【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
（産業上の利用分野）
本発明は、エンド型アルカリ性セルラーゼを含有する洗
浄剤組成物に関する。
（従来の技術）
近年、衣料の洗浄に関して、著しい発達がみられた。即
ち、洗剤に適した原料の開発、水質の改善、洗浄機械の
改良と普及、繊維の改良等によって衣料の洗浄は著しく
容易になってきた。なかでも、洗剤用原料の改良はめざ
ましく、界面活性剤、ビルダー、分散剤、蛍光染料、漂
白剤等の改質によって、衣料用洗剤の組成は、はぼ完成
の域に達したかの感がある。しかし乍ら衣料用洗剤開発
の背景にある思想は、（１）汚れ成るいは／及び繊維表
面に界面活性剤やビルダーが吸着することにより、汚れ
成るいは／及び繊維と水との間の界面張力を低下させ、
汚れと繊維を物理化学的に引き雌す、（２）汚れを界面
活性剤、無機ビルダーで分散、可溶化する。（３）汚れ
をプロテアーゼ等の酵素で化学的に分解する、（４）着
色汚れを漂白剤等で漂白する、（５）繊維表面に蛍光染
料等を吸着させで、増白する、（６）洗浄に有効な成分
の二価金属イオンによる沈澱をキレート剤で防止する等
に要約される。
即ち、従来の衣料洗浄の基本は汚れを直接に攻撃する成
分若しくは該成分の功撃力を補助する成分を如何に洗浄
剤組成物の一成分どして有効に取り入れるかということ
にあった、
（発明が解決しようとする問題点）
しかしながら、現在、該基本に基づいた洗浄剤組成物で
は、ある意味においてその洗浄性能はほぼ飽和点に達し
ており、更に高い洗浄力を有する洗浄剤組成物の開発が
望まれていた。
斯様な観点にたち本発明者らは、新規な洗浄機序を与え
る物質としてアルカリ性セルラーゼを見い出し、該酵素
を産生ずる微生物としてストレプトマイセス・エスピー
（ＳｔｒｅｐｔｏｌＩｙｃｅｓ ｓｐ、）にＳＭ−２（
微工研菌寄第７６２１号）、ストレプトマイセス・エス
ピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｒａｙｃｅｓ ｓｐ、）にＳ？ｆ
−９（微工研菌寄第７６２２号）を見い出した。
しかしながら、これら微生物の産生するアルカリ性セル
ラーゼは、エキソ（ｅｘｏ）型およびエンド（ｅｎｄｏ
）型セルラーゼの混合物であって、しかも、その生産性
は低いものであった。
（問題点を解決するための手段）
本発明者らは、ストレプトマイセス属に属するアルカリ
性セルラーゼ生産菌のアルカリ性セルラーゼを生産する
染色体遺伝子部位を、遺伝子工学の遺伝子クローニング
法でクローニングし、エンド型アルカリ性セルラーゼの
みを生成させることに成功し本発明を完成した。
すなわち、本発明はストレプトマイセス属に属するエン
ド型アルカリ性セルラーゼ生産菌が生産するエンド型ア
ルカリ性セルラーゼを含有する洗浄剤組成物に関するも
のである。
本発明に用いるエンド型アルカリ性セルラーゼは、スト
レプトマイセス属に属するアルカリ性セルラーゼ生産菌
のエンド型アルカリ性セルラーゼ生産性染色体ＤＮＡを
含有せしめてなる絹換えベクターによって形質転換され
たス１−レプ１へマイセス属に属するエンド型アルカリ
性セルラーゼ生産菌を培養した培地から回収採取するこ
とにより生産される。
ストレプトマイセス属に属するアルカリ性セルラーゼ生
産菌からのエンド型アルカリセルラーゼの生産に関与す
る染色体ＤＮＡの調製は、特に限定されない０例えば、
リゾチーム等で細胞壁を溶解後、界面活性剤を用いてお
だやかに溶菌し、無細胞抽出液を得る。ついで遠心によ
って菌体人糞とＤＮＡ画分を分離し、さらに塩化セシウ
ム平衡密度勾配遠心法でＤＮＡ画分を得る。
もしくは、ＳＤＳ等の界面活性剤によって溶菌後、フェ
ノール処理、クロロホルム処理を行い、ＤＮＡ画分を精
製分離したのち、エタノール沈澱によってＤＮＡを得る
。
調製された供与染色体ＤＮＡは、次いでベクターと連結
されるために切断される。供与染色体の切断は、通常制
限エンドヌクレアーゼを用いる方法によって実施される
が、特にこの方法に限定されるものではなく、例えば、
物理的に剪断力を加えて切断する方法でもよい。制限酵
素を使用し供与ＤＮＡを切断する場合、完全切断をおこ
す反応条件を用いるのであればアルカリ性セルラーゼ遺
伝子に切断部位を持たない制限エンドヌクレアーゼであ
れば如何なるものでも使用可能である。また、部分的に
しか切断を起さない反応条件を用いるのであれば、全て
の制限エンドヌクレアーゼが使用可能である。斯様に制
限酵素は用いる条件に応じて種々のものが選択可能では
あるが、ベクターとの連結の容易さからは使用するベク
ターに唯一の切断部位を有する制限酵素を使用するのが
よい。例えばＩ’ｓｔ Ｉ、 Ｄａｍ旧、 Ｓａｃ Ｉ
、Ｋｐｎ Ｉ、ＢｇＱ ｎ等が使用可能である。
一方、ベクターとしては、宿主として使用するストレプ
トマイセス属微生物中で複製可能なものであれば、プラ
スミド若しくはファージの区別なく使用することができ
る。
ベクターとしてプラスミドを使用する場合、宿主中にお
いて複製可能なものであれば如何なるものでもよいが、
特定の制限酵素による唯一の切断部位を有し、抗生物質
耐性等のマーカーを有するものが、供与染色体との結合
および形質転換株の選択容易性から望ましい。プラスミ
ドの例示としては、すでに公知となっているストーブ１
−ミセス属微生物から得られたｐＪｃＰｌｌｌ、ｐＩＪ
４１． ｐＩＪ６１、ｐＩＪ３６１、ｐＩＪ７０２．
ｐＩＪ３６５、ｐ Ｉ Ｊ ３８５などがあげられる。
切断された供与染色体ＤＮＡを、ベクターに挿入し結合
させる為には、供与染色体ＤＮＡとベクターとを同一の
制限酵素で切断し、然る後に、ＤＮＡリガーゼを使用し
両者を結合するのが一般的に使用される方法である。し
かし、斯様な方法に限定されることな〈従来知られてい
る如何なる方法でも実施は可能である。
ＤＮＡリガーゼの例示としては、大腸菌のＤＮＡリガー
ゼ及びＴ４ファージのＤＮＡリガーゼがあげられる。
斯様にして調製された供与染色体ＤＮＡ断片とベクター
との結合体である組換えベクターは、次いで、宿主であ
るストレプトマイセス属微生物に導入される。
宿主として使用されるストレプトマイセス属微生物は、
本発明の実施目的に応じて種々のものが適宜選択して使
用可能であ、る。
選らばれた宿主微生物であるス１−レブトマイセス属微
生物への組換λベクターの導入、すなわち形質転換法は
、特に限定されないが、プロトプラスト形質転換法が最
適である。
形質転換株から目的とするエンド型アルカリ性セルラー
ゼ遺伝子若しくはエンド型アルカリ性セルラーゼ遺伝子
を含む供与染色体ＤＮＡ断片が導入された微生物を選択
・分離する方法は特に限定されないが、ベクターが有す
る抗生物質耐性等のマーカー発現を利用し第一次的に選
択し次いで宿主のエンド型アルカリ性セルラーゼ活性を
指標とする第２次的選択をする方法が好適である。
かくして最終的に選択された形質転換株を使用したエン
ド型アルカリ性セルラーゼの培養液中での蓄積、回収、
精製法については特に制限はない。
培養で使用する培地の組成は、使用する菌株が良好に生
育し、エンド型アルカリ性セルラーゼの生産を順調に行
なわしめるために適当な炭素源、窒素源あるいは有機栄
養源、無機塩等からなっている。炭素源としては、例え
ばカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）等の可溶性繊
維素誘導体、バルブ粉末、口紙粉末、アビセル等の固型
繊維素等のセルロース等；グルコ・−ス、フラクト・−
