JPH02249489A - Vector for expressing exogenote fragment - Google Patents
Vector for expressing exogenote fragmentInfo
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- JPH02249489A JPH02249489A JP7043189A JP7043189A JPH02249489A JP H02249489 A JPH02249489 A JP H02249489A JP 7043189 A JP7043189 A JP 7043189A JP 7043189 A JP7043189 A JP 7043189A JP H02249489 A JPH02249489 A JP H02249489A
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Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は、遺伝子組換え技法において、任意の蛋白遺伝
情報を有する外来遺伝子断片を大腸菌のプラスミドベク
ター中に組み込むことにより、該蛋白とβ−ガラクトシ
ダーゼとの融合蛋白を大腸菌に生産せしめることを可能
とする外来遺伝子断片発現用ベクターを提供するもので
ある。Detailed Description of the Invention [Industrial Application Field] The present invention uses gene recombination techniques to integrate a foreign gene fragment having arbitrary protein genetic information into an Escherichia coli plasmid vector. The present invention provides a vector for expressing a foreign gene fragment that enables Escherichia coli to produce a fusion protein with galactosidase.
［従来の技術］
組換えＤＮＡ技術が１９７０年初頭に発表されて以来、
所望の外来遺伝子産物を大腸菌等の微生物に産生させる
方法は飛躍的な進歩を遂げた。[Prior Art] Since recombinant DNA technology was announced in the early 1970s,
Significant advances have been made in methods for producing desired foreign gene products in microorganisms such as E. coli.
しかしながう、所望の外来遺伝子を挿入したことを確か
める方法は、挿入遺伝子と類似の遺伝子を放射性元素で
マーカーし、ハイブリダイゼーションを行って、遺伝子
が挿入されたことを確認する等の方法を使用していた。However, a method to confirm that the desired foreign gene has been inserted is to mark a gene similar to the inserted gene with a radioactive element and perform hybridization to confirm that the gene has been inserted. I was using it.
しかしながら、挿入した後に挿入体を選択することは手
間がかかり、尚かつ類似の遺伝子がない場合には全く手
に負えない状況であった。However, it is time-consuming to select the insert after insertion, and the situation is completely unmanageable if there are no similar genes.
一方、生体内の異物の侵入に対する自己防御機構（所謂
免疫機構）の解明に伴い、その免疫現象を利用した測定
方法である所謂免疫測定方法が活発に行われるようにな
り、特に特定の抗原に対してのみ反応するモノクローナ
ル抗体を使った抗原の定量が活発に行われるようになフ
た。これに伴いモノクローナル抗体を大量に生産するた
め、所望の抗原を大量に生産する組み換えＤＮＡ技術を
用いた培養が種々の方法で行われるに至った。On the other hand, with the elucidation of the self-defense mechanism (the so-called immune mechanism) against the invasion of foreign substances within the body, the so-called immunoassay method, which is a measurement method that utilizes this immune phenomenon, has become actively used. Quantification of antigens using monoclonal antibodies that react only to these antigens has become increasingly popular. Along with this, in order to produce large amounts of monoclonal antibodies, various methods have been used to culture using recombinant DNA technology to produce large amounts of desired antigens.
このため、酵素蛋白合成制御を調節するオペロン内に外
来遺伝子を挿入させ、酵素活性を選択マーカとして利用
することにより外来遺伝子挿入体を選択し、発現した外
来遺伝子と酵素遺伝子との融合蛋白を抗原として利用す
る方法が提案されている。For this reason, we insert a foreign gene into an operon that regulates enzyme protein synthesis control, select the foreign gene insert by using enzyme activity as a selection marker, and use the expressed fusion protein of the foreign gene and enzyme gene as an antigen. A method has been proposed to use it as a
例えば、大腸菌のラクトースオペロンの構造遺伝子の一
つから合成されるβ−ガラクトシダーゼは、そのアミノ
末端を他の蛋白質のアミノ末端で置換しても酵素活性を
保持しており、外来蛋白質の全体もしくはその一部を結
合したβ−ガラクトシダーゼ融合蛋白として大腸菌を用
いて生産させることが可能となった。For example, β-galactosidase, which is synthesized from one of the structural genes of the lactose operon of Escherichia coli, retains its enzymatic activity even if its amino terminus is replaced with the amino terminus of another protein. It has now become possible to produce a partially linked β-galactosidase fusion protein using Escherichia coli.
このような融合蛋白の外来蛋白部分は一般に本来の抗原
性をも保持しているので、抗体の製造や検出に応用が可
能となるため、通常の方法では微量にしか得られない天
然の蛋白質の抗体を効率よく得ることが可能となった。The foreign protein portion of such a fusion protein generally retains its original antigenicity, making it possible to apply it to antibody production and detection. It has become possible to efficiently obtain antibodies.
遺伝子断片発現用ベクターとは、外来遺伝子断片をアミ
ノ末端部分をコードする遺伝子部分とアミノ末端を欠失
しているβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）間の
適当な制限酵素部位を有するリンカ一部位（クローニン
グ部位）に挿入し、３部分の遺伝子断片からコードされ
る融合蛋白として発現させるもので、外来遺伝子断片を
単にリンカ一部位に挿入するだけで、目的の融合蛋白を
発現させることができる。A gene fragment expression vector is a linker site (cloning) that has an appropriate restriction enzyme site between the gene portion encoding the amino-terminal portion of the foreign gene fragment and the β-galactosidase gene (lacZ) lacking the amino-terminal portion. The target fusion protein can be expressed by simply inserting the foreign gene fragment into one linker site and expressing it as a fusion protein encoded by the three gene fragments.
これまで知られている外来遺伝子断片発現用ベクターと
しては、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）のア
ミノ末端近くにクローニング部位を挿入し、この部位に
外来遺伝子断片を挿入して融合蛋白として発現させるも
の（Ｋｏｅｎａｎら、ＥＭＢＯＪ、１，５０９−５１２
１９８２； Ｍｕｔｔｅｒら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ
ｌ、 ＾ｃａｄ。So far known vectors for expressing foreign gene fragments include those that insert a cloning site near the amino terminus of the β-galactosidase gene (lacZ), insert a foreign gene fragment into this site, and express it as a fusion protein ( Koenan et al., EMBOJ, 1,509-512
1982; Mutter et al., Proc. Nat.
l, ＾cad.
Ｓｃｉ、、’７９．６８５２−８８５５Ｈ５ｈｕｌｔｘ
ら、Ｃｅ１ｌ ３１，２２７−２３５１９８２） 、
アミノ末端をコードする遺伝子として大腸菌ＯｍｐＦ遺
伝子を用いるもの（Ｖｆｅｉｎｓｔｏｃｋら、Ｐｒｏｃ
、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕｓ＾８０，４４３２
−４４３６１９８３゜Ｅｌｆａｓｓｌ ら、Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、 、８３．２２１９−２
２２２．１９８６ ） 、大腸菌ファージλのｃｌ遺伝
子（Ｇｒａｙら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃ
ｉ、Ｕｓ＾７９，６５９８−６６０２１９８２； Ｍａ
ｌｌｏｎら、Ｇｅｎｅ、４２；２４１−２５１，１９８
６ ；Ｃｈａｎｇ ら、５ｃｉｅｎｃｅ、２２８．９
３−９６．１９８５）を用い、これとクローニング部位
を含むポリリンカーおよびアミノ末端を欠＜ １ａｃ
Ｚ遺伝子から成るものなどがあった。Sci,,'79.6852-8855H5hultx
et al., Ce1l 31, 227-2351982),
One that uses the E. coli OmpF gene as the gene encoding the amino terminus (Vfeinstock et al., Proc.
, Natl, ^cad, sci, Us^80,4432
-44361983゜Elfassl et al., Proc.
Natl, ^cad, sci, , 83.2219-2
222.1986), the cl gene of Escherichia coli phage λ (Gray et al., Proc, Natl,^cad, sc
i, Us^79,6598-66021982; Ma
llon et al., Gene, 42; 241-251, 198
6 ; Chang et al., 5science, 228.9
3-96.1985) and lacking the polylinker containing the cloning site and the amino terminus <1ac
There were also those consisting of the Z gene.
