する）を重合体
分子に付加する。偏光放ｌ１線を使用して発色団を励起
する。全蛍光強度を測定することは一時的に各分子の配
向情報を供する。増感性マイクロ一チャンネルプレート
検出器を使用して顕微鏡場の中で各分子の蛍光放射線を
測定する。
るので寸法感度を高める。その実験の汎用性及び多分１
５から２０メガ塩基の非常に高い寸法分解能の故にＰＯ
Ｅは再配向時間を測定するために特に有用である。ＤＮ
Ａ分子のような硬い重合体（１５０以下の塩基対の寸法
）は棒として溶液で存在しそして回転拡散係￥ｉ（長軸
の周りにスピンしようとすると棒により感知される摩擦
）はＭ３として変わる。顕微鏡を使用して、大きすぎて
像形成できない分子を可視化し、そして像からその再配
向時間を決定する。任意の寸法の分子、特に小さすぎて
可視化できないものに対して、分光分析法により視界の
中で各棒の再配向を測定するとよい。二つのこの方法を
下記に詳細に記載し、即ち蛍光二色性及び複屈折である
： １）立体的に予知できる方法で結合する発色団（エヂジ
ウムブロマイドをＤＮＡ分子の中に挿入する）を重合体
分子に付加する。偏光放ｌ１線を使用して発色団を励起
する。全蛍光強度を測定することは一時的に各分子の配
向情報を供する。増感性マイクロ一チャンネルプレート
検出器を使用して顕微鏡場の中で各分子の蛍光放射線を
測定する。
２）複屈折測定で分子の配向動力学を追跡する。
複屈折技術は屈折率の変化を測定し、これは溶液又はマ
トリックス中のマク１コ分子の配向と容易に相関する．
ＤＮＡ分子がゲル電気泳動を受けている間に複屈折測定
を行なう。電場を適用する時に、ＤＮＡ分子は延伸しそ
して場と整合し、これによって屈折率を変化する。時間
と共に複屈折の変化を測定することによって、分子は適
用された電場で配向するので、ＤＮＡブロブトレイン運
動の詳細を理解することができる。
トリックス中のマク１コ分子の配向と容易に相関する．
ＤＮＡ分子がゲル電気泳動を受けている間に複屈折測定
を行なう。電場を適用する時に、ＤＮＡ分子は延伸しそ
して場と整合し、これによって屈折率を変化する。時間
と共に複屈折の変化を測定することによって、分子は適
用された電場で配向するので、ＤＮＡブロブトレイン運
動の詳細を理解することができる。
更に特に、小さい周波数差だけ異なるレーザー線（赤色
光）の二つの直角の偏光面の相差（二つの周波数レーザ
ーにより供される）を測定することによって複屈折測定
を行なう。分子がパルスコントローラー８２により発生
される適用電場（ＰＯＥ室中）と整合するにつれて、屈
折率は分子整合と共に変化する。レーザー７０からの光
は顕微鏡室７４を通るようミラー７２で反射され、検出
器７６により検出され、そして透過放射線で相差を生じ
、これは数値をレーザー７０で供される標準と比較する
ことにより相検出器７８（第３ｂ図》で測定される。時
間の関数として（場適用の時間）得られる相差データを
ディジタル化しそして後の検索と分析のためコンピュー
ター８０に記憶させる。
光）の二つの直角の偏光面の相差（二つの周波数レーザ
ーにより供される）を測定することによって複屈折測定
を行なう。分子がパルスコントローラー８２により発生
される適用電場（ＰＯＥ室中）と整合するにつれて、屈
折率は分子整合と共に変化する。レーザー７０からの光
は顕微鏡室７４を通るようミラー７２で反射され、検出
器７６により検出され、そして透過放射線で相差を生じ
、これは数値をレーザー７０で供される標準と比較する
ことにより相検出器７８（第３ｂ図》で測定される。時
間の関数として（場適用の時間）得られる相差データを
ディジタル化しそして後の検索と分析のためコンピュー
ター８０に記憶させる。
第１図及び第２図に示した計器は必要な場を適用して分
子配向を引起こす。多くの異なる回転機構が場の中で分
子を最適に寸法決めするために記載される。例えば、重
合体試料で共鳴周波数を見出すために回転場周波数をス
イーブできる。
子配向を引起こす。多くの異なる回転機構が場の中で分