ス、シュクロース若しくはソルビｌ−−ル等の炭水化物
；クエン酸、コハク酸等の有機酸；ｎ−ドデカン、ｎ−
ヘキサデカン等の炭化水素等々の資化されるものであれ
ばいずれも使用できる。これら炭素源のうちではセルロ
ース等、就中、可溶性繊維素誘導体を使用した培地はエ
ンド型アルカリ性セルラーゼの生産量も多く好適である
。
本発明の製造例において、遺伝子操作によって得た例示
のプラスミドｐＣＡＳ１ を用いて得た形質転換体、ス
トレプトマイセス・リビダンスＩＩＨ２１Ｎａ１（ｐＣ
ＡＳＩ）、ＦＨＲＭ Ｐ−８２７６の生産するエンド型
アルカリ性セルラーゼの理化学的性質を示すと、次の通
りである。
１゜作用：カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）等の
セルロースを、エンド（ｅｎｄｏ）型の機作で分解し粘
度低下をきたす、これに対し還元糖の生成はほとんど認
められない。
２、 基’１１異性： ＣＭＣ等のセルロースに対し
て特異的に作用する。
３、至適ｐＨ： ｐＨ８付近でＣＭＣに対する作用が至
適である。第２図に示す通りである。
４、安定ｐＨ範囲：３０℃で４８時間処理した場合、ｐ
１１６〜１１において、ＣＭＣに対し９０％以上の残存
活性を示す、第３図に示す通りである。
５、至適温度：ｐＨ８において、ＣＭＣを基質とした場
合、４５℃付近である。第４図に示す通りである。
６゜熱安定性：ｐＨ８において４０℃１時間処理におい
て９０％以上活性が残存する。第５図に示す通りである
。
本発明のエンド型アルカリ性セルラーゼの酵素活性は、
カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を基質とした時
、はとんど還元糖を生成しないため以下に述べるエンド
型ＣＭＣａｓｅ活性測定方法に従い決定した。
すなわち、和光純薬製ＣＭＣ１，０％溶液３ｍｆｌ。
グリシンバッファー ０．５Ｍ溶液（ｐＨ８） ２ｍＱ
、イオン交換水３ｍＭを混合し、ウベローデ型粘度計中
にて４０℃に保つ、これに酵素溶液１１を加え、すばや
く撹拌後粘度を測定しこの時の値をＶ、とする７４０℃
で５分間静置後再び粘度を測定しこの時の値をＶ２とす
る。
Ｖ、 −Ｖｌ
の値が１ ｅｓｔ／ｗｉｎを示した時をエンド型ＣＭＣ
ａｓｅ１ユニットとした。
本発明の洗浄剤組成物は、エンド型アルカリ性セルラー
ゼを組成物１ｋｇに対して５０ユニット以−ヒ、２５
、０００ユニッ１−以下で配合することが好ましく、別
の表現をすれば洗浄剤組成物を水に溶かした後は、洗た
く液１リットル中に０．０６７ユニツト以し、３３ユニ
ツトへ下となるように、エンド型アルカリ性セルラーゼ
を洗浄剤組成物に配合することが好ましい。
本発明の洗浄剤組成物にはエンド型アルカリ性セルラー
ゼ以外の成分は特に限定されない。
例えば、公知の次の諸成分なら本来のその効果の必要に
応じて任意に配合される。
（１）界面活性剤
アルキルベンゼンスルホン酸塩、ポリオキシアルキレン
（Ｃ−２若しくは３）アルキル又はアルケニルエーテル
硫酸エステル塩、アルキル又はアルケニル硫酸エステル
塩、オレフィンスルホン酸塩、アルカンスルホン酸塩、
高級脂肪酸塩、アルキル又はアルケニルエーテルカルボ
ン酸塩、α−スルホ脂肪酸塩又はそのエステル化物等々
の平均炭素数８〜２０のアルキル又はアルケニル鎖を有
する陰イオン性界面活性剤。
、二二で、陰イオン性界面活性剤の対イオンとしてはナ
トリウム、カリウム等のアルカリ金属イオン、カルシウ
ム、マグネシウム等のアルカリ土類金属イオン、アンモ
ニウムイオン炭素数２又は；３のアルカノール基を１〜
３個有するアルカノールアミン（例えばモノエタノール
アミン、ジェタノールアミン、トリエタノールアミン、
１−リイソプロパノールアミンなど）を挙げることがで
きる。
更に、スルホン酸型、ベタイン型等の両性界面活性剤、
ポリオキシエチレンアルキル又はアルケニルエーテル、
ポリオキシエチレンアルキル又はアルケニルフェニルエ
ーテル、ポリオキシプロピレン・ポリオキシエチレン共
重合物のアルキル又はアルケニルエーテル、高級脂肪酸
アルカノールアミド、蔗糖脂肪酸エステル、アルキルア
ミンオキサイド等の非イオン性界面活性剤も配分出来る
、また、アルキルトリメチル第４級アンモニウム塩、ジ
アルキルジメチル第４級アンモニウム塩等々の陽イオン
性界面活性剤も必要により配合してもよい。
これら界面活性剤は、一種若しくは二種以上混合して使
用出来２好ましくは洗浄剤組成物中に１０重量％（以下
％で示す）以上含有するのがよい。
（２）二価金属イオン捕捉剤
下記の各種アルカリ金属塩、アルカノール７ミン塩の一
種又は二種以上のビルダー成分を０〜５０％含有するこ
ともできる。
オルソリン酸塩、ビロリン酸塩、１−リボリリン酸塩、
メタリン酸塩、ヘキサメタリン酸塩、フィチン酸塩等の
リン酸塩。
ニトリロ三酢酸塩、エチレンジアミン四酢酸塩等のアミ
ノポリ酢酸塩、ポリアクリル酸、ポリマレイン酸ポリア
セタールカルボキシレートなどの高分子電解質、クエン
酸、コハク酸、スルホコハク酸等の有機カルボン酸塩、
？ルミ、ノケイ酸塩、アスパラギン酸、グルタミン酸等
のアミノ酸塩な乙
（３）アルカリ削成るいは無４！＆電Ｍ質更にアルカリ
剤あるいは無機電解質として次に示すものの各種のアル
カリ金属塩の一種又は二挿具」二を組成物中１・〜・５
０％、好ましくは５−３０％含有することができる。ゲ
イＶ塩、ＪＡ酢酸塩硫酸塩。
又、有機アルカリ剤として、トリ′ｆ−タノールアミン
、ジエタノ・−ルアミン、モノエタノールアミン、トリ
イソプロパツールアミンなど。
（４）再汚染防止剤
更に再汚染防止剤として次に示す化合物の一＝種又は二
種以上を組成物中に０．１．−＝−５％含有することが
できる６ポリエチ１ノングリコール、ポリビニルアルコ
ール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロ
ースなど。
なかでも、カルボキシメチルセルロースあるいは及びポ
リエチレングリコ・−ルと本発明に係るエンド型アルカ
リ性セルラーゼどの併用は、どろんこ汚れ除去に相乗的
効果を奏する。
（５）漂白剤
過炭酸ソーダ、過炭酸ソーダ、硫酸すトリウム過酸化水
素付加体、塩化す１−リウム過酸化水素付加体などの漂
白剤あるいは／及び、スルホン化フタロシアニン亜鉛塩
、あるいはアルミニウム塩等の光感応性の漂白性色素等
と本発明に係るエンド型アルカリ性セルラーゼとの併用
は、洗浄効果を一段と向上させる。
（６）酵素（本来的酵素作用を洗浄工程中になす酵素で
ある）
酵素の反応性から分類すると、ヒドロラーゼ類、リアー
ゼ類、オキシドレダクターゼ類、リガーゼ類、１−ラン
スフェラーゼ類及びイソメラーゼ類が挙げられるが、本
発明には何れも適用できる。特に好ましいのはヒドロラ
ーゼ類であり、プロテアーゼ、エステラーゼ、カルボヒ
ドラーゼ及びヌクレアーゼが含まれる。
（７）青味付剤及び蛍光染料
各種の青味付剤及び蛍光染料なども必要に応じて配合で
きる。
（８）ケーキング防止剤
粉末洗剤の場合には、次のようなケーキング防止剤も配
合できる。パラトルエンスルホン酸塩。
キシレンスルホン酸塩、酢酸塩、スルホコハク順塩、タ
ルク、微粉末シリカ、粘土、カルシウム−シリケート（
例えばＴｏｈｎｓ−Ｍａｎｖｉｌ１社のマイクロでルな
と）、炭酸カルシウム、酸化マグネシウム等々。
（９）酸化防止剤
第３ブチルヒドロキシトルエン、４，４′−ブチリデン
ビス−・（６−第３ブチル−３−メチルフェノール）、