また上記従来の外来遺伝子断片発現用ベクターのプロモ
ーターとしてはｌａｃオペロンのｌａｃプロモーター（
ｌａｃＰ）、 Ｏｍｐ Ｆ遺伝子のＯｍｐ Ｆプロモー
ターおよびλファージのλＰ、が使われていた。In addition, as a promoter of the above-mentioned conventional foreign gene fragment expression vector, the lac promoter of the lac operon (
lacP), the Omp F promoter of the Omp F gene and λP of the λ phage were used.
［発明が解決しようとする課題］
しかしながら、 ＱｔｓｐＦプロモーターは浸透圧など
の環境因子によって発現が制御されており、そ９発現に
はＯｍｐＢｃｓ変異株（温度変異株）を用いる必要があ
り、使用におのずと制限があった。またλＰＬはＣＩ遺
伝子リプレッサーの制御下にあり、ＣＩ ｔｓ１５５７
のような高温（４２℃）で用いる必要があったため、自
ずと用途に制限があること等の欠点があった。また、１
ａｃＰプロモーター等はイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガ
ラクトシド（以下、ＩＰＴＧと記す）により抑制が解除
されるが、プロモータ活性が脆弱であった（発現させる
外来蛋白によって融合蛋白の産生量は変動すると考えら
れるが、β−ガラクトシダーゼを用いた融合蛋白の場合
には収量は全蛋白の１％以下である。）。[Problems to be Solved by the Invention] However, the expression of the QtspF promoter is controlled by environmental factors such as osmotic pressure, and it is necessary to use an OmpBcs mutant strain (temperature mutant strain) for QtspF promoter expression. There were restrictions. In addition, λPL is under the control of the CI gene repressor, and CI ts1557
Because it needed to be used at such high temperatures (42°C), it naturally had drawbacks such as limitations in its uses. Also, 1
The acP promoter etc. can be derepressed by isopropylthio-β-D-galactoside (hereinafter referred to as IPTG), but the promoter activity was weak (the production amount of the fusion protein is thought to vary depending on the foreign protein expressed). However, in the case of a fusion protein using β-galactosidase, the yield is less than 1% of the total protein.)
本発明では、実用性の高い外来遺伝子断片発現用ベクタ
ーを製作することを目的とする。The purpose of the present invention is to produce a highly practical vector for expressing a foreign gene fragment.
Ｃ’Ｊ題を解決するための手段Ｊ
本発明の第１発明に係る外来遺伝子断片発現用ベクター
では、宿主細菌内で発現可能な複製開始領域と、宿主細
菌に抗生物質耐性を付与する抗生物質耐性遺伝子領域と
、酵素蛋白合成制御を調節するオペロンと、該オペロン
内に配置された外来遺伝子を挿入するポリリンカー部分
とを有し、外来遺伝子挿入を前記酵素活性により判別す
るベクターにおいて、
プラスミドｐＤＲ５４０由来のトリプトファン・プロモ
ーターと１ａｃＬＩＶｓプロモーターからなる合成プロ
モータである ｔａｃプロモーター部分（Ｐｔａｃ）と
、
プラスミドｐＤＲ５４０由来の大腸菌ガラクトキナーゼ
構造遺伝子５°末端部分（ｇａｌに°）と、１もしくは
複数の制限酵素部位を有する前記ポリリンカー部分と、
プラスミドｐＭＣ１４０３由来の大腸菌５°末端欠落β
−ガラクトシダーゼ構造遺伝子部分（′ｌａｃＺ）とを
複製方向に沿って順に配置したものである。Means for Solving the C'J Problem J The vector for expressing a foreign gene fragment according to the first aspect of the present invention has a replication initiation region that can be expressed in a host bacterium, and an antibiotic that imparts antibiotic resistance to the host bacterium. A vector comprising a resistance gene region, an operon that regulates enzyme protein synthesis control, and a polylinker portion for inserting a foreign gene located within the operon, and in which foreign gene insertion is determined by the enzyme activity, plasmid pDR540 The tac promoter portion (Ptac), which is a synthetic promoter consisting of the tryptophan promoter derived from the plasmid pDR540 and the 1acLIVs promoter, the 5° end portion (gal) of the E. coli galactokinase structural gene derived from the plasmid pDR540, and one or more restriction enzyme sites. and the E. coli 5° end missing β derived from plasmid pMC1403.
- galactosidase structural gene portion ('lacZ) are arranged in order along the replication direction.
本発明の第２発明に係る外来遺伝子断片発現用ベクター
ｐＴＫ２では、前記第１発明に記載の外来遺伝子断片発
現用ベクターにおいて、サイズが１０．６Ｋｂで、プラ
スミドｐＢＲ３２２の複製開始領域と、前記抗生物質耐
性遺伝子がアンピシリン耐性遺伝子であり、前記ポリリ
ンカー部分の制限酵素部位がＢｂｅＩ （Ｎａｒｒ ）
、Ｂｇｌｌｌ ％ＰｓｔＩ ％５ｔｒｒａＩ、 Ｂａｍ
ＨＩであり、第１図の制限酵素切断地図で表わされるも
のである。The vector pTK2 for expressing a foreign gene fragment according to the second invention of the present invention has a size of 10.6 Kb in the vector for expressing a foreign gene fragment according to the first invention, and contains the replication initiation region of plasmid pBR322 and the antibiotic. The resistance gene is an ampicillin resistance gene, and the restriction enzyme site of the polylinker portion is BbeI (Narr).
,Bgll %PstI %5trraI, Bam
HI, and is represented by the restriction enzyme cleavage map shown in FIG.
本発明の第３発明に係る外来遺伝子断片発現用ベクター
ｐＴＫ３では、前記第１発明に記載の外来遺伝子断片発
現用ベクターにおいて、サイズが６、ＩＫｂで、プラス
ミドｐＢＲ３２２の複製開始領域と、前記抗生物質耐性
遺伝子がアンピシリン耐性遺伝子であり、前記ポリリン
カー部分の制限酵素部位がＢｂｅＩ （Ｎａｒｒ ）、
Ｂｇｌｌｌ 、Ｐｓｔｌ 、５ｔｓａｌ 、 ＢａｍＨ
Ｉであり、第２図の制限酵素切断地図で表わされるもの
である。The vector pTK3 for expressing a foreign gene fragment according to the third invention of the present invention is the vector for expressing a foreign gene fragment according to the first invention, which has a size of 6, IKb, and contains the replication initiation region of plasmid pBR322 and the antibiotic. The resistance gene is an ampicillin resistance gene, and the restriction enzyme site of the polylinker portion is BbeI (Narr),
Bgll, Pstl, 5tsal, BamH
I, and is represented by the restriction enzyme cleavage map shown in FIG.
本発明の′ｓ４発明に係る外来遺伝子断片発現用ベクタ
ーｐＴＫ４では、前記第１発明に記載の外来遺伝子断片
発現用ベクターにおいて、サイズが６、ＩＫｂで、プラ
スミドｐＢＲ３２２の複製開始領域と、前記抗生物質耐
性遺伝子がアンピシリン耐性遺伝子であり、前記ポリリ
ンカー部分の制限酵素部位がＢｂｅＩ（Ｎａｒｌ ）、
Ｂｇｌ ＩＩ 、 Ｐｓｔ Ｉ ％５ｔｓａ Ｉ、８ａ
ａ＋ｆＨであり、第３図の制限酵素切断地図で表わされ
るものである。The vector pTK4 for expressing a foreign gene fragment according to the 's4 invention of the present invention is the vector for expressing a foreign gene fragment according to the first invention, which has a size of 6, IKb, and contains the replication initiation region of plasmid pBR322 and the antibiotic. The resistance gene is an ampicillin resistance gene, and the restriction enzyme site of the polylinker portion is BbeI (Narl),
Bgl II, Pst I%5tsa I, 8a
a+fH, which is represented by the restriction enzyme cleavage map in FIG.