子を最適に寸法決めするために記載される。例えば、重
合体試料で共鳴周波数を見出すために回転場周波数をス
イーブできる。
例７
６２６−１ ６３１ 、１ ６３２−１ ６３５
） 。
） 。
定数ｔで、提案されたシリーズの実験ランに対する条件
を下記に示す。
を下記に示す。
すること
棒又は硬いコイル状の形状の分子を、例１−４における
ように調製しかつ観察するが、ただしアガロースゲルよ
りむしろアクリルアミドを選択的に使用できる。
ように調製しかつ観察するが、ただしアガロースゲルよ
りむしろアクリルアミドを選択的に使用できる。
例６で前記に記載した技術の何れか一つを使用して顕微
鏡ペースシステムでコイル又は棒の回転の速度を測定す
る。分子がその中心の周りでスピンするにつれて正弦波
で変化する信号について測定する。この正弦波信号を使
用して棒の長さの３乗として変わる、回転Ｉ１！擦係数
に正弦波信号の時間を適合させることによって重合体寸
法又は分子量を決定する。換言すると、正弦波信号から
測定されるような測定角速度（ラジアン／秒）は遊離溶
液中で３乗される棒長さとして変わる（ Ｂｏｅｒｓｉ
ａ，Ｓ． （ １ ９ ６ ０ ） Ｊ．Ｃｈｅｎ．Ｐ
ｈｙｓ． ３ ２ ： １５０ｂｐ ５
１Ｘ １０−４１０１５０ｂｐ ５
１Ｘ １０’ １０５０ｋｂ ５
１ １０５
００ｋｂ ５ ５
１０５００ｋｂ ５
９００ １０従っ
て、最初の例では、５ボルト／１の対の、３つ組の又は
他のセットのパルスが反対方向に０．１ミリ秒間連続的
に適用され、各連続したセットのパルスの最初の方向が
出発点から時計方向に１０度だけ増加する。
鏡ペースシステムでコイル又は棒の回転の速度を測定す
る。分子がその中心の周りでスピンするにつれて正弦波
で変化する信号について測定する。この正弦波信号を使
用して棒の長さの３乗として変わる、回転Ｉ１！擦係数
に正弦波信号の時間を適合させることによって重合体寸
法又は分子量を決定する。換言すると、正弦波信号から
測定されるような測定角速度（ラジアン／秒）は遊離溶
液中で３乗される棒長さとして変わる（ Ｂｏｅｒｓｉ
ａ，Ｓ． （ １ ９ ６ ０ ） Ｊ．Ｃｈｅｎ．Ｐ
ｈｙｓ． ３ ２ ： １５０ｂｐ ５
１Ｘ １０−４１０１５０ｂｐ ５
１Ｘ １０’ １０５０ｋｂ ５
１ １０５
００ｋｂ ５ ５
１０５００ｋｂ ５
９００ １０従っ
て、最初の例では、５ボルト／１の対の、３つ組の又は
他のセットのパルスが反対方向に０．１ミリ秒間連続的
に適用され、各連続したセットのパルスの最初の方向が
出発点から時計方向に１０度だけ増加する。
既知の分子量の分子をゲルに入れ、そして前記の電場を
適用する時にその回転速度を測定する。
適用する時にその回転速度を測定する。
回転時間データを回収しかつ使用して分子量と特定のゲ
ル中のＧバクテリオファージＤＮＡ分子の回転時間の問
の数学的関係を計算する。次に好ましくは同様な電場を
使用して未知の寸法の分子の回転時間を測定し、そして
既知の寸法の分子に基づいて決定した数学的関係を使用
して分子の寸法を計算する。
ル中のＧバクテリオファージＤＮＡ分子の回転時間の問
の数学的関係を計算する。次に好ましくは同様な電場を
使用して未知の寸法の分子の回転時間を測定し、そして
既知の寸法の分子に基づいて決定した数学的関係を使用
して分子の寸法を計算する。
例８
既知の分子量の分子に対して例１−４の工程に従う。分
子が摂動状態にある問に分子の曲線の長さの測定が分子
を可視化することによって回収されそしてこれを使用し
て分子量と艮ざの間の数学的関係を計算する。類似の組
成及び未知の寸法の摂動された分子の曲線の長さを例１
−４の工程を使用して測定しそして既知の寸法の分子に
基づいて決定された数学的関係を使用して分子の寸法を
計算する。第４図及び第５図は曲１ｉ１艮さ測定が行な
われる摂動された分子を示す。
子が摂動状態にある問に分子の曲線の長さの測定が分子
を可視化することによって回収されそしてこれを使用し