２．２′−ブチリデンビス−（６−第３ブチル−４−メ
チルフェノール）、モノスチレン化り１ノゾール、ジス
チレン化クレゾール、モノスチレン化フェノール、ジス
チレン化フェノール、１．１′〜ビス−（４−ヒドロキ
シフェニル）シクロヘキザン等の酸化防１１−剤。
（１０）可溶化剤
エタノールのような低級アルコール、ベンゼンスルホン
酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩のような低級アルキル
ベンゼンスルホン酸塩、プロピレングリコールのような
グリコール類、アセチルベンぜンスルホン酸塩、アセト
アミド類、ピリジンジカルボン酸アミド類、安息香酸塩
又は尿素などの可溶化剤。
本発明の大きな利点は、従来の洗浄剤では十分に落とす
ことができなかった無機固体汚れ、例えば微細な泥汚れ
に特に洗浄効果があるのを初めどじて襟、袖口の汚れ、
演じみ等々の汚れに対しても有効であり、更に無燐或い
は低燐洗剤の洗浄力向上に非常に役立つことにある。繊
維と繊維の間にもぐりこんだ微細などろんこ汚れの除去
は燐酸塩で有効であった。ところが、富栄養化問題で燐
酸塩配合量が逓減化の傾向にあ（］、一部は！Ｉ！、燐
化を余儀なくされた結果、どろんこ汚れの除去は至難と
なってきた。特に、木綿布にもぐりこんだどろ汚九は全
く除去しにくいことは周知の通りである。また、木綿混
紡布から成るズックにこびりついたどる汚れも主婦の悩
みの種である。
本発明の洗浄剤はこのような課題の解決に光明をもたら
すものである。即ぢ、セルロース繊維及びそれと他の種
類の繊維との混紡布のどろんこ汚れを洗浄する際に、例
えば（１）アルカリ性の無燐或いは低燐洗剤に本発明を
適用する。′：とにより。
（２）弱アルカリ液体無燐、洗剤に本発明を適用するこ
とにより、燐酸塩を充分含有する弱アルカリ性粉末洗剤
と同等以」−の優れた洗浄力が得られる７本発明の別の
大きな利点は、如何なる形態の洗浄剤にも適用できるこ
とにある。噴Ｓ乾燥粉末粉末ブレンド粉末、錠剤、液体
等の色々な形態にアルカリセルラーゼを添加(Industrial Application Field) The present invention relates to a cleaning composition containing endo-type alkaline cellulase. (Prior Art) In recent years, there has been significant progress in washing clothes. That is, washing clothes has become much easier due to the development of raw materials suitable for detergents, improvements in water quality, improvements and spread of washing machines, improvements in fibers, etc. In particular, improvements in raw materials for detergents have been remarkable, and it seems that the composition of laundry detergents has reached a level of perfection through modifications of surfactants, builders, dispersants, fluorescent dyes, bleaching agents, etc. However, the idea behind the development of laundry detergents is that (1) the adsorption of surfactants and builders on the surface of dirt and/or fibers creates a barrier between dirt and/or fibers and water; reduce interfacial tension,
(2) Dirt and fibers are physically and chemically separated. (2) Dirt is dispersed and solubilized using surfactants and inorganic builders. (3) Chemically decompose stains with enzymes such as protease, (4) Bleach colored stains with bleach, (5) Adsorb fluorescent dyes, etc. on the fiber surface to brighten it, (6) This can be summarized as using a chelating agent to prevent precipitation of divalent metal ions in ingredients that are effective for cleaning. In other words, the basis of conventional clothing cleaning has been how to effectively incorporate ingredients that directly attack stains or ingredients that support the effective attack power of such ingredients as one component of a detergent composition. (Problems to be Solved by the Invention) However, at present, the cleaning performance of cleaning compositions based on this basic principle has almost reached a saturation point in a sense, and cleaning compositions with even higher cleaning power are currently being developed. development was desired. From this perspective, the present inventors discovered alkaline cellulase as a substance that provides a novel cleaning mechanism, and introduced SM-2 (Streptomyces sp.) as a microorganism that produces this enzyme.
Microtechnical Research Institute No. 7621), Streptomyces sp. f
-9 (Feikoken Bibori No. 7622) was discovered. However, the alkaline cellulases produced by these microorganisms are of exo type and endo type.