・本発明の第５発明に係る外来遺伝子断片発現用ベクタ
ーｐＴＫ５では、前記第１発明に記載の外来遺伝子断片
発現用ベクターにおいて、−サイズが６．１にｂで、プ
ラスミドｐＢＲ３２２の複製開始領域と、前記抗生物質
耐性遺伝子がアンピシリン耐性遺伝子であり、前記ポリ
リンカー部分の制限酵素部位がａｂｅ Ｉ （Ｎａｒ
Ｉ ）、Ｂｇｌ ＩＩ 、 Ｓａｌ Ｉ 、旧ｎｄ Ｉ
ＩＩ、ＰｓｔＩ、Ｓｅａ ＩおよびＢａｍ［であり、第
４図の制限酵素切断地図で表わされるものである。- In the vector for expressing a foreign gene fragment according to the fifth invention of the present invention, pTK5, in the vector for expressing a foreign gene fragment according to the first invention, the - size is 6.1 b and the replication initiation region of plasmid pBR322. , the antibiotic resistance gene is an ampicillin resistance gene, and the restriction enzyme site of the polylinker portion is abe I (Nar
I), Bgl II, Sal I, old nd I
II, PstI, Sea I and Bam[, which are represented by the restriction enzyme cleavage map in FIG.
［作用］
大腸菌における蛋白質生産の効率の差は、遺伝子産物の
生産に影響している。このような遺伝子産物の生産に影
響する諸刃子は、
（１）転写の制御領域（オペレーター）とプロモー夕領
域及び転写終結配列の構造
（２）シャイン・ダルガルノ配列（ＳＤ配列）を含むリ
ポソーム認識の構造
（３）アミノ酸を規定するコドンの使用頻度（４）蛋白
質の分泌などの局在化（分解からの保護）の問題
（５）遺伝子の量（コピー数）の問題
であり、特にプロモーターの強さを決めているのは、次
の因子がある。[Effect] Differences in protein production efficiency in E. coli affect the production of gene products. The factors that affect the production of such gene products are: (1) the structure of the transcription control region (operator), promoter region, and transcription termination sequence; (2) the structure of liposome recognition containing the Shine-Dalgarno sequence (SD sequence); Structure (3) Frequency of use of codons that define amino acids (4) Localization (protection from degradation) such as protein secretion (5) Gene quantity (copy number), especially promoter strength The following factors determine the
■ コンセンサス配列との相同性
■ ブリブナウ配列（−１０領域）と −３５領域との
距１１ｉ （１７ｂｐが最もよいとされている。）■
プロモーター近辺の配列のＡＴ含量また、リポソーム認
識の構造を詳しく付言するならば、ｍＲＮＡをテンプレ
ートとして翻訳が行われるにはｍＲＮＡと ３０ｓリボ
ゾームの１６ｓ ｒＲＮ＾の３°末端の適切な結合が必
要とされる。これを規定するのがシャイン・ダルガルノ
配列（ＳＤ配列）であり、１６ｓ ｒＲＮへの３゛末端
付近と相補性を持つ配列で、大腸菌の場合そのコンセン
サス配列は、５゛・・・＾ＧＧＡＧＧ・・・３゜
がこれに相当し、翻訳開始コドンＡｔ１Ｇの５〜１０塩
基上流に見出され、通常３〜５塩基の相同性を示す。■ Homology with the consensus sequence ■ Distance 11i between the Blibnow sequence (-10 region) and -35 region (17 bp is considered the best) ■
AT content of the sequence near the promoter Also, to explain the structure of liposome recognition in detail, translation using mRNA as a template requires appropriate binding between the mRNA and the 3° end of the 16s rRN^ of the 30s ribosome. Ru. This is defined by the Shine-Dalgarno sequence (SD sequence), which is complementary to the 3' end of the 16s rRN, and in the case of E. coli, the consensus sequence is 5'...^GGAGG... -3° corresponds to this, and is found 5 to 10 bases upstream of the translation initiation codon At1G, and usually shows 3 to 5 bases of homology.
本発明による外来遺伝子断片発現用ベクターでは、プラ
スミドｐＤＲ５４０由来のトリプトファン・プロモータ
ーとｔａｃｕｖｓプロモーターからなる合成プロモータ
である ｔａｃプロモーター部分（Ｐｔａｃ）と、プラ
スミドｐＤＲ５４０由来の大腸菌ガラクトキナーゼ構造
遺伝子５゛末端部分（ｇａｌに°）と、１もしくは複数
の制限酵素部位を有するポリリンカー部分と、プラスミ
ドｐＭＣ１４０３由来の大腸菌５°末端欠落β−ガラク
トシダーゼ構造遺伝子部分（′ｌａｃＺ）とを複製方向
に沿って順に配置したものであるため、外来遺伝子断片
を挿入しＩ ＰＴＧで抑制解除した場合、高い発現率で
融合蛋白の産生が期待できる。The vector for expressing a foreign gene fragment according to the present invention contains a tac promoter portion (Ptac), which is a synthetic promoter consisting of a tryptophan promoter and a tacuvs promoter derived from plasmid pDR540, and a 5' terminal portion (gal) of the E. coli galactokinase structural gene derived from plasmid pDR540. ), a polylinker portion having one or more restriction enzyme sites, and an E. coli 5° end-missing β-galactosidase structural gene portion ('lacZ) derived from plasmid pMC1403 are arranged in order along the replication direction. Therefore, when a foreign gene fragment is inserted and the repression is released with IPTG, production of a fusion protein with a high expression rate can be expected.
更に付言するならば、本発明に使用された ｔａｃプロ
モーター（Ｐｔａｃ）は、 ｔｒｐプロモーターの一３
５領域とｌａｃＵＶ５プロモーターの −１０領域（Ｐ
ｒｉｂｎｏｗｂｏｘ）からなる雑種プロモータで、１ａ
ｃＰ（野生型ラクトース・プロモーター）に比べてｌａ
ｃＵＶ５ （ｌａｃＰの変異したもの）は約１０倍、
ｔａｃプロモーターは、約５０倍活性が強い。Furthermore, the tac promoter (Ptac) used in the present invention is one of the trp promoters.
5 region and -10 region of lacUV5 promoter (P
ribnowbox), a hybrid promoter consisting of 1a
la compared to cP (wild type lactose promoter)
cUV5 (mutated version of lacP) is about 10 times
The tac promoter is about 50 times more active.
また、本発明に使用された蛋白の翻訳開始シグナルとし
て、ｇａｌに翻訳開始シグナルを含む大腸菌ガラクトキ
ナーゼ構造遺伝子５°末端部分（ｇａｌＫ’）は、
ＣＧＧＡＧ・・・９塩基・・・＾ＴＧ
であり、大腸菌のＳＤ配列のコンセンサス配列に相同性
を有する。Furthermore, as a translation initiation signal for the protein used in the present invention, the 5° terminal portion of the E. coli galactokinase structural gene (galK') containing a translation initiation signal in gal is CGGAG...9 bases...^TG. , has homology to the consensus sequence of the E. coli SD sequence.
さらに、外来性の遺伝子断片を大腸菌中で融合蛋白の一
部として発現させる有用なベクターの特質には、
■ 外来性遺伝子断片をクローニングする外来遺伝子発
現用ベクターに多様なりローニング部位（制限酵素切断
部位）があること
■ 宿主細菌に導入した際に、形質転換を行う選択マー
カとしての薬剤耐性遺伝子があること■ 分子サイズが
小さくコピー数が多いこと■ プロモータ活性の制御が
厳密に行われること等があり、具体的には本発明の別な
発明の外来遺伝子断片発現用ベクターｐＴＫ２．ｐＴＫ
３．ｐＴＫ４．ｐＴＫ５が前記の特質を有する有用な外
来遺伝子断片発現用ベクターとなっている。Furthermore, the characteristics of useful vectors for expressing foreign gene fragments as part of a fusion protein in E. coli include: ① The foreign gene expression vector for cloning foreign gene fragments has a variety of cloning sites (restriction enzyme cleavage sites). ).■ The presence of a drug resistance gene as a selection marker for transformation when introduced into a host bacterium.■ The molecular size is small and the number of copies is large.■ The promoter activity must be strictly controlled. Specifically, there is a foreign gene fragment expression vector pTK2. of another invention of the present invention. pTK
3. pTK4. pTK5 has the above-mentioned characteristics and has become a useful vector for expressing foreign gene fragments.
外来遺伝子断片を融合蛋白として大腸菌で発現させるた
めには、該遺伝子断片を、転写および翻訳開始４８号の
下流部分に正確に挿入しなければならない。In order to express a foreign gene fragment as a fusion protein in E. coli, the gene fragment must be accurately inserted downstream of transcription and translation initiation No. 48.