て分子量と艮ざの間の数学的関係を計算する。類似の組
成及び未知の寸法の摂動された分子の曲線の長さを例１
−４の工程を使用して測定しそして既知の寸法の分子に
基づいて決定された数学的関係を使用して分子の寸法を
計算する。第４図及び第５図は曲１ｉ１艮さ測定が行な
われる摂動された分子を示す。
例９
ること
既知の分子量の分子に対して例１−４の工程に従うが、
ただし分子が完全に弛緩した状態にある時に測定を行な
う。実質上球状又は楕円状のＧバクテリオファージＤＮ
Ａ分子の単数又は複数の直径の測定を回収しそして使用
してゲル中のＧバクテリオファージＤＮＡ分子の分子壜
と直径の間の数学的関係を計算する。次に未知の寸法の
分子の直径を測定しそして既知の寸法の分子に基づいて
決定した数学的関係を使用して分子の寸法を計算する。
ただし分子が完全に弛緩した状態にある時に測定を行な
う。実質上球状又は楕円状のＧバクテリオファージＤＮ
Ａ分子の単数又は複数の直径の測定を回収しそして使用
してゲル中のＧバクテリオファージＤＮＡ分子の分子壜
と直径の間の数学的関係を計算する。次に未知の寸法の
分子の直径を測定しそして既知の寸法の分子に基づいて
決定した数学的関係を使用して分子の寸法を計算する。
第４（ａ）及び第５（ｊ）図は直径測定を行なえる弛緩
した分子を示す。
した分子を示す。
例１０
像形成のため大きなＤＮＡ 子を１１すること挿入法
及びパルス化電気泳動を使用して、Ｓａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから染色体ＤＮＡ分子
を調製しかつ分離した。比較的低温の融解を許すように
調製のため低ゲル化温度アガロースゲル（ＦＭＣ社、ロ
ツランド、メイン）を使用した。
及びパルス化電気泳動を使用して、Ｓａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから染色体ＤＮＡ分子
を調製しかつ分離した。比較的低温の融解を許すように
調製のため低ゲル化温度アガロースゲル（ＦＭＣ社、ロ
ツランド、メイン）を使用した。
紫外線はＤＮＡ分子を破壊するので、所望の帯域をゲル
から切出し、ゲルから切出されたエチジウム着色側面縁
部分をガイドし、これを次に３０１ｎｍトランスイルミ
ネーター装置で写真化した。この帯域を次に秤量しそし
て室温で３時間水中で１０倍過剰の１０１Ｈのスペルミ
ンで平衡させた。
から切出し、ゲルから切出されたエチジウム着色側面縁
部分をガイドし、これを次に３０１ｎｍトランスイルミ
ネーター装置で写真化した。この帯域を次に秤量しそし
て室温で３時間水中で１０倍過剰の１０１Ｈのスペルミ
ンで平衡させた。
ＤＮＡを凄縮するにはスペルミンは非常に低いイオン強
度環境を必要とし、そして幸運にも電気泳動に使用した
緩衝液は低いイオン強度であり、従って平衡段階の必要
性を排除した。この平衡した試料を次に２時間７４℃に
炉で融解させ、融解後に、ＤＡＰＩ（１マイクログラム
／ｄ）及び２ーメルカブトエタノール（１％）を加えた
。融解したアガロース／ＤＮＡ１合物３マイクロリット
ルを予熱した顕微鏡スライドに適用しそしてｕ合物がゲ
ル化する前にカバースリップを上面に配置した。次に１
００×プランネオフルアール対物レンズをフィットした
ツアイスアキシオブランエビ蛍光顕微鏡を使用してこの
ライドを見ると小さな強ク輝ク球を示し、これはカバー
スリップサンドインチの縁を通して、塩の添加により凝
縮されよう。
度環境を必要とし、そして幸運にも電気泳動に使用した
緩衝液は低いイオン強度であり、従って平衡段階の必要
性を排除した。この平衡した試料を次に２時間７４℃に
炉で融解させ、融解後に、ＤＡＰＩ（１マイクログラム
／ｄ）及び２ーメルカブトエタノール（１％）を加えた
。融解したアガロース／ＤＮＡ１合物３マイクロリット
ルを予熱した顕微鏡スライドに適用しそしてｕ合物がゲ
ル化する前にカバースリップを上面に配置した。次に１
００×プランネオフルアール対物レンズをフィットした