) type cellulase, and its productivity was low. (Means for Solving the Problems) The present inventors have cloned the chromosomal gene site that produces alkaline cellulase of an alkaline cellulase-producing bacterium belonging to the genus Streptomyces using a genetic engineering gene cloning method, and have The present invention was completed by successfully producing only cellulase. That is, the present invention relates to a cleaning composition containing endo-alkaline cellulase produced by endo-alkaline cellulase-producing bacteria belonging to the genus Streptomyces. The endo-alkaline cellulase used in the present invention is a cellulase of the genus Streptomyces that has been transformed with a silk recombination vector containing endo-alkaline cellulase-producing chromosomal DNA of an alkaline cellulase-producing bacterium belonging to the genus Streptomyces. It is produced by collecting and collecting endo-type alkaline cellulase-producing bacteria from a culture medium. The preparation of chromosomal DNA involved in the production of endo-type alkaline cellulase from an alkaline cellulase-producing bacterium belonging to the genus Streptomyces is not particularly limited. For example,
After dissolving the cell wall with lysozyme or the like, gently lyse with a surfactant to obtain a cell-free extract. Then, the bacterial human feces and DNA fraction are separated by centrifugation, and the DNA fraction is further obtained by cesium chloride equilibrium density gradient centrifugation. Alternatively, after lysis with a surfactant such as SDS, phenol treatment and chloroform treatment are performed to purify and separate the DNA fraction, followed by ethanol precipitation to obtain DNA. The prepared donor chromosomal DNA is then cut for ligation with the vector. Cleavage of the donor chromosome is usually carried out by a method using a restriction endonuclease, but is not particularly limited to this method, for example,
A method of cutting by physically applying shearing force may also be used. When using a restriction enzyme to cleave donor DNA, any restriction endonuclease that does not have a cleavage site in the alkaline cellulase gene can be used as long as reaction conditions that cause complete cleavage are used. Also, any restriction endonuclease can be used, provided that reaction conditions that cause only partial cleavage are used. Although various restriction enzymes can be selected depending on the conditions used, it is preferable to use a restriction enzyme that has a unique cleavage site for the vector used for ease of ligation with the vector. For example, I'st I, Dam old, Sac I
, Kpn I, BgQ n, etc. can be used. On the other hand, any vector can be used regardless of whether it is a plasmid or a phage, as long as it is replicable in the Streptomyces microorganism used as a host. When using a plasmid as a vector, any plasmid can be used as long as it can be replicated in the host, but
It is desirable to have a unique cleavage site by a specific restriction enzyme and a marker for antibiotic resistance, etc., from the viewpoint of binding with the donor chromosome and ease of selection of transformed strains. As an example of a plasmid, Stove 1, which is already publicly known, is
- pJcPlll, pIJ obtained from microorganisms of the genus Mycetes
41. pIJ61, pIJ361, pIJ702.
Examples include pIJ365 and pIJ385. In order to insert and link the cut donor chromosomal DNA into a vector, it is common to cut the donor chromosomal DNA and the vector with the same restriction enzyme, and then use DNA ligase to join them together. This is the method used for However, the present invention is not limited to this method; any conventionally known method can be used. Examples of DNA ligases include E. coli DNA ligase and T4 phage DNA ligase. The recombinant vector, which is a conjugate of the donor chromosomal DNA fragment and the vector prepared in this manner, is then introduced into a host microorganism of the genus Streptomyces. Streptomyces microorganisms used as hosts are
Various materials can be appropriately selected and used depending on the purpose of implementing the present invention. The method for introducing the recombinant lambda vector into the selected host microorganism, a microorganism belonging to the genus Slebutomyces, ie, the transformation method, is not particularly limited, but a protoplast transformation method is optimal. The method for selecting and isolating microorganisms into which the desired endo-alkaline cellulase gene or the donor chromosomal DNA fragment containing the endo-alkaline cellulase gene has been introduced from the transformed strain is not particularly limited, but may include markers such as antibiotic resistance that the vector has. A preferred method is to perform primary selection using expression and then secondary selection using endo-alkaline cellulase activity of the host as an indicator. Accumulation and recovery of endo-alkaline cellulase in the culture solution using the finally selected transformant,
There are no particular restrictions on the purification method. The composition of the medium used for culture includes appropriate carbon sources, nitrogen sources, organic nutrient sources, inorganic salts, etc. to ensure good growth of the bacterial strain used and smooth production of endo-type alkaline cellulase. . Examples of carbon sources include soluble cellulose derivatives such as carboxymethyl cellulose (CMC), cellulose such as bulb powder, mouth paper powder, solid cellulose such as Avicel; glucose, fructose, etc.
carbohydrates such as sugar, sucrose or sorbyl; organic acids such as citric acid and succinic acid; n-dodecane, n-
Any substance that can be assimilated, such as hydrocarbons such as hexadecane, can be used. Among these carbon sources, a medium using cellulose or the like, especially a soluble cellulose derivative, is preferable because it produces a large amount of endo-type alkaline cellulase. In the production examples of the present invention, a transformant obtained using the exemplary plasmid pCAS1 obtained by genetic manipulation, Streptomyces lividans IIH21Na1 (pC
The physicochemical properties of the endo-type alkaline cellulase produced by ASI), FHRM P-8276 are as follows. 1° Action: Decomposes cellulose such as carboxymethylcellulose (CMC) by an endo-type mechanism, resulting in a decrease in viscosity.On the other hand, almost no reducing sugars are produced. 2. Group '11 isomerism: Acts specifically on cellulose such as CMC. 3. Optimal pH: The effect on CMC is optimal around pH 8. As shown in FIG. 4. Stable pH range: When treated at 30°C for 48 hours, p
As shown in FIG. 3, 116-11 showed a residual activity of 90% or more against CMC. 5. Optimal temperature: At pH 8, when CMC is used as a substrate, it is around 45°C. As shown in FIG. 6° Thermal stability: 90% or more activity remains after treatment at 40°C for 1 hour at pH 8. As shown in FIG. The enzyme activity of the endo-type alkaline cellulase of the present invention is
When carboxymethylcellulose (CMC) is used as a substrate, reducing sugars are hardly produced, so the determination was made according to the method for measuring endo-type CMCase activity described below. That is, 3 mfl of Wako Pure Chemical's CMC 1.0% solution. Glycine buffer 0.5M solution (pH 8) 2mQ
, mix 3mM of ion-exchanged water and keep at 40°C in an Ubbelohde viscometer, add enzyme solution 11 to this, stir quickly, measure the viscosity, and take the value at 740°C as V.
After standing still for 5 minutes, the viscosity was measured again and the value at this time was taken as V2. End type CMC when the value of V, -Vl shows 1 est/win
It was set as 1 unit of ase. The cleaning composition of the present invention contains 50 units or more of endo-alkaline cellulase per 1 kg of the composition.
, 000 units or less. In other words, after the cleaning composition is dissolved in water, the amount is 0.067 units or less, down to 33 units in 1 liter of washing liquid. Therefore, it is preferable to incorporate endo-type alkaline cellulase into the detergent composition. Components other than endo-type alkaline cellulase in the detergent composition of the present invention are not particularly limited. For example, the following known ingredients may be mixed as desired depending on the desired effect. (1) Surfactant alkylbenzene sulfonate, polyoxyalkylene (C-2 or 3) alkyl or alkenyl ether sulfate salt, alkyl or alkenyl sulfate salt, olefin sulfonate, alkanesulfonate,
Anionic surfactants having an alkyl or alkenyl chain having an average carbon number of 8 to 20, such as higher fatty acid salts, alkyl or alkenyl ether carboxylates, α-sulfo fatty acid salts or esters thereof. , 22, the counter ions of the anionic surfactant include alkali metal ions such as sodium and potassium, alkaline earth metal ions such as calcium and magnesium, ammonium ions, and alkanol groups having 2 or 3 carbon atoms.