また、これらの外来遺伝子断片発現用ベクターは、 １
ａｃＺ遺伝子の読み枠は、アミノ末端部分をコードする
遺伝子の読み枠とずれており、そのままでは大腸菌内で
活性なβ−ガラクトシダーゼを産生できなくなっており
、このような外来遺伝子断片発現用ベクターのクローニ
ング部位に適当な長さの外来遺伝子断片を挿入し、 １
ａｃＺの読み枠を５゛末端遺伝子の読み枠と正確に合致
させてやると、β−ガラクトシダーゼ活性を持つ融合蛋
白が産生されるようになる。In addition, these vectors for expressing foreign gene fragments are: 1
The reading frame of the acZ gene is misaligned with the reading frame of the gene encoding the amino-terminal portion, and active β-galactosidase cannot be produced in E. coli as it is, so cloning of such a vector for expressing a foreign gene fragment is difficult. Insert a foreign gene fragment of an appropriate length into the site, 1
When the reading frame of acZ is precisely aligned with the reading frame of the 5' end gene, a fusion protein with β-galactosidase activity will be produced.
活性なβ−ガラクトシダーゼを産生ずるコロニ−は、５
−ブロモー４−クロル−３−インドリル−β−Ｄ−ガラ
クトシド（Ｘ−ｇａｌ）を含むＭＢ２−グルコース培地
（Ｉ ＰＴＧの存在下）上で濃青色のコロニーとして容
易に検出される。Colonies producing active β-galactosidase are 5
It is easily detected as dark blue colonies on MB2-glucose medium (in the presence of IPTG) containing -bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside (X-gal).
また、本発明の外来遺伝子断片発現用ベクターｐＴＫ２
．ｐＴＫ５については、徴工研菌寄第１０６２２号、徴
工研菌寄第１０６２３号として既に寄託されており、本
発明の他の外来遺伝子断片発現用ベクターであるｐＴＫ
３．ｐＴＫ４については、ｐＴＫ２を使って本実施例に
開示されている操作により、またｐＴｋ５を使って本実
施例に開示されている逆の操作により得られるため、菌
の寄託の必要性は認められなかった。In addition, vector pTK2 for expressing a foreign gene fragment of the present invention
．． Regarding pTK5, it has already been deposited as JKK Deposit No. 10622 and JKK Deposit No. 10623, and pTK5 is another vector for expressing a foreign gene fragment of the present invention.
3. As for pTK4, it can be obtained by the operation disclosed in this example using pTK2, and by the reverse operation disclosed in this example using pTk5, so there is no need to deposit the bacteria. Ta.
［実施例］
本発明による一連の外来遺伝子断片発現用ベクターの作
成方法を以下に述べる。[Example] A method for creating a series of vectors for expressing foreign gene fragments according to the present invention will be described below.
宿主菌としては、大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉに−１２ＪＭ１０
３株（△１ａｃ−ｐｒｏ、ｔｈｉ、５ｔｒＡ、５ｕｐＥ
、ｅｎｄ＾、５ｂｃＢ、ｈｓｄＲ−、Ｆ。As host bacteria, Escherichia coli E, coli -12JM10
3 strains (Δ1ac-pro, thi, 5trA, 5upE
, end^, 5bcB, hsdR-, F.
ｔｒａＤ３６．ｐｒｏＡＢ、１ａｃｌｑ、Ｚ△Ｍ１５）
を用いた。traD36. proAB, 1aclq, Z△M15)
was used.
ＪＭＩ ０３株および外来遺伝子断片を挿入したプラス
ミドベクターを持つＪＭ１０３株はＬＢ培地（バクト・
トリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製） １０ｇ 、酵母エキス
（Ｄｉｆｃｏ社製） ５ｇ、塩化ナトリウム １０ｇ、
水ｌＩ１．、ｐｉ（７，５）またはＬＢ寒天平板上で必
要に応じアンピシリン（以下、Ａｐと記す）（明治製菓
社製）５０ｇｇ／ｍｌを加え、培養した。The JMI 03 strain and the JM103 strain, which has a plasmid vector into which a foreign gene fragment has been inserted, are grown in LB medium (Bact.
Tryptone (manufactured by Difco) 10g, yeast extract (manufactured by Difco) 5g, sodium chloride 10g,
Water lI1. , pi(7,5), or LB agar plates, 50 gg/ml of ampicillin (hereinafter referred to as Ap) (manufactured by Meiji Seika Co., Ltd.) was added as needed, and cultured.
β−ガラクトシダーゼ活性を有するクローンは、平板ま
たはＡｐおよび５−ブロモ−４−クロル−３−インドリ
ル−β−Ｄ−ガラクトシド（４０ｇｇ／＋１．以下、Ｘ
−ｇａｌと略す）（シグマ社製）及び１ｍＭＩＰＴＧを
含むＭＢ２−グルコース寒天平板培地上（にＨ２ＰＯ４
１３，６ｇ、 （ＮＨ４）２ｓｏ４２．Ｏｇ、 ０．５
ｋＦａＳＯ４”７８２００．１ｍｌ、 １ＭＭｇ５Ｏ４
４Ｈ２０１，０＋１１１．２０Ｘｇｌｕｃｏｓｅ １０
ａｌ、 ０．１９ｇｔｈｉａｍｉｎａ １．Ｏｍｌ、
Ｈ２Ｏにて１ｕ 、８Ｎ ＭｏｌにてｐＨ７，０，Ｂａ
ｔｏａｇａｒ１５ｇ）で培養し、濃青色を呈するコロニ
ーとして選択した。Clones with β-galactosidase activity were isolated from the plate or Ap and 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside (40 mg/+1.
H2PO4 on MB2-glucose agar plate medium containing 1mM IPTG
13.6g, (NH4)2so42. Og, 0.5
kFaSO4”78200.1ml, 1MMg5O4
4H201,0+111.20Xglucose 10
al, 0.19gthiamina 1. Oml,
1u in H2O, pH 7.0 in 8N Mol, Ba
toagar 15g) and selected as a colony exhibiting a deep blue color.
β−ガラクトシダーゼの誘導は培地に１ｍＭＩＰＴＧ（
イソプロとルチオーβ−Ｄ−ガラクトシド）（シグマ社
）を添加して行った。β-galactosidase was induced by adding 1mM IPTG (
The reaction was carried out by adding isopro and ruthiol β-D-galactoside (Sigma).
制限酵素は宝酒造株式会社および東洋紡株式会社より入
手した。Restriction enzymes were obtained from Takara Shuzo Co., Ltd. and Toyobo Co., Ltd.
Ｅ、ｃｏｌｉ ＤＮＡ ポリメラーゼＩ Ｋｌｅｎｏ
ｗフラグメント（以下、 Ｐｏ１ＩＫと記す）Ｔ４ＤＮ
＾リガーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼおよびＴ４ポリ
ヌクレオチド・キナーゼは東洋紡株式会社から入手した
。E. coli DNA polymerase I Kleno
w fragment (hereinafter referred to as Po1IK) T4DN
^Ligase, T4 DNA polymerase, and T4 polynucleotide kinase were obtained from Toyobo Co., Ltd.
ＯＮへの切断、修飾、分離、回収などは、ア・ラボラト
リ−・マニュアルの方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、、ｅ
ｔａｌ、、 （１９８２） 、Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａ
ｒｇｅλ、 ｉｎ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣＩｏｎｉｎｇ
、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、 Ｃｏ１
ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ） に準じて行った。Cleavage, modification, separation, recovery, etc. to ON are performed according to the laboratory manual method (Maniatis, T., e.g.
tal, (1982), Bacteriopha
rgeλ, in Molecular CIoning
, A Laboratory Manual, Co1
d Spring Harbor Laboratory
, New York).
プラスミド［）ＮＡはアルカリ溶菌法で調製し、臭化エ
チジウムを含む塩化セシウム密度勾配遠心によって精製
した。Plasmid [)NA was prepared by alkaline lysis and purified by cesium chloride density gradient centrifugation containing ethidium bromide.