ツアイスアキシオブランエビ蛍光顕微鏡を使用してこの
ライドを見ると小さな強ク輝ク球を示し、これはカバー
スリップサンドインチの縁を通して、塩の添加により凝
縮されよう。
前記のように、スペルミンは低イオン強度の環境で特に
有用である。他方、ＤＮＡ分子が高いイオン環境に置か
れる場合には、同じ型式の菱縮効果がアルコールで得ら
れる。これらの例の何れもが本発明の範囲を限定するも
のとして意図されるつもりはない。
有用である。他方、ＤＮＡ分子が高いイオン環境に置か
れる場合には、同じ型式の菱縮効果がアルコールで得ら
れる。これらの例の何れもが本発明の範囲を限定するも
のとして意図されるつもりはない。
例１１
Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ
のＤＮＡ，寸法で３、６及び８−１０メガ塩基の三つの
染色体上に分布された約１７−１９メガ塩基のゲノム寸
法を有する菌のＤＮＡを例１０の方法により、擬縮と非
崩壊により顕微鏡のため調製した。３−５マイクロリッ
トルアガロース混合物は約０．１ナノグラムのＤＮＡ，
０．５％ｂ−メノレカプトエタノール、１マイクログラ
ム／ａｅＤＡＰ １１ ００マイクログラム／ｄ牛血清
アルブミン（アセチル化：Ｂｆ３ｔｈｅＳｄａ ＲｅＳ
ｅａｒＣｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ガイザーバー
グ、ＭＤ）及び１０−２０単位の適当な制限酵素を含有
した。この混合物を３７℃に短く保ち、順微鏡スライド
上に注意深く配置し、次にカバースリップを上にのせた
。制限酵素で分解の前に、二つの方法の一つでこのＤＮ
Ａを延伸する：（１）カバースリップを動かすことによ
り液体スライド／アガロース／カバースリップサンドイ
ツチを任意に僅かにせん断し又は（２）例えば、第３図
に記載したＰＯＥｉｆｉ器を使用して電場を適用する。
のＤＮＡ，寸法で３、６及び８−１０メガ塩基の三つの
染色体上に分布された約１７−１９メガ塩基のゲノム寸
法を有する菌のＤＮＡを例１０の方法により、擬縮と非
崩壊により顕微鏡のため調製した。３−５マイクロリッ
トルアガロース混合物は約０．１ナノグラムのＤＮＡ，
０．５％ｂ−メノレカプトエタノール、１マイクログラ
ム／ａｅＤＡＰ １１ ００マイクログラム／ｄ牛血清
アルブミン（アセチル化：Ｂｆ３ｔｈｅＳｄａ ＲｅＳ
ｅａｒＣｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ガイザーバー
グ、ＭＤ）及び１０−２０単位の適当な制限酵素を含有
した。この混合物を３７℃に短く保ち、順微鏡スライド
上に注意深く配置し、次にカバースリップを上にのせた
。制限酵素で分解の前に、二つの方法の一つでこのＤＮ
Ａを延伸する：（１）カバースリップを動かすことによ
り液体スライド／アガロース／カバースリップサンドイ
ツチを任意に僅かにせん断し又は（２）例えば、第３図
に記載したＰＯＥｉｆｉ器を使用して電場を適用する。
一度ゲルが優化するとＩＱｍＨ塩化マグネシウム溶液を
サンドインチの中に拡散させる。マグネシウムイオンが
ＤＮＡ／ＩＩ素複合体に達する時に、この酵素はＤＮＡ
分子を開裂する。顕微鏡セットアップを使用して一端か
ら他端までＤＮＡストランドを追跡しそして切断部位を
注目することにより制限切断部位の位置を決定する。こ
れらの部位は酵素分解の前には連続しているストランド
中で隙間として現われる。次に下記のことを含む本発明
の顕微鏡方法によりフラグメントの各々の寸法を決定す
る：（１）各７ラグメントの曲線の長さを測定すること
、（２）フラグメントが弛緩するにまかせそしてその直
径を測定すること、（３）適用ざれた電場又はフロー場
（ゲルを通して溶媒を動かすことにより生ずるように）
で各フラグメントのコンフオメーション摂動しそしてコ
ンフォメーション及び位置の変化の直接可視検出又は分
光分析と組合わせた顕微鏡で弛緩動力学を測定すること
。大きな分子に対して直接可視観察が適しているが、小