Alkanolamines having 3 (e.g. monoethanolamine, jetanolamine, triethanolamine,
1-lyisopropanolamine, etc.). Furthermore, amphoteric surfactants such as sulfonic acid type and betaine type,
polyoxyethylene alkyl or alkenyl ether,
Nonionic surfactants such as polyoxyethylene alkyl or alkenyl phenyl ethers, alkyl or alkenyl ethers of polyoxypropylene/polyoxyethylene copolymers, higher fatty acid alkanolamides, sucrose fatty acid esters, and alkylamine oxides can also be distributed. , alkyltrimethyl quaternary ammonium salts, dialkyldimethyl quaternary ammonium salts, and other cationic surfactants may also be blended if necessary. These surfactants can be used singly or in combination of two or more, and are preferably contained in the detergent composition in an amount of 10% by weight or more (hereinafter referred to as %). (2) Divalent metal ion scavenger The builder component of one or more of the following various alkali metal salts and alkanol heptamine salts may be contained in an amount of 0 to 50%. orthophosphate, birophosphate, 1-ribolyphosphate,
Phosphates such as metaphosphate, hexametaphosphate, and phytate. Aminopolyacetates such as nitrilotriacetate and ethylenediaminetetraacetate; polymer electrolytes such as polyacrylic acid and polymaleic acid polyacetal carboxylate; organic carboxylates such as citric acid, succinic acid, and sulfosuccinic acid;
? Amino acid salts such as lumi, nosilicate, aspartic acid, glutamic acid, etc. (3) Alkali removal or no 4! & electrolyte, and one or two of the various alkali metal salts shown below as an alkaline agent or inorganic electrolyte in the composition.
0%, preferably 5-30%. Gay V salt, JA acetate sulfate. Further, as organic alkali agents, tri'f-tanolamine, diethanolamine, monoethanolamine, triisopropanolamine, etc. (4) Re-staining prevention agent Furthermore, one or more of the following compounds are added to the composition at 0.1% as a re-staining prevention agent. -=-5% 6-polyethyl-1-nonglycol, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, carboxymethylcellulose, etc. Among these, the combined use of carboxymethyl cellulose or polyethylene glycol and endo-type alkaline cellulase according to the present invention has a synergistic effect in removing muddy dirt. (5) Bleach agents such as sodium percarbonate, sodium percarbonate, sodium sulfate hydrogen peroxide adduct, 1-lium chloride hydrogen peroxide adduct, and/or sulfonated phthalocyanine zinc salt, aluminum salt, etc. The combined use of the photosensitive bleaching dye and the endo-alkaline cellulase of the present invention further improves the cleaning effect. (6) Enzymes (enzymes that perform their original enzymatic action during the washing process) Classified based on enzyme reactivity, the following are hydrolases, lyases, oxidoreductases, ligases, 1-transferases, and isomerases. However, any of these can be applied to the present invention. Particularly preferred are hydrolases, including proteases, esterases, carbohydrases and nucleases. (7) Blue-tinging agents and fluorescent dyes Various blue-tinging agents and fluorescent dyes can be added as necessary. (8) Anti-caking agent In the case of a powdered detergent, the following anti-caking agent may also be blended. Paratoluenesulfonate. Xylene sulfonate, acetate, sulfosuccinic salt, talc, finely powdered silica, clay, calcium silicate (
For example, Tohns-Manville 1), calcium carbonate, magnesium oxide, etc. (9) Antioxidant tert-butylhydroxytoluene, 4,4'-butylidene bis-(6-tert-butyl-3-methylphenol),
2.2'-butylidene bis-(6-tert-butyl-4-methylphenol), monostyrenated monosol, distyrenated cresol, monostyrenated phenol, distyrenated phenol, 1.1'-bis-(4- Antioxidant 11-agents such as hydroxyphenyl) cyclohexane. (10) Solubilizer Lower alcohols such as ethanol, benzenesulfonates, lower alkylbenzenesulfonates such as p-toluenesulfonates, glycols such as propylene glycol, acetylbenzenesulfonates, acetamides , pyridine dicarboxylic acid amides, benzoates or urea. A major advantage of the present invention is that it is particularly effective in cleaning inorganic solid stains, such as fine mud stains, which conventional cleaning agents cannot sufficiently remove.
It is also effective against dirt such as dirt, and is also extremely useful in improving the cleaning power of phosphorus-free or low-phosphorus detergents. Phosphate was effective in removing fine scale dirt that had gotten between the fibers. However, due to the problem of eutrophication, the amount of phosphate compounded has been decreasing (), and as a result of the forced phosphorization, it has become extremely difficult to remove muddy dirt, especially from cotton. It is well known that it is difficult to remove muddy dirt that has penetrated into cloth.Furthermore, housewives are troubled by traces of dirt stuck to canvas made of cotton blend fabric. For example, when cleaning muddy stains from cellulose fibers and blended fabrics with other types of fibers, (1) using alkaline phosphorus-free or low-phosphorus detergents is recommended. (2) By applying the present invention to weakly alkaline liquid phosphorus-free detergents, it is possible to obtain superior cleaning power equal to or greater than that of weakly alkaline powder detergents containing sufficient phosphates. Another great advantage of the present invention is that it can be applied to any form of cleaning agent.Alkaline cellulase can be added to various forms such as dry powder powder blend powder, tablets, liquid, etc.