クローニング部位を含む合成オリゴヌクレオチドリンカ
ーはＤＮＡ合成装置（アプライド・バイオシステム（Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔａｍｓ）社）を用い、フ
ォスフオールアミダイト法（Ｈｅｒｏｎ、Ｅ、Ｊ、、
（１９８４）Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ａｕｔｏｍａｔｅ
ｄ ＤＮＡ ５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、ＡＩ。Synthetic oligonucleotide linkers containing cloning sites were prepared using a DNA synthesizer (Applied Biosystems).
Biosystems) using the phosphoramidite method (Heron, E., J.,
(1984) System for automation
d DNA 5ynthesis, AI.
Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｌａｂ、５ｅｐｔｅａ＋ｂｅｒ）で合
成した。Synthesized by Biotech, Lab, 5eptea+ber).
実施例１
本発明に係る一連の外来遺伝子断片発現ベクターは第５
図に示す方法に従って作成した。Example 1 A series of foreign gene fragment expression vectors according to the present invention
It was created according to the method shown in the figure.
まず、ｔａｃプロモーター １ａｃオペレーターおよび
シャインーダルガルノ配列（以下、ＳＤ配列と記す）を
含むガラクトキナーゼ遺伝子（以下、ｇａｌＫと記す）
の５°末末端上流列、を有するプラスミドＰＤＲ５４０
（東洋紡■製）（１ｕｇ）を用い、そのｇａｌＫ遺伝子
のヌクレオチド番号７２〜７７にある唯一のＢｂｅＩ
（Ｎａｒｌ ）切断部位で切断した。生じた３°突出末
端をｔ４ ＩＩＮＡポリメラーゼで消化し、更に５°末
端を子牛小腸アルカリフォスファターゼで脱リン酸化し
た。First, the galactokinase gene (hereinafter referred to as galK) containing the tac promoter 1ac operator and Shine-Dalgarno sequence (hereinafter referred to as SD sequence)
Plasmid PDR540 with the 5° terminal upstream sequence of
(manufactured by Toyobo ■) (1ug), the unique BbeI located at nucleotide numbers 72 to 77 of the galK gene was used.
(Narl) Cleaved at the cleavage site. The resulting 3° overhang was digested with t4 IINA polymerase, and the 5° end was further dephosphorylated with calf small intestine alkaline phosphatase.
この直鎖状のｐＤＲ５４０に挿入されたときにＢｂｅＩ
（Ｍａｒｌ ）部位が再生され、かつそれに隣接して
Ｂａ１ｌ、ＰｓｔｌおよびＳｍａＩ部位を有するように
設計された塩基配列を持っ２３−ｍａｒ合成ポリリンカ
ー（５−ＧＣＧＣ（：ＡＧＡＴＣＴＣＴＧＣＡＧＣＣＣ
ＧＧＧ ）を合成し、これをＴ４ポリヌクレオチド・キ
ナーゼで５゛末端をリン酸化したもの（２５０ｎｇ）を
、Ｔ４リガーゼを用いて先の直鎮状のｐ Ｄ Ｒ５４０
（２５０Ｂ）に挿入した。When inserted into this linear pDR540, BbeI
A 23-mar synthetic polylinker (5-GCGC (: AGATCTCTGCAGCCC
GGG) was synthesized and phosphorylated at the 5' end with T4 polynucleotide kinase (250 ng), which was then converted into the straight pDR540 using T4 ligase.
(250B).
これをＪＭ１０３株に形質転換し、Ａｐを含むＬＢ寒天
平板上に生じるコロニーについて、そのプラスミドを適
当な制限酵素を用いて分析し、 ｇａｌＫ遺伝子の５°
末端に近接してＢｂｅＩ （Ｎａｒｌ ）部位を再生し
ているプラスミドを得てｐＴＫ １とした。This was transformed into the JM103 strain, and the colonies generated on the Ap-containing LB agar plate were analyzed for the plasmid using an appropriate restriction enzyme.
A plasmid with a restored BbeI (Narl) site proximal to the end was obtained and designated pTK1.
このｐＴＫｌ （５μｇ）をＥｃｏＲＩと Ｓｍａ Ｉ
で切断し、大きさ０．７にｂの、ｔａｃプロモーター
１ａｃオペレーター ｇａｌＫ遺伝子のＳＤ配列とアミ
ノ末端の２４個のアミノ酸をコードする配列（ｇａｌＫ
’遺伝子）および制限酵素部位（ＢｂｅＩ （Ｎａｒｌ
）。This pTKl (5 μg) was mixed with EcoRI and SmaI.
The tac promoter was cut with b to size 0.7.
1ac operator SD sequence of galK gene and sequence encoding the amino terminal 24 amino acids (galK
' gene) and restriction enzyme site (BbeI (Narl
).
８ｇ目＋ 、Ｐｓｔｌ 、ＳｍａＩ ）を含むポリリン
カーを有するＤＮＡ断片を、１％低融点アガロースゲル
電気泳動によって分ｍ精製した。A DNA fragment having a polylinker containing 8g+, Pstl, SmaI) was fractionally purified by 1% low melting point agarose gel electrophoresis.
一方、アミノ末端８個のアミノ酸を欠失した’ ｌａｃ
Ｚ遺伝子とそのすぐ５′末端上流にＥｃｏＲＩ、Ｓｍ
ａ ＩおよびＢａｍ）ＩＩ部位を持つＰＭＣ１４０３（
Ｃａｓａｄａｂａｎｍ、Ｍ、Ｊ、 ら、Ｊ、 Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ、、１４３．９７１−９８０、１９８０
東大応微研所有）（ｔμｇ）をＥｃｏＲＩＳｍａ Ｉ
で切断し、子牛小腸フォスファターゼで脱リン酸化した
。これにｐＴＫｌの０．７にｂ ＥｃｏＲＩ−Ｓｍａ
Ｉ断片（２５０ｎｇ）をＴ４リガーゼを用いて挿入し、
これをＪＭ１０３株に形質転換し、ＡｐおよびＸ−ｇａ
ｌを含むＭＢ２−グルコース寒天平板上に生じるコロニ
ーを得た。これらのクローンからプラスミドを調製し、
ポリリンカーの有する制限酵素部位をすべて持つプラス
ミドをｐＴに２とした。第１図は得られたプラスミドｐ
ＴＫ２の制限酵素切断地図である。On the other hand, 'lac' with the amino terminal eight amino acids deleted
EcoRI and Sm immediately upstream of the Z gene and its 5′ end
a PMC1403 (with I and Bam) II sites (
Casadabanm, M. J. et al., J. Bac.
teriol, 143.971-980, 1980
owned by the University of Tokyo) (tμg) as EcoRISma I
and dephosphorylated with calf intestinal phosphatase. To this, 0.7 of pTKl was added to b EcoRI-Sma
I fragment (250 ng) was inserted using T4 ligase,
This was transformed into JM103 strain, Ap and X-ga
Colonies were obtained that developed on MB2-glucose agar plates containing l. Prepare plasmids from these clones,
A plasmid containing all the restriction enzyme sites of the polylinker was designated as pT2. Figure 1 shows the obtained plasmid p
This is a restriction enzyme cleavage map of TK2.
この外来遺伝子断片発現用ベクターでは°ｌａｃ Ｚ遺
伝子はアミノ末端をコードするｇａｌＫ’遺伝子の読み
枠とは、ポリリンカーの介在によフてずれており、この
雑種遺伝子は表現形としては １ａｃＺ−である。In this foreign gene fragment expression vector, the °lacZ gene is shifted from the reading frame of the galK' gene encoding the amino terminus due to the intervention of a polylinker, and this hybrid gene has a phenotype of 1acZ-. be.
この外来遺伝子断片発現用ベクターｐＴＫ２は大きさが
１０．８Ｋｂであり、 ｇａｌＫ’遺伝子と°ｌａｃ
Ｚ遺伝子との間に、５゛側から ＢｂｅＩ （Ｎａｒｌ
）、 ＢｇｌＩＩ、Ｐｓｔｒ 、ＳｍａｌおよびＢａ
ｍＨ１部位があり、このうちＢｇｌＩＩおよびＳｍａ１
部位は唯一の制限酵素のサイトであるので、外来遺伝子
断片発現用ベクターのクローニングに用いることができ
る。This foreign gene fragment expression vector pTK2 has a size of 10.8 Kb and contains galK' gene and °lac
BbeI (Narl) from the 5゛ side between the Z gene and
), BglII, Pstr, Small and Ba
There is an mH1 site, of which BglII and Sma1
Since this site is the only restriction enzyme site, it can be used for cloning a vector for expressing a foreign gene fragment.