さすぎて像形成できないフラグメントに対して他の方法
が十分に適している。
サンドインチの中に拡散させる。マグネシウムイオンが
ＤＮＡ／ＩＩ素複合体に達する時に、この酵素はＤＮＡ
分子を開裂する。顕微鏡セットアップを使用して一端か
ら他端までＤＮＡストランドを追跡しそして切断部位を
注目することにより制限切断部位の位置を決定する。こ
れらの部位は酵素分解の前には連続しているストランド
中で隙間として現われる。次に下記のことを含む本発明
の顕微鏡方法によりフラグメントの各々の寸法を決定す
る：（１）各７ラグメントの曲線の長さを測定すること
、（２）フラグメントが弛緩するにまかせそしてその直
径を測定すること、（３）適用ざれた電場又はフロー場
（ゲルを通して溶媒を動かすことにより生ずるように）
で各フラグメントのコンフオメーション摂動しそしてコ
ンフォメーション及び位置の変化の直接可視検出又は分
光分析と組合わせた顕微鏡で弛緩動力学を測定すること
。大きな分子に対して直接可視観察が適しているが、小
さすぎて像形成できないフラグメントに対して他の方法
が十分に適している。
蛍光顕微鏡を使用して見る時に結果の試料は三０．３３
つの異なる寸法で、Ｍ として変える直径を有する
多数の輝く球を示し、これは球の容積に対する式４／３
πＲ３に基づいている。またこのゲルはマグネシウムイ
オンが存在する時にのみ活性である制限酵素を含有する
。
多数の輝く球を示し、これは球の容積に対する式４／３
πＲ３に基づいている。またこのゲルはマグネシウムイ
オンが存在する時にのみ活性である制限酵素を含有する
。
例１２
単一ＤＮ八分子へ核酸プローブの本来の場所で前記の例
１−４に記載したように顕微鏡のための核酸を調製する
。核酸粒子を含有するアガロース媒体はまたラベルした
プローブ及びプローブによりターゲット分子のストラン
ド変位を媒介する、組換え酵素、ｒｅＣＡを含有する。
１−４に記載したように顕微鏡のための核酸を調製する
。核酸粒子を含有するアガロース媒体はまたラベルした
プローブ及びプローブによりターゲット分子のストラン
ド変位を媒介する、組換え酵素、ｒｅＣＡを含有する。
ストランド変位とベアリングはＤルーブ化により起こる
（参照、Ｉ１ａｄｄｉｎｇ， Ｃ．， Ａｎｎ．二 Ｇ
ｅｎｅｔ．１ ６ ： ４ ０ ５ −３７（１９８２
））。ＡＴＰ及びマグネシウイオンを加えて反応を開始
させる。例１１に記載するようにこれらの成分はスライ
ド／ゲル／オーバースリップサンドインチの中に拡散す
る。この反応を３７℃でインキユベートする。異なるラ
ベルを有するプローブを使用して多くの異なるターゲッ
ト分子を同時に分析する。
（参照、Ｉ１ａｄｄｉｎｇ， Ｃ．， Ａｎｎ．二 Ｇ
ｅｎｅｔ．１ ６ ： ４ ０ ５ −３７（１９８２
））。ＡＴＰ及びマグネシウイオンを加えて反応を開始
させる。例１１に記載するようにこれらの成分はスライ
ド／ゲル／オーバースリップサンドインチの中に拡散す
る。この反応を３７℃でインキユベートする。異なるラ
ベルを有するプローブを使用して多くの異なるターゲッ
ト分子を同時に分析する。
前記に特に記載したちの以外の本発明の方法の変型は本
発明の範囲内である。例えば、分子の他のパラメーター
を測定でき、そして種々の型式のｍ＠Ｔｉｔ及び分光分
析装置を使用できる。粒子回転を行なうためのパルス化
ルーチンを変更できる。
発明の範囲内である。例えば、分子の他のパラメーター
を測定でき、そして種々の型式のｍ＠Ｔｉｔ及び分光分
析装置を使用できる。粒子回転を行なうためのパルス化
ルーチンを変更できる。
前記の技術の組合わせも考えられる。例えば、種種の型
式の外部力、媒体及び分光分析技術の組合わせが本発明
の笥囲内である。原核細胞または真核細有機体の核型は
、例１１または１２の技術と例４−９の可視化技術の一
つ以上とを組合せることによって決定することができる
。更に、測定技術を何回も繰返しでき、そして各トライ
アルからの測定を平均できる。