【、２て本
発明品を得ることができる。
（作 用）
洗浄剤の技術分野においで酵素を使用することは公知で
あるが、その酵素は特に汚れに対して有効に作用するも
ののみが知られているにすぎない。
即ち、蛋白汚れに対してはプロテアーゼが、澱粉汚れに
対し、ではアミラーゼが更には油脂汚れに対してはリパ
ーゼが知られており何れも汚れに直接に功撃する酵素で
ある。本発明におけるエンド型アルカリ性セルラーゼの
洗浄［作は如何なるものか未だ完全には解明されていな
いが、界面活性剤にその本質をみることのできる繊維の
単なる膨潤作用に基づくものではない。
（発明の効果）
ストレプトマイセス属に１４するアルカリ性セルラーゼ
生産菌より誘導された形質転換体の生産するエンド型ア
ルカリ性セルラーゼは、洗浄剤就中衣料用洗浄剤に配合
された場合、衣料汚れ特に衿布、袖口汚れ、更にはズッ
ク靴等の汚れに対して顕著な洗浄効果を発揮する。
次に本発明の創製例及び実施例を示す。
創製例１．（染色体ＤＮＡの！Ｊ！Ｊ製法）ストシブ１
−マイセス・エスピーＫＳＭ−９（ＦＥＲＭ Ｐ７６２
０）より染色体ＤＮＡを調製する際には１００ｍｆｌの
Ｍ Ｙ ／ Ｎ ａ ２ Ｃ０３培地（肉エキス１．５
％、酵母エキス０．５％、 Ｋ１１２ＰＯ４０，１％、
Ｎａ２Ｃｏ、 ０．２％）、で生育させた菌体を集菌、
洗浄後、８ｎ＋Ｑの２５％シュークロース５（ｈＭ ト
リス−塩酸、２０１１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）のバ
ッファーに懸濁し３゜２１のＥＤＴＡ （ｐ、 Ｈ８，
Ｏ）と５１１１ｇのりゾチームを加え、３７℃で１−時
間静置した後、２ｔＱの１０％Ｓ Ｄ Ｓを加え溶菌さ
せた。これに５ＭＮａＣｆｆを４１加え、０℃で３時間
静置した後、４８，０００ｇで１時間遠心しクリアート
ライゼートを得、ＰＥＧ ６０００を終濃度１０％にな
るように加えてＤＮＡを沈殿させ、これをＴＥバッファ
ーに溶解し、塩化セシウム密慶勾配遠心により染色体Ｄ
ＮＡとプラスミドＩ〕ＮＡを単離した。
創製例２．（組換えプラスミドの構築と調製）創製例１
で得られた染色体ＤＮＡをＰｓｔ Ｉにて、３７℃、２
時間の完全分解を行う。別にプラスミドｐｌＪ３８５も
Ｐｓｊ、１にて同様に完全分解を行う。
ついで、両者を混合し、フェノール抽出後、エタノール
沈殿を行なった後、リゲーションを行う。
ノゲ・−ジョンはＴ４リガーゼを用いて１２℃で１２時
間反応を行なった。
リゲーションが完全に行なわれたことは、アガロースゲ
ル電気泳動によって確認した。
創製例３．（受容菌の分離）
形質転換の受容菌としてはスト１ノプトマイセス・リビ
ダンスＨＨ２１株を用いるが、本菌はＣＭＣａｓｅの生
産性を有する為、そのままでは受容菌として用いること
が出来ない、そこでＣＭＣａｓｅ欠損変異株の誘導を行
なった。
ストレプトマイセス・リビダンス＋（）１２１の胞子を
０゜０５阿リン酸バツフアー・（ｐＨ７，０）に良く分
散させた後、 ＮＴＧ（Ｎ−メチル−Ｎ′−二ｌ−ロー
Ｎ−ニトロソグアニジン）を５００ｇになるように加え
、３０℃で１時間振盪する。これを生理食塩水で希釈し
、ＣＭＣを含有する８Ｍ寒天培地にブレーティングする
。
コロニー形成させた後、コンゴーレッド染色法でハロー
形成能が低下した菌を選択した。
完全なＣＭＣａｓｅ欠損株は得られなかったが、野性株
の１７５以下にハロ・−径が低下した株を分離し、スト
レプトマイセス・リビダンスＨ）１２１ Ｎ（１１株と
命名した。
創製例４、（プロトプラスト調製と形質転換）プロトプ
ラスト調製及び形質転換はビブ（Ｂｉｂｂ）らの方法（
ビブ、エム・ジェイ；ジエイ・エム・ワードとデイ・ニ
ー・ホープウッド（Ｂｉｂｂ、 Ｍ、 Ｊ、 ；Ｊ、
Ｍ、 Ｗａｒｄ＆ Ｄ、 Ａ、 Ｈｏｐｗｏｎｄ） ・
ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ） ２７４．３９８〜４００
１９７８）に従った。
すなわちＳ培地で生育させた菌体を集菌し、０．３Ｍシ
ュークローズで洗浄した後、２ｍｇ／ｍＱリゾチーム（
次に示すＰ培地に溶解）に＠濁し３０℃で１−時間静置
してプロトプラスト化する。
（Ｐ培地）
シュークロース １０３ｇＫ、５ｏ４０
．２５ｇ
Ｍｇ（Ｊ２６Ｈ，０２，０３ｇ
Ｋ）１２ＰＯ，ＩＯ、０５ｇ
ＣａＣＱ、 ・２１！２０ ３．６
８ｇＴ Ｅ Ｓ （０，２５Ｍ ｐＨ７，２）
］、０００ｍｆｆ水
ＩＱこれを綿濾過により残存菌糸体と分
難し、遠心によりプロトプラストを得た。さらにＰ培地
で良く洗浄後、少量のＰ培地に懸濁し２、そこで実施例
２で調製したＤＮＡを加え、終濃度２０％になるように
ポリエチレングリコール＃１０００ を加え、ＤＮＡを
取り込まぜた。これをＰ培地で希釈、遠心後、次に示す
Ｒ２ＹＩＥ寒天培地にまいて再生させた。
（Ｒ２ＹＥ寒天培地）
シュークローズ １０３ ｇＫｚＳ０
４０−２５ｇ
ＨｇＣＱ、・６１！２０ １０．１
２ｇＣａＣＱ２・２Ｈ２０２，９５ｇ
ＫＨ２ＰＯ４０，０５ｇ
グルコース １０ｇカザミノ酸
０．１ ｇ酵母エキス
５ｇ
ｌ、−アスパラギン ３ｇＴ Ｅ Ｓ
１００ｎ＋Ｑ寒天
２２ ｇ水
ＩＱ形質転換株はＲ２ＹＥ寒
天培地」二で充分に胞子が着生した後、これをチオスト
レプトン３０ｇ含む、次に示すＢに寒天培地にレプリカ
することにより選択した。
（８Ｍ寒天培地）
酵母エキス １ｇ肉エキス
１ｇＮＺアミン（ｔｙｐｅ Ａ
） ２ｇマルトース
ＬｏｇＣＭ Ｃ１０ｇ
寒天 ２０ｇ水
ｌＱ目的の
ＣＭＣａｓｅ遺伝子を有する株は、コンゴーレッド染色
法によりＣＭＣ含有寒天平板上で透明なハローをコロニ
ー周辺に形成する。生成したハローのうち、最大のハロ
ーを生成した該当菌株を分離し、これをストレプトマイ
セス・リビダンスＨＨ２１Ｎｔｔｌ（ｐｃＡｓｌ）と命
名した。本菌株はＦＥＲＭ Ｐ−８２７６として微工研
に寄託された。
創製例５．（プラスミドｐＣＡＳ１の確認）ストレプ［
・マイセス・リビダンス４団２１Ｎ（１１（ＰＣＡＳＩ
）、ＦＥＲＭ Ｐ−８２７６をＭＹ培地で３０℃で、３
日間培養し、培養菌体を溶菌し、超遠心分難後、クリア
ートライゼートを塩化セシウム密度勾配遠心にかけるこ
とにより、プラスミドｐＣＡＳ １の存在が確認された
。プラスミドｐｃＡｓ１の開裂地図は第１図に示す。制
限酵素を用いた解析によりプラスミドｐｃＡｓ１にはス
トレプトマイセス・エスピーＫＳＭ−９に由来する３、
４にｂの挿入断片を有することが確認された。
製造例（エンド型アルカリ性セルラーゼの生産）肉エキ
ス、１．５％（ｕ／Ｖ）、酵母エキＸ Ｏ，５％ （Ｗ
／Ｖ）、リン酸二水素カリウム０．１％（Ｗ／Ｖ）、炭
酸ナトリウム０．２％（ｌｉｔ／Ｖ） （別滅歯）を５
００ｍｆｆ容坂ロフラスコに入れ滅菌後、ＰＣＡＳＩを
有するストシブ１−コツカス・リビダンスＨＨ２１Ｎ［
１１（ＰＣＡＳＩ）、 ＦＥＲＮ Ｐ−８２７６を接種
し、３０℃、４日間振盪培養した後、培養液から遠心分
離によって菌体を除去した上清液のエンド型ＣＭＣａｓ
ｅ活性を粘度低下法によって測定したところ、０．１０
６ ｃｓｔ／ｍｊ、ｎのエンド型ＣＭＣａｓｅ活性どし
てエンド型アルカリ性セルラーゼが得られた。
実施例１゜
本実施例をもって天然エリ垢汚染布に対して、エンド型
アルカリ性セルラーゼが特に有効であることを示す。
１）洗剤配合
直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸ソーダ（Ｃ１，〜、い
１ｌ＝１．０モル）
アルキル硫酸ソーダ（０１４〜１−
石ケン（牛脂肪酸ソーダ）
結晶性アルミノケイ酸ソーダ
ケイ酸ソーダ
炭酸ソーダ
カルボキシメチルセルロース
ポリエチレングリコール（ＭＷ６０００）蛍光染料
香 料
芒 硝
水 分
１２（鱈４％）
２）天然えり布汚染布：
木綿金型Ｊｔ２０２３布をワイシャツの襟に縫い付け、
成年男子に２日間着用させる。着用後中心点に対し汚れ
が対称な布を選び出し、この汚れの対称点で布を半裁し
実験に供した。
３）洗浄条件及び方法
天然汚染布を洗浄する場合、９０ｍ Ｘ ３０ｃｍの天
然汚染布を対称の位置で半裁し、９ ｃｍ Ｘ １５ｃ
ｍの一対の汚染布の一方を基準洗浄し、片方を比較洗剤
である本発明の洗剤でそれぞれ洗浄した。まず天然汚染
布片１５枚を５０ｅｍ Ｘ ５０ｃｍの綿布に縫い付け
、粉末洗剤の場合には８Ｑの０．６６５％の洗剤溶液に
入れ３０℃で１時間浸漬後東芝製洗濯機「銀河」に移し
綿製肌着８００ｇｒ、ポリエステル綿混（６５％／３５
％）ＩｌＹシャツ５００ｇｒを加えた後、全量を４０Ｑ
とした後備反転で１０分間洗浄し、脱水、すすぎを充分
にした後、乾燥後判定に供した。
基準洗剤で洗った半裁布と本発明の洗剤で洗った半裁布
とを肉眼判定による１対比較で評価した。
汚れの程度を表わす１０段階にランクづけした標準汚れ