実施例２
つぎに、更により有用な外来遺伝子断片発現用ベクター
を作成するために、ｐＴＫ２の改良を第６図に示す方法
に従って以下のように行った。Example 2 Next, in order to create an even more useful foreign gene fragment expression vector, pTK2 was improved as follows according to the method shown in FIG.
ＰＴＫ２ （５μｇ）をＥｃｏＲｒ、口ｒａＩおよび５
ａｌｌによフて切断し、０．８％低融点アガロースゲル
電気泳動によって、最大のＥｃｏＲＩ −Ｄｒａ Ｉ断
片を分離精製した。PTK2 (5 μg) was combined with EcoRr, raI and 5
The largest EcoRI-Dra I fragment was separated and purified by 0.8% low melting point agarose gel electrophoresis.
この断片は大きさが３．８Ｋｂであり、ｔａｃプロモー
ター、Ｉａｃオペレーター ｇａｌＫ遺伝子のＳＤ配列
およびアミノ末端（ｇａｌＫ’遺伝子）、クローニング
部位を含むポリリンカー部分、′ｌａｃＺ遺伝子および
１ａｃＹ遺伝子のアミノ末端部分（１ａｃＹ’遺伝子）
を含んでいる。This fragment is 3.8 Kb in size and contains the tac promoter, the Iac operator, the SD sequence and amino terminus of the galK gene (galK' gene), the polylinker portion containing the cloning site, the amino terminal part of the 'lacZ gene and the 1acY gene ( 1acY' gene)
Contains.
一方、ｐＢＲ３２２のＡＰ遺伝子上のＰｓｔｆ部位を除
くために、以下の操作を行った。すなわち、ｐＢＲ３２
２を ＢｇｌｌおよびＰｖｕｌｌで処理して得た断片と
、ＰｓｔＩ部位を欠いたＡｐ遺伝子を有するプラスミド
ＰＫＫＩ ７７−３ （西ドイツＦｒｅｉｂｕｒｇ大学
Ｂ、Ｒａｋ氏より入手）をＢｇｌ Ｉおよびｐｖｕｌｌ
で処理して得た断片（２５３ｂｐ） とからＰｓｔ１
部位を欠いたｐＢＲ３２２△Ｐｓｔｌを得た。On the other hand, in order to remove the Pstf site on the AP gene of pBR322, the following operation was performed. That is, pBR32
The fragment obtained by treating 2 with Bgll and Pvull and the plasmid PKKI 77-3 (obtained from Mr. Rak, Freiburg University B, West Germany) containing the Ap gene lacking the PstI site were treated with Bgl I and pvull.
Pst1 from the fragment (253 bp) obtained by processing with
pBR322ΔPstl lacking the site was obtained.
このｐＢＲ３２２ΔＰｓｔｌ （５μｇ）をＥｃｏＲＩ
と ｐｖｕｌｌで切断し、０．８％低融点アガロースゲ
ル電気泳動によって分離精製し、Ａｐ遺伝子と複製開始
点を含む大きさ２．３にｂのＤＮＡ断片を得た。This pBR322ΔPstl (5 μg) was added to EcoRI
and pvull, and was separated and purified by 0.8% low melting point agarose gel electrophoresis to obtain a DNA fragment of size 2.3 and b containing the Ap gene and the replication origin.
ｐＴＫ２由来の３．８にｂ Ｅｃｏ−ＲＩ 、−Ｄｒａ
Ｉ ＤＮＡ断片（２５０ｎｇ）とｐＢＲ３２２誘導
体（ｐＢＲ３２２△ＰｓｔＢ由来の２．３にｂ ＤＮＡ
断片（２５Ｑｎｇ）をＴ４リガーゼを用いて環状化し、
これをＪＭ１０３株に形質転換し、ＡｐおよびＸ−ｇａ
ｌを含むＭＢ２−グルコース寒天平板上に生じる白色コ
ロニーを得た。これらのクローンからプラスミドを調製
し、制限酵素を用いて分析し、求めるクローンを得、こ
れをｐＴＫ３とした。第２図は得られたプラスミドｐＴ
Ｋ３の制限酵素切断地図である。b Eco-RI, -Dra in 3.8 from pTK2
I DNA fragment (250 ng) and pBR322 derivative (2.3 b DNA derived from pBR322ΔPstB)
The fragment (25Qng) was circularized using T4 ligase,
This was transformed into JM103 strain, Ap and X-ga
White colonies were obtained that formed on MB2-glucose agar plates containing l. Plasmids were prepared from these clones and analyzed using restriction enzymes to obtain the desired clone, which was named pTK3. Figure 2 shows the resulting plasmid pT.
This is a restriction enzyme cleavage map of K3.
このｐＴＫ３上のＥｃｏＲ１部位とｔａｃプｏモーター
の間にある単一のＨｉｎｄｍ部位を除去するために、ｐ
ＴＫ３（ｌμｇ）を）Ｉ ｌ ｎ ｄ ＩＩＩで切断し
、 Ｐｏ１ＩＫを用いて５“突出末端を２重鎮とし、平
滑末端としたのち、再びＴ４ＤＮ＾リガーゼで環状化し
た。これをＪＭ１０３株に形質転換し、ＡｐおよびＸ−
ｇａｌを含むＭ２Ｓ−グルコース寒天平板上に生じる。To remove the single Hindm site between the EcoR1 site and the tac promoter on pTK3, we
TK3 (lμg) was cut with ) I l n d III, the 5" protruding end was made into a double block using Po1IK, and the end was made blunt, and then circularized again with T4DN^ ligase. This was transformed into JM103 strain. , Ap and X-
Generate on M2S-glucose agar plates containing gal.
コロニーを得た。求める旧ｎ ｄ １１１部位を欠いた
ものをｐＴＫ４とした。第３図は得られたプラスミドｐ
ＴＫ４の制限酵素切断地図である。Obtained a colony. The pTK4 lacking the desired old n d 111 site was designated as pTK4. Figure 3 shows the obtained plasmid p.
This is a restriction enzyme cleavage map of TK4.
このｐＴＫ４ （１μｇ ）をＢｇｌｌｌとＳｍａ Ｉ
で切断、直線化したのち、子牛小腸アルカリフォスター
ゼで脱リン酸化した。一方、十鎖２Ｂ−ｍａｒ、−鎖２
２−＋＋ｅｒからなる一本鎖部分を含む相補的な合成２
重鎖ポリリンカーを調製し、これをＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼで５°末端をリン酸化した。この合成ポリリ
ンカーは前述の直線化されたｐＴＫ４に挿入されると、
隣接して Ｂｇｌｌｌ 、 Ｓａｌ Ｉ ％Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ％ Ｐｓｔｆ、および５ｔｒａｒ部位を与えるよ
うに設計されている。このポリリンカー（２５０ｎｇ）
を直線状ｐ Ｔ Ｋ ４ （２５０ｎｇ）にＴ４［ＩＮ
Ａリガーゼを用いて挿入し、前述の方法に従って求める
プラスミドｐＴＫ５を得た。第４図は得られたプラスミ
ドｐＴＫ５の制限酵素切断地図である。This pTK4 (1 μg) was mixed with Bgll and Sma I.
After cutting and linearizing with , it was dephosphorylated with calf small intestine alkaline forsterase. On the other hand, ten-strand 2B-mar, -strand 2
Complementary synthesis 2 containing a single-stranded portion consisting of 2-++er
A heavy chain polylinker was prepared and phosphorylated at the 5° end with T4 polynucleotide kinase. When this synthetic polylinker is inserted into the previously described linearized pTK4,
Adjacent to Bgllll, Sal I% Hind
III% Pstf, and is designed to give 5 trar sites. This polylinker (250ng)
to linear p T K 4 (250 ng)
This was inserted using A ligase, and the desired plasmid pTK5 was obtained according to the method described above. FIG. 4 is a restriction enzyme cleavage map of the obtained plasmid pTK5.