式の外部力、媒体及び分光分析技術の組合わせが本発明
の笥囲内である。原核細胞または真核細有機体の核型は
、例１１または１２の技術と例４−９の可視化技術の一
つ以上とを組合せることによって決定することができる
。更に、測定技術を何回も繰返しでき、そして各トライ
アルからの測定を平均できる。
第１図は特に蛍光顕微鏡研究に適している電気泳動顕微
鏡室の略示図である。 第２図は本発明に使用でぎる電気泳動室中の室電極の一
部略示図と一部ブロック線図である。 第３図は本発明による媒体中のＤＮＡ分子の顕微鏡研究
に使用される機器の略示図、及び複屈折を測定するため
の機器を示す更に詳細な線図である。 第４図のａ〜１は生物の形態を示す写真であって、Ｇバ
クテリオファージ分子が異なる方向に２連続電場を受け
た時のＤＮＡ分子のコンフオメーション及び位置の変化
を示す。 第５図のａ−ｊは生物の形態を示す写真であって、第４
図に記載した蛍光顕微鏡実験に示されるように、６００
秒間電気泳動の後にＧバクテリオファージＤＮＡ分子の
弛緩の間ＤＮＡ分子のコンフォメーション及び位置の変
化を示す。
鏡室の略示図である。 第２図は本発明に使用でぎる電気泳動室中の室電極の一
部略示図と一部ブロック線図である。 第３図は本発明による媒体中のＤＮＡ分子の顕微鏡研究
に使用される機器の略示図、及び複屈折を測定するため
の機器を示す更に詳細な線図である。 第４図のａ〜１は生物の形態を示す写真であって、Ｇバ
クテリオファージ分子が異なる方向に２連続電場を受け
た時のＤＮＡ分子のコンフオメーション及び位置の変化
を示す。 第５図のａ−ｊは生物の形態を示す写真であって、第４
図に記載した蛍光顕微鏡実験に示されるように、６００
秒間電気泳動の後にＧバクテリオファージＤＮＡ分子の
弛緩の間ＤＮＡ分子のコンフォメーション及び位置の変
化を示す。
Claims (46)
- （１）媒体中に粒子を置くこと、この粒子に一時的な外
部力を適用すること、これによつてこの粒子に物理的変
化を引起こすこと、そして顕微鏡を使用してこの変化を
測定すること、の諸工程を含む粒子を特性化するための
方法。 - （２）前記の変化がコンフオメーシヨンの変化又は位置
における変化を含む、請求項（１）の方法。 - （３）前記の変化が前記の粒子を可視化すること又は分
光分析法を使用することによって測定される、請求項（
１）の方法。 - （４）前記の変化がコンフォメーションの変化を含み、
そして前記の力の終了後に変化の速度が測定される、請
求項（１）の方法。 - （５）前記の変化がコンフォメーションの変化を含み、
そして前記の力の開始後に変化の速度が測定される、請
求項（１）の方法。 - （６）前記の変化が位置の変化を含み、そして前記の力
の開始後に変化の速度が測定される、請求項（１）の方
法。 - （７）前記の位置の変化が回転の変化及び任意に側方の
運動を含み、そして前記の力の開始後に変化の速度が測
定される、請求項（６）の方法。 - （８）前記の粒子のコンフオメーションが回転中実質上
均一のままである、請求項（７）の方法。 - （９）前記の媒体がマトリックスを含みそして前記の回
転の変化が一連の順次のパルスによつて行なわれる、請
求項（８）の方法。 - （１０）前記の一連のパルスがアルゴリズムにより定義
される、請求項（９）の方法。 - （１１）前記の順次のパルスが電気パルスを含み、そし
て前記のアルゴリズムが下記のもの： ■＿１（ｔ）＝Ｅ（ｔ、θ＿ｉ）（■ｃｏｓθ＿ｉ＋■
ｓｉｎθ＿ｉ）（Δｔ）■＿２（ｔ）＝Ｅ（ｔ、θ＿ｉ
）（■ｃｏｓ（θ＿ｉ＋π）＋■ｓｉｎ（θ＿ｉ＋π）
）（Δｔ）Ｐ＝ｋ＿１・■＿１（ｔ）、ｋ＿２■＿２（
ｔ）、ｋ＿１■＿１（ｔ）ここで、 ■＿１（ｔ）及び■＿２（ｔ）は時間を乗じた電場ベク
トル（ボルト・秒／ｃｍ）であり； Ｅ（ｔ、θ＿ｉ）はボルト／ｃｍで電場強度であり；■
及び■は単位ベクトルであり； θ＿ｉはラジアン又は度で場角度であり、 ｉ＝１→ｎ、ここで完全な回転において Σ＾ｎ＿ｉ＿＝＿１θ＿ｉ＝２π又は３６０°；Δｔは