を基準にし、洗浄布をランクづけした。洗浄性は基準洗
剤の洗浄力を１００としたときの本発明の洗剤の洗浄力
の点数で表わした。洗浄力指数の差は０．５以上で有意
の差とみなせる。
４）結果
表
実施例２゜
更に本発明のエンド型アルカリ性セルラーゼを。
液体洗浄剤組成物及び漂白剤含有洗浄剤組成物に配合し
、天然エリ垢汚染布の洗浄効果を確認した。
１）洗剤配合
アルキル硫酸ソーダ ２ア
ルキルエトキシ硫酸ソーダ ２０ノニオン
１５５石 鹸
】０３トリポリリン酸ソーダ
ケイ酸ソーダ
炭酸ソーダ
芒 硝
クエン酸ソーダ ３アルカノールア
ミン
ポリエチｊソングリコール ２１エタノール
７過炭酸ソーダ
２０蛍光染Ｆ４０．２ ０
．４
青味付剤 ｏ．ｏｏｓ香 料
０。２０．３水
バランス ５プロテアーゼ
０．５ ０．５にエンド
型アルカリ性セルラーゼを配合した場合、いずれも無配
合だった場合に比較して優れた洗浄効果を示した。[, 2] The product of the present invention can be obtained. (Function) The use of enzymes in the technical field of detergents is known, but only those enzymes that act particularly effectively against dirt are known. That is, protease is known for protein stains, amylase is known for starch stains, and lipase is known for oil stains, and all of these enzymes are enzymes that directly attack stains. The cleaning effect of endo-type alkaline cellulase in the present invention is not yet completely elucidated, but it is not based on a mere swelling effect of fibers whose essence can be seen in surfactants. (Effects of the Invention) Endo-type alkaline cellulase produced by a transformant derived from an alkaline cellulase-producing bacterium belonging to the genus Streptomyces can be used to stain clothing, especially collars, when added to detergents, especially clothing detergents. It has a remarkable cleaning effect on stains on cloth, cuffs, and even canvas shoes. Next, creation examples and examples of the present invention will be shown. Creation example 1. (Chromosomal DNA!J!J manufacturing method) Stoshibu 1
-Myces SP KSM-9 (FERM P762
When preparing chromosomal DNA from
%, yeast extract 0.5%, K112PO40.1%,
Collect bacteria grown in Na2Co, 0.2%),
After washing, suspend 8n+Q in a buffer of 25% sucrose 5 (hM Tris-HCl, 2011M EDTA (pH 8,0) and add 3°21 EDTA (p, H8,
0) and 5111 g of Norizozyme were added, and the mixture was allowed to stand at 37°C for 1 hour, and then 2tQ of 10% SDS was added to lyse the bacteria. Add 41ml of 5M NaCff to this, let stand at 0°C for 3 hours, centrifuge at 48,000g for 1 hour to obtain a clear trisate, add PEG 6000 to a final concentration of 10% to precipitate the DNA, This was dissolved in TE buffer and subjected to cesium chloride Mitsuyong gradient centrifugation.
NA and Plasmid I] NA was isolated. Creation example 2. (Construction and preparation of recombinant plasmid) Creation example 1
The chromosomal DNA obtained was incubated with Pst I at 37°C for 2
Complete time decomposition. Separately, plasmid plJ385 is also completely degraded using Psj,1. Next, the two are mixed, followed by phenol extraction, ethanol precipitation, and ligation. Noge-john was reacted with T4 ligase at 12°C for 12 hours. Complete ligation was confirmed by agarose gel electrophoresis. Creation example 3. (Isolation of Recipient Bacteria) Stnoptomyces lividans strain HH21 is used as a recipient bacterium for transformation, but since this bacterium has CMCase productivity, it cannot be used as a recipient bacterium as it is, so a CMCase-deficient mutation was used. The strain was induced. After the spores of Streptomyces lividans + ()121 were well dispersed in 0.05 phosphoric acid buffer (pH 7.0), NTG (N-methyl-N'-dil-rho-N-nitrosoguanidine) was added. Add 500 g of the mixture and shake at 30°C for 1 hour. This is diluted with physiological saline and plated onto 8M agar medium containing CMC. After colony formation, bacteria with reduced halo-forming ability were selected by Congo red staining. Although a complete CMCase-deficient strain was not obtained, a strain with a halo diameter reduced to 175 or less than that of the wild strain was isolated and named Streptomyces lividans H) 121 N (11 strain. Creation Example 4. (Protoplast preparation and transformation) Protoplast preparation and transformation were performed using the method of Bibb et al.