このようにして得られた外来遺伝子断片発現用ベクター
ｐＴＫ５は大きさ６．１ｋｂで、 ｇａｌＫ’遺伝子と
°１ａｃＺ遺伝子の間に唯一のＢｂｅＩ （ＭａｒＩ
）、Ｂｇｌ ｆｌ 、 Ｓａｌ Ｅ 、旧ｎ、ｄ ＩＩ
Ｉ 、 Ｐｓ ｔ、ＩおよびＳｉａ １部位を持ち、こ
れらの部位に外来遺伝子断片をクローニングすることが
で幹る。The foreign gene fragment expression vector pTK5 thus obtained has a size of 6.1 kb, and has only one BbeI (MarI) between the galK' gene and the °1acZ gene.
), Bgl fl, Sal E, old n, d II
It has I, Pst, I, and Sia 1 sites, and foreign gene fragments can be cloned into these sites.
このようにして作成した一連の外来遺伝子断片発現用ベ
クターはｇａｌに′遺伝子と゛１ａｃＺ遺伝子との間に
３ｎ＋２個のヌクレオチドからなるポリリカーを有する
ので、これらのクローニング部位に３ｎ＋１個のヌクレ
オチドからなる外来遺伝子断片を挿入すれば、ｇａｌＫ
’遺伝子と゛１ａｃＺ遺伝子の読み枠が一致し、活性の
あるβ−ガラクトシダーゼ融合蛋白が産生される。The series of foreign gene fragment expression vectors created in this way have a polylinker consisting of 3n+2 nucleotides between the 'gal' gene and the '1acZ gene, so the foreign gene consisting of 3n+1 nucleotides is inserted into these cloning sites. If you insert the fragment, galK
The reading frames of the '1acZ gene and the '1acZ gene match, and an active β-galactosidase fusion protein is produced.
実施例３
前記実施例２で得られたｐＴＫ５ （１μｇ）をＳｍａ
ｌｌで切断し、２２−ａｅｒの合成オリゴニクレオチド
（２５０ｎｇ）をＴ４ＤＮ＾リガーゼを用いて挿入した
。得られたプラスミドをＪＭ１０３株に形質転換し、Ａ
ｐ、Ｘ−ｇａｌおよびＩ ＰＴＧを含むＭ２Ｓ−グルコ
ース寒天平板上に生じる濃青色のコロニーを選択した。Example 3 pTK5 (1 μg) obtained in Example 2 was transferred to Sma
A 22-aer synthetic oligonucleotide (250 ng) was inserted using T4DN^ ligase. The obtained plasmid was transformed into JM103 strain, and A
Dark blue colonies arising on M2S-glucose agar plates containing p, X-gal and IPTG were selected.
得られたβ−ガラクトシダーゼ活性を示すクーロンを、
Ａｐおよび１ｍＭＩＰＴＧを含むＬＢ培地で培養し、こ
れをレムリ（Ｌａｅｍａｌｉ、Ｕ。The obtained coulombs showing β-galactosidase activity were
It was cultured in LB medium containing Ap and 1mM IPTG, and this was grown using Laemli (Laemali, U.).
に、、Ｎａｔｕｒｅ、ｖｏｌ ２２７，６８０ （１９
７０））の方法に従フて１０％５ＤＳ−ポリアクリルア
ミド電気泳動により分析すると、β−ガラクトシダーゼ
融合蛋白が産生されていることが確認された。In,,Nature, vol 227,680 (19
Analysis by 10% 5DS-polyacrylamide electrophoresis according to the method of 70)) confirmed that the β-galactosidase fusion protein was produced.
［発明の効果］
本発明による外来遺伝子断片発現用ベクターでは、プラ
スミドｐＤＲ５４０由来のトリプトファン・プロモータ
ーとｌａｃＵＶ５プロモーターからなる合成プロそ一タ
である ｔａｃプロモーター部分（ＰｔａＣ）と、プラ
スミドｐＤＲ５４０由来の大腸菌ガラクトキナーゼ構造
遺伝子５′末端部分（ｇａｌに°）と、１もしくは複数
の制限酵素部位を有するポリリンカー部分と、プラスミ
ドｐＭＣ１４０３由来の大腸菌５°末端欠落β−ガラク
トシダーゼ構造遺伝子部分（’Ｊａｃｋ）とを複製方向
に沿って順に配置したものであるため、外来遺伝子断片
を挿入した場合高い発現率で融合蛋白の産生を期待でき
る。[Effects of the Invention] The vector for expressing a foreign gene fragment according to the present invention contains a tac promoter portion (PtaC), which is a synthetic promoter consisting of a tryptophan promoter derived from plasmid pDR540 and a lacUV5 promoter, and an Escherichia coli galactokinase derived from plasmid pDR540. The 5' end of the structural gene (° in gal), the polylinker part having one or more restriction enzyme sites, and the E. coli 5' end missing β-galactosidase structural gene part ('Jack) derived from plasmid pMC1403 were combined in the replication direction. Because they are arranged in order along the same lines, it can be expected that a fusion protein will be produced at a high expression rate when a foreign gene fragment is inserted.
更に付言するならば、本発明に使用された ｔａｃプロ
モーター部分（Ｐｔａｃ）は、 ｔｒｐプロモーターの
一３５領域とｌａｃＵＶ５プロモーターの ＝ｌＯ領域
（Ｐｒｉｂｎｏｗ ｂｏｘ）からなる雑種プロモーター
で、１ａｃＰ （野生型ラクトース・プロそ一ター）に
比べてＩａｃｌｌＶ５（１ａｃＰの変異したもの）は約
１０倍、 ｔａｃプロモーターは、約５０倍活性が強い
。In addition, the tac promoter portion (Ptac) used in the present invention is a hybrid promoter consisting of the 135 region of the trp promoter and the =1O region (Privnow box) of the lacUV5 promoter, and is a hybrid promoter consisting of the 135 region of the trp promoter and the IacllV5 (a mutated form of 1acP) is about 10 times more active than the 1acP promoter, and the tac promoter is about 50 times more active.
また、本発明において蛋白の翻訳開始シグナルとして使
用されたｇａｌに翻訳開始シグナルを含む大腸菌ガラク
トキナーゼ構造遺伝子５°末端部分（ｇａｌＫ’）は、
ＣＧＧＡＧ・・・９塩基・・・ＡＴＧ
の配列をもち、そのＳＤ配列は大腸菌ＳＤのコンセンサ
ス配列に近似しており、外来遺伝子を挿入した場合、効
率よく融合蛋白が発現することが期待でき、該融合蛋白
により抗原の大量生産が可能となる等の効果が期待でき
る。Furthermore, the 5° end portion (galK') of the E. coli galactokinase structural gene containing a translation initiation signal in gal, which was used as a protein translation initiation signal in the present invention, has a sequence of CGGAG...9 bases...ATG. , the SD sequence is close to the consensus sequence of E. coli SD, and when a foreign gene is inserted, the fusion protein can be expected to be expressed efficiently, and the fusion protein has effects such as making it possible to mass produce antigens. can be expected.
さらに、外来性の遺伝子断片を大腸菌中で融合蛋白の一
部として発現させる有用なベクターの特質として、外来
性遺伝子断片をクローニングする外来遺伝子発現用ベク
ターに多様なマルチクローニング部位があり、また宿主
細菌に導入した際に、形質転換を行う選択マーカとして
のＡｐ耐性遺伝子がある本発明の別な発明の外来遺伝子
断片発現用ベクターｐＴＫ２．ＰＴＫ３．ｐＴＫ４゜ｐ
ＴＫ５は、実用性の高い有用な外来遺伝子断片発現用ベ
クターである。Furthermore, useful vectors for expressing foreign gene fragments as part of a fusion protein in E. coli include the fact that foreign gene expression vectors for cloning foreign gene fragments have various multi-cloning sites; The foreign gene fragment expression vector pTK2 of another invention of the present invention has an Ap resistance gene as a selection marker for transformation when introduced into a vector pTK2. PTK3. pTK4゜p
TK5 is a highly practical and useful vector for expressing foreign gene fragments.
伝子断片発現ベクターｐＴＫ４の制限酵素切断地図、第
４図は本発明による外来遺伝子断片発現ベクターｐＴＫ
５の制限酵素切断地図、第５図は本発明による外来遺伝
子断片発現ベクターの作成方法を示す説明図、第６図は
本発明による他の外来遺伝子断片発現ベクターの作成方
法を示す説明図である。Restriction enzyme cleavage map of the gene fragment expression vector pTK4, Figure 4 shows the foreign gene fragment expression vector pTK according to the present invention.