秒でパルス長さであり； ｔは秒で時間であり； ｋ＿１及びｋ＿２は連続した同一パルスの数であり；そ
して Ｐは繰返しできる、パルス化ルーチンである；を含む、
請求項（１０）の方法。 - （１２）前記の変化がコンフォメーションの変化を含み
、そして前記の粒子の長さが前記の外部力の適用の間又
は後に前記の粒子を可視化することによって測定される
、請求項（１）の方法。 - （１３）前記の粒子の半径又は直径を測定する工程を更
に含み、ここでこの粒子が実質上球形又は楕円形である
、請求項（１）の方法。 - （１４）予め決められた寸法と組成の少なくとも二つの
粒子の各々で変化を測定すること、そして予め決められ
た寸法と組成の前記の粒子の各々の寸法と速度間の数学
的関係を計算することの工程を更に含む、請求項（１）
の方法。 - （１５）請求項（１４）により未知の寸法の粒子の寸法
を決定するための方法。 - （１６）前記の媒体中に配置する前に前記の粒子を折た
たむ工程を更に含む、請求項（１）の方法。 - （１７）前記の粒子がせん断に鋭敏である、請求項（１
６）の方法。 - （１８）前記の媒体中に配置した後に、前記の粒子をひ
ろげる工程を更に含む、請求項（１６）の方法。 - （１９）前記の粒子が凝縮剤を使用して折たたまれ、そ
してイオン性物質を使用してひろげられる請求項（１８
）の方法。 - （２０）前記の凝縮剤がスペルミン、スペルミジン、ア
ルコール又はヘキサミンコバルトを含む、請求項（１９
）の方法。 - （２１）前記の粒子が核酸を含む、請求項（１）の方法
。 - （２２）前記の媒体中に組換え酵素及び前記の核酸の一
部に対するラベル化プローブを配置すること、ハイブリ
ッド化を開始すること、そして顕微鏡を使用して前記の
核酸の一部を地図化することの工程を更に含む、請求項
（２１）の方法。 - （２３）前記の粒子が制限分解物を含む、請求項（１）
の方法。 - （２４）前記の粒子が制限分解物を含む、請求項（４）
の方法。 - （２５）前記の粒子が制限分解物を含む、請求項（１２
）の方法。 - （２６）前記の制御分解物の寸法及び地図位置が決定さ
れる、請求項（２３）の方法。 - （２７）媒体中に前記の核酸及びこの核酸の一部に対す
るプローブを配置すること、ハイブリッド化を誘起する
こと、そして顕微鏡を使用してこのハイブリッド化核酸
を特性化することの工程を含む、核酸又はその一部を地
図化するための方法。 - （２８）前記の媒体中に組換え酵素を配置することの工
程を更に含む、請求項（２７）の方法。 - （２９）前記のプローブがラベルされる、請求項（２８
）の方法。 - （３０）前記の媒体が溶液、ゲル、粉末及びガラスの少
なくとも一つを含む、請求項（１）の方法。 - （３１）前記の外部力が溶媒フロー場、電場及び磁場の
少なくとも一つを含む、請求項（１）の方法。 - （３２）前記の外部力が長さ、強度及び方向の少なくと
も一つで変わる一連のパルスを有する電場を含む、請求
項（１）の方法。 - （３３）前記の電気泳動場がパルス化配向電気泳動場を
含む、請求項（３２）の方法。 - （３４）前記の粒子が測定される前にラベル化剤でラベ
ルされる、請求項（２）の方法。 - （３５）前記のラベル化剤がスティンを含む、請求項（
３４）の方法。 - （３６）前記の顕微鏡が光顕微鏡及び走査／トンネル顕
微鏡からなる群から選択される、請求項（１）の方法。 - （３７）前記の分光分析法が蛍光強度、屈折率、偏光放
射線の吸収、及び偏光放射線の放出の少なくとも一つの
変化の測定を含む、請求項（３）の方法。 - （３８）請求項（１）によりポリ分散重合体試料の分子
量分布を決定し、ここで各重合体分子における前記の変
化が同時に測定される、方法。 - （３９）前記の粒子が重合体を含む、請求項（１）の方
法。 - （４０）請求項１により原核細胞は真核細胞有機体の核
型を決定するための方法。 - （４１）前記の分子をマトリックス中に配置することそ