Bibb, M.J.; G.M. Ward and Dayney Hopewood
M, Ward & D, A, Hopwon) ・
Nature 274.398-400
(1978). That is, the bacterial cells grown in S medium were collected, washed with 0.3M sucrose, and then treated with 2mg/mQ lysozyme (
Dissolve in the following P medium) and suspend at 30°C for 1 hour to form protoplasts. (P medium) Sucrose 103gK, 5o40
．． 25g Mg (J26H, 02, 03g K) 12PO, IO, 05g CaCQ, ・21!20 3.6
8gT E S (0.25M pH7.2)
], 000mff water
IQ This was separated from residual mycelia by cotton filtration, and protoplasts were obtained by centrifugation. Further, after washing thoroughly with P medium, the suspension was suspended in a small amount of P medium 2, and the DNA prepared in Example 2 was added thereto. Polyethylene glycol #1000 was added to a final concentration of 20% to incorporate the DNA. This was diluted with P medium, centrifuged, and then spread on the following R2YIE agar medium for regeneration. (R2YE agar medium) Shourose 103 gKzS0
40-25g HgCQ, ・61!20 10.1
2gCaCQ2・2H202,95g KH2PO40,05g Glucose 10g Casamino acids
0.1 g yeast extract
5g l,-asparagine 3gT E S
100n+Q agar
22 g water
The IQ transformed strain was selected by replicating the spores onto an agar medium shown below containing 30 g of thiostrepton after sufficient spores had settled on R2YE agar medium 2. (8M agar medium) Yeast extract 1g meat extract
1g NZ amine (type A
) 2g maltose
LogCM C10g agar 20g water
A strain having the CMCase gene of interest for lQ forms a transparent halo around colonies on a CMC-containing agar plate by Congo red staining. Among the halos produced, the strain that produced the largest halo was isolated and named Streptomyces lividans HH21Nttl (pcAsl). This strain was deposited at the Microtech Institute as FERM P-8276. Creation example 5. (Confirmation of plasmid pCAS1) Strep[
・Myces Lividance 4 Troupe 21N (11 (PCASI)
), FERM P-8276 in MY medium at 30°C, 3
After culturing for days, the cultured cells were lysed, and after ultracentrifugation, the presence of plasmid pCAS1 was confirmed by subjecting the clear trisate to cesium chloride density gradient centrifugation. The cleavage map of plasmid pcAs1 is shown in FIG. Analysis using restriction enzymes revealed that plasmid pcAs1 contains 3, which is derived from Streptomyces sp. KSM-9,
4 was confirmed to have the inserted fragment b. Production example (production of endo-type alkaline cellulase) Meat extract, 1.5% (u/V), yeast extract X O, 5% (W
/V), potassium dihydrogen phosphate 0.1% (W/V), sodium carbonate 0.2% (lit/V) (separately) 5
00mff After sterilization in a Yosaka flask, Stosib 1- Kotsucus lividans HH21N with PCASI [
11 (PCASI), FERN P-8276 was inoculated, cultured with shaking at 30°C for 4 days, and the supernatant was obtained by centrifugation to remove the bacterial cells from the culture solution.
e activity was measured by viscosity reduction method and found to be 0.10
Endo-type alkaline cellulase was obtained by endo-type CMCase activity of 6 cst/mj, n. Example 1 This example shows that endo-type alkaline cellulase is particularly effective against cloth contaminated with natural burr dirt. 1) Detergent formulation Linear sodium dodecylbenzenesulfonate (C1, ~, 1l = 1.0 mol) Sodium alkyl sulfate (014-1- Sodium soap (cow fatty acid soda) Crystalline sodium aluminosilicate Sodium silicate Sodium carbonate Carboxymethyl cellulose Polyethylene glycol (MW6000) Fluorescent dye Fragrance Salt Salt Water Content 12 (Cod 4%) 2) Contaminated natural collar cloth: Cotton mold Jt2023 cloth is sewn onto the collar of a dress shirt.
Have an adult male wear it for two days. After wearing, a cloth with stains symmetrical about the center point was selected, and the cloth was cut in half at the symmetrical point of the stains and used for experiments. 3) Cleaning conditions and method When cleaning naturally contaminated cloth, cut a 90m x 30cm naturally contaminated cloth in half at symmetrical positions, and cut into 9cm x 15cm pieces.
One of a pair of contaminated cloths was subjected to standard washing, and the other was washed with the detergent of the present invention, which was a comparison detergent. First, 15 pieces of naturally contaminated cloth were sewn onto a 50em x 50cm cotton cloth, and in the case of powdered detergent, they were placed in 8Q 0.665% detergent solution and soaked for 1 hour at 30°C, then transferred to a Toshiba washing machine "Galaxy". Cotton underwear 800gr, polyester cotton blend (65%/35
%) After adding 500gr of IlY shirt, the total amount is 40Q
The sample was washed for 10 minutes by turning it upside down, thoroughly dehydrated and rinsed, and then dried and subjected to evaluation. A pair of half-cut fabrics washed with the standard detergent and a half-cut fabric washed with the detergent of the present invention were evaluated by visual judgment. The cleaning cloths were ranked based on standard soiling, which was ranked on a 10-level scale representing the degree of soiling. The detergency was expressed as a score for the detergency of the detergent of the present invention, with the detergency of the reference detergent set at 100. A difference in detergency index of 0.5 or more can be considered a significant difference. 4) Results Table Example 2゜Additionally, the endo-type alkaline cellulase of the present invention. It was added to a liquid detergent composition and a detergent composition containing a bleaching agent, and its effectiveness in cleaning cloth contaminated with natural burr dirt was confirmed. 1) Sodium alkyl sulfate containing detergent 2 Sodium alkyl ethoxy sulfate 20 Nonion
155 soap
]03 Sodium tripolyphosphate Sodium silicate Sodium carbonate Sodium nitric citrate 3 Alkanolamine polyethylene glycol 21 Ethanol
7 Soda percarbonate
20 Fluorescent stain F40.2 0
．． 4 Blue tinting agent o. oos fragrance 0.20.3 water
Balance 5 Protease 0.5 When endo-type alkaline cellulase was blended with 0.5, a superior cleaning effect was shown compared to when neither was blended.
【図面の簡単な説明】[Brief explanation of drawings]
第１図はプラスミドｐｃＡｓ１の開裂地図を示す図であ
る。カッコ内はＫｂを表している。
第２図は、エンド型フルカリ性セルラーゼの作用，至適
ｐＨを示す図で、第３図は、そのｐＨ安定性を示す図で
、第４図は、その作用至適温度を示す図で、第５図は、
その温度安定性を示す図である。
代理人 弁理士 戸 １）親 男
２）天然エリ布汚染布及び洗浄条件、方法天然エリ布汚
染布の調整及び洗浄条件、方法は実施例１に順じた。
３）結果
液体洗浄剤組成物及び漂白剤含有洗浄剤組成物第
図
ｃｏｌ、７１
の
第
図
第
図
Ｈ
第
図
温
戻
（℃）FIG. 1 shows a cleavage map of plasmid pcAs1. The value in parentheses represents Kb. Figure 2 is a diagram showing the action and optimal pH of endo-type flucalic cellulase, Figure 3 is a diagram showing its pH stability, and Figure 4 is a diagram showing its optimal temperature for action. Figure 5 shows
It is a figure which shows the temperature stability. Agent: Patent Attorney 1) Parent: Male 2) Natural Ellipse-Contaminated Cloth, Washing Conditions, and Methods The preparation of the Natural Ellipse-contaminated cloth, washing conditions, and method were as in Example 1. 3) Results Liquid detergent composition and bleach-containing detergent composition Diagram col, 71 Diagram Diagram H Diagram Warming (°C)