FIG. 5 is an explanatory diagram showing a method for creating a foreign gene fragment expression vector according to the present invention, and FIG. 6 is an explanatory diagram showing a method for creating another foreign gene fragment expression vector according to the present invention. .
代理人 弁理士 佐 藤 正 年Agent: Patent Attorney Tadashi Sato
第１図は本発明による外来遺伝子断片発現ベクターｐＴ
Ｋ２の制限酵素切断地図、第２図は本発明による外来遺
伝子断片発現ベクターｐ”ｒに３の制限酵素切断地図、
第３図は本発明による外来遺第４図Figure 1 shows the foreign gene fragment expression vector pT according to the present invention.
K2 restriction enzyme cleavage map, Figure 2 shows the restriction enzyme cleavage map of 3 for the foreign gene fragment expression vector p"r according to the present invention,
Fig. 3 is a foreign archaeological site according to the present invention Fig. 4
Claims (5)
菌に抗生物質耐性を付与する抗生物質耐性遺伝子領域と
、酵素蛋白合成制御を調節するオペロンと、該オペロン
内に配置された外来遺伝子を挿入するポリリンカー部分
とを有し、外来遺伝子挿入を前記酵素活性により判別す
るベクターにおいて、 プラスミドｐＤＲ５４０由来のトリプトファン・プロモ
ーターとｌａｃＵＶ５プロモーターからなる合成プロモ
ータであるｔａｃプロモーター部分（Ｐｔａｃ）と、 プラスミドｐＤＲ５４０由来の大腸菌ガラクトキナーゼ
構造遺伝子５′末端部分（ｇａｌＫ′）と、１もしくは
複数の制限酵素部位を有する前記ポリリンカー部分と、 プラスミドｐＭＣ１４０３由来の大腸菌５′末端欠落β
−ガラクトシダーゼ構造遺伝子部分（′ｌａｃＺ）とが
複製方向に沿って順に配置されたことを特徴とする外来
遺伝子断片発現用ベクター。(1) A replication initiation region that can be expressed within the host bacterium, an antibiotic resistance gene region that confers antibiotic resistance to the host bacterium, an operon that regulates enzyme protein synthesis control, and a foreign gene located within the operon. The vector has a polylinker portion for inserting a plasmid pDR540, and the insertion of a foreign gene is determined by the enzyme activity. the 5'-end portion (galK') of the E. coli galactokinase structural gene derived from E. coli, the polylinker portion having one or more restriction enzyme sites, and the E. coli 5'-end missing β derived from plasmid pMC1403.
- A vector for expressing a foreign gene fragment, characterized in that a galactosidase structural gene portion ('lacZ) is arranged in order along the replication direction.
ターにおいて、 サイズが１０．６Ｋｂで、 プラスミドｐＢＲ３２２の複製開始領域と、前記抗生物
質耐性遺伝子がアンピシリン耐性遺伝子であり、 前記ポリリンカー部分の制限酵素部位がＢｂｅ I （Ｎ
ａｒ I ）、ＢｇｌII、Ｐｓｔ I 、Ｓｍａ I 、Ｂａｍ
Ｈ I であり、下記の制限酵素切断地図で表わされるこ
とを特徴とする外来遺伝子断片発現用ベクターｐＴＫ２
。 ▲数式、化学式、表等があります▼(2) The vector for expressing a foreign gene fragment according to claim 1, having a size of 10.6 Kb, comprising the replication initiation region of plasmid pBR322, the antibiotic resistance gene being an ampicillin resistance gene, and the polylinker portion comprising: The restriction enzyme site is Bbe I (N
ar I), BglII, Pst I, Sma I, Bam
A vector for expressing a foreign gene fragment, pTK2, which is H I and is represented by the restriction enzyme cleavage map shown below.
. ▲Contains mathematical formulas, chemical formulas, tables, etc.▼
ターにおいて、 サイズが６．１Ｋｂで、 プラスミドｐＢＲ３２２の複製開始領域と、前記抗生物
質耐性遺伝子がアンピシリン耐性遺伝子であり、 前記ポリリンカー部分の制限酵素部位がＢｂｅ I （Ｈ
ａｒ I ）、ＢｇｌII、Ｐｓｔ I 、Ｓｍａ I 、Ｂａｍ
Ｈ I であり、下記の制限酵素切断地図で表わされるこ
とを特徴とする外来遺伝子断片発現用ベクターｐＴＫ３
。 ▲数式、化学式、表等があります▼(3) In the vector for expressing a foreign gene fragment according to claim 1, the size is 6.1 Kb, the replication initiation region of plasmid pBR322, the antibiotic resistance gene is an ampicillin resistance gene, and the polylinker portion The restriction enzyme site is Bbe I (H
ar I), BglII, Pst I, Sma I, Bam
A foreign gene fragment expression vector pTK3, which is H I and is represented by the restriction enzyme cleavage map shown below.
. ▲Contains mathematical formulas, chemical formulas, tables, etc.▼
ターにおいて、 サイズが６．１Ｋｂで、 プラスミドｐＢＲ３２２の複製開始領域と、前記抗生物
質耐性遺伝子がアンピシリン耐性遺伝子であり、 前記ポリリンカー部分の制限酵素部位がＢｂｅ I （Ｎ
ａｒ I ）、ＢｇｌII、Ｐｓｔ I 、Ｓｍａ I 、Ｂａｍ
Ｈ I であり、下記の制限酵素切断地図で表わされるこ
とを特徴とする外来遺伝子断片発現用ベクターｐＴＫ４
。 ▲数式、化学式、表等があります▼(4) The vector for expressing a foreign gene fragment according to claim 1, having a size of 6.1 Kb, comprising the replication initiation region of plasmid pBR322, the antibiotic resistance gene being an ampicillin resistance gene, and the polylinker portion comprising: The restriction enzyme site is Bbe I (N
ar I), BglII, Pst I, Sma I, Bam
A vector pTK4 for expressing a foreign gene fragment, which is H I and is represented by the restriction enzyme cleavage map shown below.
. ▲Contains mathematical formulas, chemical formulas, tables, etc.▼
ターにおいて、 サイズが６．１Ｋｂで、 プラスミドｐＢＲ３２２の複製開始領域と、前記抗生物
質耐性遺伝子がアンピシリン耐性遺伝子であり、 前記ポリリンカー部分の制限酵素部位がＢｂｅ I （Ｎ
ａｒ I ）、ＢｇｌII、Ｓａｌ I 、ＨｉｎｄIII、Ｐｓ
ｔ I 、Ｓｍａ I およびＢａｍＨ I であり、 下記の制限酵素切断地図で表わされることを特徴とする
外来遺伝子断片発現用ベクターｐＴＫ５。 ▲数式、化学式、表等があります▼(5) The vector for expressing a foreign gene fragment according to claim 1, having a size of 6.1 Kb, comprising the replication initiation region of plasmid pBR322, the antibiotic resistance gene being an ampicillin resistance gene, and the polylinker portion comprising: The restriction enzyme site is Bbe I (N
ar I), BglII, Sal I, HindIII, Ps
tI, SmaI and BamHI, and is represented by the restriction enzyme cleavage map shown below, pTK5, a vector for expressing a foreign gene fragment. ▲Contains mathematical formulas, chemical formulas, tables, etc.▼
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7043189A JPH02249489A (en) | 1989-03-24 | 1989-03-24 | Vector for expressing exogenote fragment |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7043189A JPH02249489A (en) | 1989-03-24 | 1989-03-24 | Vector for expressing exogenote fragment |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02249489A true JPH02249489A (en) | 1990-10-05 |
Family
ID=13431288
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7043189A Pending JPH02249489A (en) | 1989-03-24 | 1989-03-24 | Vector for expressing exogenote fragment |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02249489A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0763598A1 (en) * | 1989-12-11 | 1997-03-19 | KAJI, Akira | Method of preparing a fusion protein |
-
1989
- 1989-03-24 JP JP7043189A patent/JPH02249489A/en active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0763598A1 (en) * | 1989-12-11 | 1997-03-19 | KAJI, Akira | Method of preparing a fusion protein |
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