して前記の分子に一時的な外部力を適用すること、これ
によって前記の分子に変化を引起こしそして顕微鏡を使
用してこの分子を可視化することの工程を含む重合体分
子を特性化するための方法。 - （４２）前記のマトリックス中に配置する前に前記の分
子を折たたむことの工程を更に含む、請求項（４１）の
方法。 - （４３）前記の分子がせん断に鋭敏である、請求項（４
２）の方法。 - （４４）前記のマトリックス中に配置した後に前記の分
子をひろげることの工程を更に含む、請求項（４３）の
方法。 - （４５）凝縮剤を使用して前記の分子が折たたまれそし
てイオン性物質を使用してひろげられる、請求項４４の
方法。 - （４６）前記の粒子をマトリックス中に配置することそ
して顕微鏡を使用して前記の粒子の少なくとも一つの半
径又は直径を測定することの工程を含む実質上球形又は
楕円形の粒子の寸法を決定するための方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US33353189A | 1989-04-05 | 1989-04-05 | |
| US333531 | 1989-04-05 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02291944A true JPH02291944A (ja) | 1990-12-03 |
Family
ID=23303186
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2091349A Pending JPH02291944A (ja) | 1989-04-05 | 1990-04-05 | 重合体分子等の特性化法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5599664A (ja) |
| EP (1) | EP0391674B1 (ja) |
| JP (1) | JPH02291944A (ja) |
| DE (1) | DE69025969T2 (ja) |
Families Citing this family (70)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6150089A (en) | 1988-09-15 | 2000-11-21 | New York University | Method and characterizing polymer molecules or the like |
| US6147198A (en) * | 1988-09-15 | 2000-11-14 | New York University | Methods and compositions for the manipulation and characterization of individual nucleic acid molecules |
| US6610256B2 (en) | 1989-04-05 | 2003-08-26 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Image processing and analysis of individual nucleic acid molecules |
| JP3123249B2 (ja) * | 1991-09-10 | 2001-01-09 | 株式会社日立製作所 | Ｄｎａ分子の長さ計測方法および計測装置 |
| CA2170264A1 (en) * | 1993-09-10 | 1995-03-16 | Michael W. Konrad | Optical detection of position of oligonucleotides on large dna molecules |
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